CN111454939A - 一种桑树基因组dna的高效提取方法 - Google Patents

一种桑树基因组dna的高效提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种桑树基因组DNA的高效提取方法，对比于经典的CTAB法，本发明的方法在裂解植物细胞之前增加了去杂质buffer清洗过程及优化了提取工艺。其中的去杂质buffer提供一个缓冲环境，一方面防止桑树叶片组织中核酸被破坏，另一方面利用PEG8000在温和条件下聚集沉降破裂组织中的多糖、多酚次级代谢产物等大分子，从而实现离心去除杂质的目的；后续依次经酚/氯仿/异戊醇溶液、氯仿/异戊醇溶液、异丙醇三次抽提可有效去除蛋白质等物质。大量实验表明，本发明的方法提取的桑树DNA不再粘稠，琼脂糖电泳检测结果中DNA对应的条带清晰锐利、无明显拖尾，提取过程也相对容易、高效；同进，提取的DNA满足后续建库、上机测序、PCR反应等相关操作要求。

Description

一种桑树基因组DNA的高效提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种桑树基因组DNA的高效提取方法。
背景技术
桑树属桑科桑属，为落叶乔木。桑叶呈卵形或宽卵形，先端尖或渐短尖，基部圆或心形，锯齿粗钝，幼树之叶常有浅裂、深裂，上面无毛，下面沿叶脉疏生毛，脉腋簇生毛。聚花果(桑椹)紫黑色、淡红或白色，多汁味甜。花期4月，果熟5-7月。桑叶是蚕的主要食物来源，经过长期的自然和人工选择，形成了极其丰富的桑树种质资源，在DNA分子水平研究桑树种质资源遗传变异越来越受到重视，采用常规育种方法结合分子标记辅助育种，可加快桑树育种进程。
基因组DNA的提取是进行分子标记技术研究的关键步骤之一，高质量基因组DNA的获取是进行桑树生物学方面研究的基础。由于不同植物体内次生代谢物及比例不同，它们可以与DNA结合形成复合物，因此，对于不同的物种甚至不同的材料，需要有针对性地选择不同的提取方法，以获得高质量的DNA样品。一般陆地植物的DNA提取方法已经非常成熟，常见的有传统的CTAB法、SDS法等。而桑树组织细胞含有大量的多糖、多酚、单宁、色素等复杂次生化合物，这会给DNA的提取造成干扰。实验发现，用CTAB法提取桑树基因组DNA时，都会出现在研磨加入裂解液后，提取液变得异常粘稠、最终得到的DNA存在大量的不溶物等问题，导致提取出的DNA无法进行后续建库、上机中的纯化、PCR等步骤。具体问题表现在：(1)磁珠纯化步骤中，磁珠抱团，最终无法洗脱下DNA；(2)PCR扩增中，由于杂质过多导致RCR体系中的各成分无法充分接触DNA，从而扩增不出目的片段。
因此，如何寻求一种桑树基因组DNA的高效提取方法，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种桑树基因组DNA的高效提取方法，该方法成本低、易操作、并最终获得高质量的桑树基因组，方便后续的建库、上机以及PCR反应。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种桑树基因组DNA的高效提取方法，包括：
(1)液氮研磨桑树叶片至粉末；
(2)以去杂质buffer清洗粉末，每次清洗过后离心去上清，直到上清不粘稠为止；
(3)向清洗过后的桑树粉末中加入裂解液，60-70℃裂解30-40min获得混合液a；所述裂解液配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；
(4)向混合液a中加入酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液a；
(5)向上清液a加入氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液b；
(6)向上清液b中加入异丙醇，充分混匀后静置、离心获得沉淀a；
(7)乙醇清洗沉淀a获得桑树基因组DNA。
进一步地，所述去杂质buffer的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM EDTA、体积分数为5％甘油、质量分数为10％PEG8000。
进一步地，控制每克桑树叶片粉末加入5-10mL所述的裂解液。
进一步地，所述步骤(4)加入的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液与混合液a等体积，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
进一步地，所述步骤(4)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
进一步地，所述步骤(5)加入的氯仿和异戊醇的混合溶液与上清液a等体积，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
进一步地，所述步骤(5)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
进一步地，所述步骤(6)加入的异丙醇的体积为上清液b的0.7-0.9倍。
进一步地，所述步骤(6)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
进一步地，所述步骤(7)乙醇的体积浓度为75％。
常规CTAB法提取桑树基因组DNA时，由于原始样本中含有大量的多糖、多酚、单宁、色素等复杂次生化合物，导致最终提取的DNA粘稠，存在大量的不溶物，电泳无法跑出胶孔，也无法进行后续建库、上机中的纯化、PCR等步骤。因此，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明桑树基因组DNA的高效提取方法对比于经典的CTAB法，在裂解植物细胞之前增加了去杂质buffer清洗过程及优化了提取工艺。其中的去杂质buffer提供一个缓冲环境，一方面防止破裂的桑树叶片组织中核酸被破坏，另一方面充分利用PEG8000在温和条件下聚集沉降破裂组织中的多糖、多酚次级代谢产物等大分子，从而实现离心去除杂质的目的；后续依次经酚/氯仿/异戊醇溶液、氯仿/异戊醇溶液、异丙醇三次抽提可有效去除蛋白质等物质。本发明通过杂质buffer清洗、裂解液处理与后续的不同抽提试剂的多次离心、沉淀后可以较好地从桑树叶片中提取得到高质量、高纯度的DNA。实验也表明，利用本发明的方法提取的DNA不再粘稠，琼脂糖电泳检测结果中DNA对应的条带清晰锐利、无明显拖尾，提取过程也相对容易、高效，同时也满足后续的建库、上机测序、PCR反应等相关操作的要求。
附图说明
图1为实施例1、对比例1提取的桑树基因组DNA琼脂糖电泳检测图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
一种桑树基因组DNA的高效提取方法，该方法包括如下步骤：
(1)取适量桑树叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取0.2g粉末放入离心管中。
(2)以去杂质buffer清洗粉末3次，每次添加去杂质buffer 2mL，每次清洗过后离心去上清，直到上清不粘稠为止。去杂质buffer的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mMEDTA、体积分数为5％甘油、质量分数为10％PEG8000。
(3)向清洗过后的桑树粉末中加入1mL裂解液，65℃裂解30-40min获得混合液a。裂解液配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。
(4)向混合液a中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后4℃、6000rpm离心10min获得上清液a，酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
(5)向上清液a加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后4℃、6000rpm离心10min获得上清液b，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
(6)向上清液b中加入其0.75倍体积的异丙醇，充分混匀后沉淀10min，然后4℃、6000rpm离心10min获得沉淀a；
(7)体积浓度为75％的乙醇清洗沉淀a两次获得桑树基因组DNA。
实施例2：
一种桑树基因组DNA的高效提取方法，该方法包括如下步骤：
(1)取适量桑树叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取0.2g粉末放入离心管中。
(2)以去杂质buffer清洗粉末2次，每次添加去杂质buffer 2mL，每次清洗过后离心去上清，直到上清不粘稠为止。去杂质buffer的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mMEDTA、体积分数为5％甘油、质量分数为10％PEG8000。
(3)向清洗过后的桑树粉末中加入1.5mL裂解液，60℃裂解30-40min获得混合液a。裂解液配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。
(4)向混合液a中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后25℃、9000rpm离心8min获得上清液a，酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
(5)向上清液a加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后25℃、9000rpm离心8min获得上清液b，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
(6)向上清液b中加入其0.7倍体积的异丙醇，充分混匀后沉淀10min，然后25℃、9000rpm离心8min获得沉淀a；
(8)体积浓度为75％的乙醇清洗沉淀a两次获得桑树基因组DNA。
实施例3：
一种桑树基因组DNA的高效提取方法，该方法包括如下步骤：
(1)取适量桑树叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取0.2g粉末放入离心管中。
(2)以去杂质buffer清洗粉末2次，每次添加去杂质buffer 2mL，每次清洗过后离心去上清，直到上清不粘稠为止。去杂质buffer的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mMEDTA、体积分数为5％甘油、质量分数为10％PEG8000。
(3)向清洗过后的桑树粉末中加入2mL裂解液，70℃裂解30min获得混合液a。裂解液配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。
(4)向混合液a中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后37℃、12000rpm离心5min获得上清液a，酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
(5)向上清液a加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后37℃、12000rpm离心5min获得上清液b，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
(6)向上清液b中加入其0.9倍体积的异丙醇，充分混匀后沉淀10min，然后37℃、12000rpm离心5min获得沉淀a；
(7)体积浓度为75％的乙醇清洗沉淀a两次获得桑树基因组DNA。
对比例1：
对比例1具体的实验过程同实施例1，只是不进行实施例1中的步骤(2)以去杂质buffer清洗粉末过程，而直接以裂解液处理桑树研磨粉末。
对比例2：经典CTAB法提取桑树基因组DNA
(1)2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。其中2％CTAB抽提缓冲溶液：CTAB 4g、NaCl 16.364g、1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)、0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解，再定容至200ml灭菌，冷却后加入0.2-1％β-巯基乙醇(400μL)摇匀即可。
