CN106929468B - 一种鱼类单细胞悬液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种鱼类单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：PBS试剂、D‑Han氏液和IV型胶原酶液的配制，准备鱼的肾脏组织块，用PBS冲洗肾脏组织3次以上；将组织块放人冰浴中的平皿里，加入PBS，剪切成细小碎块，将组织块放入高通量组织研磨器离心管中；在离心管中加入IV型胶原酶，同时加入PBS定容至4ml，放入氧化锆球进行研磨，将组织匀浆酶解消化；过滤，离心，PBS冲洗，离心，弃上清液除去细胞碎片，过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。本发明采用酶解研磨法，结合了研磨法和酶解法两种方法的优点，通过酶解研磨对组织处理更充分，解决了制备鱼类单细胞悬液细胞得率低和细胞活力低的问题。

Description

一种鱼类单细胞悬液的制备方法
技术领域
本申请属于动物单细胞制备领域，具体地说，涉及一种鱼类单细胞悬液的制备方法。
背景技术
随着医学及细胞组学的快速发展，单细胞悬液制备已经越来越重要。单细胞悬液制备研究中，国外最先见于对小鼠畸胎瘤组织用胰蛋白酶解离制备单细胞悬液的研究中，国内最早见于对喉癌组织鳞状上皮细胞单细胞悬液的制备。组织单细胞悬液的用途广泛，可应用于细胞培养、流式细胞术检测等。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是在20世纪60年代末发展起来的一种对细胞的物理和化学性质进行快速定性和定量的技术，该技术以大量的单个细胞为检测单位，具有研究结果客观准确、灵敏且同时能够检测多个参数等优点，各种新型特异性荧光染料的不断开发和检测技术的不断进步，促使FCM的应用由临床医学领域逐渐向其他生物学领域快速扩展。
Sequeira等(Sequeira T,Vilanova M,Lobo-Da-Cunha A,et al.Flowcytometric analysis of molt-related changes in hemocyte type in male andfemale Penaeus japonicus[J].The Biological Bulletin,1995,189(3):376-380.)1995年对日本对虾(Penaeus japonicus)在蜕皮间期和蜕皮时期的血细胞亚群组成情况进行报道，Magnadottir等(óTTIR B ó T M,óTTIR H K
Figure BDA0001250476680000011
óTTIR S G.Characterisation ofmonoclonal antibodies to separate epitopes on salmon IgM heavy chain[J].Fish&Shellfish Immunology,1996,6(3):185-198.)1996年对鲑鱼血液单克隆抗体进行研究。国内关于流式细胞术在水产动物研究中的应用较早见于对鲍、泥蚶、牡蛎，对虾等的倍性、血细胞分群，细胞周期等的研究，之后部分鱼类的血液血细胞倍性分析，DNA含量测定，细胞凋亡等方面的研究陆续被报道，但都主要集中于血液和血细胞的特性检测，对鱼类活体器官组织做流式单细胞悬液制备及检测尚未见报道。
目前将动物组织处理为单细胞悬液方法主要有机械法(剪切、研磨、吹打，网搓等)，化学试剂处理法(EDTA，EGTA阳离子螯合剂等)，酶解法(胰酶、胶原酶、弹性蛋白酶，透明质酸酶、溶菌酶)等三种方法，处理方法不同对组织的处理效果也各有优劣。机械法操作简便，较为适合处理一些含纤维组织较少的软组织，但此法易产生较多组织团块和细胞碎片，必须用细胞筛过滤去除团块。Ca2+、Mg2+在组织细胞间起黏连作用，化学试剂处理法则主要是通过化学试剂处理将Ca2+、Mg2+置换出来从而破坏黏连作用以达到分离细胞的目的。该方法在制备黏连性较大的实体脏器的单细胞悬液的过程中如肿瘤组织等，可以有效的防止单细胞再聚集，但此方法可能会影响实验结果，如EDTA能够和缓冲液中的Ca2+发生螯合反应或对细胞膜结构造成破坏。
酶解法具有制得单细胞损伤较小，细胞形态规则，具有特异酶解作用等诸多优点，因此为目前将组织分散成单个细胞试验中最为常用的方法。胰酶能够水解酯键和肽键，但如消化作用较强会损伤细胞膜表面结构；各种胶原酶都能够有针对性的降解几种胶原，胶原酶Ⅳ含有多种蛋白酶，能够不损伤其它蛋白质和组织的同时特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，酶解作用较为温和；弹性蛋白酶可以将起连接作用的糖蛋白和弹性蛋白水解破坏，透明质酸酶能够降解透明质酸，溶菌酶则能够水解蛋白质和肽类的糖苷键。
发明内容
有鉴于此，本申请针对上述的问题，提供了一种鱼类单细胞悬液的制备方法，本发明采用酶解研磨法，结合了研磨法和酶解法两种方法的优点，通过酶解研磨对组织处理更充分，解决了制备鱼类单细胞悬液细胞得率低和细胞活力低的问题。
