CN116200505A - 一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物及其应用，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；所述应用为在鉴定斜带石斑鱼中的应用。本发明提供的分子特异性标记引物可对斜带石斑鱼进行快速的分子鉴定，方法简单，准确性好，灵敏度高，是形态特征辨别斜带石斑鱼的有效辅助手段。相比传统调查方法由于生物残缺不全无法进行有效的鉴定，本发明的检测方法仅需要采集环境样本，通过检测环境中是否存在斜带石斑鱼的D‑loop区片段即可鉴定是否存在斜带石斑鱼，对生态系统造成的破坏性小，有利于斜带石斑鱼的快速鉴定，在斜带石斑鱼的种质资源多样性保护以及种质生态调查中有广泛的应用前景。

Description

一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物及其应用

技术领域

本发明涉及鱼类分子生物学领域，具体地，涉及一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物及其应用。

背景技术

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)属鲈形目(Perciformes)，石斑鱼属(Epinephelus)，俗称青斑，是一种名贵的海水鱼类，在东南亚沿海广泛养殖。由于斜带石斑鱼肉质鲜美，营养丰富，具有很高的经济价值，而且斜带石斑鱼生长迅速，在沿海地区渔业养殖中占有十分重要的地位。

不同种的石斑鱼在形态学特征上有很多相似之处，外部形态相似，尤其在鱼苗阶段，很难通过肉眼对其进行区分，这对斜带石斑鱼的种类鉴定带来极大困扰，给苗种场的鱼苗筛选和管理带来很多不便。因此，研发一种鉴定斜带石斑鱼种群的特异性引物，对于水产养殖中的鱼种鉴定具有重要意义。

环境DNA(eDNA)是指从水、土壤或沉积物等环境样品中提取的DNA。水体中游离的鱼类DNA可能来源于从鱼类身体上脱落或排出的皮肤、排泄物、精子和卵子等。利用物种特异分子标记检测环境样本中的物种分布及丰度，为鱼类物种检测提供了新方法，具有对鱼类种群无损伤、简单高效、灵敏度高等优点。该技术的成功实现取决于检测引物对某鱼类物种具有高效且特异性的扩增。一般情况下，近缘关系较近的同科甚至同属鱼类物种常分布于同一水域，常用的DNA条形码引物难以对其中一个物种进行精确地检测，因此，需要针对斜带石斑鱼开发高效且特异性扩增分子标记的检测引物，才能达到鉴定斜带石斑鱼的目的。

发明内容

为了解决现有技术中缺少用于鉴定斜带石斑鱼的高效且特异性扩增分子标记的检测引物，本发明提供了一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物。

本发明的第二个目的是提供所述引物在鉴定斜带石斑鱼中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定斜带石斑鱼的方法。

本发明的第四个目的是提供所述引物在制备用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示。

上述引物为针对斜带石斑鱼的线粒体基因组D-环区的序列设计得到的，所述D-环区即D-Loop区，Genbank号为KM377093.1，扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

上述引物在鉴定斜带石斑鱼中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种鉴定斜带石斑鱼的方法，使用上述核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物进行PCR扩增；检测PCR扩增产物。

优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系中，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物的终浓度分别为0.2μM～0.4μM。

更优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系中，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物的终浓度分别为0.4μM。

优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：92～98℃预变性2～4min；92～98℃变性25～35sec；54～58℃退火25～35sec，70～74℃延伸25～35sec，循环数为32～38；70～74℃延伸8～12min。

更优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30sec；56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环数为35；72℃延伸10min。

优选地，所述鉴定斜带石斑鱼的待测样本为环境样本或核酸样本。

更优选地，所述鉴定斜带石斑鱼的待测样本为环境样本，在使用所述引物进行PCR扩增前，先用直径为45～49mm孔径为0.1～0.3μm的硝酸纤维滤膜过滤所述环境样本，再用从过滤后的滤膜提取DNA。

进一步优选地，所述鉴定斜带石斑鱼的待测样本为环境样本，在使用所述引物进行PCR扩增前，先用直径为47mm孔径为0.2μm的硝酸纤维滤膜过滤所述环境样本，再用从过滤后的滤膜提取DNA。

进一步优选地，所述环境样本为水体样本。

更进一步优选地，所述水体样本为海水样本。

更优选地，所述核酸样本为DNA。

优选地，所述检测PCR扩增产物的方法包括琼脂糖凝胶电泳检测和/或测序。

更优选地，所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明通过琼脂糖凝胶电泳检测结果显示的条带即可判定待测样本中是否存在斜带石斑鱼。

优选地，所述琼脂糖凝胶电泳检测的方法为：配制1.5％的琼脂糖凝胶；PCR产物与核酸染料充分混合后，于电压120V且电流200mA电泳25min；凝胶成像，观察。

优选地，判定待测样本中是否存在斜带石斑鱼的标准为：有250bp的条带，则表明待测样本中存在斜带石斑鱼；没有250bp的条带，则表明待测样本中不存在斜带石斑鱼。

上述引物在制备用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述待鉴定的样本为环境样本或核酸样本。

更优选地，所述待鉴定的样本为环境样本.

