CN108103008A - 一种从人羊膜中制取干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从人羊膜中制取干细胞的方法，所述方法包括：采集胎盘、取人羊膜、分离人羊膜上皮细胞、分离人羊膜间充质干细胞、细胞培养和冻存。本发明制备的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞纯度高，培养后增殖快，为操作人员节省了大量时间，同时增加了每个人羊膜的利用率。

Description

一种从人羊膜中制取干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种从人羊膜中制取干细胞的方法。

背景技术

羊膜是胎盘的最内层，与人眼结膜组织结构相似，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.02-0.5mm，在电镜下分为五层，分别是：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，人羊膜中的干细胞主要包含人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞。

研究发现，人羊膜间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表型，增殖能力比骨髓间充质干细胞更强，同时，人羊膜无免疫原性，不会产生免疫排斥反应，因此，更适合用于细胞培养，而羊膜属于分娩后的废弃物，不涉及医学伦理和法律问题，是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞，目前，原代人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞的提取方法主要是酶解法，利用相应的酶对人羊膜进行消化，再进行接种培养，该方法分离人羊膜时，往往将人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞一同分离下来，导致人羊膜上皮细胞与人羊膜间充质干细胞混杂在一起，不易分开，很难获得纯净的细胞系，影响接下来的细胞培养和应用过程，现有技术使用细胞刮刀将混合细胞中的上皮细胞分离出来，但该方法存在增加污染率和分离不彻底的问题，现有技术中通过不同的酶解法从不同的人羊膜上分离原代人羊膜间充质干细胞或人羊膜上皮细胞，该方法限制了每个人羊膜只能分离得到一种细胞，造成资源浪费。

发明内容

针对以上人羊膜细胞的分离过程中存在的大量问题，本发明提供了一种从人羊膜中制取干细胞的方法，该方法分离培养的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞纯度高，同时培养后的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞增殖快，为操作人员节省了大量时间。

本发明具体技术方案如下：

一种从人羊膜间充质干细胞分离培养方法，该方法包括以下步骤：

1)采集胎盘：取新鲜采集的胎盘，去除残留的绒毛膜，置于体积比为5:1的0.9％的氯化钠注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：将步骤1)所得的胎盘放置于圆盘中，用0.9％的氯化钠注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整个人羊膜，清洗干净；

3)分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm²的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒5-15mL细胞分离液将人羊膜全部浸润，20min后，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入15-30mL体积比为2:1的质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于30-45℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入20-40mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为4-6的60％的泛影葡胺、重量份数为8-10的青霉素和重量份数为40-50的TritonX-100；

4)分离人羊膜间充质干细胞：将步骤3)分离人羊膜上皮细胞后的人羊膜放置于第二培养皿中，加入质量浓度为0.14％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，再加入质量浓度为0.5％的Ⅳ型胶原酶消化至羊膜组织溶化，加入PBS缓冲液稀释，离心，得组织匀浆，离心，弃上清，收集下层的人羊膜间充质干细胞；

5)细胞培养：分别将步骤3)和步骤4)所得的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞调整细胞密度为2×10⁶，接种到培养瓶中进行细胞原代培养和传代培养；

6)冻存：将步骤5)所得的培养后的细胞进行冻存，即得冻存人羊膜上皮细胞和冻存人羊膜间充质干细胞。

进一步改进，步骤5)中所述细胞原代培养的具体方法为：在培养瓶中加入原代培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1-2天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底65％-75％时，加入1mg/mL的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆，立即终止消化，分离，收获原代干细胞。

本发明通过以上方法对细胞进行原代培养，可以显著的提高细胞的活力和纯度。

进一步改进，步骤5)中所述细胞传代培养的具体方法为：将获得的原代干细胞重悬于传代培养基中，放置于培养箱中，在38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞传代培养。

本发明通过以上方法对细胞进行传代培养，有利于人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞数量的增长，得到的干细胞数量多。

进一步改进，原代培养基以L-15培养基为基础，还包含以下浓度组分：100-250ng/mL的NGF、300-550ng/mL的天冬酰胺和200-500ng/mL的氯化钠。

其中，L-15培养基包含10％胎牛血清、900mg/L D-半乳糖、300mg/L L-谷氨酰胺和550mg/L丙酮酸钠，本发明通过加入以上培养基对人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞进行原代培养，可以进一步提高细胞的纯度。

