CN109652405A - 一种利用南美白对虾血淋巴直接pcr的方法 - Google Patents
一种利用南美白对虾血淋巴直接pcr的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109652405A CN109652405A CN201910059375.8A CN201910059375A CN109652405A CN 109652405 A CN109652405 A CN 109652405A CN 201910059375 A CN201910059375 A CN 201910059375A CN 109652405 A CN109652405 A CN 109652405A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hemolymph
- pcr
- penaeus vannmei
- coagulants
- direct pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 241000927735 Penaeus Species 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000530454 Litopenaeus schmitti Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- -1 albumen Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，该方法由1.抗凝剂配制；2.血淋巴采集及预处理；3.PCR处理三部分组成，其特点为操作简单、成本低廉、安全无毒，该方法不仅省去了提取DNA的繁琐步骤而且不会造成对对虾亲本的伤害，符合现代生物学要求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种对虾的PCR方法。
背景技术
南美白对虾, 因其产量高，养殖周期短，出肉率高，味道鲜美等特点，发展成为世界性的经济甲壳类养殖品种，自我国引进白对虾以来，积极培育具有自主知识产权的优良新品种，然而国内对虾品种的培育均依赖于传统选育和杂交手段进行，培育的品种无法和国外进口品种相媲美。因此，利用分子辅助标记育种的手段，培育安全、高效且杂交子代性状可控的优良新品种是国内南美白对虾长足发展的必由之路。在这一过程中，快速获取大样本的遗传数据就显得至关重要，而传统的DNA提取方法在上千样本的提取中是一种费时费力且对人体有害的低效手段。
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，在生物学上，聚合酶链式反应英文简称为PCR，PCR的最大特点是能利用微量的DNA放大获得实验要求的目的片段。现有的南美白对虾的分子辅助标记育种均是先在提取DNA基础上再进行聚合酶链式反应，利用PCR试剂盒来进行的，但单个样本的PCR扩增成本高达20-50元，这在大样本筛选的工作无疑会大量增加实验成本。此外在分子辅助标记育种中，无创或者低伤害采集繁殖亲本的组织进行遗传分析是技术人员一直想要克服的问题，但现有技术依然是采集对虾步足进行DNA提取，这无疑会对对虾亲本造成较大伤害。
发明内容
本发明的目的在于解决现有南美白对虾PCR技术成本高、费时费力且对亲本伤害较大的问题，提供了一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：血淋巴是动物血腔内流动的血样液体 ，具有生物学遗传特性。本发明用南美白对虾的血淋巴代替步足或其他组织进行DNA提取，通过微创方法直接抽取南美白对虾血淋巴，然后对南美白对虾血淋巴进行抗凝处理，以防其冷却凝固，最后进行南美白对虾血淋巴的PCR处理，提取和复制南美白对虾DNA。
具体来说，一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，包括如下步骤：
1.抗凝剂配制
分别称取EDTA2.92g、葡萄糖20.67 g、氯化钠19.25 g和柠檬酸钠8.22g，加入1L超纯水中，并充分混合溶解，混合溶解后用0.22um的细菌过滤器过滤备用。
2.血淋巴采集及预处理
a.用规格为1ml注射器以45°角对准对虾第六体节与尾节连接处的基膜处，插入基膜4mm抽取20ul血淋巴。
b.将抽取的20ul血淋巴注射入200ul PCR管中，并加上30ul步骤1中的抗凝剂吹打混匀，混匀后用掌上离心机进行快速离心处理。离心后加入70%乙醇轻微洗涤后，倒掉乙醇，加入10ul去离子水进行细胞重悬后备用。
3.PCR处理
取1ul上述已处理好血淋巴样本作为PCR处理的样板，输入程序进行PCR处理，基因检测正反向引物：0.5ul（10um/ul），2x PCR MIX：10ul，ddH2O：8ul。
作为优选，上述的一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，步骤2-b中，离心处理的时间为15s。
作为优选，上述的一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，步骤3中，PCR的程序为:
有益效果：1. 本发明主要是根据PCR反应的基本原理以及常规实验的不断摸索，探索出的一种对虾血淋巴快速直接PCR方法，其特点为操作简单、成本低廉、安全无毒，适用于分子辅助标记育种领域。
2.通过抗凝剂、离心等预处理，不仅能够有效防治血淋巴凝固，还去除绝大部分对虾血淋巴中影响直接PCR效果的蛋白、激素、糖类等杂质，且该抗凝剂无毒安全，经该抗凝剂处理后血液样本，能收集到足量用于直接PCR的对虾血细胞，改变了传统DNA复制提取费时费力的特点。
3.通过南美白对虾基膜处的血淋巴注射提取，且提取量少，不会造成对对虾亲本的伤害，符合现代生物学要求。
附图说明
图1为本发明实施例的凝胶电泳图。
具体实施方式
为描述的更为详细清楚，下面通过1个具体实例并结合附图对本发明进行阐述。
取一只鲜活的南美白对虾，按上述技术方案所说的方法进行南美白对虾MSTN基因的PCR，具体实施步骤如下：
1.抗凝剂配制
分别称取EDTA2.92g、葡萄糖20.67 g、氯化钠19.25 g和柠檬酸钠8.22g，加入1L超纯水中，并充分混合溶解，混合溶解后用0.22um的细菌过滤器过滤备用。
2.血淋巴采集及预处理
a.用规格为1ml注射器以45°角对准对虾第六体节与尾节连接处的基膜处，插入基膜4mm抽取20ul血淋巴。
b.将抽取的20ul血淋巴注射入200ul PCR管中，并加上30ul步骤1中的抗凝剂吹打混匀，混匀后用掌上离心机进行快速离心处理，离心时间为15s，离心后加入70%乙醇轻微洗涤后，倒掉乙醇，加入10ul去离子水进行细胞重悬后备用。
3.PCR处理
取1ul上述已处理好血淋巴样本作为PCR处理的样板，输入程序进行PCR处理，基因检测正反向引物：0.5ul（10um/ul），2x PCR MIX：10ul，ddH2O：8ul。PCR程序如下：
在该实施例中，南美白对虾MSTN基因PCR的最终凝胶电泳图如附图1所示。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1. 一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，其特征在于，具体步骤如下 ：
（1）抗凝剂配制
分别称取EDTA2.92g、葡萄糖20.67 g、氯化钠19.25 g和柠檬酸钠8.22g，加入1L超纯水中，并充分混合溶解，混合溶解后用0.22um的细菌过滤器过滤备用；
（2）血淋巴采集及预处理
a.用规格为1ml注射器以45°角对准对虾第六体节与尾节连接处的基膜处，插入基膜4mm抽取20ul血淋巴；
b.将抽取的20ul血淋巴注射入200ul PCR管中，并加上30ul步骤1中的抗凝剂吹打混匀，混匀后用掌上离心机进行快速离心处理，离心后加入70%乙醇轻微洗涤后，倒掉乙醇，加入10ul去离子水进行细胞重悬后备用；
（3）PCR处理
取1ul上述已处理好血淋巴样本作为PCR处理的模板，输入程序进行PCR处理，基因检测正反向引物：0.5ul（10um/ul），2x PCR MIX：10ul，ddH2O：8ul。
2.根据权利要求1所述的一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，其特征在于：所述的步骤（2-b）中，离心处理的时间为15s。
3.根据权利要求1所述的一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，其特征在于：所述的步骤3中，PCR的程序为:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910059375.8A CN109652405A (zh) | 2019-01-22 | 2019-01-22 | 一种利用南美白对虾血淋巴直接pcr的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910059375.8A CN109652405A (zh) | 2019-01-22 | 2019-01-22 | 一种利用南美白对虾血淋巴直接pcr的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109652405A true CN109652405A (zh) | 2019-04-19 |
Family
ID=66119439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910059375.8A Pending CN109652405A (zh) | 2019-01-22 | 2019-01-22 | 一种利用南美白对虾血淋巴直接pcr的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109652405A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111850137A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-30 | 扬州福岁乐生物科技有限公司 | 一种中华绒螯蟹血淋巴的直接pcr方法 |
| CN112080495A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-15 | 自然资源部第三海洋研究所 | 一种从对虾血淋巴液提取dna用于pcr的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100028887A1 (en) * | 2008-05-19 | 2010-02-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method, kit and system for collecting and processing samples for dna and rna detection |
| CN103981188A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-08-13 | 内蒙古科技大学 | 一种凡纳对虾SWD基因亚型Lv-SWDi、其编码的氨基酸序列以及克隆方法 |
| CN104450706A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-03-25 | 中山大学 | 利用rna干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生upr的方法 |
| CN104611461A (zh) * | 2013-11-05 | 2015-05-13 | 广州金水动物保健品有限公司 | 南美白对虾对虾杆状病毒检测试剂盒及检测方法 |
| CN107490672A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-12-19 | 天津师范大学 | 一种快速分析甲壳动物血淋巴细胞类群和数量的方法及应用 |
| CN108034691A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-15 | 汕头大学 | 一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法 |
-
2019
- 2019-01-22 CN CN201910059375.8A patent/CN109652405A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100028887A1 (en) * | 2008-05-19 | 2010-02-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method, kit and system for collecting and processing samples for dna and rna detection |
| CN104611461A (zh) * | 2013-11-05 | 2015-05-13 | 广州金水动物保健品有限公司 | 南美白对虾对虾杆状病毒检测试剂盒及检测方法 |
| CN103981188A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-08-13 | 内蒙古科技大学 | 一种凡纳对虾SWD基因亚型Lv-SWDi、其编码的氨基酸序列以及克隆方法 |
| CN104450706A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-03-25 | 中山大学 | 利用rna干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生upr的方法 |
| CN107490672A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-12-19 | 天津师范大学 | 一种快速分析甲壳动物血淋巴细胞类群和数量的方法及应用 |
| CN108034691A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-15 | 汕头大学 | 一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KATHY F.J. TANG等: "Quantification of white spot syndrome virus DNA through a competitive polymerase chain reaction", AQUACULTURE, vol. 189, 25 September 2000 (2000-09-25), pages 12 - 15 * |
| 刘清兰;陈香丽;郭爱莲;宁黔冀;: "日本沼虾血淋巴RNA提取方法的改进", 河南师范大学学报(自然科学版), no. 06, 15 November 2012 (2012-11-15), pages 134 - 136 * |
| 张申等: "分子生物学检验", 31 January 2017, 华中科技大学出版社, pages: 9 - 10 * |
| 蔡小辉;彭银辉;文雪;彭重威;宋忠魁;: "非伤害性取样方法获取的拟穴青蟹DNA质量研究", 广西科学院学报, no. 02, 15 May 2010 (2010-05-15), pages 143 - 145 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111850137A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-30 | 扬州福岁乐生物科技有限公司 | 一种中华绒螯蟹血淋巴的直接pcr方法 |
| CN112080495A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-15 | 自然资源部第三海洋研究所 | 一种从对虾血淋巴液提取dna用于pcr的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108048579A (zh) | 快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、方法及试剂盒 | |
| CN104498599B (zh) | 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒 | |
| CN109652405A (zh) | 一种利用南美白对虾血淋巴直接pcr的方法 | |
| CN115679004B (zh) | 鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒 | |
| CN110567951A (zh) | 基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法 | |
| CN106818552A (zh) | 一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法 | |
| CN110358816B (zh) | 一种用于鸡来源细胞pcr检测的引物组、试剂盒及应用 | |
| CN103555847B (zh) | 一种罗非鱼亲子鉴定的方法 | |
| CN113308565B (zh) | 快速鉴定杨梅叶片形态性状的分子标记引物组合及其应用 | |
| CN114657264A (zh) | 一种胡子鲇性别特异性分子标记引物及其应用 | |
| CN110724735B (zh) | 一种快速鉴定暗纹东方鲀个体性别的snp位点和引物及其方法 | |
| CN107475411A (zh) | 一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测方法 | |
| CN111454939A (zh) | 一种桑树基因组dna的高效提取方法 | |
| CN107287352A (zh) | 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法 | |
| CN101967473B (zh) | 一种提取鱼类基因组dna的方法 | |
| CN101942507B (zh) | 环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法 | |
| CN110144413B (zh) | 日本血吸虫w染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用 | |
| CN108070663A (zh) | 鉴别长毛对虾幼体和墨吉对虾幼体的分子标记引物及方法 | |
| CN111118130B (zh) | 快速鉴别罗氏沼虾性别的方法 | |
| CN109762810A (zh) | 用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法 | |
| CN111454938A (zh) | 一种红树基因组dna的高效提取方法 | |
| CN101948828B (zh) | 一种微量动物细胞基因组dna模板制备液及相应的dna模板制备方法 | |
| CN110577950A (zh) | 一种用于提取微量药用植物样品dna的提取液及其提取方法 | |
| CN116103308B (zh) | 一个指示番茄丛枝菌根形成的报告基因及其应用 | |
| CN104531678A (zh) | 一种快速制备pcr扩增模板的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |