CN105754932A - 鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法 - Google Patents

鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105754932A
CN105754932A CN201610234530.1A CN201610234530A CN105754932A CN 105754932 A CN105754932 A CN 105754932A CN 201610234530 A CN201610234530 A CN 201610234530A CN 105754932 A CN105754932 A CN 105754932A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liver
cell
hepatocytes
carp
cyprinidae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610234530.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105754932B (zh
Inventor
杨明
李意捷
雷鹏辉
蒋丽辉
吴明红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Shanghai for Science and Technology
Original Assignee
University of Shanghai for Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Shanghai for Science and Technology filed Critical University of Shanghai for Science and Technology
Priority to CN201610234530.1A priority Critical patent/CN105754932B/zh
Publication of CN105754932A publication Critical patent/CN105754932A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105754932B publication Critical patent/CN105754932B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，适用于生物工程技术领域，选鲤鱼进行解剖，无菌取肝脏并剪碎，用胰蛋白酶消化后经细胞筛过滤得细胞悬液，后经Percolll纯化，加入含有鲤鱼血清的培养液得到新的细胞悬液；用血小球计数板进行计数，再以最适培养条件铺板法培养增殖，最后对得到的原代肝细胞多种方法镜检鉴定。本发明鲤鱼原代肝细胞的纯化和培养方法直接无菌取鲤鱼肝脏，经Percolll纯化肝细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代肝细胞，并用鲤鱼血清代替传统培养基中的配牛血清，提高了所提取离体细胞的活力，为进一步开展鲤鱼原代肝细胞毒理试验及其他实验打下基础。

Description

鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法
技术领域
本发明涉及一种生物材料提取和培养方法，特别是涉及一种鱼类局部组织细胞的提取和培养方法，应用于生物工程技术领域。
背景技术
肝脏作为鱼体最大的解毒和代谢器官，在营养物质的消化吸收和保障鱼体健康方面起着重要作用。由于其复杂性与重要性，对鱼类肝脏的研究历来是鱼类生物学的重点内容，成果涉及鱼类解剖学、组织学、免疫学、生理学、病理学、毒理学、营养学等许多领域。由于体内肝脏毒性实验需要的动物样本量大、花费高昂，且实验结果的敏感性和重复性较差，开展体外细胞实验是解决这问题的方向。细胞培养最大的优势就是由于摆脱了实验动物整体存在时的局限性，通过建立细胞培养模型，可以提高实验的可操作性、重复性和结果的准确性。与传代肝细胞株相比，原代肝细胞能较好地保留和维持活体肝细胞的完整形态和代谢活性，突变和变异性小，可真实反应体内代谢情况。所以，原代肝细胞的培养为深入研究鱼类肝脏提供了一个有用的平台。
鲤鱼属鲤科，Cyprinidae，是一种原产亚洲的淡水鱼，在全国各地均有分布，是我国主要的养殖鱼种之一。鲤鱼具有很大的食用和观赏价值，深受我国广大消费者喜爱。所以作为我国水环境中典型鱼种之一，鲤鱼和人类联系紧密，可以通过探索鲤鱼自身受环境影响程度进而来评估环境对人类的影响。鉴于鱼类肝脏在机体中的重要性，通过在体外模拟肝细胞的生长环境，研究有毒物质对其代谢功能的影响，能更直观的体现出该有毒物质的代谢毒性，从而评价环境对鱼体的影响。所以提取鲤鱼原代肝细胞对进行环境毒理实验具有十分重要的意义，但通过目前的方法提取的鲤鱼原代肝细胞的纯度和活性不够理想。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，采用无菌剪取鲤鱼肝脏，胰蛋白酶消化后经筛网过滤，经密度梯度离心后加入特定培养基中，得到鲤鱼原代肝细胞。本发明鲤鱼原代肝细胞的纯化和培养方法，能实现利用多种方法经行镜检鉴定，能够很好的保证离体肝细胞的纯度和活力，从而能够保证满足以鲤鱼肝细胞为实验对象的环境激素毒理实验及其他实验的需要，并为进一步开展更深层次的鲤鱼肝细胞毒理实验打下基础。