进一步改进，传代培养基以AIM-V培养基为基础，还包括以下浓度组分：100-200ng/mL的6-苄氨基嘌呤、300-500ng/mL的白细胞介素Ⅱ和100-150ng/mL的蚕豆蛋白。

其中，AIM-V培养基是指无血清细胞培养基，其配方如下：50g/mL的葡萄糖、2mg/mL谷氨酰胺、3mg/mLNaHCO₃、5mg/mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2.5mg/mL的胰岛素、100ng/mL的转铁蛋白、20g/mL的孕酮、60mg/mL的丁二胺、30ng/mL的硒酸钠、50mg/mL的青霉素、50mg/mL的链霉素、100mg/mL的DF12，本发明通过设置以上培养基对人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞进行传代培养，可以提高细胞的活率。

进一步改进，步骤6)中所述细胞冻存的具体方法为：收集细胞并加入冻存液，将其装于冻存管中，放入程序降温盒后置于-80℃冰箱中，3-5h后，再将冻存管冻于液氮中。

进一步改进，所述离心速度为1000rpm。

进一步改进，冻存液包含以下浓度组分：5-15mL/L的knock-out血清、5-50mL/L的羟乙基淀粉和12-20mL/L右旋糖苷。

本发明通过在冻存液中加入knock-out血清、羟乙基淀粉和右旋糖苷，可延长细胞的保质期，使其在保存6个月后，细胞的存活率依然保持在85％以上。

本发明提供了一种从人羊膜中制取干细胞的方法，该方法先通过混合酶解法分离出人羊膜上皮细胞，然后将剩余人羊膜放置于全自动组织单细胞分离器内进行分离，分离培养得到的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞纯度高，培养后增殖快，为操作人员节省了大量时间，同时增加了每个人羊膜的利用率。

实施例1

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)采集胎盘：取新鲜采集的胎盘，去除残留的绒毛膜，置于体积比为5:1的0.9％的氯化钠注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：将步骤1)所得的胎盘放置于圆盘中，用0.9％的氯化钠注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整个人羊膜，清洗干净；

3)分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm²的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒5mL细胞分离液将人羊膜全部浸润，20min后，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入15mL体积比为2:1的质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于30℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入20mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为4的60％的泛影葡胺、重量份数为8的青霉素和重量份数为40的TritonX-100；

4)分离人羊膜间充质干细胞：将步骤3)分离人羊膜上皮细胞后的人羊膜放置于第二培养皿中，加入质量浓度为0.14％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，再加入质量浓度为0.5％的Ⅳ型胶原酶消化至羊膜组织溶化，加入PBS缓冲液稀释，离心，得组织匀浆，离心，弃上清，收集下层的人羊膜间充质干细胞；

5)细胞培养：分别将步骤3)和步骤4)所得的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞调整细胞密度为2×10⁶，接种到培养瓶中进行细胞原代培养和传代培养；

6)冻存：将步骤5)所得的培养后的细胞进行冻存，即得冻存人羊膜上皮细胞和冻存人羊膜间充质干细胞；

其中，原代培养基采用L-15培养基，传代培养基采用AIM-V培养基。

实施例2

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)采集胎盘：取新鲜采集的胎盘，去除残留的绒毛膜，置于体积比为5:1的0.9％的氯化钠注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：将步骤1)所得的胎盘放置于圆盘中，用0.9％的氯化钠注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整个人羊膜，清洗干净；

3)分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm²的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒10mL细胞分离液将人羊膜全部浸润，20min后，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入20mL体积比为2:1的质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于40℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入30mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为5的60％的泛影葡胺、重量份数为9的青霉素和重量份数为45的TritonX-100；

4)分离人羊膜间充质干细胞：将步骤3)分离人羊膜上皮细胞后的人羊膜放置于第二培养皿中，加入质量浓度为0.14％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，再加入质量浓度为0.5％的Ⅳ型胶原酶消化至羊膜组织溶化，加入PBS缓冲液稀释，离心，得组织匀浆，离心，弃上清，收集下层的人羊膜间充质干细胞；

5)细胞培养：分别将步骤3)和步骤4)所得的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞调整细胞密度为2×10⁶，接种到培养瓶中进行细胞原代培养和传代培养；

