CN116042507A - 冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞悬液制备技术领域。针对现有方法制备的冷水鱼鳃组织的单细胞悬液维持高活性的时间较短的问题，提供冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法及应用。通过冷水鱼心脏灌流PBS的方法，去除鳃组织中多余的红细胞，将鳃组织剪成匀浆状，离心，弃掉上清液，加入胶原酶II溶液，12～18℃连续360°旋转，至组织完全消化解离，用细胞筛过滤，离心，弃掉上清液，制得所述冷水鱼鳃组织单细胞单细胞悬液。本发明所述方法酶解更为充分，实验耗时短，操作步骤简便。所获细胞形态完整，细胞浓度高，细胞活性在90％以上，结团率低于10％。细胞稳定性较好，4℃环境条件下可保存6h左右，能够充分满足各类单细胞测序平台文库构建的需求。

Description

冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法及应用
技术领域
本发明属于细胞悬液制备技术领域，具体涉及冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法及应用。
背景技术
冷水鱼是鱼的一个种类，其对生活环境的水温条件具有严苛的要求，高于20℃则无法正常生长发育，因此称为冷水鱼类。虹鳟是世界范围养殖的重要经济性鱼类，同时也是典型冷水鱼类，具有饲养管理方便、取材容易等优势。虹鳟作为鱼类科学研究的模式物种之一，现已广泛应用于基因组学和遗传学等领域。此外，虹鳟的细胞直径较大，在显微镜下易于观察操作，也是目前单细胞实验使用最为广泛的鱼类之一。鳃是鱼类重要的组织器官，其直接与外界水环境接触，对水中温度、盐度、碱度等环境因子的变化十分敏感，是鱼体进行气体交换、离子转运、氨氮代谢、渗透调控以及激素水平调节的关键组织器官。鳃之所以能实现如此多的功能,与其特化形成的多种细胞类型是密不可分的。研究发现，鱼类鳃中包括多种不同的细胞类型，如：扁平细胞、柱状细胞、神经上皮细胞、祖细胞、中性粒细胞、树突状细胞、粘液细胞，离子细胞和辅佐细胞等。然而，目前的研究大多停留在鳃组织器官水平，其结果主要反映的是鳃组织中细胞数量占优势的群体信息或多种细胞类型信息的总和，忽略了细胞之间的异质性，造成了鳃组织细胞亚群中特异性的关键信息被掩盖甚至遗失。因此，深入探究鱼类鳃组织的生物学功能，需要突破以往的技术瓶颈从单细胞水平对分子特征进行更为精细地研究。
单细胞测序技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观基因组和蛋白组进行高通量测序分析的一项新技术。它既能揭示细胞群体差异和细胞进化关系，也能分析单个细胞的基因结构和基因表达变异情况，反映细胞间的异质性，在肿瘤、免疫、发育、微生物学和神经学等领域均发挥重要作用。单细胞测序技术的关键为高质量的组织细胞悬液。
目前将动物组织处理为单细胞悬液方法主要有机械法(剪切、研磨、吹打，网搓等)，化学试剂处理法(EDTA，EGTA阳离子螯合剂等)，酶解法(胰酶、胶原酶、弹性蛋白酶，透明质酸酶、溶菌酶)，还有酶解研磨法。CN106929468A公开了采用不同处理方法的鱼肾脏组织单细胞悬液制备效果。
鲫鱼肾脏组织单细胞悬液制备效果比较表
目前对鱼类等动物组织的单细胞悬液制备方法大多采用机械研磨-水浴酶解法，但该酶解方法制得的冷水鱼细胞悬液，细胞活性不高，细胞稳定性较差，通常只能在1h内维持较高活性，对实验者的操作技术水平有着较高的要求，不利于后续单细胞实验工作的正常开展，严重制约着细胞异质性的深入研究。
发明内容
针对采用现有单细胞悬液制备方法制备冷水鱼鳃组织时，存在细胞维持高活性的时间较短的上述问题，本发明提供一种冷水鱼鳃组织的单细胞悬液制备方法，所制备的鳃组织单细胞悬液，细胞形态更完整，细胞稳定性得到了显著的提高，细胞浓度更高，活性可达90％以上，稳定性可持续6h，结团率小于10％，细胞悬液产生的的背景信号更低，实验耗时短，成本低，可操作性较高，可充分满足单细胞转录组测序文库的构建，也可用于细胞核提取实验，应用价值较高。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
