CN108374059A - 呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，包括以下步骤：以一定比例混合磁珠裂解液以及内控品，以准备至少一第一混合液，其中所述磁珠裂解液包括磁珠以及裂解液；在高温条件下，添加样品于所述第一混合液，以使得所述样品在所述第一混合液中高温热裂解出核酸，然后冷却到室温以使得所述磁珠吸附所述核酸，形成吸附物，磁力吸附所述吸附物；以一定比例混合扩增反应液以及酶混合液，以准备至少一第二混合液；转移所述吸附物于所述第二混合液，形成扩增液，并用实时荧光定量PCR仪器检测所述扩增液。

Description

呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生命科学与生物技术领域，具体涉及一呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法，其中所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法在检测呼吸道合胞病毒RSV时不需要进行额外的核酸提取过程，具有成本低廉特异性强，灵敏度高，操作检测，结果可靠的优点。

背景技术

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是一种单链RNA呼吸道病毒，主要是通过呼吸道分泌物传播，其传染力非常强，几乎所有人在3岁前都被感染过，并且在感染过后身体不能对其产生免疫能力，所以人的终生都会有可能被感染这种病毒。

呼吸道合胞病毒RSV是造成儿童细支气管炎和哮喘的首要原因，其死亡率高达5％，是流感死亡率的10倍！呼吸道合胞病毒RSV不仅对儿童会造成危险，也会对老人造成严重威胁，呼吸道合胞病毒RSV每年导致超过65岁以上老人的死亡率仅次于流感导致的死亡率，尤其是对于有慢性阻塞性肺病(COPD)的病人，其严重程度与流感相当，有33％COPD患者会由于感染呼吸道合胞病毒RSV而最终导致肺炎，肺炎的死亡率高达5％。据统计表明，全世界每年因呼吸道合胞病毒RSV导致3.4百万人住院，66000–199000人死亡。

呼吸道合胞病毒RSV的流行时间经常与流感病毒的流行时间重合。在临床上，呼吸道合胞病毒与流感的症状非常相似，难以区别，但是针对它们的治疗方法非常不同，对于不同人群的威胁也不一样，正是因为呼吸道合胞病毒RSV对人体存在这么大的安全隐患，故在临床医学中需要快速，简单，可行地诊断呼吸道合胞病毒RSV。

目前临床上诊断呼吸道合胞病毒RSV的主要有以下几种方式：

第一，对呼吸道合胞病毒RSV进行分离培养和鉴定。这种方式是最传统的实验室诊断技术，具体而言，检测步骤如下：采取患者的鼻咽分泌物，从中分离出流感病毒或呼吸道合胞病毒，并对其进行培养和鉴定。然而病毒在细胞培养中存在生长缓慢加之病毒不稳定的问题，并且需要配置以严格的运输过程和复杂的检测技术，导致这种检测方法检测费用高，不适于快速诊断呼吸道合胞病毒RSV。

第二，血清诊断呼吸道合胞病毒RSV。检测步骤如下：对患者双份血清抗体进行测定，原理是恢复期病人血清中抗流感病毒或合胞病毒抗体滴度相较于急性期病人血清中抗流感病毒或合胞病毒抗体滴度有4倍或4倍以上升高，在实际检测过程中，可应用补体结合试验、免疫荧光、免疫酶等方法测定病毒特异性IgM抗体，从而早期诊断呼吸道合胞病毒RSV。经长期应用证明，该方法技术可靠、重复性好、特异性强，然而病人体内特异性抗体产生慢，IgM抗体也常在病后l周内才会产生，这样的检测方法需时长，并且只反映的是感染的一个间接指标，不能替代直接的病原学检测。

第三，检测呼吸道合胞病毒RSV核酸成分。该检测方法由于操作简单，又拥有极高敏感性和特异性，已经渐趋主流。目前国内的核酸诊断主要是应用Taqman探针技术并结合实时定量PCR技术检测特定核酸基因。然而目前国内呼吸道合胞病毒RSV的核酸检测试剂盒都需要对样本进行核酸提取，针对核酸的提取过程需要额外的试剂，并且核酸提取过程操作繁琐，费时费力。另外，核酸提取过程容易因为操作过程中存在的污染，导致呼吸道合胞病毒RSV检测的假阳性。

综上所述，现有技术中针对呼吸道合胞病毒RSV的检测方法存在或多或少的缺陷，如何快速高效地检测呼吸道合胞病毒RSV已经成为生物医学领域亟待解决的一重大问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法，其中所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法被适用于快速直接地检测呼吸道合胞病毒，以及早发现呼吸道合胞病毒患者。

