CN116814809B - 棘胸蛙环境dna pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，属于分子生态学技术领域。该方法包括以下步骤：S01，获取棘胸蛙的环境DNA样本；S02，以环境DNA样本为模板，进行PCR扩增；S03，分析有无目标DNA片段，判断是否存在棘胸蛙。本发明的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，引物灵敏度高稳定性好，目的片段DNA序列具有物种特异性，可鉴定棘胸蛙。本发明的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，可以对于在环境样本中的棘胸蛙目的片段DNA进行高效且特异性的扩增，灵敏度高，特异性强。
Description
技术领域
本发明属于分子生态学技术领域，特别是涉及一种棘胸蛙环境DNA PCR检测方法。
背景技术
棘胸蛙又名石鸡，是我国特有的大型野生蛙，属国家二级重点保护水生野生动物。
环境DNA测序是一种迅速兴起的方法，可研究生物多样性并监测生态系统的改变。生物会将DNA释放到其周围环境中可在不破坏生态系统的情况下检测物种是否存在。从环境样本中捕获DNA，并对其进行保存、提取、扩增、测序和分类，进而确定取样环境中生物的分布状况。
CN113215275A公开了一种中华鲟环境DNA PCR检测方法，CN113832238A公开了一种拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测的引物和探针及其应用。对于在环境样本中检测出不同的物种，需要对目标DNA片段进行高效且特异性的扩增，引物序列是其中的关键。目前还没有棘胸蛙环境DNA PCR检测方法。
发明内容
本专利提出了一种棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，发现特定的引物可以有效检测出棘胸蛙的特异性DNA片段，无需对棘胸蛙进行捕获或观察，就可以确定某个区域是否存在棘胸蛙。
本发明的在于公开一种棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，包括以下步骤：
S01，获取棘胸蛙的环境DNA样本；
S02，以环境DNA样本为模板，进行PCR扩增；
S03，分析有无目标DNA片段，判断是否存在棘胸蛙。
在本发明的一些实施方式中，S02中，进行PCR扩增的引物序列SEQ ID NO:1-2为：
SEQ ID NO:1F:CTTTGGAGACCGCTGTAAAAGA；
SEQ ID NO:2R:TGAAAGTCTACTTCCAAAAGTGCAA。
在本发明的一些实施方式中，S03中，所述目标DNA片段为棘胸蛙的特异性DNA片段。
在本发明的一些实施方式中，，S01中，所述棘胸蛙的环境DNA样本为棘胸蛙栖息地的土壤或水。
在本发明的一些实施方式中，还包括对所述棘胸蛙的环境DNA样本的冷冻保存和扩增前的解冻步骤。
在本发明的一些实施方式中，还包括对所述棘胸蛙的环境DNA样本进行富集的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增的反应体系为20μL，其中10.0μL 2xRapid Tag Master Mix，7.0μL H2O，1.0μL引物F，1.0μL引物R，模板DNA1.0μL。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
在本发明的一些实施方式中，用1.0％琼脂糖凝胶电泳PCR产物，电泳结果在凝胶成像系统中拍照、保存。
有益效果：
本发明的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，引物灵敏度高稳定性好，目的片段DNA序列具有物种特异性，可鉴定棘胸蛙。
本发明的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，可以对于在环境样本中的棘胸蛙目的片段DNA进行高效且特异性的扩增，灵敏度高，特异性强。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
一种棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，包括以下步骤：
S01，获取棘胸蛙的环境DNA样本；
水样采集沿溪水流动方向按200m间距布设采样点，用采水器采集1L表层水样(水深约0.1-0.3m)，基于野外环境的变化性，每个断面采集3瓶平行水样，置于保温箱中冷藏保存。
水样充分混合后选用直径50mm，孔径0.45μm的混合纤维素滤膜(MCE)于24h之内完成抽滤，滤膜置于5mL无菌冻存管内于-20℃冷冻保存。每次抽滤时设置1个阴性对照用以鉴定有无外源DNA污染，所有实验器材在使用前后用10％漂白粉溶液浸泡消毒30min去除残留的DNA，并用无菌水(ddH2O)充分漂洗。
环境DNA(eDNA)的提取：用无菌剪刀将滤膜剪成约3mm2的小片，采用采用OMEGA提取试剂盒进行eDNA的提取，步骤遵照试剂盒附带指导说明。
S02，以环境DNA样本为模板，进行PCR扩增；
进行PCR扩增的引物序列SEQ ID NO:1-2为：
SEQ ID NO:1F:CTTTGGAGACCGCTGTAAAAGA；
SEQ ID NO:2R:TGAAAGTCTACTTCCAAAAGTGCAA