为达到上述发明创造目的，采用下述技术方案：
一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，然后，在无菌条件下进行如下过程：
a．无菌取鲤鱼肝脏和鲤鱼肝脏预处理：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，打开左侧体壁肌肉，找到鲤鱼肝脏所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取肝脏，并将之置于D-Hank’s平衡盐工作液中，用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织2-3次至肝脏发白，以洗去肝脏组织中残留的血液，完成鲤鱼肝脏预处理过程；
b．机械破碎鲤鱼肝脏和对鲤鱼肝脏和消化处理：将在所述步骤a中选取和经过预处理的鲤鱼肝脏剪碎成约1mm×1mm块状，再用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织块至少1次，然后加入块状鲤鱼肝脏的10倍体积的0.25%胰酶，在在25℃条件下进行40min消化处理，在消化期间不断转动肝脏组织，消化处理后吸出大块肝脏组织，用移液枪温和吹打用机械切割力帮助肝脏组织消化，当向加入与胰酶同体积的培养基时停止消化过程，得到肝脏组织消化液；
c．细胞悬液的制备：将在所述步骤b中制备的肝脏组织消化液经孔径为100μm细胞筛网过滤，得到细胞悬液，然后以1000rpm离心5min后，再移去上清，接着加入培养液轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，然后用移液枪将细胞悬液缓慢温和地加到Percoll分离液上方，使Percoll分离液和细胞悬液的体积比为7:3，采用Percoll分离液的浓度为70wt%，然后在4℃条件下，以1000rpm再次离心10min，再取底层的肝脏细胞沉淀，然后将分离出来肝脏细胞中加入细胞培养液，并轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，再次得到细胞悬液；当再次离心细胞悬液后，细胞悬液优选形成四层，在上而下分别为培养基层、死细胞、碎片和杂细胞混合层、分离液层和肝实质层，细胞沉淀取自肝实质层；
d．鲤鱼肝脏细胞培养：用细胞培养基液稀释在所述步骤c中最后制备的细胞悬液，使细胞悬液稀释到1×106cells/ml的浓度水平，然后采用铺板法培养鲤鱼肝细胞，采用具有96孔板且每孔为200μl板进行铺板，使鲤鱼肝细胞在26℃条件下进行培养增殖，最终得到离体鲤鱼原代肝细胞；
在所述步骤a和b中，D-Hank’s平衡盐工作液组成为：由99ml的无Ca2+Mg2+的HBSS和1ml的浓度为1wt%双抗储液混合制备而成；
在所述步骤c中，Percoll分离液的配制：采用Percoll原液90mL与无Ca2+Mg2+HBSS的10mL进行混合，制成渗透压为335mOsm的Percoll工作液，然后取35mL的Percoll工作液与15mL无Ca2+Mg2+HBSS进行混合，并在1000rpm条件下离心3min，即获得浓度为70wt%的Percoll梯度分离液，并控制Percoll梯度分离液的密度为1.06～1.07g/mL，即得到所需的Percoll分离液，备用；
在所述步骤d中，进行铺板法时所用的培养基液组成为：按照70ml的L-15培养基、20ml的DMEM培养基、10ml的鲤鱼血清、1ml的浓度为0.01M的Hepes缓冲液、1ml的浓度为1wt%的双抗储液的混合组分配比进行混合，然后在按照上述组分比例配制培养基液后，再用浓度为1M的NaOH储液调节培养基液的pH至7.0-7.4之间，然后用0.22μm滤头过滤分装培养基液，得到培养基液，为铺板法备用；在制备培养基液时，其中鲤鱼血清的制备方法如下：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静采集鲤鱼血液，并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-40min，密封试管，以2000-3000rpm的速度离心10min，用移液枪将血清移出，然后在-20℃下进行保存，备用进行培养基液的制备。
作为本发明优选的技术方案，选择规格均匀、体格健壮的鲤鱼时满足如下饲养条件：水温25±1℃，光照周期为光照:黑暗=14h:10h，并且保持每天喂食两次。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明方法提取鲤鱼原代肝细胞所需时间短，细胞数量多，纯度和成活率高，细胞存活率高，操作简单可行；
2.本发明方法直接无菌取鲤鱼肝脏，经Percolll纯化肝细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代肝细胞，并用鲤鱼血清代替传统培养基中的配牛血清，提高了所提取离体细胞的活力，为进一步开展鲤鱼原代肝细胞毒理试验及其他实验打下基础；
3.本发明方法得到的鲤鱼原代肝细胞为分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域的深入研究奠定了基础。