进一步优选地，所述环境样本为水体样本。

更进一步优选地，所述水体样本为海水样本。

一种用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒，包含核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物和PCR反应试剂。

优选地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

S1.获得待测样本的DNA；

S2.以待测样本的DNA作为模板，使用上述引物和PCR反应试剂制备反应体系，进行PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，判定待测样本中是否含有斜带石斑鱼；

所述判定待测样本中是否存在斜带石斑鱼的标准为：有250bp的条带，则表明待测样本中存在斜带石斑鱼；没有250bp的条带，则表明待测样本中不存在斜带石斑鱼。

更优选地，所述待测样本为环境样本，则步骤S1中，先用直径为45～49mm孔径为0.1～0.3μm的硝酸纤维滤膜过滤所述环境样本，再用从过滤后的滤膜提取DNA。

进一步优选地，所述待测样本为环境样本，则步骤S1中，先用直径为47mm孔径为0.2μm的硝酸纤维滤膜过滤所述环境样本，再用从过滤后的滤膜提取DNA。

优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ IDNO:5～6所示的引物的终浓度分别为0.2μM～0.4μM。

更优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ IDNO:5～6所示的引物的终浓度分别为0.4μM。

优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：92～98℃预变性2～4min；92～98℃变性25～35sec；54～58℃退火25～35sec，70～74℃延伸25～35sec，循环数为32～38；70～74℃延伸8～12min。

更优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30sec；56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环数为35；72℃延伸10min。

优选地，所述琼脂糖凝胶电泳检测的方法为：配制1.5％的琼脂糖凝胶；PCR产物与核酸染料充分混合后，于电压120V且电流200mA电泳25min；凝胶成像，观察。

上述试剂盒在鉴定斜带石斑鱼中的应用也应在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的分子特异性标记引物可对斜带石斑鱼进行快速的分子鉴定，方法简单，准确性好，灵敏度高，是形态特征辨别斜带石斑鱼的有效辅助手段。相比传统调查方法由于生物残缺不全无法进行有效的鉴定，本发明的检测方法仅需要采集环境样本，通过检测环境中是否存在斜带石斑鱼的D-loop区片段即可鉴定是否存在斜带石斑鱼，对生态系统造成的破坏性小，有利于斜带石斑鱼的快速鉴定，在斜带石斑鱼的种质资源多样性保护以及种质生态调查中有广泛的应用前景。

附图说明

图1为3对引物的PCR扩增结果；M为DNA标准分子量标；gDNA为以斜带石斑鱼基因组DNA作为模板的扩增条带(阳性对照)；1～3为以海水样本的eDNA作为模板的扩增条带。

图2为PCR阳性条带的测序及分析结果；AC为阳性对照的测序结果；ref为斜带石斑鱼的线粒体基因组(Genbank：KM377093.1)D-环区(D-Loop区)的匹配上的部分序列。

图3为7种鱼的基因组DNA电泳图；M为DNA标准分子量标；1～7依次为以斜带石斑鱼基因组DNA、棕点石斑鱼基因组DNA、鞍带石斑鱼基因组DNA、清水石斑鱼基因组DNA、豹纹鳃棘鲈基因组DNA、驼背鲈基因组DNA和横带九棘鲈基因组DNA。

图4为7种鱼的PCR鉴定结果；M为DNA标准分子量标；1～7依次为以斜带石斑鱼基因组DNA、棕点石斑鱼基因组DNA、鞍带石斑鱼基因组DNA、清水石斑鱼基因组DNA、豹纹鳃棘鲈基因组DNA、驼背鲈基因组DNA和横带九棘鲈基因组DNA作为模板的PCR扩增条带。

图5为南海海域斜带石斑鱼的鉴定结果；M为DNA标准分子量标；1为以斜带石斑鱼基因组DNA作为模板的扩增片段(阳性对照)；2～4依次为以南海海水样本的eDNA作为模板的扩增片段。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1用于鉴定斜带石斑鱼的引物

一、实验方法

1、引物设计

针对斜带石斑鱼的线粒体基因组(Genbank：KM377093.1)进化速度最快的线粒体基因组高变异区(D-Loop区)的序列(SEQ ID NO:5)，设计得到3对引物，具体序列如下：

第一对引物：

上游引物EC-eDNA-04-F：5’-TGTAATTGTAATGGTTTGCGCAGT-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物EC-eDNA-04-R：5’-ACTGAAATATGTTATGTACCACCT-3’(SEQ ID NO:2)；

