CN114317412A - 一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法，属于细胞培养技术领域。本发明中所述的制备方法包括如下步骤：(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，传代纯化1～3次得到纯度为100％的绵羊皮肤成纤维细胞。按照本发明的制备方法制备得到的绵羊成纤维细胞的纯度高，能达100％，可以稳定传代。

Description

一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。

背景技术

成纤维细胞是结缔组织的主要细胞成分，也被称为纤维母细胞，广泛应用于动物基因功能、医药开发和胚胎技术研究等多个领域，通常单个细胞呈长纺锤形或不规则扁平状，细胞核在细胞中清晰可见呈规则圆形，胞质突起生长呈放射状。体外培养过程中成纤维细胞大多呈梭型、多角形和扁平星型。成纤维细胞体积大、数量多，具有较强的分裂增殖能力，活动旺盛，易培养。

皮肤成纤维细胞与羊毛生长发育密切相关，还是诸多羊毛生长发育相关基因体外功能研究的重要载体，因此对绵羊成纤维细胞的分离培养研究是羊毛发育机制以及绵羊育种研究的重要内容。

目前对绵羊皮肤成纤维细胞的分离培养方法文献较少，已有文献报道的绵羊成纤维细胞分离培养方法主要是取自绵羊早期胚胎组织，用胰蛋白酶消化法，离心去上清重悬培养。但该方法培养效果极不稳定，消化液的浓度和消化时间较难掌控，消化得到的细胞量较少且培养周期较长，需10天左右方可传代，最终获得的细胞活性较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；

(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；

(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。

作为优选，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；

所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；

所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。

作为优选，步骤(1)和步骤(2)中所述胰蛋白酶的浓度独立为0.2～0.3wt％；

步骤(1)所述绵羊皮肤组织与胰蛋白酶的质量体积比为1～1.5g:2mL；

所述Ⅰ型胶原酶消化时的终浓度为2～3mg/mL。

作为优选，步骤(1)所述胰蛋白酶消化的温度和Ⅰ型胶原酶消化的温度独立为36～38℃；

步骤(1)所述离心的转速为1300～1500rpm；

所述离心的时间为10～12min。

作为优选，步骤(2)和步骤(3)所述培养的温度独立为36～38℃；

所述培养的CO₂的浓度独立为4.5～5.5vt％。

作为优选，步骤(2)和步骤(3)所述培养的时间独立为46～50h。

作为优选，步骤(2)所述离心的转速为800～1000rpm；

所述离心的时间为4～5min。

作为优选，所述DMEM高糖培养基中还包括如下体积浓度的组分：18～22％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。

作为优选，所述制备方法还包括传代纯化步骤；

所述传代纯化的方法为重复操作步骤(2)和步骤(3)所述的方法；

所述传代纯化的次数为1～3次；

所述传代纯化的培养基为DMEM高糖培养基；

所述DMEM高糖培养基还包括如下体积浓度的组分：8～12％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。

本发明还提供了所述的制备方法制备得到的绵羊皮肤成纤维细胞，所述绵羊皮肤成纤维细胞的纯度≥85％。

本发明提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。该方法具有以下优点：

(1)本发明的方法操作成功率较高，相比组织块法耗时短，减少细胞培养时间消耗，同时实验稳定性更强；本发明方法相比胰酶消化法和胶原酶消化法可以有效水解结缔组织、彻底消化肉块，获取更多的细胞，从而进一步缩短消化和培养时间，降低对细胞的影响，大大减少培养时间，提高了分离培养效率，同时获得贴壁率高、活性较强的成纤维细胞。

(2)本发明的方法通过差速消化法和差速贴壁法共同进行细胞纯化，依据成纤维细胞消化速率快、贴壁速率高的特点进行纯化，获得绵羊皮肤成纤维细胞纯度更高，经2次纯化后P3代免疫荧光鉴定纯度达100％。

(3)本发明采取出生10～14h的羔羊耳部组织，避免从母羊体内胎儿取样，做到最小损伤采样，且操作简单。

附图说明

图1为分离培养48h后P1代羔羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40×)；

图2为分离培养48h后P1代羔羊皮肤成纤维细胞显微镜图(100×)；

图3为分离培养得到P2代绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40×)；

图4为分离培养得到P3代绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40×)；

图5为分离培养得到绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(100×)；

图6为绵羊皮肤成纤维细胞Vimentin免疫荧光鉴定图；

图7为对比例1的方法分离培养48h后P1代羔羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40×)；