附图说明
图1为本发明优选实施例经Percoll分离得到的肝细胞悬液微观照片。
图2为本发明优选实施例采用台盼蓝染色法鉴定红鲤鱼肝细胞的微观照片。
图3为本发明优选实施采用苏木素-伊红染色法鉴定红鲤鱼肝细胞的微观照片。
图4为本发明优选实施经Percoll分离后分别以胚牛血清、鲤鱼血清培养肝脏细胞的OD值对比图。
具体实施方式
本发明的优选实施例详述如下：
在本实施例中，参见图1～4，一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，鲤鱼的饲养条件为：水温25±1℃，光照周期为光照:黑暗=14h:10h，并且保持每天喂食两次，然后，在无菌条件下进行如下过程：
a．无菌取鲤鱼肝脏和鲤鱼肝脏预处理：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，打开左侧体壁肌肉，找到鲤鱼肝脏所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取肝脏，并将之置于冰的D-Hank’s平衡盐工作液中，用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织2-3次至肝脏发白，以洗去肝脏组织中残留的血液，完成鲤鱼肝脏预处理过程；
b．机械破碎鲤鱼肝脏和对鲤鱼肝脏和消化处理：将在所述步骤a中选取和经过预处理的鲤鱼肝脏剪碎成约1mm×1mm块状，再用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织块1次，然后加入块状鲤鱼肝脏的10倍体积的0.25%胰酶，在在25℃条件下进行40min消化处理，在消化期间不断转动肝脏组织，消化处理后吸出大块肝脏组织，用移液枪温和吹打用机械切割力帮助肝脏组织消化，当向加入与胰酶同体积的培养基时停止消化过程，得到肝脏组织消化液；
c．细胞悬液的制备：将在所述步骤b中制备的肝脏组织消化液经孔径为100μm细胞筛网过滤，得到细胞悬液，然后以1000rpm离心5min后，再移去上清，接着加入培养液轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，然后用移液枪将细胞悬液缓慢温和地加到Percoll分离液上方，使Percoll分离液和细胞悬液的体积比为7:3，采用Percoll分离液的浓度为70wt%，然后在4℃条件下，以1000rpm再次离心10min，细胞悬液形成四层，在上而下分别为培养基层、死细胞、碎片和杂细胞混合层、分离液层和肝实质层，其中细胞沉淀位于肝实质层，取底层的实质层，得到肝脏细胞沉淀，然后将分离出来肝脏细胞中加入细胞培养液，并轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，再次得到细胞悬液，此过程要在无菌条件下严格操作；此时，用血小球计数板进行计数，并用血小球计数板对细胞悬液进行计数，计数时，血小球计数板共25个大格，每个大格放大后是4×4的小格，数血小球计数板的四个角以及中央位置的大格共5个大格，得到5个大格的细胞总数N，然后按下式计算：，单位为cells/ml；
d．鲤鱼肝脏细胞培养：用细胞培养基液稀释在所述步骤c中最后制备的细胞悬液，使细胞悬液稀释到1×106cells/ml的浓度水平，然后采用铺板法培养鲤鱼肝细胞，采用具有96孔板且每孔为200μl板进行铺板，使鲤鱼肝细胞在26℃条件下进行培养增殖，最终得到离体鲤鱼原代肝细胞；
在所述步骤a和b中，D-Hank’s平衡盐工作液组成为：由99ml的无Ca2+Mg2+的HBSS（1×，D-Hank’s平衡盐溶液）和1ml的浓度为1wt%双抗储液混合制备而成D-Hank’s平衡盐溶液，作为D-Hank’s平衡盐工作液；
在所述步骤c中，Percoll分离液的配制：采用Percoll原液90mL与无Ca2+Mg2+HBSS的10mL进行混合，制成渗透压为335mOsm(1kPa=38178mOsm)的缓冲型Percoll工作液，然后取35mL的Percoll工作液与15mL无Ca2+Mg2+HBSS进行混合，并在1000rpm条件下离心3min，即获得浓度为70wt%的Percoll梯度分离液，并控制Percoll梯度分离液的密度为1.06～1.07g/mL，即得到所需的Percoll分离液，备用；
在所述步骤d中，进行铺板法时所用的培养基液组成为：按照70ml的Leibovitz’sL-15培养基、20ml的DMEM培养基、10ml的鲤鱼血清、1ml的浓度为0.01M的Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml的浓度为1wt%的双抗储液的混合组分配比进行混合，配制铺板法中所用的最适培养基液，然后在按照上述组分比例配制培养基液后，再用浓度为1M的NaOH储液调节培养基液的pH至7.0-7.4之间，然后用0.22μm滤头过滤分装培养基液，得到培养基液，为铺板法备用；在制备培养基液时，其中鲤鱼血清的制备方法如下：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静采集鲤鱼血液，并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-40min，密封试管，以2000-3000rpm的速度离心10min，用移液枪将血清移出，然后在-20℃下进行保存，备用进行培养基液的制备。
