CN106755438A - 一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法 - Google Patents
一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法。本发明利用分子标记来进行个体鉴定，通过提取鱼类鳞片DNA，筛选微卫星引物，多重PCR扩增，Cervus软件分析微卫星标记等步骤鉴定出放流的个体，准确率达到99.99%。该方法具有不损伤鱼体，操作性强，准确率高等优点。通过本方法建立的一套操作流程，可应用于鱼类的增殖放流效果评估研究中。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物及鉴别方法。
背景技术
增殖放流指用人工方式向海洋、江河、湖泊等公共水域放流水生生物苗种或亲体的活动。对于濒危物种，通过增殖放流不仅可以补充和恢复生物资源的群体，保护濒危物种、增加渔业资源产量和修复生态环境，还具有培养渔民环保意识和增加渔民收入等多方面的重要意义。
在增殖放流过程中，通常通过体外标志法或体内标志方法跟踪增殖放流的鱼类。体外标志法主要包括剪鳍法、烙印法、挂牌法等。该方法操作简单、易于识别，不需要专门的仪器，但可能会影响鱼类行为活动、易脱落，所以准确率不高。体内标志法主要包括线码标志法、档案式标志法、被动式整合雷达标志法和分离式卫星标志法等。该方法几乎不影响鱼类的生长，也不会遗失，准确率高于体外标志，但费用比较昂贵。近年来，微卫星分子标记作为一种新型的标志方法，已在国内外开始逐步试用。与传统标志方法相比，分子标记技术是以个体间遗传物质为基础的遗传标记，不存在脱落或改变的情况，最大程度减少了传统标志方法对鱼体造成的伤害，适用于鱼类的放流活动。
微卫星，亦称简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，一般为2～6个碱基单元重复，如(CA)n、(CAA)n、(GACA)n。微卫星DNA作为一种分子标记，具有分布广且均匀、多态信息含量高、共显性遗传等特点，已被广泛应用于群体遗传研究、生物遗传作图、个体鉴定以及亲子鉴定等方面。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是提供一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物及鉴别方法，采用本发明的鉴别方法可准确的鉴定出渔获物中哪些是放流的个体，为鱼类的增殖放流效果评估提供依据，准确率能达到99.99％，可应用于鱼类的增殖放流效果评估研究中。
技术方案：一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，包括有用于扩增的15对微卫星引物，其序列如下：F1SEQ ID NO.1～2、F2SEQ ID NO.3～4、F3SEQ ID NO.5～6、F4SEQ IDNO.7～8、F5SEQ ID NO.9～10、F6SEQ ID NO.11～12、F7SEQ ID NO.13～14、F8SEQ IDNO.15～16、F9SEQ ID NO.17～18、F10SEQ ID NO.19～20、F11SEQ ID NO.21～22、F12SEQID NO.23～24、F13SEQ ID NO.25～26、F14SEQ ID NO.27～28、F15SEQ ID NO.29～30。
所述的每对引物对中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
每对引物进行标记时是采用PET、6FAM、NED和VIC中的任意一种进行染色。
所述的引物对是经过分组的。具体分组为：
F1、F2、F3、F4、F5为第一组；
F6、F7、F8、F9、F10为第二组；
F11、F12、F13、F14、F15为第三组。
根据本发明的另一个方面，还提供了包含有上述引物组的检测试剂盒。
所述的试剂盒由如下组成：DNA模板，2×Taq PCR Mix，正向和反向引物，去离子水。
根据本发明的另一个方面，还提供了上述试剂盒用于鉴定鱼类增殖放流个体的方法，包括以下步骤：
步骤1，在放流前收集放流鱼类的鳞片样本、在调查水域采集和放流品种一致的鱼类鳞片样本，提取两种来源样本的基因组DNA；
步骤2，以步骤1得到的DNA为模板进行PCR扩增；
步骤3，运用Cervus软件分析两种来源的鱼类微卫星标记，鉴定得到调查水域采集的鱼类增殖放流个体。
所述的鉴定鱼类增殖放流个体的方法中，步骤2中PCR扩增体系为：PCR反应总体积为15μL，其中16.6ng/μL DNA模板2μL，2×Taq PCR Mix 5μL，10μmol/L正向和反向引物各0.5μL，去离子水7μL。
有益效果：本发明利用分子标记来进行个体鉴定，通过提取鱼类鳞片DNA，筛选微卫星引物，多重PCR扩增，Cervus软件分析微卫星标记等步骤鉴定出放流的个体，准确率达到99.99％。该方法具有不损伤鱼体，操作性强，准确率高等优点。通过本方法建立的一套操作流程，可应用于鱼类的增殖放流效果评估研究中。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1.用磁珠富集法开发微卫星标记，筛选出扩增效率好，多态性高的引物。取15对微卫星引物，用PET6，FAM，NED和VIC等不同荧光标记引物，根据扩增片段大小及标记的荧光构成三组多重PCR，建立稳定的PCR反应体系。其中Multiplex1含有5对PCR引物，Multiplex2含有5对PCR引物，Multiplex3含有5对PCR引物，见表1。在三组多重PCR中，每对引物的浓度均一致。
表1扩增的微卫星引物及其荧光标记
| 引物名称 | 荧光标记 | 引物序列(5’-3’) | 多重PCR |
| F1-F | PET | CGTAATGGAAGTCAGTGGACTGG | Multiplex1 |
| F1-R | CTGATTTAGCTTTTTAGTGCCCAATGC | ||
| F2-F | NED | TTATTATCCAAAGGGGTCAAAA | Multiplex1 |
| F2-R | GAGGTCGCTGGGGTTTACTAT | ||
| F3-F | PET | CTTTACAAATAGACAGACT | Multiplex1 |
| F3-R | GTCATACAGTCACTATCATC | ||
| F4-F | NED | CCTTTTGACAGATTTAGGATTTC | Multiplex1 |
| F4-R | CAAACCAAACATACCTAAAGC C | ||
| F5-F | 6FAM | GGCCCAGACAGATAAACAAACACGC | Multiplex1 |
| F5-R | GCCAACAGCAGCATCTACACCCAG | ||
| F6-F | NED | TTGTGAAGGGGCTGACTAAC | Multiplex2 |
| F6-R | TCAATTGTTGGGTGCACATAG | ||
| F7-F | 6FAM | CTTGGAATATCTAGAATATGGC | Multiplex2 |
| F7-R | GTTCATGTGTTAATGTTGCGTG | ||
| F8-F | PET | CTTGGTCCCGTTCTTACGACAACC | Multiplex2 |
| F8-R | TGCACGCTGCTTGGTCCTTG | ||
| F9-F | PET | TTAGATGGTGGGATACTGGGAGGC | Multiplex2 |
| F9-R | CGGGAGCCCCATAACCCTACTAATAAC | ||
| F10-F | NED | ATCGAAATGGAACTTTTGAATG | Multiplex2 |
| F10-R | GCTTAGGGCTGAGAGAGGAATAC | ||
| F11-F | PET | TGGCAGGGATTTGACATAAC | Multiplex3 |
| F11-R | GGGTTGAGTAGGGAGGCTTG | ||
| F12-F | NED | TCGCTGTGTATCAGTATTTTG G | Multiplex3 |
| F12-R | ACTCGGATAACACTCACAGGTC | ||
| F13-F | 6FAM | TGTGGATTTTTGTATTATGTTA | Multiplex3 |
| F13-R | ATACATTTCCTCCTCATTCAGT | ||
| F14-F | VIC | AGGAAGGTGCTGAAGAGGAAC | Multiplex3 |
| F14-R | CAATTACCACAAGCCCGCTC | ||
| F15-F | VIC | GATGGCAAAGAGGAAAGTGAG | Multiplex3 |
| F15-R | TTGTTATGCTCTACCTCTGAA |
2.放流前，用镊子取1143尾三文鱼尾部鳞片，同样方法取河流上游垂钓到的210尾三文鱼尾部鳞片放入牛皮样品袋中保存。取上述不同来源样品的三片鳞片放入96孔板中的样品孔中，加入75μl碱性裂解液(0.25mM NaOH,0.2mM EDTA)，加热样品到95℃，持续10分钟，迅速冷却样品到4℃，加75μl中性液(40mM Tris-HCl)，得到样品的DNA。4℃保存备用。
3.运用PCR仪同时扩增两种来源的三文鱼DNA，ABI 3730测序仪分析扩增的微卫星片段大小。三组多重PCR扩增的反应体系为：PCR反应总体积为15μL，其中DNA模板(约16.6ng/μL)2μL，2×Taq PCR Mix 5μL，正向和反向引物(10μmol/L)各0.5μL，去离子水7μL。其中multiplex1和Multiplex PCR2的反应程序均为：95℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火温度45s，72℃延伸1min，循环28次；72℃延伸5min；4℃保存。Multiplex PCR3的反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性45s，57℃退火温度45s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min；4℃保存。PCR产物直接通过ABI 3730测序仪分析，获得扩增的微卫星片段大小。
4.运用Cervus软件分析放流和垂钓的三文鱼个体微卫星标记，Allow fuzzymatching选项设为2。分析得出210尾垂钓到的三文鱼中有135尾是来自放流的三文鱼，见表2。其中第一列是垂钓到的三文鱼个体编号，第三列是来自放流的三文鱼个体编号。从表2中可看出，除了SF138和V386有一个位点错配外，其它的垂钓到的三文鱼基因型和放流的三文鱼基因型完全匹配，可认定这135尾三文鱼来自放流的，而另外65尾三文鱼则来自其它源头。
表2放流和垂钓的三文鱼个体微卫星标记比对
由上表可知，采用本发明的鉴别方法可准确的鉴定出渔获物中哪些是放流的个体，为鱼类的增殖放流效果评估提供依据，准确率能达到99.99％，可应用于鱼类的增殖放流效果评估研究中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法
<130> 2016
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtaatggaa gtcagtggac tgg 23
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgatttagc tttttagtgc ccaatgc 27
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttattatcca aaggggtcaa aa 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaggtcgctg gggtttacta t 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctttacaaat agacagact 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtcatacagt cactatcatc 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccttttgaca gatttaggat ttc 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caaaccaaac atacctaaag cc 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggcccagaca gataaacaaa cacgc 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gccaacagca gcatctacac ccag 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttgtgaaggg gctgactaac 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcaattgttg ggtgcacata g 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cttggaatat ctagaatatg gc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gttcatgtgt taatgttgcg tg 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cttggtcccg ttcttacgac aacc 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgcacgctgc ttggtccttg 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttagatggtg ggatactggg aggc 24
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgggagcccc ataaccctac taataac 27
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
atcgaaatgg aacttttgaa tg 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcttagggct gagagaggaa tac 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tggcagggat ttgacataac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gggttgagta gggaggcttg 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tcgctgtgta tcagtatttt gg 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
actcggataa cactcacagg tc 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtggatttt tgtattatgt ta 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
atacatttcc tcctcattca gt 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
aggaaggtgc tgaagaggaa c 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
caattaccac aagcccgctc 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gatggcaaag aggaaagtga g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ttgttatgct ctacctctga a 21
Claims (8)
1.一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：包括有用于扩增的15对微卫星引物，其序列如下：F1 SEQ ID NO.1～2、F2 SEQ ID NO.3～4、F3 SEQ ID NO.5～6、F4SEQ ID NO.7～8、F5 SEQ ID NO.9～10、F6 SEQ ID NO.11～12、F7 SEQ ID NO.13～14、F8SEQ ID NO.15～16、F9 SEQ ID NO.17～18、F10 SEQ ID NO.19～20、F11 SEQ ID NO.21～22、F12 SEQ ID NO.23～24、F13 SEQ ID NO.25～26、F14 SEQ ID NO.27～28、F15 SEQ IDNO.29～30。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：所述的每对引物对中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：每对引物进行标记时是采用PET、6FAM、NED和 VIC中的任意一种进行染色。
4.根据权利要求1所述的用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：所述的引物对是经过分组的。
5.根据权利要求4所述的用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：F1、F2、F3、F4、F5为第一组；F6、F7、F8、F9、F10为第二组；F11、F12、F13、F14、F15为第三组。
6.包含有权利要求1至5任一项所述的用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：由如下组成：DNA模板，2×Taq PCR Mix，正向和反向引物，去离子水。
8.权利要求6所述的试剂盒用于鉴定鱼类增殖放流个体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，在放流前收集放流鱼类的鳞片样本、在调查水域采集和放流品种一致的鱼类鳞片样本，提取两种来源样本的基因组DNA；
步骤2，以步骤1得到的DNA为模板进行PCR扩增；
步骤3，运用Cervus软件分析两种来源的鱼类微卫星标记，鉴定得到调查水域采集的鱼类增殖放流个体。
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|---|---|
| CN106755438B (zh) | 2020-07-24 |
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