CN114621913A - 一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，属于鱼类细胞培养技术领域。本发明通过组织块培养法、酶消化法、肝细胞原代培养基的优化、台盼蓝染色、CCK‑8法、糖原染色、透射电镜鉴定、虹鳟肝细胞支原体检测这八个步骤予以实现。本发明组织块分离法并不适用于虹鳟鱼肝细胞分离，在培养过程中未见细胞从组织块中迁出，而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的分离效果，经0.25％胰蛋白酶消化25min，每克肝重可收集细胞数量达到1.8×108个，平均细胞存活率达到95％；不同培养基和不同血清浓度均会影响细胞贴壁以及生长，含15％FBS DMEM培养基生长效果明显优于MEM、M199以及L15培养基。

Description

一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法
技术领域
本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法。
背景技术
鱼类细胞系的建立主要应用于鱼类病毒学、环境毒理学、免疫调节、基因筛选以及功能分析等方面。Qin等建立了斜带石斑鱼脾脏细胞系，并用细胞系去感染虹彩病毒，结果显示，感染后的细胞系表现出明显的病理学效应；Qin等以牙鲆体外培养的鳃细胞系为模型，探讨了壬基酚对牙鲆鳃细胞的毒性影响，发现此类环境激素可以降低鳃细胞抗氧化酶活性；2003年Meng等利用体外培养的草鱼头肾巨噬细胞探讨多种人工合成的寡核苷酸序列和两种不同细菌的基因组DNA对巨噬细胞活化的作用。
肝脏作为鱼体重要的免疫器官，在肝脏细胞系的研究方面，已相继建立了斜带石斑鱼、斑石鲷、半滑舌鳎、剑尾鱼等肝脏细胞系的建立。
当前，在培养过程中细胞从组织块中迁出，没有稳定地分离效果，存活率较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养过程中细胞未从组织块中迁出，有稳定地分离效果，存活率高的虹鳟鱼肝细胞系的建立方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，包括如下步骤：
1)组织块培养法：取暂养1d后的试验鱼，用酒精擦拭鱼体进行消毒，随后用高温灭菌后的手术剪从虹鳟鱼的泄殖孔将其腹腔剪开，小心取出肝脏组织，用不含GA2+、MG2+的Hanks液清洗3～4次，洗掉肝脏表面的血污；
2)酶消化法：取材方法同步骤1)，紧接着将组织块剪至1mm3大小组织块后，利用0.1％胶原酶Ⅱ与0.25％胰蛋白酶按体积比1:1混合后进行消化，将消化时间分别设置为5min、10min、15min、20min和40min，消化期间不断摇动组织块，待消化完成时加入等体积的培养液终止消化；
3)肝细胞原代培养基的优化：检测4种不同培养基下细胞的生长能力：DMEM、M199、L15和MEM培养基，设置4个血清浓度梯度5％、10％、15％和20％，每种培养基中加入200IU/mL青霉素、200μg/mL链霉素，分别将大约1.8×105个细胞接种到4种培养基中，于20℃，5％CO2培养箱中分别培养12、24、36和48h；培养12、24、36及48h后用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞在不同培养基条件下的生长曲线；
4)台盼蓝染色：将细胞悬液与0.4％台盼蓝按体积比9:1比例混合，1min后滴于血球计数板上计数，在显微镜下观察，活细胞呈圆形且透明，死细胞被染成蓝色，用活细胞占计数所有细胞百分比表示细胞存活率；
5)CCK-8法：在96孔板肝细胞培养板中，向每孔加入10uL CCK-8溶液，将培养板置于18℃，5％CO2培养箱中孵育4h,然后用酶标仪检测在450nm处的吸光度值；
6)糖原染色：肝细胞爬片用PAS固定液固定15min，用PBS清洗3次、晾干，加入5g/L的过碘酸氧化剂，室温避光氧化20min，氧化后用自来水冲洗2次，蒸馏水浸洗2次，然后加入Schiff Reagent，置于室温避光处浸染20min，加入亚硫酸钠溶液滴洗2次，每次2min，接着用流水冲洗2min，加入Mayer苏木素染色液，复染2min；
7)透射电镜鉴定：细胞贴壁后，用0.25％胰酶消化细胞，含15％FBS的DMEM培养基终止消化，1000r/min，离心5min，弃上清，加0.5mL 5％戊二醛固定；制备为电镜细胞标本，于透射电镜下观察肝细胞胞质内的特征性细胞器；
8)虹鳟肝细胞支原体检测：通过Hoechst染色方法来检测支原体。