为了解决上述技术问题，本申请公开了一种鱼类单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
1)PBS试剂、D-Han氏液和IV型胶原酶液的配制；
2)准备试验鱼的肾脏组织块，放入提前置于冰浴中的平皿中，用PBS冲洗肾脏组织3次以上，将组织表面的血细胞冲洗干净；
3)将肾脏组织块放人冰浴中的平皿里，然后加入PBS，将肾脏组织剪切成为1mm3细小碎块，移液枪小心吸走多余PBS，将肾脏组织块放入SCIENTZ 50高通量组织研磨器5ml离心管中；
4)将IV型胶原酶在水浴中加热，取2ml加热后的IV型胶原酶加入离心管中，同时加入水浴预热的PBS定容至4ml，放入2颗氧化锆球进行研磨，研磨好后打开研磨器开关将组织匀浆放入恒温水浴振荡器中酶解消化；
5)用细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内进行离心处理，PBS洗3次，每次进行低速离心处理，弃上清液除去细胞碎片，用细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。
进一步地，步骤1)中的PBS试剂、D-Han氏液和IV型胶原酶液的配制具体为：
1.1)PBS试剂配制：0.01mol/L PBS(pH＝7.2)：准确称量8.00gNaCl，0.20gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶解于800ml经高压灭菌的超纯水中，用盐酸调节pH至7.2，灭菌超纯水定容到1000ml，4℃保存备用。
1.2)D-Han氏液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HP04·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g，溶于800m1高压灭菌的双蒸水，调节PH值至7.2-7.4，灭菌超纯水定容为1000ml，4℃保存备用；
1.3)IV型胶原酶液配制：准确称量50mgIV型胶原酶，室温25℃搅拌溶解于100mlD-Han氏液，4℃过夜，0.22um过滤除菌，配制成0.5g/L IV型胶原酶液。
进一步地，步骤3)中的肾脏组织块与PBS的质量体积比为10-20g/L。
进一步地，步骤4)中的水浴温度为37℃，研磨转速为2000r/min-3000r/min，研磨时间为1-3min；酶解消化时间为1小时-1.5小时。
进一步地，步骤5)中用细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内进行离心处理，PBS洗3次，每次进行低速离心处理，弃上清液除去细胞碎片，用细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用，具体为：以300目细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内，1000/min-1500r/min离心3min-5min，PBS洗3次，每次以500r/min-800r/min低速离心3min-5min，弃上清液除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
1)本发明采用鱼类肾脏组织制备单细胞悬液，检测比较酶解研磨法、研磨法、酶解法、剪切法分别制备单细胞悬液的差异，采用流式细胞仪对其细胞得率、细胞活力、凋亡细胞，坏死及死细胞比例进行测定分析，从而建立了一种最佳的鱼类单细胞悬液制备方法。
2)鱼类单细胞悬液酶解研磨制备法，处理组织后已完全成为单细胞悬液状态；显微镜下可见细胞分散良好，杂质及细胞碎片和细胞团块极少；所得细胞能够方便地用流式细胞仪检测，在流式点图中含有三群细胞群，同镜检结果一致。
3)鱼类肾脏单细胞悬液的细胞得率从高到低变化趋势依次为酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差异极显著(p<0.01)；用酶解研磨法制备的细胞得率远高于其他制备方法。
4)鱼类肾脏单细胞悬液的细胞活力从高到低依次为酶解研磨法>酶解法>研磨法>剪切法，用酶解研磨法制备单细胞悬液的细胞活力极显著高于另外3种制备方法(P<0.01)。
5)鱼类肾脏单细胞悬液的活细胞比例从高到低变化趋势依次为酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差异极显著(p<0.01)；用酶解研磨法制备单细胞悬液的活细胞比例远高于其他制备方法。
6)用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的坏死和损伤细胞比例极显著低于酶解法、研磨法和剪切法(P<0.01)。