所述PCR扩增的反应体系为20μL，其中10.0μL 2x Rapid Tag Master Mix，7.0μLH2O，1.0μL引物F，1.0μL引物R，模板DNA 1.0μL。
PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。用1.0％琼脂糖凝胶电泳PCR产物，电泳结果在凝胶成像系统中拍照、保存。
对每个eDNA样品进行3次重复的PCR扩增，设置阴性对照及阳性对照，产物经1.0％凝胶电泳检测目的片段条带。DNA分子量标准选用StarMarker D2000[100-2000bp]，若电泳结果中出现分子量约300bp左右的条带，则判定为棘胸蛙eDNA检测呈阳性。为避免假阳性和假阴性结果的出现，对所有PCR产物扩增结果进行一代测序验证。
S03，分析有无目标DNA片段，判断是否存在棘胸蛙。
传统监测方法需要分类学知识丰富的专家，且耗费更多的人力物力，eDNA方法具有高效、经济、对调查者要求不高、不损伤物种、不破坏栖息地环境等特点，由于eDNA持久性受到温度、光照等环境因素的影响，其检测精度只能是对一段时间物种存在的判断，且不能对个体进行绝对定量，也不能判断目标物种的年龄大小和发育状况、雌雄性别及健康状况。本实施例中选用的棘胸蛙eDNA引物特异性强，仅检测到水体中的棘胸蛙，未检测到其他伴生两栖动物。在有黑斑蛙、牛蛙分布的水体中进行了水样采集，PCR未扩增出相同位置的条带。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
Claims (8)
1.一种棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01，获取棘胸蛙的环境DNA样本；
S02，以环境DNA样本为模板，进行PCR扩增；
S03，分析有无目标DNA片段，判断是否存在棘胸蛙；
S02中，进行PCR扩增的引物序列SEQ ID NO:1-2为：
SEQ ID NO:1 F: CTTTGGAGACCGCTGTAAAAGA；
SEQ ID NO:2 R: TGAAAGTCTACTTCCAAAAGTGCAA。
2.根据权利要求1所述的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，S03中，所述目标DNA片段为棘胸蛙的特异性DNA片段。
3.根据权利要求1或2所述的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，S01中，所述棘胸蛙的环境DNA样本为棘胸蛙栖息地的土壤或水。
4.根据权利要求1或2所述的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，还包括对所述棘胸蛙的环境DNA样本的冷冻保存和扩增前的解冻步骤。
5.根据权利要求1或2所述的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，还包括对所述棘胸蛙的环境DNA样本进行富集的步骤。
6.根据权利要求1或2所述的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为20 μL，其中10.0μL 2 x Rapid Tag Master Mix，7.0 μL H2O，1.0 μL引物F，1.0 μL引物R，模板DNA 1.0 μL。
7.根据权利要求1或2所述的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10min，4℃保存。
8.根据权利要求1或2所述的棘胸蛙环境DNA PCR检测方法，其特征在于，用1.0%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，电泳结果在凝胶成像系统中拍照、保存。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008056325A2 (en) * | 2006-11-06 | 2008-05-15 | Universidade Do Porto | Process for animal species identification in samples with genetic material based on mitochondrial dna size variation |
| CN113355403A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-09-07 | 邢迎春 | 一种利用环境dna技术检测鱼类物种多样性的方法 |
| CN113215275A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-08-06 | 水利部中国科学院水工程生态研究所 | 中华鲟环境dna数字pcr检测方法 |
| CN113832238A (zh) * | 2021-10-13 | 2021-12-24 | 中国科学院水生生物研究所 | 拉萨裸裂尻鱼环境dna检测的引物和探针及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
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| 环境DNA技术在湖泊生物资源调查中的应用进展;徐欣靖;《水产养殖》;第43卷(第3期);第1-7页 * |
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