CN105861494B - 一种制备鱼类肠壁黏液菌群dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法，该方法包括：利用化学方法与物理方法的共同作用，使黏液与肠壁分开，使黏液中的细胞充分分散到溶液中；利用过滤法将细菌细胞与宿主细胞分离开，获得肠壁黏液菌群混合液；利用裂解液对肠壁黏液菌群进行裂解，获得含有核酸的裂解液；进一步利用RNase A、蛋白酶K等对含有核酸的裂解液进行提纯，获得鱼类肠壁黏液菌群DNA。此方法操作简便，制备的DNA收率高、纯度高、质量好，DNA信息更加全面、完整、准确。

Description

一种制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法。
背景技术
鱼类肠道内共附生着大量的已知和未知的微生物，形成一个特定的微生态群落，对宿主的生长、发育、免疫调节、营养吸收等方面有着极其重要的作用（Glad et al.2010）。鱼类肠道菌群主要由专性厌氧菌、兼性厌氧菌和好氧菌共同组成，其中：1）厌氧菌主要粘附在紧贴肠壁黏液层中，为肠道优势菌群，与宿主是共生关系，具有抵制病原菌入侵和促进营养吸收的作用，如：乳酸菌和双歧杆菌等；2）兼性厌氧菌主要粘附在肠壁黏液靠肠腔侧，为肠道非优势菌群，与宿主共栖，多为条件致病菌，如：大肠杆菌和肠球菌等。一般情况下，这些菌群在宿主肠道微生态平衡时是无害的，但在特定条件下会具有侵袭性，危害宿主健康，导致发病；3）好氧菌主要游动于肠腔，多为过路菌。因此，研究鱼类肠壁黏液菌群的结构和功能，对鱼类的健康养殖具有重要的意义。
近年来，分子生物学及高通量测序技术的发展和变革开辟了微生物功能和生态学研究的新途径。宏基因组学能够直接对特定环境中所有物种的基因组DNA进行遗传分析。利用宏基因组学不仅能够对环境中的菌群结构特征进行精确分析，还能够获得大量的功能基因，并对环境微生物所特有的代谢功能进行鉴定(Simon & Daniel, 2011)。而应用宏基因组学或传统分子生物学研究鱼类肠壁黏液菌群的前提是获得菌群基因组总DNA，因此有效提取群落中各种类型微生物的DNA，是客观反映群落微生物多样性的基础。但是，目前提取鱼类肠壁黏液菌群DNA存在着一些亟待解决的关键问题，包括：1）鱼类肠壁黏液细菌表面包裹着一层黏液，致使细菌在溶液中不易分散，不利于后续基因组DNA的提取，导致提取的菌群总DNA收率不高，甚至不能真实反映肠壁黏液细菌的种类和数量；2)由于肠壁黏液与肠壁粘结紧密，使得肠壁黏液取样难度高，在提取鱼类肠壁黏液菌群DNA的过程中通常会混入大量的宿主DNA，导致提取的菌群总DNA纯度较低，使得测序结果掺入大量无用的干扰数据，极大地增加后续信息分析的处理难度，甚至不利于后续PCR扩增等分子操作；3)提取的鱼类肠道菌群DNA电泳条带常常拖带或弥散严重，不利于后续宏基因组测序研究。
因此，鱼类肠壁黏液菌群DNA的制备方法有待进一步的改进。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种能够高效制备得到纯度高、浓度高、质量好的鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法，该方法包括以下步骤：
1)在无菌条件下，用75%酒精清洗鱼体表面，用无菌剪刀和镊子解剖取出肠道，所取鱼肠道用75%酒精消毒表面，再用PBS 缓冲液清洗肠道表面3~5遍；
2)用无菌剪刀将所述肠道纵向剪开，使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部8~12次，去除肠道中的粪便污水等内容物，得到去除内容物的肠道；
3)用无菌剪刀将所述去除内容物的肠道剪成小段，放入50 mL离心管中，加入PBS-ET 缓冲液、蓖麻油、石英砂，置于涡旋振荡仪上振荡，得到含肠混合物；
4)将所述含肠混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，所得滤液即为获得肠壁黏液菌群混合液；
5)直接向所述肠壁黏液菌群混合液中加入裂解液进行细胞裂解；得到含核酸的裂解液；
6)向所述含核酸的裂解液中加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理30~60min，RNase A进行处理，得到含DNA的处理液1；
7)向所述含DNA的处理液1中加入50 µL20mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理30~60min，蛋白酶K进行处理，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上清，得到含DNA的处理液2；
