CN108504751B - 微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物；(2)采集鲫鱼尾部鳍条，提取基因组DNA；(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；(5)分析ABI3730测序仪的峰值图。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述的微卫星标记具有特异性强，灵敏度高，扩增效率好的优点；(2)本发明所述方法较传统的染色体核型以及流式细胞方法操作性强，成本降低，时间缩短；(3)本发明所述方法在不损伤鱼体的前提下能够准确、快速的鉴定鲫鱼倍性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种采用分子标记的方法鉴定鲫鱼种质的方法，具体为微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用。
背景技术
鲫鱼在分类上属鲤科，鲤亚科，鲫属，广泛分布在中国、日本、朝鲜半岛，后移植引种驯化到印度、北美和世界各地，适应能力极强，目前世界各地均有分布。鲫有两个亚种：鲫(Carassius auratus)和银鲫(Carassius auratus gibelio)，以及红鲫、白鲫、金鱼等多个变种。它们染色体数目各异，倍性不一，目前认为：银鲫是三倍体物种(3n＝150+)，如方正银鲫；红鲫、白鲫和金鱼为二倍体物种(2n＝100)。在长江以及大型湖泊水域中，同时存在染色体数不同的鲫鱼，有二倍体，三部体，甚至还存在少量的四倍体群体，但很难通过外形以及侧线鳞数目来判断鲫鱼倍性。为了更好的利用和保护鲫鱼种质资源，需要对鲫鱼进行倍性鉴定。
鲫鱼多倍体的鉴定，可通过染色体制备或流式细胞仪来完成，虽然结果准确，但费时费力，特别是鉴定大批量的个体时，比如繁殖用的亲本，很难通过上述方法完成。此时更需要一种快速批量化的方法来鉴定鲫鱼多倍体。微卫星标记(Microsatellite)，是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列，其位点通过PCR扩增，ABI3730测序仪对荧光标记的DNA片段进行检测，结合分子量内标进行DNA片段长度计算，使STR分型变得高效快捷，结果也更加精确。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种快速、准确地鲫鱼倍性鉴定方法，本发明提供了微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用。
技术方案：微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物，选用的11对微卫星引物为：Caraur1，SEQ IDNO.1～2；Caraur 2，SEQ ID NO.3～4；Caraur3，SEQ ID NO.5～6；Caraur4，SEQ ID NO.7～8；Caraur5，SEQ ID NO.9～10；Caraur6，SEQ ID NO.11～12；Caraur7，SEQ ID NO.13～14；Caraur8，SEQ ID NO.15～16；Caraur9，SEQ ID NO.17～18；Caraur10，SEQ ID NO.19～20；Caraur11，SEQ ID NO.21～22；
(2)采集鲫鱼尾部鳍条，提取基因组DNA；
(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；
(5)分析ABI3730测序仪的峰值图。
优选的，步骤(1)中的引物采用荧光标记，具体为：Caraur1，Caraur4，Caraur7，Caraur8，Caraur11的荧光染料标记物为FAM；Caraur 2，Caraur3，Caraur5，Caraur6，Caraur9，Caraur10的荧光染料标记物为HEX。
11对微卫星引物的具体信息如表1所示：
表1 11对微卫星引物具体信息
优选的，步骤(3)中PCR扩增的体系为15μL，包括10×反应缓冲液1.5μL，Mg2+2mmol/L，dNTP 200μmol/L，上下游引物各0.1μmol/L，Taq酶0.25U，DNA 50ng～100ng，灭菌双蒸水补足至15μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃15s，56～60℃30s，72℃30s，28个循环；72℃延伸5min。
优选的，步骤(4)的具体操作为：采用琼脂糖凝胶电泳结果估算步骤(3)中PCR产物的浓度，并将产物稀释20倍后，与GeneScanTM 500LIZ内标，大小分别为35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500混匀，置于ABI3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测，同时检测两种STR类型，FAM和HEX标记；毛细管电泳反应体系为：20倍稀释的PCR产物2μL，超纯去离子甲酰胺8μL，GeneScanTM 500LIZ的分子量标记0.085μL。