S1、通过冷水鱼心脏灌流PBS的方法，去除鳃组织中多余的红细胞，待鳃组织呈现淡粉色或白色，使用经高温高压灭菌后的手术剪迅速剥离，PBS溶液和DMEM/F12溶液分别浸泡清洗，使用手术剪将鳃组织剪成匀浆状，收集至无菌离心管；
S2、将步骤S1制得的组织匀浆液离心，弃掉上清液，加入胶原酶II溶液，12～18℃连续360°旋转，光学显微镜下镜检至酶将组织完全消化解离；
S3、将步骤S2制得的单细胞匀浆用细胞筛过滤，并用DMEM/F12清洗掉细胞筛上残留的冷水鱼细胞，得到的滤液用新细胞筛再次过滤，用DMEM/F12清洗细胞筛后，将滤液转移到离心管中；
S4、将步骤S3制得的酶解液离心，弃掉上清液，加入DMEM/F12溶液重悬，混匀细胞沉淀；重复上述离心-重悬操作，制得所述冷水鱼鳃组织单细胞悬液。
优选，步骤S1，利用医用无菌注射器向冷水鱼心脏上方的静脉窦内连续灌流PBS溶液。
优选，步骤S1，所述的DMEM/F12溶液含有质量比为1：1的L-谷氨酰胺和HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。
优选，步骤S1，所述PBS溶液pH为7.2-7.4，0.01M。
优选，步骤S2，向冷水鱼鳃组织匀浆离心后的沉淀中加入胶原酶II溶液，18℃连续360度旋转混匀酶解消化1.5～3h。
优选，步骤S2，所述的离心温度为18℃，转速设置为200-300RCF，离心时间为10s，胶原酶II溶液浓度为2mg/mL，胶原酶II需通过0.22μm的无菌滤膜于酒精灯外焰处过滤除菌。
优选，步骤S3，所述使用的细胞筛直径依次为70μm和40μm。优选每次过筛后清洗细胞筛的次数为两次。
优选，步骤S4，所述的离心温度为4℃，转速为200RCF。
优选，步骤S4，两次离心，第一次离心时间为3min，第二次离心时间为6min。
优选，步骤S1剪取鳃组织100mg进行匀浆，步骤S2胶原酶II的用量为2mL，步骤S3每次清洗细胞筛的DMEM/F12溶液的用量为200μL，步骤S4，每次重悬用的DMEM/F12溶液的量为200μL。
得到的冷水鱼鳃组织单细胞悬液，用AO/PI染液染色后检测细胞的活性、浓度和结团率。
优选地，所述的AO/PI染色液与细胞悬液的混匀比例为1:1，染色时间为30s。
本发明的冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法可应用于构建冷水鱼鳃组织单细胞转录组文库，开可应用于ATAC实验样本细胞核提取。
所述应用包括将制备的冷水鱼鳃组织单细胞悬液置于冰上，于6h内完成建库或者细胞核的提取。
有益效果：
本发明提供的制备方法，通过将冷水鱼的鳃组织进行剪切处理，经过连续旋转消化，双层过滤和单次离心等过程，可快速制备成冷水鱼鳃组织单细胞悬液。本发明所述方法较常用的水浴法，酶解更为充分，效果更好，且实验耗时可缩短至2-3h，相较于水浴酶解法，减少了实验操作流程，不需要水浴锅，成本低，操作步骤简便、实验可实施性高。所获细胞形态较其他方法更为完整，实验过程中产生的细胞碎片较少，细胞浓度可达1600个/μL以上，细胞活性在90％以上，结团率低于10％。细胞稳定性较好，4℃环境条件下可保存6h左右，能够充分满足各类单细胞测序平台文库构建的需求。本发明为挖掘鱼类鳃组织深层次的生物学机制研究提供了新的技术方案，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施1提供的虹鳟鳃组织单细胞悬液质检结果(AO/PI)图；
图2为本发明实施1提供的虹鳟鳃组织单细胞悬液提取的细胞核质检图；
图3为本发明实施1提供的虹鳟鳃组织单细胞悬液的单细胞测序图；
图4为本发明实施1提供的虹鳟鳃组织单细胞悬液的单细胞测序图；
图5为实施例2虹鳟鳃组织单细胞悬液质检结果(AO/PI)图；
