CN115418342A - 一种鱼组织单细胞悬液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种鱼组织单细胞悬液及其制备方法，所述方法包括：将鱼体的目的组织预处理为组织碎片，并置于装有缓冲液的离心管内；将离心管离心，除去上清液，加入BSA‑DPBS溶液，吹打以重悬组织碎片；除去离心管内上层清液，加入酶解离试剂消化组织碎片；除去离心管内上层清液，加入BSA‑DPBS溶液，吹打以重悬消化后的组织碎片，得到细胞混合物；将细胞混合物通过细胞过滤筛过滤，收集滤液；滤液中加入DNase I，室温孵育；孵育后的混合物离心，除去上清液，重悬于DPBS中，吹打分散细胞，得到目的组织单细胞悬液。通过本发明的制备方法，能够实现快速、高效获得鱼类组织单细胞悬液，并保证解离的细胞活力，单细胞悬液质量满足单细胞测序要求。
Description
技术领域
本公开涉及单细胞悬液技术领域，尤其涉及一种鱼组织单细胞悬液及其制备方法。
背景技术
细胞是生物体基本的结构和功能单位，单细胞水平研究可以反映细胞的异质性，近年来，单细胞测序技术已广泛用于哺乳动物、斑马鱼等模式生物的转录组学、基因组和表观基因组学及多组学方面的研究，并且取得了重大突破，但在经济鱼类上的报道较少。
单细胞测序的细胞悬液要求细胞存活率>80％，浓度不低于700细胞/μL，细胞悬液背景清晰，无大量团块、碎片和杂质。目前已有水产鱼类细胞悬液的制备主要针对组织细胞培养，且多为机械破碎和胰蛋白酶解离，存在解离不够充分、细胞损伤较大、细胞聚团及存活率和浓度无法满足测序要求等问题，这限制了单细胞测序在水产养殖研究中的应用。
发明内容
本公开提供了一种鱼组织单细胞悬液及其制备方法，以至少解决现有技术中细胞悬液存在的解离不够充分、对细胞损伤较大、细胞聚团及存活率和浓度无法满足测序要求技术问题。
根据本公开的第一方面，提供了一种鱼组织单细胞悬液的制备方法，所述方法包括：
将鱼体的目的组织预处理为组织碎片，并置于装有缓冲液的离心管内；
将离心管离心，除去上清液，加入BSA(牛血清白蛋白)-DPBS(Dulbeccophosphate-buffered saline，杜氏磷酸盐缓冲盐)溶液，吹打以重悬组织碎片；
除去离心管内上层清液，加入酶解离试剂消化组织碎片；
除去离心管内上层清液，加入BSA-DPBS溶液，吹打以重悬消化后的组织碎片，得到细胞混合物；
将细胞混合物通过细胞过滤筛过滤，收集滤液；
滤液中加入DNase I(脱氧核糖核酸酶I)，室温孵育；
孵育后的混合物离心，除去上清液，重悬于DPBS中，吹打分散细胞，得到目的组织单细胞悬液。
在一可实施方式中，所述将鱼体的目的组织预处理为组织碎片，包括：
取鱼体新鲜的目的组织去除脂肪和白膜，并将目的组织清洗干净后置于无菌培养皿中剪切，再将组织碎片置于装有缓冲液的离心管内。
在一可实施方式中，所述BSA-DPBS溶液中BSA与DPBS的质量体积比为0.04-0.1g：100mL。
在一可实施方式中，所述BSA-DPBS溶液中BSA与DPBS的质量体积比为0.08g：100mL。
在一可实施方式中，所述酶解离试剂包括体积分数为90-95％胶原酶和分散酶溶液，以及5％-10％的FBS(胎牛血清)。
在一可实施方式中，所述胶原酶的浓度为0.1U/mL，所述分散酶的浓度为0.8U/mL。
在一可实施方式中，所述将细胞混合物通过细胞过滤筛过滤，收集滤液，包括：
用BSA-DPBS溶液润洗细胞过滤筛，并将润洗后的细胞过滤筛置于离心管中；
将细胞混合物倒入细胞过滤筛，并用BSA-DPBS溶液冲洗细胞过滤筛，收集离心管底部滤液。
在一可实施方式中，所述离心条件为4℃，300g离心5min。
在一可实施方式中，所述吹打为使用宽口玻璃管吹打或宽口低吸附枪头吹打。
根据本公开的第二方面，提供了一种鱼组织单细胞悬液，所述单细胞悬液根据上述方法制备得到。
本发明公开一种鱼组织单细胞悬液及其制备方法，通过对鱼的目的组织进行预处理，然后加入BSA-DPBS溶液重悬，再加入酶解离试剂对组织碎片消化，再次重悬，对收集的滤液中的细胞进行孵育，最后对孵育后的混合物离心，除去上清液，重悬于DPBS中，吹打分散细胞，得到目的组织单细胞悬液。本发明通过宽口玻璃吹打的方式使细胞重悬，能够减少吹打过程中对细胞的损伤；进一步使用牛血清白蛋白BSA和DNA酶(DNase I)，减少消化后的细胞聚集；通过本发明的制备方法，能够实现快速、高效获得鱼类组织单细胞悬液，并保证解离的细胞活力，单细胞悬液质量满足单细胞测序要求。