本发明的目的在于提供一呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法，其中应用呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒的呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法在检测呼吸道合胞病毒时，不需要额外试剂提取核酸，从而简化了呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的操作，并且可避免核酸提取过程中的操作污染对呼吸道合胞病毒造成的检测影响。

本发明的目的在于提供一呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法，其中所述核酸通过高温裂解的方式从呼吸道合胞病毒中被提取，以简化呼吸道合胞病毒的检测操作过程，提高检测效率，降低检测成本。

本发明的目的在于提供一呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法，其中所述应用呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒的呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法存在特异性高，灵敏度高，可靠性高以及重复性高等特点。

本发明的目的在于提供一呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及其检测方法，其中所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒针对性检测呼吸道合胞病毒，具有极高的敏感性和特异性等特性，所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法具有操作简单，检测方便，检测效率高等特性。

为达上述目的，本发明的主要技术解决手段是提供一种呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，其中所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法被适用于检测样品是否为呼吸道合胞病毒，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法包括以下步骤：

S1:以一定比例混合磁珠裂解液以及内控品，以准备至少一第一混合液，其中所述磁珠裂解液包括磁珠以及裂解液，其中内控品被实施为监控试剂；

S2:在高温条件下，添加所述样品于所述第一混合液，以使得所述样品在所述第一混合液中高温热裂解出核酸，然后冷却到室温以使得所述磁珠吸附所述核酸，形成吸附物，磁力吸附所述吸附物，并吸弃所述第一混合液的上清液；

S3:以一定比例混合扩增反应液以及酶混合液，以准备至少一第二混合液，其中所述引物包括对应所述核酸的核酸引物以及对应所述内控品的内控引物，其中所述探针包括对应所述核酸引物的核酸探针以及对应所述内控引物的内控探针；

S4:转移所述吸附物于所述第二混合液中，形成扩增液；以及

S5:实时荧光定量PCR仪器扩增检测所述扩增液。

在一些实施例中，所述呼吸道合胞病毒快速检测方法进一步包括以下步骤：

S6：在与所述步骤S2相同的条件下，添加等量的阳性对照物于全新的第一混合液，添加等量的阴性对照物于另一全新的第一混合液，得到吸附物，其中所述阳性对照物被实施为含有呼吸道合胞病毒的目的片段的慢病毒，所述阴性对照物被实施为水溶液。

在一些实施例中，其中所述核酸引物具有GF1/GR1对应的序列，所述核酸探针具有P1对应的序列。

在一些实施例中，其中所述内控引物具有GF2/GR2对应的序列，所述内控探针具有P2对应的序列。

在一些实施例中，其中所述探针的5端修饰荧光报告基团，所述探针的3端修饰荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自FAM,VIC,JOE或Texas Red中的一种，所述内控探针荧光报告基团选自ROX,CY3或CY5的一种，所述荧光淬灭基团选自TAMARA,BHQ-2和BHQ-1的一种。

根据本发明的一实施例，本发明提供一呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其中所述呼吸道合胞病毒检测试剂盒被适用于检测样品是否为呼吸道合胞病毒，所述呼吸道病毒检测试剂盒包括：

磁珠裂解液，其中所述磁珠裂解液包括磁珠以及裂解液；

扩增反应液，其中所述扩增反应液包括反应液，特定序列的引物以及特定序列的探针，其中所述引物进一步包括核酸引物以及内控引物，其中所述探针包括对应所述核酸引物的核酸探针以及对应所述内控引物的内控探针；

酶反应液，其中所述酶反应液包括至少一活性酶；以及内控品，其中所述内控品被实施为监控试剂。

在一些实施例中，所述呼吸道合胞病毒检测试剂盒进一步包括阳性对照物以及阴性对照物，其中所述阳性对照物被实施为含有呼吸道合胞病毒的目的片段的慢病毒，所述阴性对照物被实施为水溶液。

在一些实施例中，所述所述核酸引物具有GF1/GR1对应的序列，所述核酸探针具有P1对应的序列，其中所述内控引物具有GF2/GR2对应的序列，所述内控探针具有P2对应的序列。

在一些实施例中，其中所述探针的5端修饰荧光报告基团，所述探针的3端修饰荧光淬灭基团，所述核酸探针荧光报告基团选自FAM,VIC,JOE或Texas Red中的一种，所述内控探针荧光报告基团选自ROX,CY3或CY5的一种，所述荧光淬灭基团选自TAMARA,BHQ-2和BHQ-1的一种。

在一些实施例中，所述酶混合液被实施为逆转录酶，热启动Taq酶以及UNG酶的一种，其中所述内控品被实施为失去活性的噬菌体，其中所述裂解液被实施为氯化钠、氯化钾以及二氯化镁的混合液，所述反应液被实施为包含但不限于Tris-Hcl，MgCl2，dNTP以及KCl的混合液。