第二对引物：

上游引物EC-eDNA-05-F：5’-GTAATTGTAATGGTTTGCGCAGT-3’(SEQ IDNO:3)；

下游引物EC-eDNA-05-R：5’-TACTGAAATATGTTATGTACCACCT-3’(SEQ ID NO:4)；

第三对引物：

上游引物EC-eDNA-07-F：5’-TTAGATATATAATGTAATTGTAATGGTTTG-3’(SEQ ID NO:5)；

下游引物EC-eDNA-07-R：5’-TCTGGAATAAGTGCTCGGCA-3’(SEQ IDNO:6)。

2、引物鉴定

(1)斜带石斑鱼基因组DNA提取

剪取斜带石斑鱼的鳍条样品保存于无水乙醇中，利用基因组DNA提取试剂盒(厂家：Magen，货号：D3121-03)，从鳍条样品中提取得到斜带石斑鱼基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测合格后进行后续实验。

(2)环境DNA(eDNA)提取

于阳江市海陵岛，使用采水器采集3L南海底层的海水样本，将3L海水平均分为3份，分别用直径为47mm孔径为0.2μm的硝酸纤维滤膜，使用真空泵抽滤海水进行过滤，过滤后的滤膜于-20℃冷冻保存备用。

采用Hipure土壤DNA试剂盒(厂家：Magen)，从保存备用的滤膜中提取得到海水样本的eDNA，于-20℃冷冻保存。

(3)PCR扩增

分别以斜带石斑鱼基因组DNA(即gDNA，作为阳性对照)和海水样本的eDNA作为模板，用本实施例的3对引物进行PCR扩增。

PCR反应体系(总体积20μL)为：2×PCR DS Mix，10μL；10μM上游引物，0.8μL；10μM下游引物，0.8μL；模板，3μL；超纯水，5.4μL。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30sec；56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环数为35；72℃延伸10min。

PCR反应结束后，取3μL PCR产物与TS-GelRed核酸凝胶染料混合后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在电压为120V，电流为200mA进行电泳25min。

电泳结束后，通过凝胶成像系统检测条带扩增情况，并将对阳性条带进行测序分析。

二、实验结果

如图1所示，第一对引物(EC-eDNA-04-F(SEQ ID NO:1)和EC-eDNA-04-R(SEQ IDNO:2))可以从斜带石斑鱼基因组DNA中扩增出目的片段，但无法从海水样本的eDNA中扩增出目的片段；第二对引物(EC-eDNA-05-F(SEQ IDNO:3)和EC-eDNA-05-R(SEQ ID NO:4))可以从斜带石斑鱼基因组DNA中扩增出目的片段，但无法从海水样本的eDNA中扩增出目的片段；第三对引物(EC-eDNA-07-F(SEQ ID NO:5)和EC-eDNA-07-R(SEQ ID NO:6))从斜带石斑鱼基因组DNA和南海水样本的eDNA均扩增出目的片段。

如图2所示，测序结果显示，第三对引物(EC-eDNA-07-F(SEQ ID NO:5)和EC-eDNA-07-R(SEQ ID NO:6))PCR扩增得到目的片段长度为250bp，与斜带石斑鱼基因组DNA的D-loop序列(SEQ ID NO:7)的比对结果显示匹配度为98％，扩增得到目的片段与斜带石斑鱼基因组DNA的D-loop序列(SEQ IDNO:7)存在2％的偏差可能是由于斜带石斑鱼存在种群内遗传多态性导致的。与斜带石斑鱼基因组DNA的D-loop序列(SEQ ID NO:7)的匹配度在98％及以上，说明PCR扩增得到目的片段是斜带石斑鱼的D-loop区片段。

以上结果表明，引物对EC-eDNA-07-F(SEQ ID NO:5)和EC-eDNA-07-R(SEQ ID NO:6)的特异性好，灵敏性强，能够成功扩增斜带石斑鱼基因组DNA的D-loop区片段，可用于鉴定斜带石斑鱼，可以有效进行斜带石斑鱼近缘种间甚至同种不同群体间的鉴别。

实施例2斜带石斑鱼的鉴定

一、实验方法

1、样本DNA提取

分别剪取斜带石斑鱼、棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼、清水石斑鱼、豹纹鳃棘鲈、驼背鲈和横带九棘鲈的鳍条样品保存于无水乙醇中，利用基因组DNA提取试剂盒(厂家：Magen，货号：D3121-03)，提取得到斜带石斑鱼基因组DNA、棕点石斑鱼基因组DNA、鞍带石斑鱼基因组DNA、清水石斑鱼基因组DNA、豹纹鳃棘鲈基因组DNA、驼背鲈基因组DNA和横带九棘鲈基因组DNA，如图3所示，7种鱼的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行后续实验。