6)冻存：将步骤5)所得的培养后的细胞进行冻存，即得冻存人羊膜上皮细胞和冻存人羊膜间充质干细胞；

其中，原代培养基采用L-15培养基，传代培养基采用AIM-V培养基。

实施例3

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)采集胎盘：取新鲜采集的胎盘，去除残留的绒毛膜，置于体积比为5:1的0.9％的氯化钠注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：将步骤1)所得的胎盘放置于圆盘中，用0.9％的氯化钠注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整个人羊膜，清洗干净；

3)分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm²的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒15mL细胞分离液将人羊膜全部浸润，20min后，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入30mL体积比为2:1的质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于45℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入40mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为6的60％的泛影葡胺、重量份数为10的青霉素和重量份数为50的TritonX-100；

4)分离人羊膜间充质干细胞：将步骤3)分离人羊膜上皮细胞后的人羊膜放置于第二培养皿中，加入质量浓度为0.14％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，再加入质量浓度为0.5％的Ⅳ型胶原酶消化至羊膜组织溶化，加入PBS缓冲液稀释，离心，得组织匀浆，离心，弃上清，收集下层的人羊膜间充质干细胞；

5)细胞培养：分别将步骤3)和步骤4)所得的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞调整细胞密度为2×10⁶，接种到培养瓶中进行细胞原代培养和传代培养；

6)冻存：将步骤5)所得的培养后的细胞进行冻存，即得冻存人羊膜上皮细胞和冻存人羊膜间充质干细胞；

其中，原代培养基采用L-15培养基，传代培养基采用AIM-V培养基。

实施例4

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，包括实施例2的所述各步骤，区别之处在于，

细胞原代培养的具体方法为：在培养瓶中加入原代培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底65％时，加入1mg/mL的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆，立即终止消化，分离，收获原代干细胞；原代培养基以L-15培养基为基础，还包含以下浓度组分：250ng/mL的NGF、550ng/mL的天冬酰胺和500ng/mL的氯化钠。

细胞传代培养的具体方法为：将获得的原代干细胞重悬于传代培养基中，放置于培养箱中，在38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞传代培养；传代培养基以AIM-V培养基为基础，还包括以下浓度组分：200ng/mL的6-苄氨基嘌呤、500ng/mL的白细胞介素Ⅱ和150ng/mL的蚕豆蛋白。

实施例5

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，包括实施例2的所述各步骤，区别之处在于，

细胞原代培养的具体方法为：在培养瓶中加入原代培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1.5天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底70％时，加入1mg/mL的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆，立即终止消化，分离，收获原代干细胞；原代培养基以L-15培养基为基础，还包含以下浓度组分：200ng/mL的NGF、450ng/mL的天冬酰胺和350ng/mL的氯化钠。

细胞传代培养的具体方法为：将获得的原代干细胞重悬于传代培养基中，放置于培养箱中，在38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞传代培养；传代培养基以AIM-V培养基为基础，还包括以下浓度组分：150ng/mL的6-苄氨基嘌呤、400ng/mL的白细胞介素Ⅱ和125ng/mL的蚕豆蛋白。

实施例6

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，包括实施例2的所述各步骤，区别之处在于，

细胞原代培养的具体方法为：在培养瓶中加入原代培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔2天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底75％时，加入1mg/mL的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆，立即终止消化，分离，收获原代干细胞；原代培养基以L-15培养基为基础，还包含以下浓度组分：100ng/mL的NGF、300ng/mL的天冬酰胺和200ng/mL的氯化钠。

细胞传代培养的具体方法为：将获得的原代干细胞重悬于传代培养基中，放置于培养箱中，在38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞传代培养；传代培养基以AIM-V培养基为基础，还包括以下浓度组分：100ng/mL的6-苄氨基嘌呤、300ng/mL的白细胞介素Ⅱ和100ng/mL的蚕豆蛋白。

实施例7

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，包括实施例2所述各步骤，其中，在收集的人羊膜间充质干细胞中加入冻存液，将其装于冻存管中，放入程序降温盒后置于-80℃冰箱中，3-5h后，再将冻存管冻于液氮中；冻存液包含以下浓度组分：5mL/L的knock-out血清、5mL/L的羟乙基淀粉和12mL/L右旋糖苷。

实施例8

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，包括实施例2所述各步骤，其中，在收集的人羊膜间充质干细胞中加入冻存液，将其装于冻存管中，放入程序降温盒后置于-80℃冰箱中，3-5h后，再将冻存管冻于液氮中；冻存液包含以下浓度组分：10mL/L的knock-out血清、25mL/L的羟乙基淀粉和16mL/L右旋糖苷。