根据以上特征，所述步骤1)中的将肝脏洗干净后用无菌的眼科剪剪成1mm3的小块，接种于6cm培养皿中，置于18℃，5％CO2培养箱中培养2h，待组织小块贴附后加入3mlDMEM培养液继续培养，每2d换液一次。
根据以上特征，所述步骤2)中处理的细胞用100目筛网过滤，以1000r/min离心5min，弃掉上清液，加入含15％FBS的DMEM培养液重悬沉淀，制备单细胞悬液，然后转至25mL细胞瓶放入18℃，5％CO2培养箱进行培养，每2d换液一次。
根据以上特征，所述步骤6)中复染后进行水洗、晾干、镜检。根据以上特征，所述多变化互感器与CT状态模拟模块相连接。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明通过不同的分离方法和培养条件探索虹鳟鱼肝细胞的原代培养，以建立稳定的虹鳟鱼肝细胞原代培养模型。
2)本发明细胞分离后用0.4％台盼蓝染色检测细胞存活力，并通过CCK-8检测细胞活力；同时在倒置显微镜下观察长期培养过程中肝细胞的形态变化。
3)本发明组织块分离法并不适用于虹鳟鱼肝细胞分离，在培养过程中未见细胞从组织块中迁出，而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的分离效果，经0.25％胰蛋白酶消化25min，每克肝重可收集细胞数量达到1.8×108个，平均细胞存活率达到95％；不同培养基和不同血清浓度均会影响细胞贴壁以及生长，含15％FBS DMEM培养基生长效果明显优于MEM、M199以及L15培养基。
附图说明
图1为本发明不同胰蛋白酶消化对肝细胞活力的影响示意图。
图2为本发明培养基对细胞活力的影响示意图。
图3为本发明血清浓度对细胞活力的影响示意图。
图4为本发明倒置荧光显微镜下观察的虹鳟肝细胞形态示意图。
图5为本发明虹鳟肝细胞糖原染色示意图。
图6为本发明透射电镜观察示意图。
图7为本发明荧光显微镜下虹鳟原代肝细胞支原体检测结果示意图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的实施例。虽然附图中显示了本发明的实施例，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。本领域的技术人员可以在不偏离本发明精神和保护范围的基础上从下述描述得到替代技术方案。
一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，包括如下步骤：
1)组织块培养法：取暂养1d后的试验鱼，用酒精擦拭鱼体进行消毒，随后用高温灭菌后的手术剪从虹鳟鱼的泄殖孔将其腹腔剪开，小心取出肝脏组织，用不含GA2+、MG2+的Hanks液清洗3～4次，洗掉肝脏表面的血污；将肝脏洗干净后用无菌的眼科剪剪成1mm3的小块，接种于6cm培养皿中，置于18℃，5％CO2培养箱中培养2h，待组织小块贴附后加入3mlDMEM培养液继续培养，每2d换液一次。
2)酶消化法：取材方法同步骤1)，紧接着将组织块剪至1mm3大小组织块后，利用0.1％胶原酶Ⅱ与0.25％胰蛋白酶按体积比1:1混合后进行消化，将消化时间分别设置为5min、10min、15min、20min和40min，消化期间不断摇动组织块，待消化完成时加入等体积的培养液终止消化；处理的细胞用100目筛网过滤，以1000r/min离心5min，弃掉上清液，加入含15％FBS的DMEM培养液重悬沉淀，制备单细胞悬液，然后转至25mL细胞瓶放入18℃，5％CO2培养箱进行培养，每2d换液一次。
3)肝细胞原代培养基的优化：检测4种不同培养基下细胞的生长能力：DMEM、M199、L15和MEM培养基，设置4个血清浓度梯度5％、10％、15％和20％，每种培养基中加入200IU/mL青霉素、200μg/mL链霉素，分别将大约1.8×105个细胞接种到4种培养基中，于20℃，5％CO2培养箱中分别培养12、24、36和48h；培养12、24、36及48h后用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞在不同培养基条件下的生长曲线；
4)台盼蓝染色：将细胞悬液与0.4％台盼蓝按体积比9:1比例混合，1min后滴于血球计数板上计数，在显微镜下观察，活细胞呈圆形且透明，死细胞被染成蓝色，用活细胞占计数所有细胞百分比表示细胞存活率；
5)CCK-8法：在96孔板肝细胞培养板中，向每孔加入10uL CCK-8溶液，将培养板置于18℃，5％CO2培养箱中孵育4h,然后用酶标仪检测在450nm处的吸光度值；
