CN111575273A - 一种中药贝母dna提取试剂及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液和TE Buffer，其中核裂解液包括Tris‑HCl、EDTA、NaCl、PVP‑40、β‑巯基乙醇，与CTAB缓冲液组成相近；本发明DNA提取试剂适用于中药贝母DNA的提取，次生代谢产物去除率高，贝母DNA完整度好；本发明还提供了一种中药贝母DNA提取方法，采用上述提取试剂，以已有的CTAB法为基础，进行提取试剂配方的改进以及提取步骤的优化，能获高纯度、高质量的贝母总DNA，提取方法简单易控制，污染少。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种中药贝母DNA提取试剂及提取方法。
背景技术
目前，分子生物学技术已被广泛应用于中药材鉴定等方面，其中DNA的提取和纯化是中药材研究的重要基础，快速有效地大量提取高质量的DNA是是对中药材实施分子标记、基因文库构建、基因分离以及遗传转化及分子鉴定的重要前提。然而大多数中药材经过加工处理后，其中所含的DNA可能会受到不同程度的降解，不利于保持DNA的完整性；其次，中药材含有的次生代谢物很难与DNA分开，会直接影响中药材DNA的提取及后续研究。同种中药材用不同方法提取的DNA，其纯度和提取效率不尽相同，不同中药材用相同方法提取DNA的结果也不同。
贝母属为百合科多年生草本植物，大多数种类鳞茎供药用，有清热润肺，止咳祛痰的功效。该属全世界约有130种，我国有61种(含50个变种，5个变型)，其中具有药用价值的有20余种，常用药材品种主要为川贝母、平贝母、浙贝母和伊贝母等。贝母属植物种间形状交叉普遍，由于自然条件和地形多变，给传统形态分类带来很大不便，因此，对贝母DNA的分子检测成为有效分类的方法之一，而如何有效地提取高质量的贝母DNA是保证快速有效分子检测的前提和基础。目前，对于提取贝母DNA的方法一般有试剂盒法，CTAB法和SDS法。虽然试剂盒法操作简便且耗时短，但提取出的DNA完整性有时欠佳。因此，本发明在之前CTAB法的基础上进行改良，建立一种有效和高质量的贝母总DNA提取方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液和TE Buffer，适用于中药贝母DNA的提取，次生代谢产物去除率高，贝母DNA完整度好；
本发明的另一个目的是提供一种中药贝母DNA提取方法，采用上述提取试剂，以已有的CTAB法为基础，进行提取试剂配方的改进以及提取步骤的优化，能获高纯度、高质量的贝母总DNA，提取方法简单易控制，污染少。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液、TE Buffer，所述核裂解液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 90-110mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 8-12mL、NaCl 13-16g、PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。
优选地，所述核裂解液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 100mL、0.5mol/L pH8.0EDTA 10mL、NaCl 14.6g、PVP-40 20g、β-巯基乙醇2ml，ddH2O定容至1000mL。
Tris-HCl(pH8.0)主要是提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2 +离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使脱氧核糖核蛋白可溶。
进一步地，所述CTAB缓冲液包括：CTAB 28-32g、NaCl 75-85g、0.5mol/L pH8.0EDTA 35-45mL、1mol/L pH 8.0Tris-HCl 95-105mL、PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。
优选地，所述CTAB缓冲液包括：CTAB 30g、NaCl 81.9g、0.5mol/L pH 8.0EDTA40mL、1mol/L pH 8.0Tris-HCl 100mL、PVP-40 20g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，使其分离。
进一步地，所述TE Buffer包括：1M pH8.0 Tris-HCl Buffer 10mL、0.5MpH8.0EDTA 2mL，ddH2O定容至1000mL。
本发明的目的之二采用以下技术方案实现：
一种中药贝母DNA提取方法，包括：
核裂解液预处理：将研磨好的贝母粉与核裂解液混合，剧烈振荡后离心，弃上清液，得到样本裂解液；
CTAB缓冲液处理：向样本裂解液中加入CTAB缓冲液，振荡混匀后，进行恒温孵育。
进一步地，所述贝母粉的质量与核裂解液的体积比为(0.9-1.1)：(7.5-8.5)。
所述恒温孵育的条件为：60-70℃金属浴1.2-1.7h。
所述样本裂解液与所述CTAB缓冲液的体积比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
