CN103276089A - 胭脂鱼亲子鉴定的方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
胭脂鱼亲子鉴定的方法，包括以下步骤（1）胭脂鱼个体DNA提取；（2）胭脂鱼微卫星标记的筛选；（3）胭脂鱼微卫星荧光标记的合成和PCR扩增；（4）胭脂鱼亲子鉴定技术的建立。胭脂鱼亲子鉴定的试剂盒，包括：10mM/L的10×PCR Buffer，25mmol/L的MgCl2，10mM/L的dNTPs，10mM/L的17个微卫星标记（F.R），5U/μL的rTaq Enzyme及ddH2O。本发明可以实现胭脂鱼养殖场人工繁殖以及建立胭脂鱼家系谱系提供依据，指导胭脂鱼人工增殖放流，提高胭脂鱼繁殖的成活率。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域，特别涉及到鱼类亲子鉴定的方法及试剂盒。
背景技术
胭脂鱼（myxocyprinus asiaticus），鲤形目，亚口鱼科，胭脂鱼科胭脂鱼属，本种是迄今所知亚口鱼科分布于我国唯一的种，分布在长江、闽江水系，20世纪70年代之前，胭脂鱼曾经是长江上游大型经济鱼类之一，由于过度捕捞，水域污染，水利工程建设特别是葛洲坝截流后使其资源量急剧下降，目前，闽江已很难发现胭脂鱼的踪迹，长江胭脂鱼可能是现存的中国胭脂鱼的唯一野生种群，被列为国家Ⅱ级野生保护动物。
微卫星又称为短串联重复序列（Short tandem repeats；STR）是指一类重复单位在2～6个碱基的重复序列，微卫星序列作为分子标记有诸多优点：在真核基因组中分布广泛、等位基因多杂合度高；扩增片段短扩增率高；灵敏度比传统的DNA指纹高得多，由于其结果可靠，方法简单，省时省力，在亲子鉴定和遗传多态性研究中微卫星标记技术正在逐步取代其他分子标记技术，目前国内外的科研工作者已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠及几个植物物种的染色体遗传图谱，并将微卫星标记广泛应于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、繁殖育种以及进化研究等领域。就目前胭脂鱼所处的环境和资源状况来看，加强长江胭脂鱼人工增殖放流是避免其资源进一步减少，并使其资源得以比较快地恢复与增殖的最有效途径。但人工增殖放流工作如果在没有考虑其物种遗传背景的情况下进行，则具有较大的盲目性和随意性，由此带来的人工增殖放流个体对天然群体的遗传多样性和种群结构的短期影响和长期效应，则急需要用可靠手段如分子标记等加以评价。本发明利用微卫星建立胭脂鱼亲子鉴定技术可以用于指导胭脂鱼各个养殖场人工繁殖，有效防止胭脂近亲繁殖或某些胭脂鱼亲本过度繁殖所带来的胭脂鱼种群遗传多样性的减少和某些稀有地方群体的消失，使得长江胭脂鱼资源得以较快的恢复与增殖，从而更好的保护胭脂鱼。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用荧光标记微卫星建立胭脂鱼亲子鉴定的方法及试剂盒，该方法可以实现胭脂鱼养殖场人工繁殖以及建立胭脂鱼家系谱系提供依据，指导胭脂鱼人工增殖放流，提高胭脂鱼繁殖的成活率。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
胭脂鱼亲子鉴定的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤
（1）、胭脂鱼个体DNA提取：提取胭脂鱼亲本和子代DNA备用；
（2）、胭脂鱼微卫星标记的筛选：将69对微卫星标记合成非荧光标记引物之后PCR扩增，初步筛选分离多态性高的的引物进一步进行温度梯度筛选并进行群体分析；
（3）、胭脂鱼微卫星荧光标记的合成和PCR扩增：筛选得到17对多态性高并且能稳定扩增的微卫星标记，分别标上2种荧光引物，然后以每2对引物扩增的PCR产物混合之后读取等位基因值；
（4）、胭脂鱼亲子鉴定技术的建立：挑选一组胭脂鱼个体单独进行受精孵化养殖，提取30个个体DNA作为子代群体，同时选取繁殖亲本10尾用于候选亲本用于建立亲子鉴定体系，进行亲子鉴定分析。
步骤（3）中筛选出的17对胭脂鱼微卫星标记特征为：