优选的，步骤(5)中峰值图的分析标准为：11对引物中，至少1对引物的结果出现3个峰值时，为三倍体鲫鱼，至少1对引物的结果出现2个峰值，且无3个峰值时，为二倍体鲫鱼。实际判断过程中，需结合多个微卫星标记的峰值图，判别鉴定鲫鱼个体倍性。
以上任一所述方法在鲫鱼种质鉴定中的应用。
有益效果：(1)本发明所述的微卫星标记具有特异性强，灵敏度高，扩增效率好的优点；(2)本发明所述方法较传统的染色体核型以及流式细胞方法操作性强，成本降低，时间缩短；(3)本发明所述方法在不损伤鱼体的前提下能够准确、快速的鉴定鲫鱼倍性。
附图说明
图1是Caraur1在家系2的个体中扩增峰值图；
图2是Caraur1在家系1的个体中扩增峰值图；
图3是Caraur11在家系1的个体中扩增峰值图；
图4是Caraur11在家系2的个体中扩增峰值图；
图5是1号家系样品的肾细胞染色体图；
图6是2号家系样品的肾细胞染色体图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
试验对象：选择太湖野生鲫鱼，一对一繁殖，构建12个全同胞家系，从每个家系后代中随机选择5尾，共计60尾鱼用于多倍性鉴定。
微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物，选用的11对微卫星引物为：Caraur1，SEQ IDNO.1～2；Caraur 2，SEQ ID NO.3～4；Caraur3，SEQ ID NO.5～6；Caraur4，SEQ ID NO.7～8；Caraur5，SEQ ID NO.9～10；Caraur6，SEQ ID NO.11～12；Caraur7，SEQ ID NO.13～14；Caraur8，SEQ ID NO.15～16；Caraur9，SEQ ID NO.17～18；Caraur10，SEQ ID NO.19～20；Caraur11，SEQ ID NO.21～22；
上述引物采用荧光标记，具体为：Caraur1，Caraur4，Caraur7，Caraur8，Caraur11的荧光染料标记物为FAM；Caraur 2，Caraur3，Caraur5，Caraur6，Caraur9，Caraur10的荧光染料标记物为HEX。
11对微卫星引物的具体信息如表1所示：
表1 11对微卫星引物具体信息
(2)采集待鉴别鲫鱼尾部的鳍条，置于1.5mL离心管中，加95％酒精保存。提取DNA时，用滤纸吸干鳍条上附着的酒精，剪碎，用E.Z.N.ATM Tissue DNA Kit(Omega Bio-tek)试剂盒提取基因组DNA；
(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增的体系为15μL，包括10×反应缓冲液1.5μL，Mg2+2mmol/L，dNTP 200μmol/L，上下游引物各0.1μmol/L，Taq酶0.25U，DNA50ng～100ng，灭菌双蒸水补足至15μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃15s，56～60℃30s，72℃30s，28个循环；72℃延伸5min。
(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；具体操作为：采用琼脂糖凝胶电泳结果估算步骤(3)中PCR产物的浓度，并将产物稀释20倍后，与GeneScanTM 500LIZ内标，大小分别为35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500混匀，置于ABI3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测，同时检测两种STR类型，FAM和HEX标记；毛细管电泳反应体系为：20倍稀释的PCR产物2μL，超纯去离子甲酰胺8μL，GeneScanTM 500LIZ的分子量标记0.085μL。
(5)分析ABI3730测序仪的峰值图。分析标准为：11对引物中，至少1对引物的结果出现3个峰值时，为三倍体鲫鱼，至少1对引物的结果出现2个峰值，且无3个峰值时，为二倍体鲫鱼。实际判断过程中，需结合多个微卫星标记的峰值图，判别鉴定鲫鱼个体倍性。
结果分析：试验的12个家系中，家系2，7，9的个体为二倍体，其余9个家系的个体为三倍体。以Caraur1、Caraur11鉴别家系1和家系2为鉴别代表例，结果如图1～4所示。
结合微卫星对12个鲫鱼家系分析的结果，从1号，2号，家系中随机选择鲫鱼样本，做头肾染色体核型分析。鲫鱼体腔注射PHA，16-36h后再注射秋水仙素溶液，4h后取头肾组织，低渗处理，预固定，固定，干燥，染色，自然干燥后镜检，选择分裂相好的多个染色体图片，计数，得到该个体的染色体数目。计数显示1号中的鲫鱼染色体数目为150条，而2号家系中的鲫鱼染色体数目为100条，这与微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的结果一致。图5，图6分别为1号家系和2号家系样品中的肾细胞染色体图。