应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：
在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
图1示出了本公开实施例一种鱼组织单细胞悬液的制备方法的流程示意图；
图2示出了本公开实施例罗非鱼肠道组织单细胞悬液台盼蓝染色显微镜检照片(标尺60μm)；
图3示出了本公开实施例罗非鱼肠道组织单细胞悬液台盼蓝染色显微镜检照片(标尺50μm)。
具体实施方式
为使本公开的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而非全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
目前，已有水产鱼类细胞悬液的制备主要针对组织细胞培养，多为机械破碎和胰蛋白酶解离，机械破碎对细胞损伤较大，胰蛋白酶单独使用对很多组织解离不佳，并且它能导致细胞内DNA链断裂和RNA降解，存在解离不够充分、细胞聚团及活率和浓度无法满足测序要求等问题。因此需要确定最适的酶或酶组合、优化具体的组织解离操作以减少细胞聚团和细胞损伤、获得足够多的活细胞至关重要，且有效的组织解离方案获得具有高细胞活率和完整核酸信息的高质量单细胞悬液是单细胞测序成功开展的重要基础。基于此，本发明提出一种鱼组织单细胞悬液的制备方法用于解决现有技术存在的上述技术缺陷。
如图1示出了一种鱼组织单细胞悬液的制备方法的流程示意图，该方法包括如下步骤：
S1、目的组织预处理：将鱼体的目的组织预处理为组织碎片，并置于装有缓冲液的离心管内。
其中目的组织可以是鱼体上的各种器官组织，鳃和脾脏组织等，本实施例中目的组织以鱼肠道组织为例。
在一个示例中，将鱼体的目的组织预处理为组织碎片，包括：
取鱼体新鲜的目的组织去除脂肪和白膜，并将目的组织清洗干净后置于无菌培养皿中剪切，再将组织碎片置于装有缓冲液的离心管内，缓冲液为1xPBS。
S2、重悬组织碎片：将离心管离心，除去上清液，加入BSA-DPBS溶液，吹打以重悬组织碎片；
将离心管置于低温离心机内，于4℃，300g离心5min；除去离心管内上层清液，并加入冰冷的BSA-DPBS溶液，BSA-DPBS溶液中，BSA与DPBS的质量体积比为0.04-0.1g：100mL，即将0.04-0.1g的BSA溶解在100mLDPBS中，BSA的质量浓度为0.04-0.1％，BSA的质量浓度优选0.08％；用宽口玻璃管轻轻吹打，重悬组织碎片，此步骤可重复2次或多次。
S3、消化组织碎片：除去离心管内上层清液，加入酶解离试剂消化组织碎片；
将离心管置于低温离心机内，于4℃，300g离心5min；除去离心管内上层清液，加入酶解离试剂，其中酶解离试剂包括体积分数为90-95％胶原酶和分散酶溶液，以及5％-10％的FBS，优选95％胶原酶和分散酶溶液，以及5％的FBS，胶原酶的浓度为0.1U/mL，分散酶的浓度为0.8U/mL。消化在37℃水浴中进行，消化时间根据组织碎片的大小、组织碎片的量以及具体组织部位调整，消化过程，间隔几分钟上下颠倒离心管，以使离心管内组织碎片能够充分消化。
需要说明的是，若该单细胞悬液用于单细胞RNA-seq(转录组测序)，还需添加RNase抑制剂。
S4、重悬消化后的组织碎片：除去离心管内上层清液，加入BSA-DPBS溶液，吹打以重悬消化后的组织碎片，得到细胞混合物；
将离心管置于低温离心机内，于4℃，300g离心5min，除去离心管内上层清液，加入预冷的BSA-DPBS溶液，用宽口玻璃管轻轻吹打细胞1min；离心后加入预冷的0.08％ BSA-DPBS再重悬。
S5、过滤：将细胞混合物通过细胞过滤筛过滤，收集滤液；
在一个示例中，将细胞混合物通过细胞过滤筛过滤，收集滤液，包括：
用BSA-DPBS溶液润洗细胞过滤筛，并将润洗后的细胞过滤筛置于离心管中；
将细胞混合物倒入细胞过滤筛，并用BSA-DPBS溶液冲洗细胞过滤筛，收集离心管底部滤液。
S6、孵育：滤液中加入DNase I，室温孵育；
S7、目的组织单细胞悬液：孵育后的混合物离心，除去上清液，重悬于DPBS中，吹打分散细胞，得到目的组织单细胞悬液。
将离心管置于低温离心机内，于4℃，300g离心5min，除去离心管内上层清液，将细胞重悬于400μL预冷的DPBS中，用宽口低吸附枪头轻轻吹打细胞使其分散，重复此步骤2次或多次，得到目的组织单细胞悬液。
本发明公开一种鱼组织单细胞悬液及其制备方法，通过对鱼的目的组织进行预处理，然后加入BSA-DPBS溶液重悬，再加入酶解离试剂对组织碎片消化，再次重悬，对收集的滤液中的细胞进行孵育，最后对孵育后的混合物离心，除去上清液，重悬于DPBS中，吹打分散细胞，得到目的组织单细胞悬液。本发明通过宽口玻璃吹打的方式使细胞重悬，能够减少吹打过程中对细胞的损伤；进一步使用牛血清白蛋白BSA和DNA酶(DNase I)，减少消化后的细胞聚集；通过本发明的制备方法，能够实现快速、高效获得鱼类组织单细胞悬液，并保证解离的细胞活力，单细胞悬液质量满足单细胞测序要求。
实施例1
本实施例以罗非鱼为例，目的组织以罗非鱼的肠道为例，因为鱼的肠道不仅是鱼体消化和吸收营养物质的器官，还是微生物种群的栖息地和重要的免疫组织，是黏膜免疫系统的重要组成部分，在鱼体的代谢、营养、肠道菌群和免疫等方面具有重要的研究意义。
一种鱼肠道单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
1、取3-5cm罗非鱼新鲜的肠道组织，去除肠道表面的脂肪和肠系膜，并用注射器吸取预冷的1xPBS冲洗肠道内容物，避免用力刮擦；
2、将清洗后的肠道组织置于干净无菌培养皿中，将组织剪切成1-2mm3的组织碎块，并转移到装有1mL预冷1xPBS的1.5mL离心管中；
3、将离心管置于低温离心机中，在4℃，离心(300g)5分钟，轻轻除去上清液并加入1mL冰冷的0.08％ BSA-DPBS，用宽口玻璃管轻轻吹打，重悬组织碎片，重复该步骤2次；
4、将离心管置于低温离心机中，在4℃，离心(300g)5分钟，轻轻除去上清液，加入1mL酶解离试剂，在37℃水浴消化组织片段；其中酶解离试剂由体积分数95％的胶原酶和分散酶(胶原酶：0.1U/mL，分散酶：0.8U/mL)溶液以及体积分数5％的FBS组成；水浴解离30min-1h，期间每5min上下颠倒两次离心管(孵育时间因组织、量和组织剪切大小而异，显微镜下观察游离细胞数量和肉眼观察组织块消化情况以确定解离效果)。
5、消化结束后，将离心管置于低温离心机中，在4℃，离心(300g)5分钟，轻轻除去上清液；
6、加入1mL预冷的0.08％ BSA-DPBS，用宽口玻璃管轻轻吹打细胞1min，离心后再次加入预冷的0.08％ BSA-DPBS再重悬；
7、用0.08％ BSA-DPBS润洗40μm细胞过滤筛，并将细胞过滤筛放入50mL离心管中，将细胞混合物(步骤6得到的产物)通过细胞过滤筛并额外用0.08％ BSA-DPBS冲洗过滤筛，收集离心管底部滤液；
8、收集的滤液中加入5μL DNase I，室温孵育15min；
9、将孵育完的混合物转移到1.5mL离心管中，将离心管置于低温离心机中，在4℃，离心(300g)5分钟，轻轻除去上清液；
10、将细胞重悬于400μL预冷的DPBS中，用宽口低吸附枪头轻轻吹打细胞使其分散，重复此步骤2次，得到肠道组织单细胞悬液。
镜检活细胞得率：吸取单细胞悬液稀释到合适浓度，加入台盼蓝染液与等体积的肠道组织单细胞悬液充分混匀后加入血细胞计数板中，显微镜下计数，测得活细胞比率。以该方法进行罗非鱼肠道解离，肠道组织约4cm，解离获得具有高达90％细胞活力的单细胞悬液、细胞浓度约为1.4×107/mL，细胞悬液背景应干净，无大量团块、碎片和杂质。
如图2-3所示为罗非鱼肠道组织单细胞悬液台盼蓝染色显微镜检照片(图片做了灰度处理)，其中白色亮的表示活细胞，深灰色的表示死细胞。
应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本公开公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种鱼组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将鱼体的目的组织预处理为组织碎片，并置于装有缓冲液的离心管内；
