CN115109745B - 一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法；包括以下步骤：无菌解剖并分离黄颡鱼肝脏组织，立即置于组织清洗液中冲洗；将清洗后的肝脏剪碎，加入胶原酶Ⅳ，恒温震荡消化组织块；离心组织消化液，重悬沉淀，过筛，并进一步经分离液离心提纯后，使用含有黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素‑链霉素的DMEM完全培养基重悬沉淀，即获得黄颡鱼原代肝细胞，调整细胞密度后铺瓶培养；本发明黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，操作步骤简单，使用的酶试剂少，分离后肝细胞得率高，经原代培养后，肝细胞生长状态好，生理状态稳定，为后续黄颡鱼肝细胞系的建立和细胞层面科学研究的开展提供了理论和技术支持。
Description
技术领域
本发明属于鱼类细胞离体培养技术领域，具体涉及一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法。
背景技术
黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属于鲇形目，鲿科鱼类，在我国长江、黄河、珠江及黑龙江等流域均有分布。黄颡鱼因其肉质鲜嫩、脊间刺少等特点，深受消费者的喜爱，养殖规模逐年扩大，已成为我国重要的淡水养殖经济鱼类。然而随着产业的迅速发展，养殖过程中如病害频发、种质退化等问题也逐渐凸显，造成巨大经济损失。深入解析黄颡鱼相关分子机制，对促进可持续绿色健康养殖具有重要意义。
肝脏作为鱼类的重要器官，在代谢调节和免疫防御方面发挥双重功能，对维持鱼体内环境稳态和响应病原体感染起到关键作用，具有重要的研究价值。原代培养的肝细胞离体时间短，较好地保留和维持活体肝细胞的功能组成，是建立体外模型和研究细胞水平分子调控机制的重要手段。因此，发明黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，是开展基础理论研究的关键前提。但现有鱼类肝细胞分离和原代培养技术存在操作步骤较为繁琐，细胞分离后得率不够高，以及在黄颡鱼中适用性较差的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，包括以下步骤：
（1）解剖黄颡鱼，分离肝脏组织，立即置于组织清洗液中，并使用组织清洗液冲洗肝脏组织；
（2）使用无菌剪刀破碎冲洗后的肝脏至1-3mm³大小的组织块，向组织块中加入其体积4-5倍的胶原酶Ⅳ，在恒温摇床中振荡消化30min，获得组织消化液；
（3）离心组织消化液，弃上清，利用DMEM完全培养基重悬沉淀，吹打混匀后，过100μm的细胞筛网，再通过Percoll分离液进一步提纯肝细胞，经1000rpm离心10min后，收获沉淀，利用含有黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素-链霉素的DMEM完全培养基重悬沉淀，即可获得黄颡鱼原代肝细胞；
（4）调整肝细胞密度，28℃恒温培养黄颡鱼原代肝细胞，培养48h后更换原培养瓶中的一半培养基，继续扩大培养，获得黄颡鱼原代肝细胞。
进一步地，步骤（1）中所述组织清洗液组成为：100ml无菌PBS溶液中加入100μl双抗青霉素-链霉素，磁力搅拌器充分混匀后使用。
进一步地，步骤（2）中所述胶原酶Ⅳ是Servicebio，其使用浓度为1mg/ml，消化条件为26-28℃、100rpm震荡消化30-40min。
进一步地，步骤（3）中，DMEM完全培养基为100ml DMEM中含有15%体积的胎牛血清，2%体积的黄颡鱼血清和1%体积的双抗青霉素-链霉素溶液，其中青霉素和链霉素的浓度分别为100Units/ml和100μg/ml；pH为7.0-7.4。
进一步地，步骤（4）中，调整黄颡鱼原代肝细胞密度至104cells/ml-105cells/ml。
本发明的有益效果为：
本发明的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，操作步骤简单，使用的酶试剂少，分离后肝细胞得率高，经原代培养后，肝细胞生长状态好，生理状态稳定，满足后续细胞层面代谢、毒理以及分子机理等方面的研究需要。
附图说明
图1为无菌分离并经组织清洗液清洗后的黄颡鱼肝脏组织；
图2为本发明实施例、对比例1、对比例2分离培养24h后的黄颡鱼原代肝细胞；
图3为本发明实施例、对比例1、对比例2培养48h后的黄颡鱼原代肝细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，具体的操作步骤为：
（1）选取黄颡鱼体重为9±0.2g，体长为8.54±1.66cm，取肝组织之前饥饿处理48h，使用75%的酒精棉球擦拭鱼体，利用经高压灭菌后的无菌剪刀和镊子解剖分离肝脏，在组织清洗液中清洗杂质，得到如图1所示肝脏组织；
（2）用灭菌后的剪刀将肝脏组织剪至1-3mm3，加入1mg/ml的胶原酶Ⅳ(Servicebio)，加入量为肝脏组织块体积的4-5倍，置于恒温震荡摇床上28℃、100rpm消化30min；