实验检验测试分析：
如图1为经Percoll分离得到的肝细胞悬液微观照片，观察细胞纯度。将得到的原代肝细胞分别用台盼蓝染色法，HE染色法镜检鉴定细胞。如图2，可以清晰地看到：原代肝细胞经台盼蓝染色后死细胞被染成蓝色，死细胞的轮廓模糊，活细胞没有被染上颜色，切细胞轮廓清晰，发现细胞生长状态良好，死亡率低；如图3，采用苏木素-伊红染色法鉴定红鲤鱼肝细胞，经HE染色后，细胞核为蓝色，而细胞质为红色，细胞形态规则，胞质丰富，含有大小不一的空泡，细胞核主要为圆形，说明该细胞为单核细胞。如图4，用MTS/PMS法测定细胞，可见经percoll纯化并用含10%鲤鱼血清培养基培养的细胞存活率明显高于经Percoll纯化并用含10%鲤鱼血清培养基培养的细胞存活率。上述实施例提供一种生物工程技术领域的鲤鱼原代肝细胞的纯化和培养方法，即，选鲤鱼进行解剖，无菌取肝脏并剪碎，用胰蛋白酶消化后经细胞筛过滤得细胞悬液，后经Percolll纯化，加入含有鲤鱼血清的培养液得到新的细胞悬液；用血小球计数板进行计数，再以最适培养条件铺板法培养增殖，最后对得到的原代肝细胞多种方法镜检鉴定。本发明直接无菌取鲤鱼肝脏，经Percolll纯化肝细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代肝细胞，并用鲤鱼血清代替传统培养基中的配牛血清，提高了所提取离体细胞的活力，为进一步开展鲤鱼原代肝细胞毒理试验及其他实验打下基础。上述实施例所提取的鲤鱼原代肝细胞生长良好，适合于进行以鲤鱼原代肝细胞为实验对象的环境激素毒理实验及其他实验。
上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，其特征在于，选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，然后，在无菌条件下进行如下过程：
a．无菌取鲤鱼肝脏和鲤鱼肝脏预处理：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，打开左侧体壁肌肉，找到鲤鱼肝脏所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取肝脏，并将之置于D-Hank’s平衡盐工作液中，用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织2-3次至肝脏发白，以洗去肝脏组织中残留的血液，完成鲤鱼肝脏预处理过程；
b．机械破碎鲤鱼肝脏和对鲤鱼肝脏和消化处理：将在所述步骤a中选取和经过预处理的鲤鱼肝脏剪碎成约1mm×1mm块状，再用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织块至少1次，然后加入块状鲤鱼肝脏的10倍体积的0.25%胰酶，在在25℃条件下进行40min消化处理，在消化期间不断转动肝脏组织，消化处理后吸出大块肝脏组织，用移液枪温和吹打用机械切割力帮助肝脏组织消化，当向加入与胰酶同体积的培养基时停止消化过程，得到肝脏组织消化液；
c．细胞悬液的制备：将在所述步骤b中制备的肝脏组织消化液经孔径为100μm细胞筛网过滤，得到细胞悬液，然后以1000rpm离心5min后，再移去上清，接着加入培养液轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，然后用移液枪将细胞悬液缓慢温和地加到Percoll分离液上方，使Percoll分离液和细胞悬液的体积比为7:3，采用Percoll分离液的浓度为70wt%，然后在4℃条件下，以1000rpm再次离心10min，再取底层的肝脏细胞沉淀，然后将分离出来肝脏细胞中加入细胞培养液，并轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，再次得到细胞悬液；
d．鲤鱼肝脏细胞培养：用细胞培养基液稀释在所述步骤c中最后制备的细胞悬液，使细胞悬液稀释到1×106cells/ml的浓度水平，然后采用铺板法培养鲤鱼肝细胞，采用具有96孔板且每孔为200μl板进行铺板，使鲤鱼肝细胞在26℃条件下进行培养增殖，最终得到离体鲤鱼原代肝细胞；
在所述步骤a和b中，D-Hank’s平衡盐工作液组成为：由99ml的无Ca2+Mg2+的HBSS和1ml的浓度为1wt%双抗储液混合制备而成；
在所述步骤c中，Percoll分离液的配制：采用Percoll原液90mL与无Ca2+Mg2+HBSS的10mL进行混合，制成渗透压为335mOsm的Percoll工作液，然后取35mL的Percoll工作液与15mL无Ca2+Mg2+HBSS进行混合，并在1000rpm条件下离心3min，即获得浓度为70wt%的Percoll梯度分离液，并控制Percoll梯度分离液的密度为1.06～1.07g/mL，即得到所需的Percoll分离液，备用；
在所述步骤d中，进行铺板法时所用的培养基液组成为：按照70ml的L-15培养基、20ml的DMEM培养基、10ml的鲤鱼血清、1ml的浓度为0.01M的Hepes缓冲液、1ml的浓度为1wt%的双抗储液的混合组分配比进行混合，然后在按照上述组分比例配制培养基液后，再用浓度为1M的NaOH储液调节培养基液的pH至7.0-7.4之间，然后用0.22μm滤头过滤分装培养基液，得到培养基液，为铺板法备用；在制备培养基液时，其中鲤鱼血清的制备方法如下：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静采集鲤鱼血液，并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-40min，密封试管，以2000-3000rpm的速度离心10min，用移液枪将血清移出，然后在-20℃下进行保存，备用进行培养基液的制备。