(2)取少量桑树叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状；
(3)加入700μL的2％CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
(4)将磨碎液倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二。
(5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。
(6)冷却2min后，加入氯仿-异戊醇(体积比为24：1)至满管，剧烈振荡2～3min，使两者混合均匀。
(7)放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600μL的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
(8)10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
(9)10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
(10)60sec后，直立离心管，加入720μL的75％乙醇及80μL l5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
(11)放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；
(12)10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800μL 75％的乙醇，将DNA再洗30min；
(13)10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干)。
(14)加入50μL 0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；
(15)置于-20℃保存、备用。
结果分析：
观察实施例1-3及对比例1-2制备的桑树基因组DNA样品，并将实施例、对比例制备的DNA进行琼脂糖电泳检测，结果如表1所示。
表1实施例1-3、对比例1-2提桑树DNA结果比较
Figure BDA0002444558020000081
其中实施例1及对比例1对应的DNA的琼脂糖凝胶色谱分析如图1所示。其中条带1是实施例1提取的DNA条带，带型清晰锐利，无明显拖尾，可见较好的去除了桑树叶片组织中的蛋白、多酚、多糖等杂质。条带2是对比例1提取的DNA条带，表明裂解之前如果不添加去杂质buffer清洗粉末，提取的桑树DNA对应的条带有明显的拖带现象。
通过实施例与对比例的分析实验可知，针对桑树基因组DNA提取，本发明的方法相对于常规的CTAB法，提取的DNA不再粘稠，样本正常，提取过程也相对容易、高效，同时满足后续的建库、上机等相关操作对DNA样品的要求。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，包括：
(1)液氮研磨桑树叶片至粉末；
(2)以去杂质buffer清洗粉末，每次清洗过后离心去上清，直到上清不粘稠为止；
(3)向清洗过后的桑树粉末中加入裂解液，60-70℃裂解30-40min获得混合液a；所述裂解液配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；
(4)向混合液a中加入酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液a；
(5)向上清液a加入氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液b；
(6)向上清液b中加入异丙醇，充分混匀后静置、离心获得沉淀a；
(7)乙醇清洗沉淀a获得桑树基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述去杂质buffer的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM EDTA、体积分数为5％甘油、质量分数为10％PEG8000。
3.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，控制每克桑树叶片粉末加入5-10mL所述的裂解液。
4.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(4)加入的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液与混合液a等体积，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
5.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(4)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
6.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(5)加入的氯仿和异戊醇的混合溶液与上清液a等体积，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
7.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(5)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
8.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(6)加入的异丙醇的体积为上清液b的0.7-0.9倍。
9.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(6)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
10.根据权利要求1所述的一种桑树基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(7)乙醇的体积浓度为75％。
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