附图说明

图1是根据本发明的一实施例的呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒中的引物序列图。

图2是根据本发明的所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒中的探针序列图，其中所述探针序列对应于所述引物序列。

图3是根据本发明的呼吸道合胞病毒核酸检测方法的检测过程示意图，其中每组呼吸道合胞病毒核酸检测有对应的对照组比对。

图4到图5是根据本发明的所述呼吸道合胞病毒核酸检测方法的检测过程示意图。

图6是根据本发明的所述呼吸道合胞病毒核酸检测方法的方法流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

目前国内的呼吸道合胞病毒中的核酸诊断主要是应用核酸检测试剂盒并结合实时定量PCR技术检测，但是这种PCR技术检测呼吸道合胞病毒RSV的方法都需要对呼吸道合胞病毒RSV进行核酸提取。然而针对核酸的提取过程需要额外的提取试剂，并且核酸提取过程存在操作繁琐，费时费力等问题，另外在检测过程中也容易由于核酸提取而在检测过程中引入不必要的污染，从而导致呼吸道合胞病毒检测的假阳性。

为了解决现有技术中利用PCR技术检测呼吸道合胞病毒的缺陷，本发明提供一呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒及呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，其中所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法在检测呼吸道合胞病毒时不需要进行额外的核酸提取过程，具有成本低廉特异性强，灵敏度高，操作检测，结果可靠的优点。换言之，本发明提供的呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法应用所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒直接快速地完成对呼吸道合胞病毒的检测。

呼吸道合胞病毒的英文名为“respiratory syncytial virus”，可简称为RSV，为了便于理解，在接下来的介绍若出现RSV，所述RSV被实施为呼吸道合胞病毒。本发明提供的所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法可直接快速地检测RSV，其主要原理是利用高温热裂解将呼吸道合胞病毒RSV中核酸释放到一磁珠裂解液中，然后所述磁珠裂解液中的磁珠吸附于呼吸道合胞病毒RSV的核酸，形成一核酸复合体，并随后针对所述核酸复合体进行实时荧光定量PCR检测。具体而言，本发明的所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法通过高温热裂解提取呼吸道合胞病毒中的核酸，而不需要额外的提取试剂，从而简化了呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的操作，并且可避免核酸提取过程中的操作污染对呼吸道合胞病毒的检测造成的不必要的影响。

为了实现本发明的发明原理，本发明提供适配于所述呼吸道合胞病毒快速检测方法的呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其中所述呼吸道合胞病毒检测试剂盒包括至少一磁珠裂解液10，至少一扩增反应液20，至少一酶反应液30以及至少一内控品40，其中所述磁珠裂解液10与所述内控品40混合以完成对呼吸道合胞病毒RSV的高温裂解，其中所述扩增反应液20与所述酶反应液30混合以完成对呼吸道合胞病毒RSV中核酸的扩增，随后被扩增的呼吸道合胞病毒RSV的核酸通过PCR技术被检测，从而使得所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒可直接快速地检测呼吸道合胞病毒RSV。

具体而言，所述磁珠裂解液10包括磁珠11以及裂解液12，所述磁珠11混合于所述裂解液12中形成所述磁珠裂解液10。在本发明的一实施例中，所述裂解液12被实施为氯化钠、氯化钾以及二氯化镁的混合液，但熟悉该项技术的人应该明白，所述裂解液12的具体成分并不受本实施例的限制，所述裂解液12只需要满足不影响所述呼吸道合胞病毒RSV的高温热裂解过程，并且可保证所述磁珠11在一定条件下可脱离所述裂解液12的条件即可。

在本发明的一具体实施例中，所述裂解液12被实施为1.2mol NaCl，0.1nmol KCl，磁珠，0.04nmolMgCl2的组合，即在本发明的一实施例中，所述裂解液12中所述NaCl，KCl以及MgCl2的摩尔比控制在6×10^10:5：2。当然，所述裂解液12内成分的具体比例关系也不受本实施例的影响。

另外，所述内控品40可被认为是一种监控试剂，所述监控试剂被适用于监控所述呼吸道合胞病毒RSV的裂解，在本发明的一实施例中，所述内控品40被实施为灭活的噬菌体，具体而言，所述内控品40被实施为失去活性的噬菌体，但熟悉该项技术的人应该明白，所述内控品40的类型包括但不限于本实施例提及的灭活的噬菌体。

当所述呼吸道合胞病毒核酸试剂盒被适用于检测所述呼吸道合胞病毒RSV时，所述内控品40和所述磁珠裂解液10以一定的比例混合形成一第一混合液，所述呼吸道合胞病毒RSV添加至所述第一混合液内，在一定环境条件下，所述呼吸道合胞病毒RSV中的核酸被高温裂解，此时，所述核酸独立游离于所述呼吸道合胞病毒RSV母体，并在一定条件下所述核酸与所述磁珠11彼此吸附，形成一吸附物，其中所述吸附物被适用于所述核酸的后续扩增与检测过程。

所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂提供所述扩增反应液20以及所述酶混合液30以完成对所述吸附物的扩增，被扩增的所述吸附物形成一扩增体，所述扩增体通过所述PCR技术被检测，在本发明的实施例中，所述扩增体被置于实时荧光定量PCR仪器中检测。

具体而言，所述扩增反应液20包括反应液21，特定序列的引物22以及特定序列的探针23，其中每一对引物22对应于特定序列的探针23，所述引物22以及所述探针23混合于所述反应液21。所述酶反应液40包括但不限于核酸活性酶，在本发明的一实施例中，所述酶反应液40包括逆转录酶，热启动Taq酶，UNG酶。在所述添加物质的扩增和检测过程中，所述酶反应液40与所述扩增反应液20以一定的比例在一定条件下混合形成一第二混合液，所述添加物质被添加至所述第二混合液中完成扩增和检测。

在此稍微提及PCR技术的基本检测原理：一般而言，探针包括位于5‘端的报告基团即荧光基因以及位于3’端的淬灭基团。当探针处于一完整状态时，所述淬灭基团与所述报告基团接近而被淬灭，导致无荧光产生。然而在PCR反应延伸过程中，酶反应液中的5‘-3’外切核酸活性酶切断与添加物质结合的探针，导致所述探针的报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。随着每一轮PCR的循环，都有新的报告基团被剪切，故荧光信号强度与扩增产物成正比。

在本发明的实施例中，当所述添加物质被实施为所述扩增物以及所述内控品40时，其中所述扩增物包括所述呼吸道合胞病毒RSV的游离核酸以及所述磁珠11，值得注意的是，所述磁珠11不参与引物探针的扩增。为了可检测所述添加物质，所述引物22进一步包括至少一对核酸引物221以及至少一对内控引物222，相对应地，所述探针23进一步包括至少一核酸探针231以及一内控探针232，其中所述核酸探针221对应于所述核酸引物221，所述内控探针232对应于所述内控引物222。

如图1所示，根据本发明的所述引物22序列被展示，由于所述呼吸道合胞病毒RSV的核酸以及所述内控品40具有自己独特的序列，所述核酸引物221以及所述内控引物222也相对应地具有独特的序列。

如图所示，所述核酸引物221被实施为一组GF1/GR1引物，所述GF1引物的序列被实施AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA，所述GR1引物的序列被实施为TGTGTTTCTGCACATCATAATTAGGA，所述GF1/GR1引物被适用于扩增所述核酸。但熟悉该项技术的人应该明白，所述核酸引物221的序列包括但不限于所述GF1/GR1的引物序列，所述核酸引物221的序列随着所述核酸的序列变化而变化。

相对应地，所述内控引物222被实施为一组GF2/GR2引物，所述GF2引物的序列被实施CGCGGATACCCGTACCT，所述GR2引物的序列被实施为TCGTGCTTTTCGCTGAAG，所述GF2/GR2引物被适用于扩增所述内控品40。但熟悉该项技术的人应该明白，所述内控引物222的的序列包括但不限于所述GF2/GR2的引物序列，所述内控引物222的序列随着所述内控品40的序列变化而变化。而本发明提供的所述内控品40可被实施为除了所述灭活的噬菌体以外的裂解剂，则所述内控引物222可被实施为其他序列，本发明在这方面不受限制。

如图2所示，当所述GF1引物的序列被实施AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA，所述GR1引物的序列被实施为TGTGTTTCTGCACATCATAATTAGGA时，本发明提供的所述核酸探针231的序列被实施为ACACCATCCAACGGAGCACAGGAGA，但熟悉该项技术的人应该明白，所述核酸探针231对应于所述核酸引物221设置，即当所述核酸引物221的序列发生变动时，所述核酸探针231的序列也相应发生变动。

另外，当所述GF2引物的序列被实施CGCGGATACCCGTACCT，所述GR2引物的序列被实施为TCGTGCTTTTCGCTGAAG时，所述内控探针232的序列被实施为TCGTGCTTTTCGCTGAAG，同样的，熟悉该项技术的人应该明白，所述内控探针232对应于所述内控引物222设置，即当所述内控引物222的序列发生变动时，所述内控探针232的序列也相应发生变动。