8)向所述含DNA的处理液2中加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇混合液，苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1，充分混匀后，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上层液，得到含DNA的处理液3；
9)向所述含DNA的处理液3中加入等体积氯仿:异戊醇混合液，氯仿:异戊醇体积比=24:1，充分混匀后，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上层液，得到含DNA的处理液4；
10)向所述含DNA的处理液4中加入0.6~0.8倍体积异戊醇混合均匀，-20℃放置1~2h后，8000~10000 rpm离心15~30 min后，弃上清得到的沉淀用70%酒精洗涤2~3遍，即获得所述鱼类肠壁黏液菌群DNA。
其中，所述步骤2）中使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部8~12次，当PBS 缓冲液冲洗肠道内部次数<8次，肠道中的粪便污水等内容物清除不干净；当PBS 缓冲液冲洗肠道内部次数>12次，肠壁黏液可能会有少许损失。
所述步骤3)用无菌剪刀将所述去除内容物的肠道剪成小段，取3~5 g肠小段放入50mL离心管中，加入10~15 mLPBS-ET 缓冲液、1~2 mL蓖麻油、6~10 g石英砂，置于涡旋振荡仪上，3000 rmp振荡2~3 min，1500 rmp振荡5~7 min，得到含肠混合物；并且所述PBS-ET 缓冲液的成分为0.5wt.% Twen-20、10 mmol/LEDTA、137 mmol/LNaCl、2.7 mmol/LKCl、10mmol/LNa2HPO4、2 mmol/LKH2PO4，所述蓖麻油可以替换为橄榄油或茶籽油，所述石英砂为40目~100目的石英砂。
所述的PBS 缓冲液为137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2mmol/L KH2PO4。
由于鱼类肠壁黏液细菌表面包裹着一层黏液，且黏液与肠壁粘结紧密，使得鱼类肠壁黏液菌群DNA的提取难度很大。本发明中的PBS-ET 缓冲液可以有助于细胞分散，保护核酸免于降解；蓖麻油等油类起乳化、分散、润滑、溶化等作用，帮助肠壁黏液与肠壁分离，帮助细菌从黏液均匀分散到溶液中，以及避免细菌在石英砂的研磨作用下裂解；石英砂起机械研磨作用，帮助细菌从黏液中分散开，帮助蓖麻油乳化。微生物细胞在化学方法（PBS-ET 缓冲液、蓖麻油）和物理方法（石英砂涡旋振荡）共同作用下，可以充分从鱼类肠壁黏液中释放分散到溶液中，有利于后续基因组DNA的提取，同时进一步提高细菌基因组DNA提取效率以及信息的准确性和完整性。此外，当振荡速度为3000 rmp，振荡时间>5 min时，细菌容易破碎。
同样，由于肠壁黏液与肠壁粘结紧密，导致解剖肠道取肠壁黏液的操作难度很高。常规取样中，力度过轻容易导致紧贴肠壁的黏液未能完整取到，而力度过重又容易导致样品中混入大量的宿主组织。本发明的取样过程操作简单，不仅肠壁黏液与肠壁能有效分离，并且操作过程中无需考虑是否有携带宿主组织。动植物细胞直径为10~100 μm，而细菌细胞直径为1~2 μm，本发明所述步骤4)将所述含肠混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，可以有效截留宿主等非微生物细胞，从而最大程度地降低了宿主DNA的污染，保证了肠壁黏液菌群DNA的纯度；同时运用100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜进行四级过滤，过滤阻力小、效率高，且微生物收率高，保证了肠壁黏液菌群DNA信息的全面性，对后续宏基因组测序研究等具有重要意义。若直接使用8µm滤膜进行单极过滤，会因为负荷太重极易堵塞，微生物收率低下。
鱼类肠壁黏液内定殖着含量丰富且结构复杂的微生物群落，其中难以裂解的细菌占一定比例。因此，本发明对常规SDS裂解液成分和用量进行修改，采用所述步骤5)中裂解液，其成分为6wt.% SDS、200 mmol/L NaCl、200 mmol/L Tris、20 mmol/L EDTA，并且所述加入裂解液的体积所述肠壁黏液菌群混合液体积的5~7倍，裂解温度为70℃，裂解时间为30~60 min。在此裂解液的作用下，细菌的裂解效果好，DNA释放完全，且细胞破碎后DNA不易降解，由此可以进一步提高制备肠壁黏液细菌DNA的效率以及纯度。
所述步骤6）向所述含核酸的裂解液中加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理30~60 min。由此可以进一步提高制备肠壁黏液细菌DNA的效率以及纯度。