染色体分析鲫鱼多倍性的结果与微卫星分析结果一致，这进一步证实了可用微卫星标记对鲫鱼进行多倍性鉴定。一个微卫星位点在一个样品上扩增峰值图如果是三个峰，则可判断此样品为三倍体，如果是一个峰或二个峰，则很难判断样品的倍性，所以需要运用多个微卫星位点对一个样品同时进行扩增。本方案中，11个微卫星位点扩增峰值图，均在1号，3号，4号，5号，6号，8号，10号，11号，12号等9个家系的不同个体中出现过三个峰，依此判读此9个家系为三倍体。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (4)
1.微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）开发微卫星序列，设计、筛选引物，选用的11对微卫星引物为：Caraur1，SEQ IDNO.1~2；Caraur 2，SEQ ID NO.3~4；Caraur3，SEQ ID NO.5~6；Caraur4，SEQ ID NO.7~8；Caraur5，SEQ ID NO.9~10；Caraur6，SEQ ID NO.11~12；Caraur7，SEQ ID NO.13~14；Caraur8，SEQ ID NO.15~16；Caraur9，SEQ ID NO.17~18；Caraur10，SEQ ID NO.19~20；Caraur11，SEQ ID NO.21~22；
（2）采集鲫鱼尾部鳍条，提取基因组DNA；
（3）以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；
（4）将步骤（3）获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；
（5）分析ABI3730测序仪的峰值图；
步骤（1）中的引物采用荧光标记，具体为：Caraur1，Caraur4，Caraur7，Caraur8，Caraur11的荧光染料标记物为FAM； Caraur 2，Caraur3，Caraur5，Caraur6，Caraur9，Caraur10的荧光染料标记物为HEX；
步骤（5）中峰值图的分析标准为：11对引物中，至少1对引物的结果出现3个峰值时，为三倍体鲫鱼，至少1对引物的结果出现2个峰值，且无3个峰值时，为二倍体鲫鱼。
2.根据权利要求1所述的微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，其特征在于，步骤（3）中PCR扩增的体系为15μL，包括10×反应缓冲液1.5 μL，Mg2+ 2mmol/L，dNTP 200μmol/L，上下游引物各0.1μmol/L，Taq酶0.25U，DNA 50 ng～100ng，灭菌双蒸水补足至15μL；PCR反应条件为：94℃ 3min；94℃ 15s，56～60℃ 30s，72℃ 30s，28个循环；72℃延伸5 min。
3.根据权利要求1所述的微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，其特征在于，步骤（4）的具体操作为：采用琼脂糖凝胶电泳结果估算步骤（3）中PCR产物的浓度，并将产物稀释20倍后，与GeneScanTM 500 LIZ内标，大小分别为35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500混匀，置于ABI3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测，同时检测两种STR类型，FAM和HEX标记；毛细管电泳反应体系为：20倍稀释的PCR产物2μL，超纯去离子甲酰胺8μL，GeneScanTM 500 LIZ的分子量标记0.085μL。
4.权利要求1～3任一所述方法在鲫鱼种质鉴定中的应用。
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| 《利用微卫星遗传标记探讨达氏鳇的多倍体倍性》;张小敏等;《动物学杂志》;20130820;第48卷(第4期);第509页，图1，表2 * |
| Identification of Triploid Individuals and Clonal Lines in Carassius Auratus Complex Using Microsatellites;ZhiyiBai et al;《International Journal of Biological Sciences》;20110318;第7卷(第3期);第280-281页，图1 * |
| ZhiyiBai et al.Identification of Triploid Individuals and Clonal Lines in Carassius Auratus Complex Using Microsatellites.《International Journal of Biological Sciences》.2011,第7卷(第3期),第280-281页，图1. * |
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