（3）离心组织消化液，弃上清，重悬沉淀，吹吸混匀后，用100μm的细胞筛网过滤，滤液经1000rpm离心5min后，弃去上清，再次重悬沉淀，混匀后缓慢加入到60% percoll分离液上方，细胞悬液与percoll分离液的体积比为3:7，1000rpm离心10min，收获提纯后的肝细胞沉淀；向沉淀中加入含有黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素-链霉素的DMEM完全培养基，多次吹吸混匀，即制得黄颡鱼原代肝细胞；
（4）在细胞培养瓶中调整肝细胞密度至104cells/ml-105cells/ml，显微镜下观察后，放置于28℃恒温细胞培养箱中培养，培养48h后更换原培养瓶中的一半培养基，继续扩大培养。
其中，含黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素-链霉素的DMEM完全培养基配制比例为：每100ml DMEM培养基中含有2%体积的黄颡鱼血清，15%体积的胎牛血清，及1%体积的双抗溶液(青霉素100Units/ml，链霉素100μg/ml)。
对比例1
其余与本发明实施例相同，调整处为：将实施例步骤（2）中胶原酶Ⅳ替换成0.25%胰蛋白酶，其中0.25%胰蛋白酶的配制方法为：将胰蛋白酶粉末与D-Hank’s平衡盐溶液按比例混匀。
对比例2
其余与本发明实施例相同，调整处为：将实施例步骤（2）中胶原酶Ⅳ的浓度从1mg/ml更改至0.5mg/ml，稀释方法为：通过D-Hank’s平衡盐溶液将现有1mg/ml浓度胶原酶Ⅳ按比例稀释至0.5mg/ml，磁力搅拌混匀。
黄颡鱼原代肝细胞数量、活细胞率和细胞状态结果比较；
比较实施例、对比例1和对比例2的细胞数量、状态和活力：通过显微镜计数细胞数量、观察细胞状态，利用台酚蓝染色法统计细胞活力。结果如下：
实施例、对比例1和对比例2分离获得的黄颡鱼原代肝细胞数量以及活细胞率如表1所示，本发明方法分离收获的细胞数显著高于对比例1和2，而对比例2又高于对比例1，说明胶原酶Ⅳ比胰蛋白酶分离黄颡鱼肝细胞的效果更好，且胶原酶Ⅳ的浓度也会影响肝细胞分离效果；根据表1所示的活细胞率，实施例的活细胞率最高，可达到98.1%。
表1：活细胞率统计表
| 细胞总数(106) | 活细胞数(106) | 活细胞率(%) | |
| 实施例 | 9.00 | 8.83 | 98.1 |
| 对比例1 | 3.20 | 3.01 | 94.1 |
| 对比例2 | 4.50 | 3.84 | 85.3 |
实施例、对比例1和对比例2分离培养24h后的黄颡鱼原代肝细胞如图2所示，发明实施例中的细胞数量更多、形态更好。
实施例、对比例1和对比例2培养48h后的黄颡鱼原代肝细胞如图3所示，相比于对比例，发明实施例中的细胞排列均匀且紧密，细胞形态发生改变，状态稳定，且杂质更少。
通过上述结果对比，进一步说明本发明实施例分离黄颡鱼肝细胞的得率更高，培养后的细胞活力更好。
需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）解剖黄颡鱼，分离肝脏组织，立即置于组织清洗液中，并使用组织清洗液冲洗肝脏组织；
（2）使用无菌剪刀破碎冲洗后的肝脏组织至1-3mm3大小的组织块，向组织块中加入其体积4-5倍的胶原酶IV，在恒温摇床中100rpm振荡消化30-40min，获得组织消化液，所述胶原酶IV的使用浓度为1mg/ml；
（3）离心组织消化液，弃上清，重悬沉淀，吹打混匀后，过100μm的细胞筛网，再通过Percoll分离液进一步提纯肝细胞，经1000rpm离心10min后，收获沉淀，利用含有黄颡鱼血清、胎牛血清、双抗青霉素-链霉素的DMEM完全培养基重悬沉淀，即可获得黄颡鱼原代肝细胞；
（4）调整黄颡鱼原代肝细胞密度，28℃恒温培养黄颡鱼原代肝细胞，培养48h后更换原培养瓶中的一半培养基，继续扩大培养。
2.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述组织清洗液组成为：100ml无菌PBS溶液中加入100μl双抗青霉素-链霉素溶液，磁力搅拌器充分混匀后使用。
3.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述消化温度为26-28℃。
4.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（3）中，DMEM完全培养基为100ml DMEM中含有15%体积的胎牛血清，2%体积的黄颡鱼血清和1%体积的双抗青霉素-链霉素溶液。
5.根据权利要求1所述的黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法，其特征在于，步骤（4）中，调整黄颡鱼原代肝细胞密度至104cells/ml-105cells/ml。
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