当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本申请肾脏单细胞悬液流式检测图，其中，R1、R2，R3分别为小圆上皮细胞、红细胞、大圆上皮细胞；
图2是本申请肾脏单细胞悬液镜检图，其中，E.红细胞；LRE.大圆上皮细胞；SRC.小圆上皮细胞。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种鱼类单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
1)试剂配制
1.1)PBS试剂配制：0.01mol/L PBS(pH＝7.2)：准确称量8.00gNaCl，0.20gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶解于800ml经高压灭菌的超纯水中，用盐酸调节pH至7.2，灭菌超纯水定容到1000ml，4℃保存备用。
1.2)D-Han氏液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HP04·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g，溶于800m1高压灭菌的双蒸水，调节PH值至7.2-7.4，灭菌超纯水定容为1000ml，4℃保存备用；
1.3)IV型胶原酶液配制：准确称量50mgIV型胶原酶(Sigma公司，生产批号：C012900)，室温25℃搅拌溶解于100ml D-Han氏液，4℃过夜，0.22um过滤除菌，配制成0.5g/L IV型胶原酶液。
2)准备试验鱼的肾脏组织块(工业或者食品下脚料)，放入提前置于冰浴中的平皿中，用PBS冲洗肾脏组织3次以上，将组织表面的血细胞冲洗干净；
3)将肾脏组织块放人冰浴中的平皿里，加入PBS，其中，肾脏组织块与PBS的质量体积比为10-20g/L，剪切成约为1mm3细小碎块，移液枪小心吸走多余PBS，将组织块放入SCIENTZ 50高通量组织研磨器5ml离心管中；若肾脏组织块与PBS的质量体积比低于10g/L时会造成PBS浪费，并且增加处理操作时间；高于20g/L则容易造成组织块前处理剪切不充分，因此，选择肾脏组织块与PBS的质量体积比为10-20g/L；
4)在离心管中加入2ml提前在37℃水浴加热的IV型胶原酶，同时加入37℃水浴预热的PBS定容至4ml，放入2颗氧化锆球(每颗均重0.11±0.01g)进行研磨，转速为2000r/min-3000r/min，2min后打开研磨器开关将组织匀浆放入37℃恒温水浴振荡器中酶解消化1小时-1.5小时；
5)以300目细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内，1000r/min-1500r/min离心3min-5min，PBS洗3次，每次以500r/min-800r/min低速离心3min-5min，弃上清液除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。先以300目细胞筛过滤后以400目细胞筛过滤细胞悬液的原因是在有效滤掉细胞团块的同时尽可能的减小单细胞的损失，从而增加细胞得率。如在操作中发现步骤5)中两次都使用400目细胞筛，细胞团块最少，但得率会大幅降低；两次均使用300目细胞筛则仍会有极少量的细胞团块出现；此外以300目过滤后以400目过滤效果比先以400目过滤后以300目过滤效果好。
实施例1
鲫鱼肾脏组织单细胞悬液制备法：
1)试剂配制
1.1)PBS试剂配制：0.01mol/L PBS(pH＝7.2)：准确称量8.00gNaCl，0.20gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶解于800ml经高压灭菌的超纯水中，用盐酸调节pH至7.2，灭菌超纯水定容到1000ml，4℃保存备用。
1.2)D-Han氏液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HP04·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g，溶于800m1高压灭菌的双蒸水，调节PH值至7.2-7.4，灭菌超纯水定容为1000ml，4℃保存备用；
1.3)IV型胶原酶液配制：准确称量50mgIV型胶原酶(Sigma公司，生产批号：C012900)，室温25℃搅拌溶解于100ml D-Han氏液，4℃过夜，0.22um过滤除菌，配制成0.5g/L IV型胶原酶液；
2)准确称取0.10g试验鱼的肾脏组织块，放入提前置于冰浴中的平皿中，用PBS冲洗肾脏组织3次以上，将组织表面的血细胞冲洗干净；
3)将组织块放人冰浴中的平皿里，加入10mlPBS，剪切成约为1mm3细小碎块，移液枪小心吸走多余PBS，将组织块放入SCIENTZ 50高通量组织研磨器5ml离心管中；
4)在离心管中加入2ml提前在37℃水浴加热的IV型胶原酶，同时加入37℃水浴预热的PBS定容至4ml，放入2颗氧化锆球进行研磨，转速为2000r/min，2min后打开研磨器开关将组织匀浆放入37℃恒温水浴振荡器中酶解消化1小时；