优选地，所述恒温孵育的条件为：65℃金属浴1.5h。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明中药贝母DNA提取方法在CTAB处理前先进行贝母核裂解预处理，核裂解液配方与后续的CTAB缓冲液近似，可减少DNA的降解；核裂解液中加入了PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)和β-巯基乙醇复合作用，在核裂解阶段即进行次生代谢产物的分离，去除效果更好，更能保持贝母DNA的完整性；CTAB缓冲液中添加PVP-40和β-巯基乙醇复合作用，进一步去除核酸提取液中的次生代谢产物。其中，PVP-40是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除待提取样本中的多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效防止酚氧化成醌，避免褐变，并使酚更多的与PVP-40络合，使酚更容易去除。
2、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物；它具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在该条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。该复合物在高盐溶液中(NaCl>0.7mol/L)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸从中分离出来。
3、本发明中药贝母DNA提取方法进一步优化了处理试剂、处理温度、处理时间等工艺参数，其中所有温度反应均在恒温金属浴上进行，温度恒定，控温准确、稳定性高并且节能无噪音，同时还可以避免因可能引入水浴锅的水而导致样品污染的问题。此外，恒温金属浴还可以设置固定转速的水平转动，无需手动颠倒混匀，使得样本细胞裂解效果更佳。
附图说明
图1为本发明实施例1-2和对比例2提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例1-2提取的DNA的PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液、TE Buffer，其中，核裂解液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 90-110mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 8-12mL、NaCl 13-16g、PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。其中β-巯基乙醇现用现加。
CTAB缓冲液包括：CTAB 28-32g、NaCl 75-85g、0.5mol/L pH 8.0EDTA 35-45mL、1mol/L pH 8.0Tris-HCl 95-105mL、PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。其中β-巯基乙醇现用现加。
TE Buffer包括：1M pH8.0 Tris-HCl Buffer 9-11mL、0.5M pH8.0 EDTA 1.8-2.2mL，ddH2O定容至1000mL。
一种中药贝母DNA提取方法，包括：
核裂解液预处理：将研磨好的贝母粉与核裂解液混合，剧烈振荡后离心，弃上清液，得到样本裂解液；其中，贝母粉的质量与核裂解液的体积比为(0.9-1.1)：(7.5-8.5)；
CTAB缓冲液处理：向样本裂解液中加入CTAB缓冲液，振荡混匀后，进行恒温孵育，其中，样本裂解液与CTAB缓冲液的体积比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)，恒温孵育的条件为：60-70℃金属浴1.2-1.7h。金属浴是在ThermoMixer F2.0设备上完成的。
实施例1
一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液、TE Buffer，其中：
核裂解液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 100mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 10mL、NaCl 14.6g、PVP-40 20g、β-巯基乙醇2ml，ddH2O定容至1000mL；
CTAB缓冲液包括：CTAB 30g、NaCl 81.9g、0.5mol/L pH 8.0EDTA 40mL、1mol/L pH8.0Tris-HCl 100mL、PVP-40 20g、β-巯基乙醇2ml，ddH2O定容至1000mL；
TE Buffer包括：1M pH8.0 Tris-HCl Buffer 10mL、0.5M pH8.0 EDTA 2mL，ddH2O定容至1000mL。
本实施例的中药贝母DNA通过以下方法提取：
(1)取已研磨好的样品100mg，向各样品管中加入800μL核裂解液剧烈振荡混匀5min，12000r/min离心3min，弃去上清液；
(2)重复步骤(1)1～2次，直至上清不粘稠；
(3)向样品管中加入800μL CTAB缓冲液，充分振荡混匀，65℃金属浴中孵育1.5h，期间设置每隔10min左右颠倒混匀数下；
(4)12000r/min离心10min，吸上清并置于新的2.0mL离心管中；
(5)加入700μL氯仿-异戊醇(24：1，V：V)，充分振荡混匀20s，12000r/min离心10mins，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中；
(6)重复步骤(5)，直至离心后两个液面之间没有沉淀；
(7)加入等体积预冷的异丙醇并上下颠倒混匀10次，-20℃放置30min；
(8)4℃、13000r/min离心15mins(富集沉淀的DNA)，弃上清；再短暂离心收集剩余液体，用微量移液器吸除剩余液体；
(9)加入700μL(4℃)预冷的75％乙醇，上下颠倒混匀数次，12000r/min离心1min，弃上清；
(10)加入700μL(4℃)预冷的100％乙醇，上下颠倒混匀数次，12000r/min离心1min，弃上清；
(11)待管中乙醇挥发完毕后，加入50μL的TE Buffer溶解DNA，如需立即使用贮存于4℃，短期贮存于-20℃，长期贮存于-80℃。
实施例2
一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液、TE Buffer，其中：
核裂解液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 90mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 8mL、NaCl13g、PVP-40 18g、β-巯基乙醇1.5ml，ddH2O定容至1000mL；
CTAB缓冲液包括：CTAB 28g、NaCl 75g、0.5mol/L pH 8.0EDTA 35mL、1mol/L pH8.0Tris-HCl 95mL、PVP-40 18g、β-巯基乙醇1.5ml，ddH2O定容至1000mL；
TE Buffer包括：1M pH8.0 Tris-HCl Buffer 10mL、0.5M pH8.0 EDTA 2mL，ddH2O定容至1000mL。
本实施例的中药贝母DNA提取方法与实施例1相同，此处不再详述。
实施例3
一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液、TE Buffer，其中：
核裂解液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 110mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 12mL、NaCl 16g、PVP-40 22g、β-巯基乙醇2.5ml，ddH2O定容至1000mL；
CTAB缓冲液包括：CTAB 32g、NaCl 85g、0.5mol/L pH 8.0EDTA 45mL、1mol/L pH8.0Tris-HCl 105mL、PVP-40 22g、β-巯基乙醇2.5ml，ddH2O定容至1000mL；
TE Buffer包括：1M pH8.0 Tris-HCl Buffer 10mL、0.5M pH8.0 EDTA 2mL，ddH2O定容至1000mL。
本实施例的中药贝母DNA提取方法与实施例1相同，此处不再详述。
对比例1
一种中药贝母DNA提取试剂，包括CTAB缓冲液、TE Buffer，其中：
CTAB缓冲液包括：CTAB 30g、NaCl 81.9g、0.5mol/L pH 8.0EDTA 40mL、1mol/L pH8.0Tris-HCl 100mL、PVP-40 20g、β-巯基乙醇2ml，ddH2O定容至1000mL；
TE Buffer包括：1M pH8.0 Tris-HCl Buffer 10mL、0.5M pH8.0 EDTA 2mL，ddH2O定容至1000mL。
本对比例的中药贝母DNA通过以下方法提取：
(1)取已研磨好的样品100mg，向各样品管中加入800μL CTAB缓冲液，充分振荡混匀，65℃金属浴中孵育1.5h，期间设置每隔10min左右颠倒混匀数下；
(2)12000r/min离心10min，吸上清并置于新的2.0mL离心管中；
(3)加入700μL氯仿-异戊醇(24：1，V：V)，充分振荡混匀20s，12000r/min离心10mins，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中；
(4)重复步骤(3)，直至离心后两个液面之间没有沉淀；
(5)加入等体积预冷的异丙醇并上下颠倒混匀10次，-20℃放置30min；
(6)4℃、13000r/min离心15mins(富集沉淀的DNA)，弃上清；再短暂离心收集剩余液体，用微量移液器吸除剩余液体；
(7)加入700μL(4℃)预冷的75％乙醇，上下颠倒混匀数次，12000r/min离心1min，弃上清；
(8)加入700μL(4℃)预冷的100％乙醇，上下颠倒混匀数次，12000r/min离心1min，弃上清；
(9)待管中乙醇挥发完毕后，加入50μL的TE Buffer溶解DNA，如需立即使用贮存于4℃，短期贮存于-20℃，长期贮存于-80℃。
对比例2
采用市场购买的试剂盒1(柱纯化法)和试剂盒2(磁珠法)提取中药贝母DNA；
采用本领域常规使用的未改良的CTAB法提取中药贝母DNA。
测试例
(1)对实施例1-2和对比例1-2提取得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