步骤（2）中69对微卫星PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，最适退火温度下退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min，4℃保存。
步骤（3）中17对微卫星PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 3.0μL；25 mmol/L Mg2+0.5μL；dNTPs 1.0μL；Primer 各0.5μL；5 U/μL rTaq Enzyme 0.4μL；1000 ng/μL Template 1.0μL；ddH2O 18.1μL。
步骤（3）中17对微卫星PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃再延伸10min4℃保存产物。
胭脂鱼亲子鉴定的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中药品包括：10mM/L的10×PCR Buffer，25 mmol/L的MgCl2，10 mM/L的dNTPs，10 mM/L的17个微卫星标记（F.R），5 U/μL的rTaq Enzyme及ddH2O。
本发明的有益效果为：本发明所建立的胭脂鱼亲子鉴定技术和试剂盒能准确的用于胭脂鱼亲子鉴定，指导胭脂鱼各个养殖场人工繁殖，有效防止近亲交配或某些胭脂鱼亲本过度繁殖所带来的胭脂鱼种群遗传多样性的减少和某些稀有地方群体的消失，为胭脂鱼种质鉴定和家系管理提供基础，从而指导胭脂鱼人工增殖放流，保护长江胭脂鱼的遗传多样性，使得长江胭脂鱼种群得以较快的恢复和增殖，对胭脂鱼保护具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明。
一） 胭脂鱼个体DNA提取
采集胭脂鱼亲本尾鳍样本10尾，子代30尾，无水酒精-20℃保存备用。取0.5g左右的尾鳍组织，用双蒸水洗净尾鳍上沾附的酒精，用TE缓冲液浸泡6h以充分置换出酒精，放入1.5mL离心管中充分剪碎，分别加入600μLSTE缓冲液，40μL10%SDS，10μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，在50℃～54℃之间消化4小时以上，直到组织完全消化完之后加入650ul体积比为25:24:1体积酚-氯仿-异戊醇混合液，缓慢转动混匀20min，12000rpm离心10min，吸上清液，重复一次后再加入500ul体积比24:1的氯仿-异戊醇混合液，混匀20min以上，12000rpm离心10min，吸上清液加入1ml的无水乙醇，4℃过夜后12000rpm离心10min，去上清液，留沉淀于底，温箱干燥或空气干燥后加入50μL双蒸水，待完全溶解后稀释成100ng/ul保存备用。
二） 胭脂鱼微卫星标记的筛选
1、微卫星标记引物的查找
下载GenBank上发表的69对微卫星标记，将这69对微卫星标记合成非荧光标记引物之后以如下PCR反应条件扩增：94℃预变性5min；94℃变性45s，最适退火温度下退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min，4℃保存。
2、群体分析和引物筛选
将筛选出的胭脂鱼多态引物在万州24个个体进行群体分析，以进行群体多态性的筛选，以设计的引物为模板，进行PCR扩增后8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，使软件POPGENE32计算各微卫星的等位基因数（K），观测杂合度（HO），期望杂合度（HE），使用PIC-CALC计算多态信息含量（PIC）。其筛选出17对微卫星引物特征如表1：
表1 17对胭脂鱼微卫星标记特征
三） 胭脂鱼微卫星荧光标记的合成和PCR扩增
将已筛选的17对多态性高胭脂鱼微卫星正向引物5’加上荧光标志（HEX/FAM），按照以下体系PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃再延伸10min4℃保存产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步检测后，然后每2对引物扩增的PCR产物混合之后读取等位基因值。
表2 胭脂鱼亲子鉴定PCR反应体系
| 反应物（Reactant） | 体积(μL)Volume |