另外，所述探针23的5端标记为荧光报告基团，3’端标记为荧光淬灭基团，在本发明的实施例中，所述核酸探针231的荧光报告基团选自FAM,VIC,JOE或Texas Red中的一种，在其中，所述核酸探针231的荧光报告基团优选为FAM荧光基因，所述内控探针232的荧光报告基团选自ROX,CY3或CY5的一种，在其中，所述内控探针232的荧光报告基团优选为CY5，但熟悉该项技术的人应该明白，所述探针23的荧光报告基团的选择并不受限制。同理，所述探针23的荧光淬灭基团选自BHQ1,BHQ2或TAMRA中的一种。

另外，在本发明的实施例中，所述引物22以及所述探针23混合于所述反应液21，所述反应液21的成分组成并不受本发明的限制，所述反应液21满足引物探针与添加物质的扩增即可，在本发明的实施例中，所述反应液21包含但不限于Tris-Hcl，MgCl2，dNTP以及KCl，熟悉该项技术的人应该明白，所述反应液21的类型并不受限制。

综上所述，当所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒被适用于检测所述呼吸道合胞病毒RSV时，一样品60被添加至所述第一混合液中高温热裂解，其中所述第一混合液被实施为所述磁珠裂解液10以及所述内控品40的混合，此时，当所述样品60被实施为所述呼吸道合胞病毒RSV时，所述样品60中的一核酸61被裂解，所述核酸61与所述磁珠11吸附形成所述吸附物。所述吸附物再被添加至所述第二混合液中得以扩增以形成所述扩增物，其中所述第二混合液被实施为所述扩增反应液20与所述酶反应液30的混合，此时所述扩增物通过PCR技术被检测。

另外，为了排除不必要的因素对PCR技术检测呼吸道合胞病毒RSV的干扰，所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒包括阳性对照物50以及阴性对照物70，其中所述阳性对照物50被实施为含有呼吸道合胞病毒RSV的目的片段的慢病毒，所述阴性对照物50被实施为没有RNA酶的水溶液。

在实际检测过程中，如图3所示，所述样品60被添加至所述第一混合液以及所述第二混合液中被检测，此时，定义该情况为第一反应体系。与所述样品60相同分量的所述阳性对照物50被添加至一第二反应体系反应，以做阳性对照。同理，与所述样品60相同分量的所述阴性对照物70被添加至一第三反应体系中反应，以做阴性对照。值得注意的是，所述第一反应体系，所述第二反应体系以及所述第三反应体系的反应条件完全相同，唯一不同的是，所述第一反应体系中添加一定分量的所述样品60，所述第二反应系统中添加相同分析的所述阳性对照物50，所述第三反应体系中添加相同分享的所述阴性对照物60。值得注意的是，每次实验均需检测阴性对照和阳性对照，质控结果满足质量要求后方可进行检测结果的判断

所述第一反应体系，所述第二反应体系以及所述第三反应体系所产生的三类扩增物被添加至所述扩增仪中得以检测，在所述扩增仪的数据分析过程中，以取高于样本组的噪声线和以及阴性对照组的荧光值作为检测阀值。检测标准如下：待测样本的FAM通道Ct值为0，且内控的CY5通道Ct值≤40，样本为RSV阴性；待测样本的FAM荧光信号明显增长，且为典型S曲线，Ct值≤40，样本为RSV阳性。

如图4到图5所示，本发明提供的所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒被适用于检测所述呼吸道合胞病毒RSV的过程示意图被展示，值得注意的是，图4和图5以所述样品60被实施为所述呼吸道合胞病毒RSV为例进行说明，即图4和图5展示的为所述第一反应体系的过程示意图。

根据本发明的另一方面，本发明提供一呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，其中所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法应用所述呼吸道合胞病毒检测试剂盒直接快速地完成对所述呼吸道合胞病毒RSV的检测，以下将以具体的实施例说明所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的检测过程。但熟悉该项技术的人应该明白，本发明仅仅提供一具体实施例，而不作为本发明的限制。

所述实施例实施情况如下：

1、将呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒中的磁珠裂解液10取出，将所述磁珠裂解液10振荡摇匀后并短暂离心，另外将所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒放置于一化冻环境中化冻，其中所述化冻环境可被实施为冰上或4度冰箱，此时，所述呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒需要在冰上或4度冰箱里化冻30-60分钟。

该步骤被实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的准备步骤，在所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的准备步骤中，所述磁珠裂解液10需要摇匀后并离心，所述试剂盒需要置于一化冻环境中。

2、取合适的离心管，并向所述离心管中加入n×80μL的磁珠裂解液10和n×1μL的内控品40，混匀形成第一混合液，然后用移液枪按照81μL/管，加入到1.5mL离心管或者PCR八联管中。

该步骤被实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的裂解液准备步骤，其中所述磁珠裂解液10以及所述内控品40以80：1的体积比混合，形成所述第一混合液，所述第一混合液被添加至一反应容器中。