2.根据权利要求1所述鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，其特征在于：选择规格均匀、体格健壮的鲤鱼满足如下饲养条件：水温25±1℃，光照周期为光照:黑暗=14h:10h，并且保持每天喂食两次。
3.根据权利要求1或2所述鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，其特征在于：在所述步骤c中，当再次离心细胞悬液后，细胞悬液形成四层，在上而下分别为培养基层、死细胞、碎片和杂细胞混合层、分离液层和肝实质层，细胞沉淀取自肝实质层。
CN201610234530.1A 2016-04-15 2016-04-15 鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法 Active CN105754932B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610234530.1A CN105754932B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610234530.1A CN105754932B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105754932A true CN105754932A (zh) 2016-07-13
CN105754932B CN105754932B (zh) 2021-04-09

Family

ID=56335144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610234530.1A Active CN105754932B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105754932B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161515A (zh) * 2018-08-06 2019-01-08 南京农业大学 团头鲂原代肝细胞的分离培养方法
CN109549955A (zh) * 2019-01-04 2019-04-02 湖南海济药业有限公司 一种牛肝脏提取液的制备方法
CN110684718A (zh) * 2019-10-30 2020-01-14 南京师范大学 一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法
CN111117947A (zh) * 2020-01-09 2020-05-08 电子科技大学 一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法
CN114591886A (zh) * 2022-03-09 2022-06-07 华中农业大学 一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法
CN114774349A (zh) * 2022-04-07 2022-07-22 南京师范大学 一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法
CN115109745A (zh) * 2022-07-19 2022-09-27 南京师范大学 一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304492A (zh) * 2011-08-27 2012-01-04 上海海洋大学 鲫肝细胞原代培养方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304492A (zh) * 2011-08-27 2012-01-04 上海海洋大学 鲫肝细胞原代培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李月红等: "鲫鱼肝细胞的原代培养研究", 《安徽农业科学》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161515B (zh) * 2018-08-06 2021-12-03 南京农业大学 团头鲂原代肝细胞的分离培养方法
CN109161515A (zh) * 2018-08-06 2019-01-08 南京农业大学 团头鲂原代肝细胞的分离培养方法
CN109549955A (zh) * 2019-01-04 2019-04-02 湖南海济药业有限公司 一种牛肝脏提取液的制备方法
CN110684718A (zh) * 2019-10-30 2020-01-14 南京师范大学 一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法