| 10×PCR Buffer（15 mM Mg2+） | 3.0 |
| Mg2+（25 mmol/L） | 0.5 |
| dNTPs（10 mM） | 1.0 |
| Primer（F.R） | 各0.5 |
| rTaq Enzyme（5 U/μL） | 0.4 |
| Template（1000 ng/μL） | 1.0 |
| ddH2O | 18.1 |
| Total | 25 |
四） 胭脂鱼亲子鉴定技术的建立
胭脂鱼全人工繁殖后代挑选一组个体单独进行受精孵化养殖，利用酚氯法提取30个个体作为子代群体，同时选取其他繁殖亲本个体10尾作为候选亲本用于建立亲子鉴定体系。利用软件cervus统计等位基因数、杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、平均排除概率、以及累积排除概率如表3。
表3：17个微卫星标记等位基因数、杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、平均排除概率、以及累积排除概率
| 位点 | k | Ho | He | PIC | NE-1P | NE-2P | NE-PP | NE-I | NE-SI |
| Mas1 | 3 | 0.700 | 0.562 | 0.456 | 0.846 | 0.743 | 0.615 | 0.297 | 0.547 |
| Mas2 | 3 | 1.000 | 0.531 | 0.411 | 0.863 | 0.781 | 0.67 | 0.339 | 0.573 |
| Mas3 | 6 | 1.000 | 0.747 | 0.696 | 0.666 | 0.49 | 0.303 | 0.111 | 0.409 |
| Mas4 | 6 | 0.900 | 0.644 | 0.565 | 0.784 | 0.638 | 0.474 | 0.204 | 0.483 |
| Mas5 | 4 | 1.000 | 0.66 | 0.594 | 0.769 | 0.607 | 0.435 | 0.179 | 0.469 |
| Mas6 | 7 | 0.667 | 0.527 | 0.464 | 0.856 | 0.716 | 0.559 | 0.286 | 0.561 |
| Mas7 | 5 | 0.925 | 0.648 | 0.578 | 0.777 | 0.621 | 0.451 | 0.191 | 0.478 |
| Mas8 | 7 | 0.538 | 0.603 | 0.52 | 0.81 | 0.675 | 0.517 | 0.239 | 0.512 |
| Mas9 | 4 | 0.650 | 0.556 | 0.491 | 0.846 | 0.702 | 0.548 | 0.262 | 0.541 |
| Mas10 | 6 | 0.975 | 0.646 | 0.57 | 0.781 | 0.632 | 0.466 | 0.199 | 0.481 |
| Mas11 | 4 | 0.700 | 0.64 | 0.556 | 0.796 | 0.654 | 0.502 | 0.211 | 0.487 |
| Mas12 | 4 | 0.650 | 0.636 | 0.554 | 0.799 | 0.656 | 0.503 | 0.213 | 0.489 |
| Mas13 | 7 | 0.975 | 0.723 | 0.664 | 0.704 | 0.533 | 0.355 | 0.132 | 0.426 |
| Mas14 | 5 | 0.632 | 0.63 | 0.551 | 0.796 | 0.651 | 0.49 | 0.214 | 0.492 |
| Mas15 | 7 | 0.775 | 0.68 | 0.634 | 0.73 | 0.55 | 0.354 | 0.145 | 0.451 |
| Mas16 | 9 | 0.697 | 0.695 | 0.643 | 0.721 | 0.544 | 0.353 | 0.141 | 0.443 |
| Mas17 | 10 | 0.650 | 0.709 | 0.649 | 0.714 | 0.545 | 0.363 | 0.141 | 0.435 |