图8为对比例2的方法分离培养48h得到成年绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40×)。

具体实施方式

本发明提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；

(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；

(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。

在本发明中，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；

所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；

所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。

在本发明中，所述绵羊的出生时间优选为12h。

在本发明中，所述绵羊耳部组织无菌采集后于75％酒精中浸泡消毒1～3min后，加入含有Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液中洗涤1～3次，剪去中间部分的软骨后，再将组织块剪成1mm³的组织。

在本发明中，所述Hanks缓冲液中Ca²⁺浓度为1.26mM；Mg²⁺浓度为0.9mM。

在本发明中，所述绵羊耳部皮肤组织的采集方法为：

(1)使用手术刀片刮净绵羊耳部羊毛，用酒精棉球反复擦拭；

(2)使用手术剪剪取绵羊耳部组织，迅速放入75％酒精中浸泡60s；

(3)取出组织放置在含有1.5％青霉素、链霉素和两性霉素三抗的PBS中，冰袋中保存。

在本发明中，所述PBS的浓度为10mM。

在本发明中，步骤(1)和步骤(2)中所述胰蛋白酶的浓度独立为0.2～0.3wt％，优选为0.25wt％；

步骤(1)所述绵羊皮肤组织与胰蛋白酶的质量体积比为1～1.5g:2mL；

所述Ⅰ型胶原酶消化时的终浓度为2～3mg/mL，优选为2.5mg/mL。

在本发明中，所述胰蛋白酶消化的时间优选为35min。

在本发明中，步骤(1)所述胰蛋白酶消化的温度和Ⅰ型胶原酶消化的温度独立为36～38℃，优选为37℃；

步骤(1)所述离心的转速为1300～1500rpm，优选为1400rpm；所述离心的时间为10～12min，优选为11min。

在本发明中，步骤(1)所述终止胰蛋白酶消化的方法为：加入DMEM高糖培养基；

所述终止胰蛋白酶消化时DMEM高糖培养基的加入体积为胰蛋白酶加入体积一致。

在本发明中，所述终止胰蛋白酶消化后还需要进行冲洗；

所述冲洗的缓冲液为含有Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液；在本发明中，所述Hanks缓冲液中Ca²⁺浓度为1.26mM；Mg²⁺浓度为0.9mM。

所述冲洗的次数为3～5次，优选为4次。

在本发明中，所述消化细胞进行重悬培养时，先经200目细胞筛过滤。

在本发明中，步骤(2)和步骤(3)所述培养的温度独立为36～38℃，优选为37℃；

所述培养的CO₂的浓度独立为4.5～5.5vt％，优选为5vt％。

在本发明中，步骤(2)所述培养的时间独立为46～50h，优选为48h；

步骤(2)所述培养至24h后更换培养基1次。

在本发明中，步骤(2)所述离心的转速为800～1000rpm，优选为900rpm；

所述离心的时间为4～5min，优选为4.5min。

在本发明中，步骤(2)所述的纯化方法为差速消化法。

在本发明中，步骤(2)所述的终止胰蛋白酶消化的时机为显微镜观察95％以上的消化细胞变圆时；

步骤(2)所述的胰蛋白酶终止消化的方法为与步骤(1)胰蛋白酶终止消化的方法一致。

在本发明中，步骤(3)所述的纯化方法为差速贴壁法。

在本发明中，步骤(3)所述培养的时间独立为46～50h，优选为48h。

在本发明中，步骤(3)所述培养的方法为：先在DMEM高糖培养基中培养25～30min，使成纤维细胞完成贴壁后，更换培养基再次培养至细胞汇合度85～95％时。

在本发明中，所述DMEM高糖培养基中优选的还包括如下体积浓度的组分：18～22％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素；进一步优选的包括如下体积浓度的组分：20％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素和1％两性霉素。