2、PCR扩增

分别以提取得到的斜带石斑鱼基因组DNA、棕点石斑鱼基因组DNA、鞍带石斑鱼基因组DNA、清水石斑鱼基因组DNA、豹纹鳃棘鲈基因组DNA、驼背鲈基因组DNA和横带九棘鲈基因组DNA作为模板，用本发明实施例1的引物对EC-eDNA-07-F(SEQ ID NO:5)和EC-eDNA-07-R(SEQ ID NO:6)进行PCR扩增。

PCR反应体系(总体积20μL)为：2×PCR DS Mix，10μL；10μM上游引物EC-eDNA-07-F(SEQ ID NO:5)，0.8μL；10μM下游引物EC-eDNA-07-R(SEQ ID NO:6)，0.8μL；模板，3μL；超纯水，5.4μL。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30sec；56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环数为35；72℃延伸10min。

PCR反应结束后，取3μL PCR产物与TS-GelRed核酸凝胶染料混合后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在电压为120V，电流为200mA进行电泳25min。

电泳结束后，通过凝胶成像系统检测条带扩增情况。

二、实验结果

如图4所示，在7种不同鱼的基因组DNA中，只有斜带石斑鱼基因组DNA可以扩增出250bp的目的条带，其他六种与斜带石斑鱼的近缘鱼类样品中并未扩增出相同大小的目的条带。

实施例3一种用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒

一、组成

包含本发明实施例1的引物对EC-eDNA-07-F(SEQ ID NO:5)和EC-eDNA-07-R(SEQID NO:6)，以及PCR反应试剂，所述PCR反应试剂可以是PCR预混液。

二、使用方法

(1)待测样本DNA的提取

待测样本DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或市购试剂盒提取待测样本DNA。

当待测样本为环境样本(水体样本)时，可以先用直径为47mm孔径为0.2μm的硝酸纤维滤膜和真空泵抽滤水体样本，进行过滤，再用市购试剂盒从过滤后的滤膜提取待测样本DNA。

(2)PCR反应体系(总体积20μL)

2×PCR DS Mix，10μL；10μM上游引物EC-eDNA-07-F(SEQ ID NO:5)，0.8μL；10μM下游引物EC-eDNA-07-R(SEQ ID NO:6)，0.8μL；模板，3μL；超纯水，5.4μL。

(3)PCR反应程序

95℃预变性3min；95℃变性30sec；56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环数为35；72℃延伸10min。

(4)琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在电压为120V，电流为200mA进行电泳25min。

电泳结束后，通过凝胶成像系统检测条带扩增情况。

(5)结果判读

当待测样本DNA扩增出250bp的条带，则表明待测样本中存在斜带石斑鱼；当待测样本DNA没有扩增出250bp的条带，则表明待测样本中不存在斜带石斑鱼。

实施例4一种用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒的应用

一、实验方法

1、样本采集

于珠海市万山群岛，使用采水器采集3L南海底层的海水样本

2、样本鉴定

(1)用直径为47mm孔径为0.2μm的硝酸纤维滤膜和真空泵抽滤海水样本进，行过滤，过滤后的滤膜于-20℃冷冻保存备用。

采用Hipure土壤DNA试剂盒(厂家：Magen)，从保存备用的滤膜中提取得到海水样本的eDNA，于-20℃冷冻保存。

(2)以实施例1所得斜带石斑鱼基因组DNA(作为阳性对照)和本实施例所得海水样本的eDNA作为模板，使用本发明实施例4的试剂盒进行PCR反应和琼脂糖凝胶电泳检测。

二、实验结果

如图5所示，本发明实施例4的试剂盒对采集到的海水样本进行检测，可以扩增出大小为250bp的目的片段，与斜带石斑鱼基因组DNA的扩增条带大小一致。表明珠海市万山群岛的南海海域存在斜带石斑鱼。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于鉴定斜带石斑鱼的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:5～6所示。

2.权利要求1所述引物在鉴定斜带石斑鱼中的应用。

3.一种鉴定斜带石斑鱼的方法，其特征在于，使用权利要求1所述引物进行PCR扩增；检测PCR扩增产物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物的终浓度分别为0.2μM～0.4μM。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述鉴定斜带石斑鱼的待测样本为环境样本或核酸样本。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：92～98℃预变性2～4min；92～98℃变性25～35sec；54～58℃退火25～35sec，70～74℃延伸25～35sec，循环数为32～38；70～74℃延伸8～12min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30sec；56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环数为35；72℃延伸10min。

8.权利要求1所述引物在制备用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述待鉴定的样本为环境样本或核酸样本。

10.一种用于鉴定斜带石斑鱼的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物和PCR反应试剂。

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