CN117737221A - 星突江鲽性别相关的特异性dna片段、引物、应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种星突江鲽性别相关的特异性DNA片段、引物、应用和试剂盒，属于分子生物学领域，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。利用所述引物对星突江鲽的DNA进行PCR扩增，在雄性个体中扩增出两条带，长度分别是1327bp和762bp；在雌性个体中扩增出一条带，为所述的762bp片段。本发明还提供包含所述引物用于鉴定星突江鲽遗传性别的试剂盒。本发明性别特异性分子标记引物可以准确、高效地鉴定出星突江鲽的遗传性别，鉴定方法简单易操作，所需成本低。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体的涉及一种星突江鲽性别相关的特异性DNA片段、引物、应用和试剂盒。
背景技术
星突江鲽属于鲽形目、鲽科、川鲽属。其性格温顺，对温度和盐度适应能力强，生活范围广，在海水和淡水中均可存活，适合车间、网箱和池塘多种养殖模式，是一种潜力巨大的鱼类养殖新品种。由于星突江鲽具有明显的性别二态性，雌性的生长速度比雄性快2～4倍，雌雄的养殖比例将直接影响水产养殖所产生的经济效益。但是其在幼体时，雌雄个体不易区分，并且没有异形性染色体，无法根据观察性染色体的形态来区分遗传性别，因此需要开发一种鉴定星突江鲽遗传性别的特异分子标记。
该标记的开发将促进星突江鲽性别分化机制的探索，有助于开展人工选育、繁殖以及性别控制育种技术的研究，提高水产养殖业的经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种星突江鲽性别相关的特异性DNA片段、引物、应用和试剂盒。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种星突江鲽性别相关的特异性DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列为SEQ IDNO:1所示。
SEQ ID NO:1所示核苷酸具体序列，长度为620bp：
gaggaagaatgccatgacgtataaattctgctgtcaaaagtaaagtgtttttgttgacagcactttttgtcatcgacacacccactcacttgttgtgaattttccaccaaattgacatgctgtattctcatgtggacacactcagaaattttacagaataaagtgccggcagggaaagtccctgaaaatgtctgactgactcgggcatttgagttcttacatacagcctcctcagggtttatctgcaggaaaatgtccagacttcaacacacaataactccggccactgctattgttctcaatcaaaacaataacaaaagacccctgctcttagtttgatgacaccatgaagcagtgttggatcgtgggagttgttaatggttcattgatgaggtactgaatcccaagttttattcacattatgcagcaaacaacactgagtgaacataatccattacgagtgactgttaactggccaactggctaacatcgtgttcttccttcgtcatatgatgttgtggaaataatttcagagacaggcaaagctacattaaaaatggatatgacgcaattggaaggcaacttagatataatgtccaattaccatgaatacattttga。
本发明还提供一对用于鉴定星突江鲽遗传性别的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
PSTEL-正向:5'-agtgaatgacctcagcagcc-3'(SEQ ID NO:4)；
PSTEL-反向:5'-gcatcaaggacgcagtaaat-3'(SEQ ID NO:5)。
本发明还提供上述引物的应用，所述应用方法为利用所述引物对星突江鲽的DNA进行PCR扩增，在雄性个体中扩增出两条带，长度分别是1327bp和762bp；在雌性个体中扩增出一条带，为所述的762bp片段。
SEQ ID NO:2所示核苷酸具体序列，长度为1327bp：
gtgatctgaacgtctgttagacgatttaagcttttattttattattttttccccccaaataaaatatgaaagggatctgatgtaattctattattatactgatactgccgccagttcatctgctagtggtattaccattgcctctactattcctaatgtcatgagacccgttacaaaagctatttcaccaaatctttattggatttgtttgtgaggattaacgaactgaagctgtttttagaagtgaacacccggaaatgtctgaaaaattggtcttgccacaggagattgttcaggacagacgctttcaggacaacagtcaacaattttggcctggttagggcatggaggaagaatgccatgacgtataaattctgctgtcaaaagtaaagtgtttttgttgacagcactttttgtcatcgacacacccactcacttgttgtgaattttccaccaaattgacatgctgtattctcatgtggacacactcagaaattttacagaataaagtgccggcagggaaagtccctgaaaatgtctgactgactcgggcatttgagttcttacatacagcctcctcagggtttatctgcaggaaaatgtccagacttcaacacacaataactccggccactgctattgttctcaatcaaaacaataacaaaagacccctgctcttagtttgatgacaccatgaagcagtgttggatcgtgggagttgttaatggttcattgatgaggtactgaatcccaagttttattcacattatgcagcaaacaacactgagtgaacataatccattacgagtgactgttaactggccaactggctaacatcgtgttcttccttcgtcatatgatgttgtggaaataatttcagagacaggcaaagctacattaaaaatggatatgacgcaattggaaggcaacttagatataatgtccaattaccatgaatacattttgagatttctctggttgttggaaccatttttgatgatattagtccacaagtcgtttttggaatttttaatggagaatagttacatgttatatcttccactgcatggctgtctcaagaaaattcacttttgcactctgcacgctcagtggctgtcatactggcagctctatgatatcccaaagatgctgatgagcaggaaatgctgagattgaaacgtgggttgatattgtaatttaatattgtgatactttattgagccatgcaggaacattttcgtcattcccctgtcctcatggaggtcagaccacaggcagagctacacaacaacactgctgcagagaggaagatatatgtagaaggggc。
SEQ ID NO:3所示核苷酸具体序列，长度为762bp：
accgtttgtcttagctggtgaatccctgaaccgtctgttagacgatttaagcttttattttattatttttttcccccccaaataaaatatgaaagggatctgatgtaattctattattatactgatactgccgccagttcatctgctagtggtattaccattgcctctactattcctaatgtcatgagacccgttacaaaagctatttcaccatatctttattggatttgtttggtgaggattaacgagctgaagctgttttagaagtgaacacccggaaatgtctgaaaaattggtcctgccacaggagattgttcaggtcagacgttttcaggacaacagtcgacaattttggcctggttagggcatgctggatttctctggttgttggaaccatttttgatgatattagtccacaagtcgtttttggaatttttaatggagaatagttatatgttatatcttccactgcatggctgtctcaagaaaattcacttttgcactctgcacgctcagtggctgtcatactggcagctctatgatatcccaaagatgctgatgagcaggaaatgctgagattgaaacgtgggttgatattgtaatttaatattgtgatactttattgagccctgcaggaacattttcgtcattcctctgtcctcatggaggtcagaccacaggcagagctacacaacaacactgctgcagagaggaagatatattgtagaagggtgcaggtgcaacatgctctggacttgctct。
本发明还提供鉴定星突江鲽遗传性别的试剂盒，所述试剂盒中包括所述引物对。
本发明与现有技术相比的有益效果：本发明性别特异性分子标记引物可以准确、高效地鉴定出星突江鲽的遗传性别，鉴定方法简单易操作，所需成本低，适合在育种工作中大规模检测。由于只需要采集鱼鳍，检测过程中对鱼体的伤害极低，有利于星突江鲽的性控育种和种质资源的保护。同时，有助于推动星突江鲽性别分化机制的研究，筛选性逆转个体，开展性控育种。
附图说明
图1为星突江鲽遗传性别鉴定的雄性和雌性电泳检测结果；
图2为SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3核苷酸序列比对图，SEQ ID NO:1为SEQ ID NO:2中独有的部分；
图3为星突江鲽的样本性腺组织学切片图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，结合附图1-3与具体实施案例对本发明的技术内容进行进一步的说明，所用的材料试剂均可从商业途径得到。所描述的实施案例仅是本发明一部分，不是全部的实施例。本发明的保护范围不受任何形式上的限制，在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
为了验证本发明的性别特异分子标记的准确性，将其在星突江鲽中进行验证。
星突江鲽样本取材：在养殖场挑选19尾星突江鲽性成熟个体。
性腺组织学判定：将19尾星突江鲽进行解剖，将性腺置于4％多聚甲醛中固定过夜，然后在10mM磷酸盐缓冲溶液中浸泡1小时。固定后用梯度乙醇进行脱水，将组织进行石蜡包埋，切成4um的切片，用伊红/苏木精染色后，在显微镜下观察，区分性别，雌性10尾、雄性9尾，如图3所示。
DNA提取：采集每个样本的鱼鳍，使用DNA提取试剂盒制备DNA样品，核酸定量仪对所提的DNA进行质量检测。
PCR扩增：将采集的星突江鲽DNA样本与上述引物进行PCR扩增。反应体系是50ul：上下游引物(10umol/L)各2ul，Rapid酶25ul，DNA模板(300-500ng/ul)1ul，超纯水20ul。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；95℃变性15s，退火温度Tm＝55℃复性15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸5min；12℃保存。
所述的引物为：
PSTEL-正向:5'-agtgaatgacctcagcagcc-3'；
PSTEL-反向:5'-gcatcaaggacgcagtaaat-3'。
扩增结果检测：PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测，分析其特异性。电泳结果如图1和图2所示。图1中的雄性个体扩增为所述SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3片段组合，长度分别为1327bp和762bp；雌性个体扩增为所述SEQ ID NO:3片段，长度为762bp。
本实施案例验证星突江鲽的性别特异分子标记引物扩增的PCR电泳结果与性腺组织学判定结果一致，如图3所示，证明此特异的分子标记可以准确鉴定出星突江鲽的遗传性别。本鉴定方法，操作简单，流程清晰，结果直观准确。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，并不限制本发明。根据本发明的内容进行同等替换和改变都在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种星突江鲽性别相关的特异性DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.一对用于鉴定星突江鲽遗传性别的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
3.权利要求2所述引物的应用，其特征在于，所述应用方法为利用所述引物对星突江鲽的DNA进行PCR扩增，在雄性个体中扩增出两条带，长度分别是1327bp和762bp；在雌性个体中扩增出一条带，为所述的762bp片段。
4.一种鉴定星突江鲽遗传性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求2所述引物。
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