实施例9

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，包括实施例2所述各步骤，其中，在收集的人羊膜间充质干细胞中加入冻存液，将其装于冻存管中，放入程序降温盒后置于-80℃冰箱中，3-5h后，再将冻存管冻于液氮中；冻存液包含以下浓度组分：15mL/L的knock-out血清、50mL/L的羟乙基淀粉和20mL/L右旋糖苷。

对照例1

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例1的不同之处在于，删除了DNA酶。

对照例2

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例1的不同之处在于，步骤3)的具体方法如下：

分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm²的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入15mL质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和8mL质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于40℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入30mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为5的60％的泛影葡胺、重量份数为9的青霉素和重量份数为45的TritonX-100。

对照例3

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例1的不同之处在于，胰蛋白酶的pH为8。

对照例4

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例1的不同之处在于，用Ⅲ型胶原酶代替了Ⅱ型胶原酶。

对照例5

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例1的不同之处在于，用Ⅰ型胶原酶代替了DNA酶。

对照例6

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，在细胞分离液中增加了5份链霉素。

对照例7

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，用吐温-80代替了TritonX-100。

对照例8

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，删除了泛影葡胺。

对照例9

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，在原代培养基中增加了500ng/mL的甘氨酸，在传代培养基中增加了100ng/mL的核黄素。

对照例10

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，用L-缬氨酸代替天冬酰胺，用月桂酰肌氨酸代替6-苄氨基嘌呤。

对照例11

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，删除NGF和蚕豆蛋白。

对照例12

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例8的区别之处在于，在冻存液中增加10mL/L二甲基亚砜。

对照例13

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例8的区别之处在于，用胎牛血清代替knock-out血清。

对照例14

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，与实施例8的区别之处在于，删除右旋糖苷。

试验例1细胞表面免疫表型遗传试验

分别以实施例1-3和对照例1-8分离培养得到的人羊膜上皮细胞为试验1-11组，以实施例1-3和对照例1-8分离培养得到的人羊膜间充质干细胞为试验12-22组，并对以上细胞的表面抗原进行流式检测，观察其对CD49d的表达情况，结果见表1和表2。

其中，人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞的鉴别标志为：人羊膜间充质干细胞表达CD49d，人羊膜上皮细胞不表达CD49d。

表1试验1-11组细胞表面抗原流式检测结果

表2试验12-22组细胞表面抗原流式检测结果

由表1和表2可知，与实施例2相比，对照例1删除了DNA酶，对照例2删除了向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒10mL细胞分离液将人羊膜全部浸润的步骤，对照例3将胰蛋白酶的pH改为8，对照例4用Ⅲ型胶原酶代替了Ⅱ型胶原酶，对照例5用Ⅰ型胶原酶代替了DNA酶，对照例6在细胞分离液中增加了5份链霉素，对照例7用吐温-80代替了TritonX-100，对照例8删除了泛影葡胺。

试验1-3组的人羊膜上皮细胞表达的CD49d较低，而试验4-11组的人羊膜上皮细胞都对CD49d有较高程度的表达，由此可知，本发明提供的分离培养方法能够将人羊膜上皮细胞单独的分离出来而较少的混杂人羊膜间充质干细胞，当删除该方法中的某个步骤或替换细胞原代培养基和细胞传代培养基时，将会影响人羊膜上皮细胞的纯度。

试验12-14组的人羊膜间充质干细胞对CD49d的表达均高于90％，试验15-22组的人羊膜间充质干细胞对CD49d的表达显著降低，证明本发明提供的分离培养方法能够得到较高纯度的人羊膜间充质干细胞，当删除该方法中的某个步骤或替换细胞原代培养基和细胞传代培养基时，将会影响人羊膜间充质干细胞的纯度。

试验例2人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞增殖效率对比试验

分别以实施例4-6和对照例9-11的方法对人羊膜进行人羊膜进行分离和培养，得到人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞，用胰酶消化后以1×10⁴/mL接种于96孔培养板内，自当天起确定一个固定时间点，隔天取出3孔加入20μL 5mg/mL的MTT，混匀，孵育6h后弃培养液，加入100μL异丙醇，分别测第1、3、5、7、9、11、13、15天用酶联免疫检测仪在490nm波长处侧其OD值，取平均值，结果见表3和表4。