肠壁黏液的主要成分是蛋白质，所述步骤7）向所述含DNA的处理液1中加入50 µL20 mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理30~60 min，离心取上清，可以高效去除肠壁粘液中的蛋白质以及所述步骤6）的RNase A，进一步提高制备肠壁黏液细菌DNA的效率以及纯度。
所述步骤8）中利用等体积苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）对含DNA的处理液2进行去蛋白等提纯步骤，离心得到含DNA的处理液3；所述步骤9）中利用等体积氯仿:异戊醇（24:1）进一步对含DNA的处理液3进行提纯，由此能够最大程度的去除含DNA的处理液中的杂质，进一步提高制备肠壁黏液细菌DNA的纯度和效率。
所述步骤10）中向所述含DNA的处理液4中加入0.6~0.8倍体积异戊醇，低温处理使DNA沉淀，得到的沉淀用70%酒精洗涤2~3遍。由此可以进一步提高制备肠壁黏液细菌DNA的收率以及纯度。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1. 由于鱼类肠壁黏液与肠壁粘结紧密，对其取样操作具有一定的难度，取样力度过轻容易导致紧贴肠壁的黏液未能完整取到，而力度过重又容易导致样品中混入大量的宿主组织。本发明的取样操作简单，只需分离出鱼体肠道，剖开肠道，用无菌PBS 缓冲液清洗去除肠道内容物即可，不需要考虑操作过程中肠壁黏液与肠壁分开以及是否有携带宿主组织的问题。
2. 本发明运用化学方法（PBS-ET 缓冲液、蓖麻油）与物理方法（石英砂涡旋振荡）的共同作用，可以实现肠壁黏液与肠壁的有效分离，同时有效解决被肠壁黏液包裹的细菌在液体中不能完全分散的问题。因此，本发明能获得较高浓度的细菌宏基因组DNA（平均收率可达2 μg/g肠），所得DNA信息更加全面、完整、准确。
3. 本发明利用100 μm、20μm、11 μm、8 μm的过滤膜进行四级过滤，可以有效将细菌细胞与鱼体宿主细胞分离开，保证了鱼类肠壁黏液细菌DNA的纯度，极大地减少了宿主和其它非微生物物质的干扰，有利于后续的宏基因组测序等研究，同时也极大地减轻了取样操作的难度。
4. 本发明直接向肠壁黏液菌群混合液中加入5~7倍的裂解液裂解，细胞裂解效果好，DNA释放完全；在RNase A、蛋白酶K、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）、氯仿:异戊醇（24:1）、异丙醇、乙醇等的作用下对DNA进行提纯，得到的宏基因组DNA质量好、纯度及浓度高，有利于后续宏基因组测序研究等操作。
附图说明
图1是根据本发明的实施例1、2、3、4制备得到的肠壁黏液菌群DNA电泳检测结果（M：λHindⅢ Marker，1：成鳗，2：草鱼，3：幼鳗，4：黑仔）
图2是根据本发明实施例1的成鳗肠壁黏液菌群DNA的纯度检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步地说明，所述是对本发明的解释而不是限制。
试剂
NaCI、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Twen-20、蓖麻油、EDTA(二钠盐)、Tris-base、SDS、RNase A、蛋白酶K、NaOH、盐酸、Tris饱和酚、氯仿(AR)、异戊醇(AR)、异丙醇(AR)、无水乙醇(AR)、琼脂糖、6×Loading buffer、λHindⅢ Marker
仪器
离心机、水浴锅、超净工作台、通风橱、分析天平、水浴锅（37°C、70°C）、通风橱、移液器（10 mL、1000 µL、200 µL、100 µL、10 µL）及相对应的吸头、真空泵、滤膜（100 µm、20 µm、11 µm、8 µm），50 mL及1.5 mL离心管、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、微波炉、尖头镊子，解剖剪、眼科剪、一次性培养皿(直径9 cm)。
实施例1
制备成鳗（体重>50 g的鳗鲡）肠壁黏液菌群DNA，具体包括以下步骤：
1)随机挑选成年健康的（无明显疾病特征，饮食正常）鳗鲡3只，平均体重约为200g，将其窒息致死；
2)在超净工作台下，首先使用75%的酒精清洗鳗鲡体表，随后利用无菌眼科剪从鳗鲡头部下方处将鳗鲡腹部剪开，并将鳗鲡肠道分离出来放入培养皿中，用75%酒精消毒肠道表面，再用无菌PBS 缓冲液清洗表面5遍，将肠道外壁上的残留的酒精、血液、脂肪等物质清洗下来；
3)随后用无菌眼科剪将鳗鲡肠道纵向剪开，使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部10次，去除肠道中的粪便污水等内容物；
4)用无菌眼科剪将清洗的肠道剪成小段，放入50 mL离心管中，加入15 mL PBS-ET缓冲液、1.5 mL蓖麻油、6 g石英砂，，置于涡旋振荡仪上，3000 rmp振荡3 min，1500 rmp振荡5 min；