5)以300目细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内，1000r/min离心5min，PBS洗3次，每次以500r/min低速离心3min，弃上清液除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。
采用本发明方法所得细胞能够方便地用流式细胞仪检测，如图1所示，在流式点图中含有三群细胞群R1、R2，R3，根据细胞大小及颗粒度分别对应图2中的小圆上皮细胞、红细胞、大圆上皮细胞；因此，同镜检结果一致。
对照试验采用剪切法、研磨法和组织酶解法，其中，剪切法、研磨法和组织酶解法的具体操作步骤如下：
剪切法是通过手术剪刀等器具将组织逐渐剪切为匀浆状，是组织机械法处理中较常用的一种方法。将活体组织块放人冰浴中的平皿里，加入10mlPBS，剪切成约为1mm3细小碎块后用200目细胞筛过滤，PBS清洗以冲掉组织内血细胞。将组织块转入平皿中，加入10mlPBS将组织块用眼科剪继续剪至匀浆状。先以300目细胞筛过滤到在预冷处理过的10ml离心管中，1000r/min离心沉淀5min，弃上清后加2ml预冷的PBS重悬并转移到5ml离心管，PBS洗3次，每次以500r/min低速离心3min，弃上清除去细胞碎片。用400目细胞筛过滤并定容为3ml，4℃保存待用。
研磨法即利用普通研磨器对组织进行研磨处理，是机械法处理组织的另一种较为常用的方法。肾脏组织块前处理同剪切法，后将处理后的组织块转入预冷处理过的5ml高通量组织研磨器离心管中，放入两颗氧化锆球。加入PBS定容到4ml，转速为2000r/min，2min后打开研磨器开关将组织匀浆，以300目细胞筛过滤到预冷过的的5ml离心管中。1000r/min离心5min弃上清，PBS洗3次每次以500r/min 3min低速离心，弃上清除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤并用预冷PBS定容为3ml，4℃保存待用(Bin G,Ke-wu H,Jia-jia L.Preparationof single cell suspension from rabbit muscle VX2 tumor with scissors versushomogenate method[J].Chinese Journal of Tissue Engineerin 2007；11(41):8315-8317.)。
组织酶解法即利用酶的特异性酶解作用而对组织进行处理的一种方法。肾脏组织块前处理同剪切法，后转入5ml离心管中，加入2ml PBS和2mlIV型胶原酶(终浓度0.25mg/mL)在37℃水浴1h，期间不断震荡充分消化，确保组织被消化成单细胞。先以300目细胞筛过滤到预冷处理的5ml离心管内；1000r/min离心5min，PBS洗3次，每次以500r/min 3min低速离心，弃上清除去细胞碎片；以400目细胞筛过滤细胞悬液计并用PBS定容为3ml，4℃保存待用(陈朱波，曹雪涛.流式细胞术：原理、操作及应用(第二版)[M].北京：科学出版社，2014.1，54-55)。
用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的细胞得率最高为(27.99±0.19)×107/g，活细胞比例最高为91.67±0.81，细胞得率和活细胞比例从高到低变化趋势一致依次为酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差异极显著(p<0.01)；用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的细胞活力最高为92.33±1.80，极显著高于另外三种方法(P<0.01)；用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的坏死和损伤细胞比例最低为8.20±0.75，极显著低于酶解法、研磨法和剪切法(P<0.01)(见表1)。
表1鲫鱼肾脏组织单细胞悬液制备效果比较表
n＝3；Means±SD
Figure BDA0001250476680000081
注：表格中所给数据为平均数及3个重复的标准差；同列肩标有相同大写字母或无字母表示差异不极显著(p>0.01)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，同列肩标有相同小写字母或无字母表示差异不显著(p>0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.05)，下表同。
实施例2
台湾泥鳅肾脏组织单细胞悬液制备法：
1)试剂配制