6)糖原染色：肝细胞爬片用PAS固定液固定15min，用PBS清洗3次、晾干，加入5g/L的过碘酸氧化剂，室温避光氧化20min，氧化后用自来水冲洗2次，蒸馏水浸洗2次，然后加入Schiff Reagent，置于室温避光处浸染20min，加入亚硫酸钠溶液滴洗2次，每次2min，接着用流水冲洗2min，加入Mayer苏木素染色液，复染2min；复染后进行水洗、晾干、镜检。
7)透射电镜鉴定：细胞贴壁后，用0.25％胰酶消化细胞，含15％FBS的DMEM培养基终止消化，1000r/min，离心5min，弃上清，加0.5mL 5％戊二醛固定；制备为电镜细胞标本，于透射电镜下观察肝细胞胞质内的特征性细胞器；
8)虹鳟肝细胞支原体检测：通过Hoechst染色方法来检测支原体。
试验用鱼为4-5月龄的虹鳟鱼，100-120g，均来自于刘家峡虹鳟鱼养殖基地。
试验试剂：DMEM高糖培养基、MEM培养基、M199培养基、L15培养基、0.25％胰蛋白酶，0.1％胶原酶Ⅱ；新生胎牛血清FBS购自于GIBCO公司(USA)；CCK-8试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司。
胰蛋白酶消化法对肝细胞数量以及细胞存活率的影响如表1所示：
Figure BDA0003562099470000071
由表1可知，胰蛋白酶消化时间对细胞数量影响显著，0.25％胰酶在25min消化效果最好，细胞数量达到1.8×108，消化40min后细胞数量反而减少。胰酶消化效果明显优于0.1％胶原酶Ⅱ，消化25min为0.1％胶原酶Ⅱ最佳消化时间，细胞数量达到4.2×107，细胞数量少于0.25％胰酶在25min时消化的细胞数量。台盼蓝染色后观察细胞的存活率发现(图1):用0.25％胰蛋白酶和0.1％胶原酶Ⅱ1:1混匀消化收集的肝细胞存活率高于两种单独的方法法收集的细胞，在5～25min，细胞活力均大于90％，而用0.25％胰蛋白酶消化收集的肝细胞存活率小于90％；在25min时，细胞存活率为86％，用0.1％胶原酶Ⅱ消化收集的肝细胞存活率更低，在25min存活率最高，仅达到80％。综合以上分析，用0.25％胰蛋白酶和0.1％胶原酶Ⅱ混匀消化25min细胞数量达到最大且细胞存活率最高。
为确定虹鳟鱼肝细胞体外培养的最适条件，比较分析了DMEM、M199、L15和MEM四种培养基在20℃培养条件下对肝细胞贴壁以及长期生长的影响。结果显示，肝细胞在DMEM培养基的整个过程中细胞活力明显高于同时期的其它三种培养基(图3)，说明DMEM培养基更利于虹鳟肝细胞的贴壁和生长。同时，虹鳟肝细胞在含不同浓度血清的DMEM培养基中，细胞的贴壁和生长也受到不同程度的影响。第12h的OD值可表示细胞的贴壁程度，结果显示，含15％和20％FBS的培养基中细胞贴壁数量最多。第24～36h细胞处于增殖期，15％FBS培养基中细胞增殖最快，但第36h后细胞数量开始减少，，可能是由于培养基中血清含量减少，营养成分不足。因此长期培养虹鳟肝细胞需每2d更换新鲜的培养基。
经用0.25％胰蛋白酶与0.1％胶原酶Ⅱ1:1混合消化分离的新鲜肝细胞呈圆形透明，(图4-A，B)。培养12h后细胞开始贴壁，细胞体积还是较小(图4-C)，在24h后观察到大部分细胞贴壁，细胞呈扁平状铺开，体积明显增大(图4-D)，48h后，随着细胞的生长，细胞贴壁数量明显增加，细胞之间开始连接在一起(图4-E)，培养72h后，贴壁的细胞大面积连接成片(图4-F)，细胞形态呈纤维细胞状，培养96h后细胞已基本铺满细胞瓶(图4-G),120h后细胞生长处于停滞期，细胞开始出现衰老和坏死的情况(图4-H)。
肝细胞培养3d后可进行糖原染色，由图5可见，肝细胞胞质内含有丰富的糖原，糖原被染成紫红色，呈均质或颗粒状分布。
虹鳟肝细胞呈卵圆形，双层核膜清晰，可见核孔；核仁(nucleolus)位于核中央，清晰可见，核仁与核内异染色质(heterochromatin)密切相关。虹鳟肝细胞胞质内含丰富的细胞器及内含物。线粒体(mitochondrium)呈长椭圆形杆状规则排列且数量众多(图2-5-A)，其主要分布于血窦及胆小管周围。高尔基复合体(golgi complex)由数个扁平囊构成。细胞质内还含有大量的糖原颗粒(glycogen)，主要以α形式分散或聚集在细胞质中(图6-A)。粗面内质网(rough endoplasmic reticulum)呈片状排列，大量核糖核蛋白体颗粒(ribosome)附着在膜上(图6-B)。然而滑面内质网(smooth endoplasmic reticulum)表面无核糖体附着，一般呈分枝的小管(图6-C)。除以上各种细胞器外，细胞质中还含有许多大小不同的脂滴(lipid droplet)，一些肝细胞中数量多达数十个，并伴有囊泡化现象(图6-A)。