5)混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，所得滤液即为获得肠壁黏液菌群混合液；
6)直接向上述肠壁黏液菌群混合液中加入6倍体积的裂解液（60 mL），70℃水浴60min；
7)加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理60 min；
8)加入50 µL 20 mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理60 min，10000 rpm 离心30 min，移液器取上清；
9)向上清中加入等体积（70 mL）的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），缓慢上下颠倒5min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
10)向上清中加入等体积（55 mL）氯仿:异戊醇（24:1），缓慢上下颠倒5 min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
11)加入0.8倍体积（35 mL）的冰预冷的异丙醇，上下颠倒使其充分混匀，放入-20℃低温冰箱中沉淀2小时，10000 rpm离心30 min，小心倒掉上清；
12)用15 mL冰预冷的70%乙醇清洗沉淀，10000 rpm离心30 min，重复清洗一次；
13)待酒精完全挥发后，加入200 μL TE缓冲液将沉淀完全溶解；
14)采用Nanodrop2000检测DNA纯度，检测结果为OD260/280=1.82，OD260/230=2.31；
15)采用TBS-380检测DNA浓度，DNA浓度为102 ng/μL；
16)采用1%琼脂糖凝胶电泳30min，凝胶成像系统检测提取DNA完整性，结果见图1，从图1可以看出，所提成鳗肠壁黏液菌群DNA电泳条带清晰，无拖尾、弥散现象，DNA完整、质量好。
17)取30 µL基因组DNA样品送上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组solexa测序，测序数据经处理后，共2495条contigs序列提交NCBI比对分析，比对结果见图2，由图2可知，本方法提取成鳗肠壁黏液菌群DNA结果较好，仅有3%宿主DNA污染及5%其它生物DNA污染，剩余高达92%为肠壁黏液微生物DNA，说明本发明实施例制备的鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法可以极大地减少了宿主和其他非微生物物质的干扰，有利于后续的宏基因组测序研究。
实施例2
制备草鱼肠壁黏液菌群DNA，具体包括以下步骤：
1)随机挑选成年健康草鱼1只，体重为1.2 Kg，将其窒息致死；
2)在超净工作台下，首先使用75%的酒精清洗草鱼体表，随后利用无菌剪刀从草鱼肛门处将草鱼腹部，并将草鱼的肠道分离出来放入培养皿中，用75%酒精消毒肠道表面，再用无菌PBS 缓冲液清洗表面5遍，将肠道外壁上的残留的酒精、血液、脂肪等物质清洗下来；
3)随后用无菌眼科剪将草鱼肠道纵向剪开，使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部10次，去除肠道中的粪便污水等内容物；
4)用无菌眼科剪将清洗的肠道剪成小段，取10 g放入50 mL离心管中，加入15 mLPBS-ET 缓冲液、2 mL蓖麻油、6 g石英砂，，置于涡旋振荡仪上，3000 rmp振荡3 min，1500rmp振荡5 min；
5)混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，所得滤液即为获得肠壁黏液菌群混合液；
6)直接向上述肠壁黏液菌群混合液中加入6倍体积的裂解液（60 mL），70℃水浴60min；
7)加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理60 min；
8)加入50 µL 20 mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理60 min，10000 rpm 离心30 min，移液器取上清；
9)向上清中加入等体积（70 mL）的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），缓慢上下颠倒5min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
10)向上清中加入等体积（55 mL）氯仿:异戊醇（24:1），缓慢上下颠倒5 min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
11)加入0.8倍体积（35 mL）的冰预冷的异丙醇，上下颠倒使其充分混匀，放入-20℃低温冰箱中沉淀2小时，10000 rpm离心30 min，小心倒掉上清；
12)15 mL冰预冷的70%乙醇清洗沉淀，10000 rpm离心30 min，重复清洗一次；
13)待酒精完全挥发后，加入200 μL TE缓冲液将沉淀完全溶解；
14)采用Nanodrop2000检测DNA纯度，检测结果为OD260/280=1.89，OD260/230=2.32；
15)采用TBS-380检测DNA浓度，DNA浓度为424.3 ng/μL；
16)采用1%琼脂糖凝胶电泳30 min，凝胶成像系统检测提取DNA完整性，结果见图1，从图1可以看出，所提草鱼肠壁黏液菌群DNA除轻微降解、少量RNA污染外，浓度较高，条带清晰。
实施例3
制备幼鳗（体重=10~50 g的鳗鲡）肠壁黏液菌群DNA，具体包括以下步骤：
1)随机挑选健康幼鳗（无明显疾病特征，饮食正常）鳗鲡8只，平均体重约为20 g，将其窒息致死；
2)在超净工作台下，首先使用75%的酒精清洗鳗鲡体表，随后利用无菌眼科剪从鳗鲡头部下方处将鳗鲡腹部剪开，并将鳗鲡肠道分离出来放入培养皿中，用75%酒精消毒肠道表面，再用无菌PBS 缓冲液清洗表面5遍，将肠道外壁上的残留的酒精、血液、脂肪等物质清洗下来；
3)随后用无菌眼科剪将鳗鲡肠道纵向剪开，使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部10次，去除肠道中的粪便污水等内容物；
4)用无菌眼科剪将清洗的肠道剪成小段，放入50 mL离心管中，加入15 mL PBS-ET缓冲液、1.5 mL蓖麻油、6 g石英砂，置于涡旋振荡仪上，3000 rmp振荡3 min，1500 rmp振荡5 min；
5)混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，所得滤液即为获得肠壁黏液菌群混合液；
6)直接向上述肠壁黏液菌群混合液中加入6倍体积的裂解液（55 mL），70℃水浴60min；
7)加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理60 min；
8)加入50 µL 20 mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理60 min，10000 rpm 离心30 min，移液器取上清；
9)向上清中加入等体积（65 mL）的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），缓慢上下颠倒5min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
10)向上清中加入等体积（48 mL）氯仿:异戊醇（24:1），缓慢上下颠倒5 min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
11)加入0.8倍体积（30 mL）的冰预冷的异丙醇，上下颠倒使其充分混匀，放入-20℃低温冰箱中沉淀2小时，10000 rpm离心30 min，小心倒掉上清；
12)15 mL冰预冷的70%乙醇清洗沉淀，10000 rpm离心30 min，重复清洗一次；
13)待酒精完全挥发后，加入200 μL TE缓冲液将沉淀完全溶解；
14)采用Nanodrop2000检测DNA纯度，检测结果为OD260/280=1.79，OD260/230=2.42；
15)采用TBS-380检测DNA浓度，DNA浓度为52.8 ng/μL；
16)采用1%琼脂糖凝胶电泳30min，凝胶成像系统检测提取DNA完整性，结果见图1，从图1可以看出，所提幼鳗肠壁黏液菌群DNA电泳条带清晰，无拖尾、弥散现象，DNA完整、质量好。
实施例4
制备黑仔（体重=2~10 g的鳗鲡）肠壁黏液菌群DNA，具体包括以下步骤：
1)随机挑选健康黑仔（无明显疾病特征，饮食正常）18只，平均体重约为8 g，将其窒息致死；
2)在超净工作台下，首先使用75%的酒精清洗鳗鲡体表，随后利用无菌眼科剪从鳗鲡头部下方处将鳗鲡腹部剪开，并将鳗鲡肠道分离出来放入培养皿中，用75%酒精消毒肠道表面，再用无菌PBS 缓冲液清洗表面5遍，将肠道外壁上的残留的酒精、血液、脂肪等物质清洗下来；
3)随后用无菌眼科剪将鳗鲡肠道纵向剪开，使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部10次，去除肠道中的粪便污水等内容物；
4)用无菌眼科剪将清洗的肠道剪成小段，放入50 mL离心管中，加入15 mL PBS-ET缓冲液、1.5 mL蓖麻油、6 g石英砂，，置于涡旋振荡仪上，3000 rmp振荡3 min，1500 rmp振荡5 min；
5)混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，所得滤液即为获得肠壁黏液菌群混合液；