表3人羊膜间充质干细胞的增殖检测

表4人羊膜上皮细胞的增殖检测

由表3和表4可知，实施例4-6的方法分离培养得到的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞1-15天的OD值均高于对照例9-11，说明本发明提供的分离培养方法得到的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞的增殖能力强，当增加、删除或替换本发明提供的原代培养基或传代培养基中的成分时，都会导致人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞增殖能力的降低，并且，实施例6的OD值远远高于实施例4-5的OD值，证明实施例6提供的原代培养基或传代培养基中的成分能够显著增强人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞增殖能力。

试验例3使用不同冻存液时对人羊膜间充质干细胞冻存时间的考察

使用实施例7-9和对照例12-14的冻存液冻存人羊膜间充质干细胞，分别于0、1、3、6个月检测冻存细胞的存活数量，计算细胞的存活率，结果见表5。

表5不同冻存液保存的人羊膜间充质干细胞存活率(％)

由表5可知，对照例12-14是在本发明所提供的冻存液配方的基础上进行常规的增加、删除或替换，实施例7-9的冻存液对人羊膜间充质干细胞的冻存效果明显好于对照例12-14，证明本发明提供的冻存液配方对人羊膜间充质干细胞的冻存效果较好，而实施例9份冻存效果明显高于实施例7-8，因此，实施例9提供的冻存液对人羊膜间充质干细胞的冻存效果最好。

结论

由上述试验可知，使用本发明所述的从人羊膜中制取干细胞的方法及其专用培养基，可以有效的对人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞进行体外培养，而本发明所提供的原代培养基和传代培养基对人羊膜间充质干细胞的扩增培养非常高效，且本发明所提供的冻存液对人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞的冻存效果较好。

Claims (8)

1.一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)采集胎盘：取新鲜采集的胎盘，去除残留的绒毛膜，置于体积比为5:1的0.9％的氯化钠注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：将步骤1)所得的胎盘放置于圆盘中，用0.9％的氯化钠注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整个人羊膜，清洗干净；

3)分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm²的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒5-15mL细胞分离液将人羊膜全部浸润，20min后，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入15-30mL体积比为2:1的质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于30-45℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入20-40mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为4-6的60％的泛影葡胺、重量份数为8-10的青霉素和重量份数为40-50的TritonX-100；

4)分离人羊膜间充质干细胞：将步骤3)分离人羊膜上皮细胞后的人羊膜放置于第二培养皿中，加入质量浓度为0.14％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，再加入质量浓度为0.5％的Ⅳ型胶原酶消化至羊膜组织溶化，加入PBS缓冲液稀释，离心，得组织匀浆，离心，弃上清，收集下层的人羊膜间充质干细胞；

5)细胞培养：分别将步骤3)和步骤4)所得的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞调整细胞密度为2×10⁶，接种到培养瓶中进行细胞原代培养和传代培养；

6)冻存：将步骤5)所得的培养后的细胞进行冻存，即得冻存人羊膜上皮细胞和冻存人羊膜间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，步骤5)中所述细胞原代培养的具体方法为：在培养瓶中加入原代培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1-2天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底65％-75％时，加入1mg/mL的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆，立即终止消化，分离，收获原代干细胞。

3.如权利要求2所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，步骤5)中所述细胞传代培养的具体方法为：将获得的原代干细胞重悬于传代培养基中，放置于培养箱中，在38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞传代培养。

4.如权利要求2所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述原代培养基以L-15培养基为基础，还包含以下浓度组分：100-250ng/mL的NGF、300-550ng/mL的天冬酰胺和200-500ng/mL的氯化钠。

5.如权利要求3所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述传代培养基以AIM-V培养基为基础，还包括以下浓度组分：100-200ng/mL的6-苄氨基嘌呤、300-500ng/mL的白细胞介素Ⅱ和100-150ng/mL的蚕豆蛋白。

6.如权利要求1所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，步骤6)中所述细胞冻存的具体方法为：收集细胞并加入冻存液，将其装于冻存管中，放入程序降温盒后置于-80℃冰箱中，3-5h后，再将冻存管冻于液氮中。

7.如权利要求1所述从人羊膜中制取干细胞的方法，所述离心速度为1000rpm。

8.如权利要求6所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述冻存液包含以下浓度组分：5-15mL/L的knock-out血清、5-50mL/L的羟乙基淀粉和12-20mL/L右旋糖苷。