3、在步骤2制备的至少一离心管或PCR管中，加入20μL样品60。

该步骤实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的样品准备步骤，其中所述样品60与所述第一混合液的体积比大致为1：4，具体而言，在本发明的实施例中，所述样品60与所述第一混合液的提及比控制在20：81。

4、在所述步骤2制备的至少一离心管或PCR管中，加入20ul阳性对照物50，在另一离心管或PCR管中，加入20ul的阴性对照物70。

该步骤实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的对照组准备步骤，其中值得一提的是，所述步骤2中应制备相同条件的多管离心管或PCR管，以备用于添加所述样品60，所述阳性对照物50以及所述阴性对照物70。

5、将准备好离心管都盖好管盖，进行短暂离心，并置于80℃恒温中孵育5min，然后置于室温中放置5min。其中八联管可放入PCR仪中，设定80℃×5min，20℃×5min。另外8联管在金属浴中加热无需盖盖子。

该步骤实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的裂解步骤。其中本发明提供的裂解条件被实施为80℃×5min，20℃×5min，但这不作为限制，所述裂解条件随着所述裂解步骤所处的环境变化而变化。另外，在本发明的实施例中，当所述样品60或者所述阳性对照物50或者所述阴性对照物70被置于不同的反应容器中时，不同的反应容器可在不同条件下裂解。

6、将步骤5离心管或八联管放在磁力架上静置1-2min。用移液器小心地吸去液体。如不小心吸到磁珠11，则将液体打回管内，重新静置1min后再吸。吸弃液体要完全。

该步骤实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的吸附物转移步骤。根据本发明的呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，所述呼吸道合胞病毒被裂解出所述核酸61，所述核酸61与所述磁珠11吸附形成所述吸附物，所述吸附物需要从所述第一混合液中被转移到所述第二混合液中被扩增检测。

7.按照n×49ul核酸反应液20加入n×1ul酶混合液30于一管离心管中混匀，然后用移液枪吸取50μL分别加入到步骤6的离心管或八联管中。

该步骤实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的第二混合液准备步骤。其中所述核酸反应液20与所述酶混合液30的体积比控制在49：1，形成所述第二混合液。

8.用移液枪反复吸打至磁珠11完全分散。如为1.5mL离心管，须转移至PCR管或PCR盘中。盖上盖子或封上胶膜。

该步骤依旧实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的第二混合液准备步骤。在该步骤中，需要让所述吸附物中的所述磁珠11和所述核酸61完全分离，从而使得所述磁珠11不会影响所述核酸61的扩增。

9、立即放入PCR仪进行扩增检测。如暂时不检测，须将PCR管或PCR盘避光保存在4度冰箱里不超过2小时。

该步骤实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的扩增准备步骤。即当所述磁珠11与所述核酸61完全分离后，要么快速转移到所述扩增仪中进行扩增反应，要么就放置于一化冻环境中保存，其中在本发明的实施例中，所述化冻条件被实施为在4度冰箱里不超过2小时。

10、在PCR仪里设置以下的循环参数：45℃×10min；95℃×10min；再按95℃×15s→60℃×45s循环40次；荧光检测在60℃；反应体系为50μL。荧光通道检测选用FAM和CY5；如果用ABI系列的PCR仪器，Quencher Dye选择None。

该步骤实施为所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法的扩增准备步骤。该实施例提供一具体的扩增程序，但熟悉该项技术的人应该明白，所述扩增程序仅仅作为参考而不作为限制。根据不同的反应条件和不同的扩增仪特性，所述扩增程序可选用不同参数。其中所述PCR检测标准如下：待测样本的FAM通道Ct值为0，且内控的CY5通道Ct值≤40，样本为RSV阴性；待测样本的FAM荧光信号明显增长，且为典型S曲线，Ct值≤40，样本为RSV阳性。

如图6所示，根据本发明的所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法被展示，其中所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法被适用于检测一样品是否为呼吸道合胞病毒RSV，包括以下步骤：

S1:以一定比例混合磁珠裂解液10以及内控品40，以准备至少一第一混合液，其中所述磁珠裂解液10包括磁珠11以及裂解液12，其中内控品40被实施为监控试剂；

S2:在高温条件下，添加所述样品60于所述第一混合液，以使得所述样品在所述第一混合液中高温热裂解出核酸61，然后冷却到室温以使得所述磁珠11吸附所述核酸61，形成吸附物，磁力吸附所述吸附物，并吸弃所述第一混合液的上清液；