图6为对比例1虹鳟鳃组织单细胞悬液质检结果(AO/PI)图；
图7为对比例2虹鳟鳃组织单细胞悬液质检结果(AO/PI)图；
图8为对比例3虹鳟鳃组织单细胞悬液质检结果(AO/PI)图。
具体实施方式
为更加清楚的解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
以下实施例和对比例中，若无特殊说明，DMEM/F12购自VivaCell，中国(货号：C3130-0500)；胶原酶II购自Sigma，美国(货号：1148090；CAS:9001-12-1)；TESCA buffer购自Solarbio，中国(货号：G0150)。
实施例1
一、样品制备
S1、向虹鳟心脏上方用无菌注射器注射10mL pH7.2-7.4 0.01M无菌PBS，心脏灌流1min，洗出大量的鳃组织红细胞，直至鳃组织呈现淡粉色或白色后，用高温高压灭菌后的剪刀和镊子解剖出虹鳟鳃组织，用无菌PBS清洗后，剪取100mg，放入5mL无菌无酶离心管中，并在离心管中加入2mL含L-谷氨酰胺和HEPES的DMEM/F12(1:1)，用剪刀将鳃组织剪至匀浆状。
S2、用5mL无菌枪头将鳃组织匀浆转移至2mL无菌无酶离心管中，18℃温度下转速200-300RCF离心10s，弃掉上清液，在沉淀中加入2mL 2mg/mL胶原酶II溶液，将离心管夹在水平摇床上，18℃酶解，连续旋转消化1.5h，将离心管从混匀仪上取下，上下缓慢颠倒3次，确保管内组织匀浆可以均匀接触酶解混合液。用移液器从离心管中吸取12μL细胞悬液，置于载玻片上，盖上盖玻片后，在光学显微镜下观察细胞解离的状态，如果细胞悬液中仍存有未完全消化成单个细胞的组织块，则延长胶原酶的消化时间，每隔10分钟，吸出12μL在显微镜下观察，直至组织块基本全部消化完全。
所采用的胶原酶II溶液配制方法如下：向50mL pH7.4的TESCA buffer中加入100mg的胶原酶II，震荡混匀，直到胶原酶II完全溶解，用0.22μm的无菌滤膜于酒精灯外焰处过滤，得到浓度为2mg/mL的胶原酶II混合溶液。
S3、将70μm的细胞筛放在50mL的无菌离心管上，用5mL宽口枪头吸取已经充分消化了的细胞悬液，然后用5mL枪头缓慢加入到细胞筛中过滤，加入DMEM/F12溶液清洗细胞筛2次，取出过滤后的细胞悬液，并缓慢加入到40μm的细胞筛中进行再次过滤，并用DMEM/F12溶液作为洗涤液冲洗细胞筛2次，用移液器充分吹吸混匀10次后，取出第二次过滤的细胞悬液，转移到1.5mL离心管。
S4、将步骤S3中制备的细胞悬液放到离心机中，温度设置为4℃，离心转速200RCF，离心3min后，于离心管的底部可观察到白色沉淀，用大枪头吸取位于沉淀上层的上清液，然后加入200μL DMEM/F12溶液，并用大枪头缓慢吹吸沉淀10次，使细胞均匀地悬浮于溶液。
S5、将步骤S4中的细胞悬液于温度4℃，离心转速200RCF，离心6min，再次收集离心管底部的白色沉淀于2ml无菌离心管中，并用200μL DMEM/F12溶液重新悬浮沉淀，将制得的细胞悬液迅速放在冰上，保持细胞悬液的温度为4℃。
S6、反复吹打混匀步骤S5中获得的鳃组织单细胞悬液，吸取10μL步骤S5中获得的鳃组织单细胞悬液，加入10μL的AO/PI染液，1:1比例充分混匀后，吸取20μL混合液加入到Countstar Rigel S3中进行质检，测定细胞活性、细胞结团率和细胞浓度，结果如表1和图1所示。
表1虹鳟鳃组织单细胞悬液制备效果
二、细胞核的提取
将制备的单细胞悬液反复用移液器吹打混匀后，吸取6×104个细胞，提取细胞核的结果如图2所示。
如图2所示，虹鳟鳃组织细胞核呈现圆形或是椭圆形，细胞核间可以较好的分离，细胞核间不相互重叠，细胞核的结果证明了本发明技术方案的完整性和高效性。
三、测序
将获得的虹鳟鳃组织单细胞悬液进行单细胞转录组测序(Single cell RNAsequencing，scRNA-seq)，结果如图3和图4所示。