在本发明中，所述制备方法还包括传代纯化步骤；

所述传代纯化的方法为重复操作步骤(2)和步骤(3)所述的方法；

所述传代纯化的次数为1～3次，优选为2次；

所述传代纯化的培养基为DMEM高糖培养基；

所述DMEM高糖培养基还包括如下体积浓度的组分：8～12％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。

本发明还提供给了所述的制备方法制备得到的绵羊皮肤成纤维细胞，所述绵羊皮肤成纤维细胞的纯度≥85％。

下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明实施例和对比例中所述的DMEM高糖培养基购自北京全式金生物技术有限公司。

在本发明实施例和对比例中所述的含有Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液购自浙江森瑞生物科技有限公司。

实施例1绵羊耳部皮肤组织采样方法

选取出生12h内的羔羊，使用手术刀片刮净绵羊耳部羊毛，用酒精棉球反复擦拭；使用手术剪剪取绵羊耳部组织，迅速放入75％酒精中浸泡60s充分消毒；取出组织放置在含有青霉素、链霉素和两性霉素三抗的PBS中，冰袋中保存，迅速带回实验室。

所述PBS的浓度为10mM。

所述PBS中还包括如下体积浓度的组分：1.5％青霉素、1.5％链霉素、1.5％两性霉素。

实施例2绵羊皮肤成纤维细胞分离培养方法

将实施例1得到的离体的绵羊耳部组织1.5g用10mL75％的酒精浸泡2min，将组织块放置培养皿中，加入含Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液没过组织块清洗两遍，洗去表面残留羊毛。

将洗涤后的组织块转移至2mL含有Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液的干净培养皿中，用手术剪和手术镊去除中间部分的软骨，再将组织充分剪碎成1mm³的小块，使用Hanks缓冲液再次清洗2遍；组织置于6cm培养皿中，加入2mL浓度为0.25wt％的胰蛋白酶浸没组织块，置于37℃、5％CO₂培养箱中消化30min后，加入2mL的DMEM高糖培养基终止消化，使用含Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液反复冲洗组织4次，加入含Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液浸没组织，将组织和缓冲液转移至50mL离心管中，按照比例加入Ⅰ型胶原酶，使Ⅰ型胶原酶的终浓度为2.5mg/mL，置于37℃、5％CO₂培养箱中摇床消化4h后，得到组织液。将所述组织液经200目细胞筛过滤至15mL离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，加入1mL DMEM高糖培养基重悬。37℃、5％CO₂培养箱培养48h，培养至24h时更换一次培养基。

所述DMEM高糖培养基中还含有20vt％的胎牛血清、1vt％的青霉素、1vt％的链霉素、1vt％的两性霉素。

培养48h后显微镜观察细胞的形态和数量。结果如图1～2所述。

图1显示，培养48h后细胞数量变多，细胞汇合度达到70％，其中含有60～70％成纤维细胞和30～40％的上皮细胞，两者共同生长。

图2显示，在100倍显微镜下可以看出成纤维细胞和上皮细胞之间明显的边界，两者具有较大的形态学差异。

实施例3绵羊皮肤成纤维细胞纯化方法

取实施例2培养得到的细胞利用浓度为10mM的PBS缓冲液清洗2次，加入浓度为0.25wt％的胰蛋白酶1mL消化2min。显微镜下观察95％细胞变圆时，加入DMEM培养基终止消化，使用移液枪吹打培养皿内壁，根据差速消化法进行纯化，此时成纤维细胞已脱落而上皮细胞依旧贴壁，收集细胞至15mL离心管中，1000rpm离心5min，加入1mL培养基重悬接种至含有20vt％胎牛血清、1vt％青霉素、1vt％链霉素和1vt％两性霉素的DMEM高糖培养基的培养皿中，根据差速贴壁法进一步纯化细胞，接种后的细胞在37℃条件下，消化培养30min，成纤维细胞已完成贴壁，更换培养皿中的培养基，在37℃条件下继续培养48h，观察P2代成纤维细胞的生长状况和分离情况。结果如图3所示。

重复操作实施例3的纯化方法对P2代成纤维细胞进行进一步纯化，纯化2次后得到的P3代成纤维细胞的情况如图4所示。

图3显示，上皮细胞大部分被分离，成纤维细胞纯度为90％，仍有少量上皮细胞存在。

图4显示，P3代成纤维细胞密度纯度较高成簇排列，得到纯度为100％的绵羊皮肤成纤维细胞，可以看出使用本发明中差速消化法和差速贴壁法可以得到高纯度的绵羊皮肤成纤维细胞。