S3:以一定比例混合扩增反应液20以及酶混合液30，以准备至少一第二混合液，其中所述引物22包括对应所述核酸61的核酸引物221以及对应所述内控品40的内控引物222，其中所述探针23包括对应所述核酸引物221的核酸探针231以及对应所述内控引物222的内控探针232；

S4:转移所述吸附物于所述第二混合液中，形成扩增液；以及

S5:实时荧光定量PCR仪器扩增检测所述扩增液。

值得一提的是，在所述步骤S2中进一步包括以下步骤:

S6：在与所述步骤S2相同的条件下，添加等量的阳性对照物50于全新的第一混合液，添加等量的阴性对照物70于另一全新的第一混合液，得到吸附物。

值得一提的是所述步骤S3，S4，S5以及S6中提到的所有步骤完全适用于所述步骤S7得到的吸附物，可以说，所述样品60被添加至所述第一混合液以及所述第二混合液中被检测，此时，定义该情况为第一反应体系。与所述样品60相同分量的所述阳性对照物50被添加至一第二反应体系反应，以做阳性对照。同理，与所述样品60相同分量的所述阴性对照物70被添加至一第三反应体系中反应，以做阴性对照。所述第一反应体系，所述第二反应体系以及所述第三反应体系的反应条件完全相同，唯一不同的是，所述第一反应体系中添加一定分量的所述样品60，所述第二反应系统中添加相同分析的所述阳性对照物50，所述第三反应体系中添加相同分享的所述阴性对照物60。

另外，所述阳性对照物50被实施为含有呼吸道合胞病毒RSV的目的片段的慢病毒，所述阴性对照物50被实施为没有RNA酶的水溶液。

在所述步骤S1当中，所述磁珠裂解液10需要先振荡摇匀后并短暂离心后方可使用，所述磁珠裂解液10以及所述内控品40以80：1的体积比混合，形成所述第一混合液。另外，在本发明的一实施例中，所述裂解液12被实施为所述裂解液12被实施为氯化钠、氯化钾以及二氯化镁的混合液，所述内控品40被实施为灭活的噬菌体。

在所述步骤S2当中，所述高温条件被实施为在80℃恒温中孵育5min，然后置于室温中放置5min，此时，所述室温为20摄氏度。当然，所述步骤S6当中，所述高温条件也被实施为80℃恒温中孵育5min，然后置于室温中放置5min，但这绝对不作为绝对限制。

在所述步骤S3当中，在一个实施例中，所述扩增反应液20另外包括反应液21，其中所述反应液21被实施为Tris-Hcl，MgCl2，dNTP，KCl的组合，所述所述核酸引物221被实施为一组GF1/GR1引物，所述GF1引物的序列被实施AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA，所述GR1引物的序列被实施为TGTGTTTCTGCACATCATAATTAGGA，相对应地，所述内控引物222被实施为一组GF2/GR2引物，所述GF2引物的序列被实施CGCGGATACCCGTACCT，所述GR2引物的序列被实施为TCGTGCTTTTCGCTGAAG，所述GF2/GR2引物被适用于扩增所述内控品40。

当所述GF1引物的序列被实施AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA，所述GR1引物的序列被实施为TGTGTTTCTGCACATCATAATTAGGA时，本发明提供的所述核酸探针231的序列被实施为ACACCATCCAACGGAGCACAGGAGA。

另外，当所述GF2引物的序列被实施CGCGGATACCCGTACCT，所述GR2引物的序列被实施为TCGTGCTTTTCGCTGAAG时，所述内控探针232的序列被实施为TCGTGCTTTTCGCTGAAG。

另外，所述探针23的5端标记为荧光报告基团，3’端标记为荧光淬灭基团，在本发明的实施例中，所述核酸探针231的荧光报告基团选自FAM,VIC,JOE或Texas Red中的一种，在其中，所述核酸探针231的荧光报告基团优选为FAM荧光基因，所述内控探针232的荧光报告基团选自ROX,CY3或CY5的一种，在其中，所述内控探针232的荧光报告基团优选为CY5，但熟悉该项技术的人应该明白，所述探针23的荧光报告基团的选择并不受限制。同理，所述探针23的荧光淬灭基团选自BHQ1,BHQ2或TAMRA中的一种。

另外所述酶反应液20包括但不限于核酸活性酶，在本发明的一实施例中，所述酶反应液40包括逆转录酶，热启动Taq酶，UNG酶。其中所述核酸反应液20与所述酶混合液30的体积比控制在49：1，形成所述第二混合液。

在所述步骤S4当中，具体转移步骤被实施为将吸附物和所述第二混合液放在磁力架上静置1-2min。用移液器小心地吸去液体。如不小心吸到磁珠11，则将液体打回管内，重新静置1min后再吸。吸弃液体要完全。

在所述步骤S5当中，所述扩增步骤为立即放入PCR仪进行扩增检测。如暂时不检测，须将PCR管或PCR盘避光保存在4度冰箱里不超过2小时。在PCR仪里设置以下的循环参数：45℃×10min；95℃×10min；再按95℃×15s→60℃×45s循环40次；荧光检测在60℃；反应体系为50μL。荧光通道检测选用FAM和CY5；如果用ABI系列的PCR仪器，Quencher Dye选择None。

另外，本发明不局限于上述最佳实施方方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上做出任何变化，凡是具有与本发明相同或相似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，其中所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法被适用于检测样品是否为呼吸道合胞病毒，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法包括以下步骤：

S1:以一定比例混合磁珠裂解液以及内控品，以准备至少一第一混合液，其中所述磁珠裂解液包括磁珠以及裂解液，其中内控品被实施为监控试剂；

S2:在高温条件下，添加所述样品于所述第一混合液，以使得所述样品在所述第一混合液中高温热裂解出核酸，然后冷却到室温以使得所述磁珠吸附所述核酸，形成吸附物，磁力吸附所述吸附物，并吸弃所述第一混合液的上清液；

S3:以一定比例混合扩增反应液以及酶混合液，以准备至少一第二混合液，其中所述引物包括对应所述核酸的核酸引物以及对应所述内控品的内控引物，其中所述探针包括对应所述核酸引物的核酸探针以及对应所述内控引物的内控探针；

S4:转移所述吸附物于所述第二混合液中，形成扩增液；以及

S5:实时荧光定量PCR仪器扩增检测所述扩增液。

2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒快速检测方法，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒快速检测方法进一步包括以下步骤：

S6：在与所述步骤S2相同的条件下，添加等量的阳性对照物于全新的第一混合液，添加等量的阴性对照物于另一全新的第一混合液，得到吸附物，其中所述阳性对照物被实施为含有呼吸道合胞病毒的目的片段的慢病毒，所述阴性对照物被实施为水溶液。

3.根据权利要求1到2任一所述的呼吸道合胞病毒快速检测方法，其特征在于，其中所述核酸引物具有GF1/GR1对应的序列，所述核酸探针具有P1对应的序列。

4.根据权利要求3所述的呼吸道合胞病毒快速检测方法，其特征在于，其中所述内控引物具有GF2/GR2对应的序列，所述内控探针具有P2对应的序列。

5.根据权利要求4所述的呼吸道合胞病毒快速检测方法，其特征在于，其中所述探针的5端修饰荧光报告基团，所述探针的3端修饰荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自FAM,VIC,JOE或Texas Red中的一种，所述内控探针荧光报告基团选自ROX,CY3或CY5的一种，所述荧光淬灭基团选自TAMARA,BHQ-2和BHQ-1的一种。

6.一呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其中所述呼吸道合胞病毒检测试剂盒被适用于检测样品是否为呼吸道合胞病毒，所述呼吸道病毒检测试剂盒包括：

磁珠裂解液，其中所述磁珠裂解液包括磁珠以及裂解液；

扩增反应液，其中所述扩增反应液包括反应液，特定序列的引物以及特定序列的探针，其中所述引物进一步包括核酸引物以及内控引物，其中所述探针包括对应所述核酸引物的核酸探针以及对应所述内控引物的内控探针；

酶反应液，其中所述酶反应液包括至少一活性酶；以及内控品，其中所述内控品被实施为监控试剂。

7.根据权利要求6所述的呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒检测试剂盒进一步包括阳性对照物以及阴性对照物，其中所述阳性对照物被实施为含有呼吸道合胞病毒的目的片段的慢病毒，所述阴性对照物被实施为水溶液。

8.根据权利要求6到7任一所述的呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其特征在于，所述所述核酸引物具有GF1/GR1对应的序列，所述核酸探针具有P1对应的序列，其中所述内控引物具有GF2/GR2对应的序列，所述内控探针具有P2对应的序列。

9.根据权利要求8所述的呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其特征在于，其中所述探针的5端修饰荧光报告基团，所述探针的3端修饰荧光淬灭基团，所述核酸探针荧光报告基团选自FAM,VIC,JOE或Texas Red中的一种，所述内控探针荧光报告基团选自ROX,CY3或CY5的一种，所述荧光淬灭基团选自TAMARA,BHQ-2和BHQ-1的一种。

10.根据权利要求9所述的呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液被实施为逆转录酶，热启动Taq酶以及UNG酶的一种，其中所述内控品被实施为失去活性的噬菌体，其中所述裂解液被实施为氯化钠、氯化钾以及二氯化镁的混合液，所述反应液被实施为包含但不限于Tris-Hcl，MgCl2，dNTP以及KCl的混合液。