如图3所示，基于每细胞barcode的全部UMI数量的细胞分群结果图，每个点的横纵坐标由UMAP算法获得，每个点代表一个细胞，每个点的颜色根据UMI数量着色，相同颜色的点聚成一个分群(Cluster)；与UMI数量低的细胞相比，UMI数量高的细胞可能有高的RNA含量。如图4所示，基于每细胞barcode的全部UMI数量的颜色热度的二维UMAP降维聚类图，具有相似基因表达谱的细胞聚成一个分群(Cluster)，每个点代表一个细胞，根据不同的聚类细胞颜色不同。
如图4所示，测序后的细胞数量为6254，每细胞的UMI中位数5015，每细胞的基因中位数1297，每细胞的平均reads数为108221；Beads to cells曲线图的转折点明显，说明测序质量很好，干扰背景较少；Summary为样本检测的各项信息，每细胞的平均表达丰度为9949，检测到的全部的基因数为42491，每细胞中基因表达的活性1753，用于聚类的细胞数量是5634；Sequencing中显示测序的总reads为1,830,571,803，过滤低质量reads和无效barcodes后的用于下游分析的质控后的reads为84.42％；Mapping&Annotation中过滤掉低质量的reads和无效barcodes后用于下游分析的质控后的reads为1,545,341,473，比对到基因组上的reads比例为94.89％，比对到正义链的reads为49.03％，比对到反义链的reads为45.86％，比对到外显子区域的reads为66.9％，比对到内含子区域的reads为3.7％，比对到转录组反义链的reads为8.2％。
实施例2
在实施例1的基础上，改变步骤S2中酶解温度和时间，具体操作为：用5mL无菌枪头将鳃组织匀浆转移至2mL无菌无酶离心管中，18℃温度下转速200-300RCF离心10s，弃掉上清液，在沉淀中加入2mL 2mg/mL胶原酶II溶液，将离心管夹在水平摇床上，12℃酶解，连续旋转消化3h，将离心管从混匀仪上取下，上下缓慢颠倒3次，确保管内组织匀浆可以均匀接触酶解混合液。用移液器从离心管中吸取12μL细胞悬液，置于载玻片上，盖上盖玻片后，在光学显微镜下观察细胞解离的状态，如果细胞悬液中仍存有未完全消化成单个细胞的组织块，则延长胶原酶的消化时间，每隔10分钟，吸出12μL在显微镜下观察，直至组织块基本全部消化完全。其它操作与实施例1相同。
测定的虹鳟鳃组织细胞活性、细胞结团率和细胞浓度，结果如表2和图5所示。
表2虹鳟鳃组织单细胞悬液制备效果
对比例1
在实施例1的基础上，改变步骤S2中酶解温度和时间，具体操作为：用5mL无菌枪头将鳃组织匀浆转移至2mL无菌无酶离心管中，室温转速200-300RCF离心10s，弃掉上清液，在沉淀中加入2mL 2mg/mL胶原酶II溶液，将离心管放在水浴锅中，37℃酶解，消化0.5h，将离心管从水浴锅中取出，上下缓慢颠倒3次，确保管内组织匀浆可以均匀接触酶解混合液。用移液器从离心管中吸取12μL细胞悬液，置于载玻片上，盖上盖玻片后，在光学显微镜下观察细胞解离的状态，如果细胞悬液中仍存有未完全消化成单个细胞的组织块，则延长胶原酶II的消化时间，每隔10分钟，吸出12μL在显微镜下观察，直至组织块基本全部消化完全。其它操作与实施例1相同。
测定所得虹鳟鳃组织细胞活性、细胞结团率和细胞浓度，结果如表3和图6所示。
表3虹鳟鳃组织单细胞悬液制备效果
对比例2
胰蛋白酶购自Solarbio，中国(货号：T1320)。
在实施例1的基础上，改变步骤S2中酶的种类，具体操作为：用5mL无菌枪头将鳃组织匀浆转移至2mL无菌无酶离心管中，18℃温度下转速200-300RCF离心10s，弃掉上清液，在沉淀中加入2mL 0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管夹在水平摇床上，18℃酶解，连续旋转消化1.5h，将离心管从混匀仪上取下，上下缓慢颠倒3次，确保管内组织匀浆可以均匀接触酶解混合液。用移液器从离心管中吸取12μL细胞悬液，置于载玻片上，盖上盖玻片后，在光学显微镜下观察细胞解离的状态，如果细胞悬液中仍存有未完全消化成单个细胞的组织块，则延长胰蛋白酶的消化时间，每隔10分钟，吸出12μL在显微镜下观察，直至组织块基本全部消化完全。其它操作与实施例1相同。
测定所得虹鳟鳃组织细胞活性、细胞结团率和细胞浓度，结果如表4和图7所示。
表4虹鳟鳃组织单细胞悬液制备效果
对比例3
在实施例1的基础上，改变步骤S2中酶的种类和酶解温度，具体操作为：用5mL无菌枪头将鳃组织匀浆转移至2mL无菌无酶离心管中，室温转速200-300RCF离心10s，弃掉上清液，在沉淀中加入2mL 0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管放在水浴锅中，37℃酶解，消化0.5h，将离心管从水浴锅中取出，上下缓慢颠倒3次，确保管内组织匀浆可以均匀接触酶解混合液。用移液器从离心管中吸取12μL细胞悬液，置于载玻片上，盖上盖玻片后，在光学显微镜下观察细胞解离的状态，如果细胞悬液中仍存有未完全消化成单个细胞的组织块，则延长胰蛋白酶的消化时间，每隔10分钟，吸出12μL在显微镜下观察，直至组织块基本全部消化完全。其它操作与实施例1相同。
测定所得虹鳟鳃组织细胞活性、细胞结团率和细胞浓度，结果如表5和图8所示。
表5虹鳟鳃组织单细胞悬液制备效果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、通过冷水鱼心脏灌流PBS的方法，去除鳃组织中多余的红细胞，待鳃组织呈现淡粉色或白色，使用经高温高压灭菌后的手术剪迅速剥离，PBS溶液和DMEM/F12溶液分别浸泡清洗，使用手术剪将鳃组织剪成匀浆状，收集至无菌离心管；
S2、将步骤S1制得的组织匀浆液离心，弃掉上清液，加入胶原酶II溶液，12～18℃连续360°旋转，光学显微镜下镜检至酶将组织完全消化解离；
S3、将步骤S2制得的单细胞匀浆用细胞筛过滤，并用DMEM/F12清洗掉细胞筛上残留的冷水鱼细胞，得到的滤液用新细胞筛再次过滤，用DMEM/F12清洗细胞筛后，将滤液转移到离心管中；
S4、将步骤S3制得的酶解液离心，弃掉上清液，加入DMEM/F12溶液重悬，混匀细胞沉淀；重复上述离心-重悬操作，制得所述冷水鱼鳃组织单细胞单细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的心脏灌流方法为：利用医用无菌注射器向冷水鱼心脏上方的静脉窦内缓慢注入无菌PBS溶液，至鳃组织变为浅白色为止。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述的胶原酶II溶液浓度为2mg/mL，且胶原酶II溶液需通过0.22μm的无菌滤膜过滤除菌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的细胞筛直径依次为70μm和40μm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述的离心温度为4℃，离心转速为200-300RCF，离心时间为3-6min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷水鱼为虹鳟。
7.权利要求1所述的冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法在构建冷水鱼鳃组织单细胞转录组文库中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将利用权利要求1制备的单细胞悬液置于冰上，于6h内完成建库。
9.权利要求1所述的冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法在ATAC实验样本细胞核提取中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将利用权利要求1制备的单细胞悬液置于冰上，于6h内完成细胞核的提取。
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