吸取P2代成纤维细胞的培养液，PBS缓冲液进行冲洗，若产生较多分泌物可进行多次冲洗，0.25％胰酶消化1min后加入DMEM培养基终止消化，用移液枪吹打培养皿内壁收集细胞1000rpm离心5min，弃上清加培养基重悬，细胞悬液接种至培养皿中37℃、5％CO₂培养箱中培养，得到正常传代的成纤维细胞。结果如图5所示。

图5显示，正常传代培养的绵羊成纤维细胞轮廓清晰呈梭形放射状。

实施例4绵羊皮肤成纤维细胞鉴定

取实施例3中得到的P3代绵羊皮肤成纤维细胞，用PBS缓冲液清洗一遍，再加入0.25％胰酶消化离心去上清，重悬得到细胞悬液接种于15mm爬片培养至密度60％时取出，PBS冲洗后多聚甲醛固定30min后，每隔5min PBS冲洗一遍，加入免疫荧光封闭液孵育1h后加入一抗Vimentin波形蛋白单克隆抗体4℃过夜，加入二抗1h后DAPI染色封片荧光显微镜观察。观察结果如图6所示。

图6显示，细胞核不着色、细胞质着色，鉴定为绵羊皮肤成纤维细胞。

对比例1

将实施例1得到的离体的绵羊耳部组织1.5g，用75％的酒精浸泡2min，将组织块放置培养皿中，将组织块放置培养皿中，加入含Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液没过组织块清洗两遍，洗去表面残留羊毛。

将洗涤后的组织块转移至含有2mL，Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks缓冲液的干净培养皿中，用手术剪和手术镊去除中间部分的软骨，再将组织充分剪碎，使用Hanks缓冲液再次清洗2遍。

清洗干净的组织块置于6cm培养皿中，加入2mL浓度为0.25％的胰蛋白酶浸没组织块，置于37℃、5％CO₂培养箱中消化1h；

细胞悬液均匀分布在含有20％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)青霉素、1％(v/v)链霉素和1％(v/v)两性霉素的DMEM高糖培养基的6cm培养皿上，37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，培养至24h时更换一次培养基。培养48h后显微镜观察成纤维细胞的数量。结果如图7所示。

图7显示，细胞数量少，无法观测到明显的细胞群。

对比例2

按照实施例2的方法设置本对比例2的分离方法，与实施例2不同的是，本对比例2采用出生60天的绵羊耳部组织进行成纤维细胞分离。培养48h后显微镜观察结果见图8。

图8显示，细胞数量较少，其中上皮细胞数量较多，并且产生较多排泄物。

由以上实施例可知，本发明提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。按照本发明的制备方法可以得到纯度为100％的绵羊成纤维细胞，并且操作简单，耗时短。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；

(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；

(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；

所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；

所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述胰蛋白酶的浓度独立为0.2～0.3wt％；

步骤(1)所述绵羊皮肤组织与胰蛋白酶的质量体积比为1～1.5g:2mL；

所述Ⅰ型胶原酶消化时的终浓度为2～3mg/mL。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述胰蛋白酶消化的温度和Ⅰ型胶原酶消化的温度独立为36～38℃；

步骤(1)所述离心的转速为1300～1500rpm；

所述离心的时间为10～12min。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述培养的温度独立为36～38℃；

所述培养的CO₂的浓度独立为4.5～5.5vt％。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述培养的时间独立为46～50h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的转速为800～1000rpm；

所述离心的时间为4～5min。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述DMEM高糖培养基中还包括如下体积浓度的组分：18～22％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括传代纯化步骤；

所述传代纯化的方法为重复操作步骤(2)和步骤(3)所述的方法；

所述传代纯化的次数为1～3次；

所述传代纯化的培养基为DMEM高糖培养基；

所述DMEM高糖培养基还包括如下体积浓度的组分：8～12％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。

10.权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备得到的绵羊皮肤成纤维细胞，其特征在于，所述绵羊皮肤成纤维细胞的纯度≥85％。

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