支原体是一种大小约0.2-0.3μm，无细胞壁的原核生物。在细胞培养过程中支原体污染较常见，支原体污染发生率可达30％-60％，因此在细胞培养过程中避免支原体污染非常重要。为了确保后续试验无其它外界因素干扰，对细胞进行支原体检测也显得至关重要。细胞被支原体感染后，短期内细胞培养液并不变浑浊，但是在显微镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡，并且细胞生长速度减慢，严重污染时细胞生长终止，最终细胞发生病变，本发明进行了支原体检测，在光学显微镜下也未观察到细胞核及胞浆的变化，细胞生长速度较好，细胞形态也未发生变化，因此本试验细胞培养过程中未发现支原体污染，这也为后续试验提供了较好的样本。
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开实施例的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开实施例揭露的技术范围内或者在本公开实施例揭露的思想下，可轻易想到变化、替换或组合，都应涵盖在本公开实施例的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：
1)组织块培养法：取暂养1d后的试验鱼，用酒精擦拭鱼体进行消毒，随后用高温灭菌后的手术剪从虹鳟鱼的泄殖孔将其腹腔剪开，小心取出肝脏组织，用不含GA2+、MG2+的Hanks液清洗3～4次，洗掉肝脏表面的血污；
2)酶消化法：取材方法同步骤1)，紧接着将组织块剪至1mm3大小组织块后，利用0.1％胶原酶Ⅱ与0.25％胰蛋白酶按体积比1:1混合后进行消化，将消化时间分别设置为5min、10min、15min、20min和40min，消化期间不断摇动组织块，待消化完成时加入等体积的培养液终止消化；
3)肝细胞原代培养基的优化：检测4种不同培养基下细胞的生长能力：DMEM、M199、L15和MEM培养基，设置4个血清浓度梯度5％、10％、15％和20％，每种培养基中加入200IU/mL青霉素、200μg/mL链霉素，分别将大约1.8×105个细胞接种到4种培养基中，于20℃，5％CO2培养箱中分别培养12、24、36和48h；培养12、24、36及48h后用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞在不同培养基条件下的生长曲线；
4)台盼蓝染色：将细胞悬液与0.4％台盼蓝按体积比9:1比例混合，1min后滴于血球计数板上计数，在显微镜下观察，活细胞呈圆形且透明，死细胞被染成蓝色，用活细胞占计数所有细胞百分比表示细胞存活率；
5)CCK-8法：在96孔板肝细胞培养板中，向每孔加入10uL CCK-8溶液，将培养板置于18℃，5％CO2培养箱中孵育4h,然后用酶标仪检测在450nm处的吸光度值；
6)糖原染色：肝细胞爬片用PAS固定液固定15min，用PBS清洗3次、晾干，加入5g/L的过碘酸氧化剂，室温避光氧化20min，氧化后用自来水冲洗2次，蒸馏水浸洗2次，然后加入Schiff Reagent，置于室温避光处浸染20min，加入亚硫酸钠溶液滴洗2次，每次2min，接着用流水冲洗2min，加入Mayer苏木素染色液，复染2min；
7)透射电镜鉴定：细胞贴壁后，用0.25％胰酶消化细胞，含15％FBS的DMEM培养基终止消化，1000r/min，离心5min，弃上清，加0.5mL 5％戊二醛固定；制备为电镜细胞标本，于透射电镜下观察肝细胞胞质内的特征性细胞器；
8)虹鳟肝细胞支原体检测：通过Hoechst染色方法来检测支原体。
2.根据权利要求1所述的一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，其特征在于所述步骤1)中的将肝脏洗干净后用无菌的眼科剪剪成1mm3的小块，接种于6cm培养皿中，置于18℃，5％CO2培养箱中培养2h，待组织小块贴附后加入3ml DMEM培养液继续培养，每2d换液一次。
3.根据权利要求1所述的一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，其特征在于所述步骤2)中处理的细胞用100目筛网过滤，以1000r/min离心5min，弃掉上清液，加入含15％FBS的DMEM培养液重悬沉淀，制备单细胞悬液，然后转至25mL细胞瓶放入18℃，5％CO2培养箱进行培养，每2d换液一次。
4.根据权利要求1所述的一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，其特征在于所述步骤6)中复染后进行水洗、晾干、镜检。
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