CN110684718B (zh) * 2019-10-30 2021-05-11 南京师范大学 一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法
CN111117947B (zh) * 2020-01-09 2022-03-08 电子科技大学 一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法
CN111117947A (zh) * 2020-01-09 2020-05-08 电子科技大学 一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法
CN114591886A (zh) * 2022-03-09 2022-06-07 华中农业大学 一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法
CN114591886B (zh) * 2022-03-09 2024-02-13 华中农业大学 一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法
CN114774349A (zh) * 2022-04-07 2022-07-22 南京师范大学 一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法
CN114774349B (zh) * 2022-04-07 2024-06-25 南京师范大学 一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法
CN115109745A (zh) * 2022-07-19 2022-09-27 南京师范大学 一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法
CN115109745B (zh) * 2022-07-19 2024-05-31 南京师范大学 一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105754932B (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105754932A (zh) 鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法
CN102304492B (zh) 鲫肝细胞原代培养方法
CN109609460B (zh) 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用
CN102085390A (zh) 软骨脱细胞基质及其制备方法和用途
CN108935249A (zh) 珍珠贝养殖天然珍珠方法及所得珍珠
CN102007879A (zh) 雌核发育鲤鱼的培育方法
CN106577409A (zh) 一种诱导桡足类产生滞育卵的方法
CN101940169B (zh) 一种虹鳟四倍体育种方法
CN107517899A (zh) 无核一贝多珠的海水珍珠培育方法
CN104293731A (zh) 建鲤原代肝细胞的分离培养方法
CN109294974A (zh) 一种异育银鲫脊髓组织细胞系及其构建方法与其应用
CN106434537A (zh) 一种培养、诱导罗非鱼腹腔前脂肪细胞的方法及培养基
CN103756952A (zh) 一种半滑舌鳎卵巢细胞系的构建与应用方法
CN109971700B (zh) 一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法
CN107937444A (zh) 体细胞克隆犬的方法
CN104381158B (zh) 一种采用卵生型手段繁育幼生型牡蛎的方法
CN107129962B (zh) 一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法
CN104059874A (zh) 金华猪耳真皮成纤维细胞系的构建方法
CN103484425B (zh) 一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法
CN110169378A (zh) 一种实验鱼类近交系的培育保种方法
CN102409021A (zh) 金华猪成纤维细胞系的建立及其培养方法
RU2348689C1 (ru) Постоянная линия клеток sso-2 пула паренхиматозных органов сибирского осетра acipenser baeri
CN101451121A (zh) 褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法
Seol et al. Haematological parameters and respiratory function in diploid and triploid Far Eastern catfish, Silurus asotus
CN110295137A (zh) 一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant