CN109762810A

CN109762810A - 用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法

Info

Publication number: CN109762810A
Application number: CN201910222322.3A
Authority: CN
Inventors: 唐永凯
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-05-17

Abstract

本发明公开了用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，所述方法通过取鱼类鳞片，加入变性液，煮沸，最后加入中性液来快速提取鱼类DNA，该方法相较于传统的DNA提取方法具有取样方便、操作简单、快速提取和经济实惠等优点；所述方法提取的DNA，能够作为高通量微卫星分析的模板，与传统方法提取的DNA具有相同的效果。

Description

用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种DNA提取方法，具体为用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法。

背景技术

在鱼类种群遗传学的研究中，以鱼类基因组DNA为研究对象，运用SSR等分子标记对种群进行遗传多样性分析以及种群鉴定。而在DNA提取过程中，通常以血液、肌肉、鳍条等组织为样品，应用酚-仿、磁珠富集、DNA提取试剂盒等方法提取DNA，DNA长度能达到100Kb以上，质量稳定可靠，可直接应用于PCR、Q-PCR、Southern杂交等分子生物学实验。但在分子标记应用上，PCR扩增模板不需要长链DNA，质量不高的短片段DNA也能扩增目的条带，获得相同效果。另外，血液样品的采集虽然是一种非伤害性取样，但费时费力，而且还需要熟练操作的技术人员，准确快速的从尾静脉抽取血液。肌肉、鳍条等组织的取样则是一种伤害性取样，影响鱼类的生理功能，而且极易引起鱼类伤口感染，导致病害发生，最终引起鱼类死亡。鱼类鳞片取样则简便易行，既可从鱼体表取样，也可收集鱼自身脱落的鳞片。虽然鳞片取样也是一种伤害性取样，但1至2片鳞片的缺失显然不会对鱼体造成严重的伤害，而且鱼类的生理功能也不会受到影响。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种减少因取样引起的鱼类伤口感染或病害发生的方法，建立一套可从鱼鳞片中快速提取DNA，为鱼类高通量微卫星分析的广泛应用提供平台，本发明提供了用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法。

技术方案：用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，所述方法包含以下步骤：

(1)用镊子从鲤鱼尾部取鳞片1至2片，剪碎，放入1.5mL的EP管中；

(2)向EP管中加入75μL碱性裂解液，放入95℃水浴锅中加热20～60分钟；

(3)将步骤(2)中的反应液迅速置于冰水中冷却2～5分钟；

(4)向步骤(3)中的加入中和缓冲液75μL；

(5)收集步骤(4)中的DNA，直接取1～3μL作为模板，用于高通量微卫星PCR扩增。

优选的，所述碱性裂解液组成成分及浓度为：25mM NaOH，0.2mM EDTA，pH为12。

优选的，中和缓冲液的组成成分及浓度为40mM Tris-HCl，pH为5。

优选的，所述高通量微卫星PCR扩增体系中DNA的模板量为2μL。

优选的，所述高通量微卫星PCR扩增体系中的引物序列为SEQ ID NO.1～2。

本发明所述方法的原理在于：NaOH作为一种强碱，使细胞中的蛋白质变性并分解蛋白质，也可降低DNA酶的活性，而EDTA作为一种螯合剂，螯合DNA酶的辅助因子Mg²⁺和Ca²⁺，使DNA酶活性降低，最后加入的Tris-HCl作为一种缓冲液，降低提取液的pH值，使提取的DNA适合保存，染色体DNA最终从细胞中分离出。

有益效果：本发明所述方法通过取鱼类鳞片，加入变性液，煮沸，最后加入中性液来快速提取鱼类DNA，该方法相较于传统的DNA提取方法具有取样方便、操作简单、快速提取和经济实惠等优点；所述方法提取的DNA，能够作为高通量微卫星分析的模板，与传统方法提取的DNA具有相同的效果。

附图说明

图1是本发明所述方法提取的DNA用于高通量微卫星PCR扩增的电泳结果图；

M：DL1000marker 1和2:血液DNA,3和4:鳞片DNA

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，所述方法包括以下步骤：

1、用镊子从鲤鱼尾部取鳞片1片，剪碎，放入1.5mL的EP管中。

2、向EP管中加入75μL碱性裂解液，放入95℃水浴锅中加热40分钟。其中裂解液的组成成份及浓度为：25mM NaOH，0.2mM EDTA，pH为12。

3、迅速将反应液置于冰水中冷却5分钟。

4、加入中和缓冲液75μL，其中中和缓冲液的组成成份及浓度为40mM Tris-HCl，pH为5。

5、获得DNA，直接取2μL作为模板，用于PCR扩增。

6、PCR反应体系为15μL，其中含2μL模版，1μL正向引物F(10μM)、1μL反向引物R(10μM)、7.5μL PCRmix(TransGen)、3.5μL ddH2O。PCR反应流程为：94℃预变性3min，然后30个循环(94℃30s，58℃30s，72℃40s)，最后72℃延伸3min，4℃保存。正向引物为(SEQ ID NO.1)F:TGGACTGTTAAAGAAGGGTATGTG；反向引物为(SEQ ID NO.2)R：TGCTTGGGTACTGGATGAAC)。

取10μLPCR扩增液，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳(含NaRed核酸染色剂，5μL/100mL)，电压140V，电泳20min。在凝胶成像系统下观察，并拍照记录。结果显示(图1)：扩增条带清晰，和对照组(血液DNA模板)无明显差异，这表明从鱼类鳞片中快速提取DNA的方法可行，提取的DNA可直接用于PCR扩增。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggactgtta aagaagggta tgtg 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcttgggta ctggatgaac 20

Claims

1.用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

(3)将步骤(2)中的反应液迅速置于冰水中冷却2～5分钟；

(4)向步骤(3)中的加入中和缓冲液75μL；

2.根据权利要求1所述的用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，其特征在于，所述碱性裂解液组成成分及浓度为：25mM NaOH，0.2mM EDTA，pH为12。

3.根据权利要求1所述的用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，其特征在于，中和缓冲液的组成成分及浓度为40mM Tris-HCl，pH为5。

4.根据权利要求1所述的用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，其特征在于，所述高通量微卫星PCR扩增体系中DNA的模板量为2μL。

5.根据权利要求1所述的用于高通量微卫星分析的鱼鳞DNA快速提取方法，其特征在于，所述高通量微卫星PCR扩增体系中的引物序列为SEQ ID NO.1～2。