由图1可以看出实施例1-2提取出的贝母DNA，相比其它方法(图1中泳道1-3)，主带清晰(图1泳道4-5)，DNA完整性更好；而对比例1未经核裂解液处理的样本琼脂糖凝胶电泳检测无条带，即未提取到贝母DNA。
(2)用酶标仪检测实施例1-2和对比例2提取到的DNA的浓度和质量，结果如表2所示。
表2不同方法提取贝母DNA浓度和质量检测统计表
| 样本 | 260/280 | 260/230 | ng/μL |
| 试剂盒1 | 1.731 | 3.583 | 18.502 |
| 试剂盒2 | 1.759 | 15.095 | 7.057 |
| CTAB法改良前 | 1.232 | 0.863 | 2.594 |
| 实施例1 | 1.811 | 2.449 | 96.620 |
| 实施例2 | 1.804 | 2.378 | 59.612 |
由表2可以看出，相比常规的试剂盒提取和未改良的CTAB法，本发明实施例1和2提取到的贝母DNA浓度较高，实施例1提取的DNA浓度可高达96.62％，且实施例1和2提取的DNAOD260/280在1.8-1.9之间，OD260/230大于2.0，DNA纯度高，次生代谢产物、提取试剂中的有机物质等残余较少，DNA提取液质量较高。
(3)PCR检测实施例1-2提取的DNA，其中，
1)引物序列为：
CBITS1-qF2：CCGTGAACCATCGAGTC；
CBITS1-qR2：CCTGCTGGTGCTCCGTCCACC。
2)PCR反应体系如表1所示。
表1 PCR反应体系
3)阴性对照
阴性对照采用ddH2O为模板，其余成分与表1相同。
阳性对照采用已明确可检测出片段的贝母DNA样本为模板，其余成分与表1相同。
4)PCR反应条件：94℃，4min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s，32个循环；72℃，10min；4℃hold。
PCR反应完成后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR产物，结果如图2所示。由图2可以看出，本发明实施例1-2提取的DNA均可获得清晰地目的条带。
上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种中药贝母DNA提取试剂，其特征在于，包括核裂解液、CTAB缓冲液、TE Buffer，所述核裂解液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 90-110mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 8-12mL、NaCl13-16g、PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。
2.根据权利要求1所述的中药贝母DNA提取试剂，其特征在于，核裂解液包括：1mol/LpH 8.0Tris-HCl 100mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 10mL、NaCl 14.6g、PVP-40 20g、β-巯基乙醇2ml，ddH2O定容至1000mL。
3.根据权利要求1所述的中药贝母DNA提取试剂，其特征在于，所述CTAB缓冲液包括：CTAB 28-32g、NaCl 75-85g、0.5mol/L pH 8.0EDTA 35-45mL、1mol/L pH 8.0Tris-HCl 95-105mL、PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。
4.根据权利要求3所述的中药贝母DNA提取试剂，其特征在于，所述CTAB缓冲液包括：CTAB 30g、NaCl 81.9g、0.5mol/L pH 8.0 EDTA 40mL、1mol/L pH 8.0 Tris-HCl 100mL、PVP-40 20g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。
5.根据权利要求1所述的中药贝母DNA提取试剂，其特征在于，所述TE Buffer包括：1MpH8.0 Tris-HCl Buffer 10mL、0.5M pH8.0 EDTA 2mL，ddH2O 定容至1000mL。
6.一种中药贝母DNA提取方法，其特征在于，包括：
核裂解液预处理：将研磨好的贝母粉与权利要求1或2所述的核裂解液混合，剧烈振荡后离心，弃上清液，得到样本裂解液；
CTAB缓冲液处理：向样本裂解液中加入权利要求3或4所述的CTAB缓冲液，振荡混匀后，进行恒温孵育。
7.根据权利要求6所述的中药贝母DNA提取方法，其特征在于，所述贝母粉的质量与核裂解液的体积比为(0.9-1.1)：(7.5-8.5)。
8.根据权利要求6所述的中药贝母DNA提取方法，其特征在于，所述恒温孵育的条件为：60-70℃金属浴1.2-1.7h。
9.根据权利要求6所述的中药贝母DNA提取方法，其特征在于，所述样本裂解液与所述CTAB缓冲液的体积比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
10.根据权利要求8所述的中药贝母DNA提取方法，其特征在于，所述恒温孵育的条件为：65℃金属浴1.5h。
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