将离心管离心，除去上清液，加入BSA-DPBS溶液，吹打以重悬组织碎片；
除去离心管内上层清液，加入酶解离试剂消化组织碎片；
除去离心管内上层清液，加入BSA-DPBS溶液，吹打以重悬消化后的组织碎片，得到细胞混合物；
将细胞混合物通过细胞过滤筛过滤，收集滤液；
滤液中加入DNase I，室温孵育；
孵育后的混合物离心，除去上清液，重悬于DPBS中，吹打分散细胞，得到目的组织单细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将鱼体的目的组织预处理为组织碎片，包括：
取鱼体新鲜的目的组织去除脂肪和白膜，并将目的组织清洗干净后置于无菌培养皿中剪切，再将组织碎片置于装有缓冲液的离心管内。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BSA-DPBS溶液中BSA与DPBS的的质量体积比为0.04-0.1g:100mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述BSA-DPBS溶液中BSA与DPBS的质量体积比为0.08g：100mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解离试剂包括体积分数为90-95％胶原酶和分散酶溶液，以及5％-10％的FBS。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胶原酶的浓度为0.1U/mL，所述分散酶的浓度为0.8U/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将细胞混合物通过细胞过滤筛过滤，收集滤液，包括：
用BSA-DPBS溶液润洗细胞过滤筛，并将润洗后的细胞过滤筛置于离心管中；
将细胞混合物倒入细胞过滤筛，并用BSA-DPBS溶液冲洗细胞过滤筛，收集离心管底部滤液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心条件为4℃，300g离心5min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吹打为使用宽口玻璃管吹打或宽口低吸附枪头吹打。
10.一种鱼组织单细胞悬液，其特征在于，所述单细胞悬液根据权利要求1-9任一项所述的方法制备得到。
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| CN115418342A true CN115418342A (zh) | 2022-12-02 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116042507A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-05-02 | 中国海洋大学 | 冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法及应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN112662614A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-04-16 | 四川大学华西医院 | 一种制备胰腺炎组织单细胞悬液的试剂盒和方法 |
| CN113403255A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-17 | 上海派森诺生物科技有限公司 | 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法 |
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2022
- 2022-10-10 CN CN202211236230.9A patent/CN115418342A/zh active Pending
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