以30个个体作为子代群体，假设10个候选亲本均为这30个子代个体的亲本，用筛选出的17个胭脂鱼微卫星进行模拟亲子鉴定，抽样10000次，以父母本均不知进行建模分析，同时选取其他繁殖亲本个体10尾作为候选亲本用于建立亲子鉴定体系分别以母本或父本已知、父母本均已知和父母本均未知建模进行亲子鉴定分析，初步结果显示，在双亲未知时，17个位点累积排除概率为0.98746106，在双亲之一的已知的情况下，17个位点累积排除概率为0.99971843，在双亲都已知的情况下，17个位点累积排除概率为0.9999988。30个子代个体均准确找到亲本，其30个子代个体的亲子鉴定结果如表4所示。
表4：30个子代个体亲子鉴定结果
表4：30个子代个体亲子鉴定结果
上述30个个体亲子鉴定结果如表4所示，其中LOD值为亲子指数（paternity index）的对数值，LOD大于0的意义是，与任意亲本相比，候选亲本最有可能是真实的亲代。上述结果表明30个个体均准确的找到了真正的亲本5487，以上分析结果证实这17个胭脂鱼微卫星标记用于胭脂鱼亲子鉴定是可行的。
综上所述利用上述方法，可以实现胭脂鱼的亲子鉴定，根据方法中所用试剂组成用于胭脂鱼亲子鉴定的试剂盒。试剂盒（100次规格）包括一下试剂如表5。
表5：胭脂鱼亲子鉴定试剂盒
| 名称 | 浓度 | 剂量（ul） |
| 10×PCR Buffer | 10mM/L | 300 |
| MgCl2 | 25 mmol/L | 50 |
| dNTPs | 10 mM/L | 100 |
| 17个微卫星标记（F.R） | 10 mM/L | 50 |
| rTaq Enzyme | 5 U/μL | 40 |
| ddH2O | 2000 |
按上述剂量对试剂盒中的各组分分别进行包装组成胭脂鱼亲子鉴定试剂盒。
Claims (6)
1.胭脂鱼亲子鉴定的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤
（1）、胭脂鱼个体DNA提取：提取胭脂鱼亲本和子代DNA备用；
（2）、胭脂鱼微卫星标记的筛选：将69对微卫星标记合成非荧光标记引物之后PCR扩增，初步筛选分离多态性高的的引物进一步进行温度梯度筛选并进行群体分析；
（3）、胭脂鱼微卫星荧光标记的合成和PCR扩增：筛选得到17对多态性高并且能稳定扩增的微卫星标记，分别标上2种荧光引物，然后以每2对引物扩增的PCR产物混合之后读取等位基因值；
（4）、胭脂鱼亲子鉴定技术的建立：挑选一组胭脂鱼个体单独进行受精孵化养殖，提取30个个体DNA作为子代群体，同时选取繁殖亲本10尾用于候选亲本用于建立亲子鉴定体系，进行亲子鉴定分析。
2.根据权利要求1所述的胭脂鱼亲子鉴定的方法，其特征在于：步骤（3）中筛选出的17对胭脂鱼微卫星标记特征为：
。
3.根据权利要求1所述的胭脂鱼亲子鉴定的方法，其特征在于：步骤（2）中69对微卫星PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，最适退火温度下退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的胭脂鱼亲子鉴定的方法，其特征在于：步骤（3）中17对微卫星PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 3.0μL；25 mmol/L Mg2+0.5μL；dNTPs 1.0μL；Primer 各0.5μL；5 U/μL rTaq Enzyme 0.4μL；1000 ng/μL Template 1.0μL；ddH2O 18.1μL。
5.根据权利要求1所述的胭脂鱼亲子鉴定的方法，其特征在于：步骤（3）中17对微卫星PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃再延伸10min4℃保存产物。
6.胭脂鱼亲子鉴定的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中药品包括：10mM/L的10×PCR Buffer，25 mmol/L的MgCl2，10 mM/L的dNTPs，10 mM/L的17个微卫星标记（F.R），5 U/μL的rTaq Enzyme及ddH2O。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130904 |