1.1)PBS试剂配制：0.01mol/L PBS(pH＝7.2)：准确称量8.00gNaCl，0.20gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶解于800ml经高压灭菌的超纯水中，用盐酸调节pH至7.2，灭菌超纯水定容到1000ml，4℃保存备用。
1.2)D-Han氏液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HP04·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g，溶于800m1高压灭菌的双蒸水，调节PH值至7.2，灭菌超纯水定容为1000ml，4℃保存备用；
1.3)IV型胶原酶液配制：准确称量50mgIV型胶原酶(Sigma公司，生产批号：C012900)，室温25℃搅拌溶解于100ml D-Han氏液，4℃过夜，0.22um过滤除菌，配制成0.5g/L IV型胶原酶液。
2)准备台湾泥鳅的肾脏组织块(工业或者食品下脚料)，放入提前置于冰浴中的平皿中，用PBS冲洗肾脏组织3次以上，将组织表面的血细胞冲洗干净；
3)将肾脏组织块放人冰浴中的平皿里，加入PBS，其中，肾脏组织块与PBS的质量体积比为10g/L，剪切成约为1mm3细小碎块，移液枪小心吸走多余PBS，将组织块放入SCIENTZ50高通量组织研磨器5ml离心管中；
4)在离心管中加入2ml提前在37℃水浴加热的IV型胶原酶，同时加入37℃水浴预热的PBS定容至4ml，放入2颗氧化锆球进行研磨，转速为3000r/min，2min后打开研磨器开关将组织匀浆放入37℃恒温水浴振荡器中酶解消化1.5小时；
5)以300目细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内，1000r/min离心5min，PBS洗3次，每次以500r/min低速离心5min，弃上清液除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。
对照试验采用剪切法、研磨法和组织酶解法，其中，剪切法、研磨法和组织酶解法的具体操作步骤同实施例1。
用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的细胞得率最高为(25.31±1.35)×107/g，活细胞比例最高为92.73±0.35，细胞得率和活细胞比例从高到低变化趋势一致依次为酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差异极显著(p<0.01)；用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的细胞活力最高为92.83±0.45，极显著高于另外三种方法(P<0.01)；用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的坏死和损伤细胞比例最低为7.13±0.35，极显著低于酶解法、研磨法和剪切法(P<0.01)(见表2)。
表2台湾泥鳅肾脏组织单细胞悬液制备效果比较表
n＝3；Means±SD
Figure BDA0001250476680000101
实施例3
瓦氏黄颡鱼肾脏组织单细胞悬液制备法：
1)试剂配制
1.1)PBS试剂配制：0.01mol/L PBS(pH＝7.2)：准确称量8.00gNaCl，0.20gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶解于800ml经高压灭菌的超纯水中，用盐酸调节pH至7.2，灭菌超纯水定容到1000ml，4℃保存备用。
1.2)D-Han氏液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HP04·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g，溶于800m1高压灭菌的双蒸水，调节PH值至7.4，灭菌超纯水定容为1000ml，4℃保存备用；
1.3)IV型胶原酶液配制：准确称量50mgIV型胶原酶(Sigma公司，生产批号：C012900)，室温25℃搅拌溶解于100ml D-Han氏液，4℃过夜，0.22um过滤除菌，配制成0.5g/L IV型胶原酶液。
2)准备瓦氏黄颡鱼的肾脏组织块，放入提前置于冰浴中的平皿中，用PBS冲洗肾脏组织3次以上，将组织表面的血细胞冲洗干净；
3)将肾脏组织块放人冰浴中的平皿里，加入PBS，其中，肾脏组织块与PBS的质量体积比为20g/L，剪切成约为1mm3细小碎块，移液枪小心吸走多余PBS，将组织块放入SCIENTZ50高通量组织研磨器5ml离心管中；
4)在离心管中加入2ml提前在37℃水浴加热的IV型胶原酶，同时加入37℃水浴预热的PBS定容至4ml，放入2颗氧化锆球进行研磨，转速为2000r/min，2min后打开研磨器开关将组织匀浆放入37℃恒温水浴振荡器中酶解消化1.2小时；
5)以300目细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内，1500r/min离心3min，PBS洗3次，每次以800r/min低速离心3min，弃上清液除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。
对照试验采用剪切法、研磨法和组织酶解法，其中，剪切法、研磨法和组织酶解法的具体操作步骤同实施例1。
用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的细胞得率最高为(33.85±0.50)×107/g，活细胞比例最高为90.60±0.50，细胞得率和活细胞比例从高到低变化趋势一致依次为酶解研磨法>研磨法>酶解法>剪切法，且差异极显著(p<0.01)；用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的细胞活力最高为89.47±1.10，极显著高于另外三种方法(P<0.01)；用酶解研磨法制备的鱼类肾脏单细胞悬液的坏死和损伤细胞比例最低为9.23±0.45，极显著低于酶解法、研磨法和剪切法(P<0.01)(见表3)。
表3瓦氏黄颡鱼肾脏组织单细胞悬液制备效果比较表
n＝3；Means±SD
Figure BDA0001250476680000111
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种鱼类单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)PBS试剂、D-Han氏液和IV型胶原酶液的配制；
2)准备试验鱼的肾脏组织块，放入提前置于冰浴中的平皿中，用PBS冲洗肾脏组织3次以上，将组织表面的血细胞冲洗干净；
3)将肾脏组织块放入冰浴中的平皿里，然后加入PBS，将肾脏组织剪切成为1mm3细小碎块，移液枪小心吸走多余PBS，将肾脏组织块放入SCIENTZ 50高通量组织研磨器5ml离心管中；
4)将IV型胶原酶液在水浴中加热，取2ml加热后的IV型胶原酶液加入离心管中，同时加入水浴预热的PBS定容至4ml，放入2颗氧化锆球进行研磨，研磨好后打开研磨器开关将组织匀浆放入恒温水浴振荡器中酶解消化；
5)用细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内进行离心处理，PBS洗3次，每次进行低速离心处理，弃上清液除去细胞碎片，用细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用；
所述步骤3)中的肾脏组织块与PBS的质量体积比为10-20g/L；
所述步骤4)中的水浴温度为37℃，研磨转速为2000r/min-3000r/min，研磨时间为1-3min；酶解消化时间为1小时-1.5小时。
2.根据权利要求1所述的鱼类单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的PBS试剂、D-Han氏液和IV型胶原酶液的配制具体为：
1.1)PBS试剂配制：0.01mol/L PBS，pH＝7.2：准确称量8.00gNaCl，0.20gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶解于800ml经高压灭菌的超纯水中，用盐酸调节pH至7.2，灭菌超纯水定容到1000ml，4℃保存备用；
1.2)D-Han氏液配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HPO4·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，酚红0.02g，溶于800m1高压灭菌的双蒸水，调节pH值至7.2-7.4，灭菌超纯水定容为1000ml，4℃保存备用；
1.3)IV型胶原酶液配制：准确称量50mgIV型胶原酶，室温25℃搅拌溶解于100mlD-Han氏液，4℃过夜，0.22μm过滤除菌，配制成0.5g/L IV 型胶原酶液。
3.根据权利要求1所述的鱼类单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中用细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内进行离心处理，PBS洗3次，每次进行低速离心处理，弃上清液除去细胞碎片，用细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用，具体为：以300目细胞筛过滤到预冷的5ml离心管内，1000/min-1500r/min离心3min-5min，PBS洗3次，每次以500r/min-800r/min低速离心3min-5min，弃上清液除去细胞碎片，以400目细胞筛过滤细胞悬液并用PBS定容为3ml，4℃保存待用。
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