6)直接向上述肠壁黏液菌群混合液中加入6倍体积的裂解液（55 mL），70℃水浴60min；
7)加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理60 min；
8)加入50 µL 20 mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理60 min，10000 rpm 离心30 min，移液器取上清；
9)向上清中加入等体积（65 mL）的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），缓慢上下颠倒5min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
10)向上清中加入等体积（45 mL）氯仿:异戊醇（24:1），缓慢上下颠倒5 min，使其充分混匀，静置5 min后，10000 rpm离心30 min，移液器取上清；
11)加入0.8倍体积（30 mL）的冰预冷的异丙醇，上下颠倒使其充分混匀，放入-20℃低温冰箱中沉淀2小时，10000 rpm离心30 min，小心倒掉上清；
12)15 mL冰预冷的70%乙醇清洗沉淀，10000 rpm离心30 min，重复清洗一次；
13)待酒精完全挥发后，加入200 μL TE缓冲液将沉淀完全溶解；
14)采用Nanodrop2000检测DNA纯度，检测结果为OD260/280=1.86，OD260/230=2.28；
15)采用TBS-380检测DNA浓度，DNA浓度为23.9 ng/μL；
16)采用1%琼脂糖凝胶电泳30 min，凝胶成像系统检测提取DNA完整性，结果见图1，从图1可以看出，所提黑仔肠壁黏液菌群DNA电泳条带清晰，无拖尾、弥散现象，DNA完整、质量好。
上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.一种制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，用75%酒精清洗鱼体表面，用无菌剪刀和镊子解剖取出肠道，所取鱼肠道用75%酒精消毒表面，再用PBS 缓冲液清洗肠道表面3~5遍；
（2）用无菌剪刀将所述肠道纵向剪开，使用PBS 缓冲液冲洗肠道内部8~12次，去除肠道中的粪便污水等内容物，得到去除内容物的肠道；
（3）用无菌剪刀将所述去除内容物的肠道剪成小段，放入50 mL离心管中，加入PBS-ET缓冲液、蓖麻油、石英砂，置于涡旋振荡仪上振荡，得到含肠混合物；
（4）将所述含肠混合物依次通过100 µm、20 µm、11 µm、8 µm的滤膜分级过滤，所得滤液即为获得肠壁黏液菌群混合液；
（5）直接向所述肠壁黏液菌群混合液中加入裂解液进行细胞裂解；得到含核酸的裂解液；
（6）向所述含核酸的裂解液中加入10 µL 10 mg/mL RNase A，37℃水浴处理30~60min，得到含DNA的处理液1；
（7）向所述含DNA的处理液1中加入50 µL 20mg/mL蛋白酶K，70℃水浴处理30~60 min，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上清，得到含DNA的处理液2；
（8）向所述含DNA的处理液2中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1，充分混匀后，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上层液，得到含DNA的处理液3；
（9）向所述含DNA的处理液3中加入等体积的氯仿:异戊醇混合液，氯仿:异戊醇体积比=24:1，充分混匀后，8000~10000 rpm离心15~30 min，离心取上层液，得到含DNA的处理液4；
（10）向所述含DNA的处理液4中加入0.6~0.8倍体积异戊醇混合均匀，-20℃放置1~2 h后，8000~10000 rpm离心15~30 min后，弃上清得到的沉淀用70%酒精洗涤2~3遍，即获得所述鱼类肠壁黏液菌群DNA；
所述步骤1)、2）的PBS 缓冲液中含有137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/LNa2HPO4、2 mmol/L KH2PO4；
所述步骤3)用无菌剪刀将所述去除内容物的肠道剪成小段，取6~10 g肠小段放入50mL离心管中，加入10~15 mL PBS-ET 缓冲液、1~2 mL蓖麻油、6~10 g石英砂，置于涡旋振荡仪上，3000 rmp振荡2~3 min后，1500 rmp振荡5~7min，得到含肠混合物；并且所述PBS-ET缓冲液的成分为0.5wt.% Twen-20、10 mmol/L EDTA、137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，所述石英砂为40目~100目的石英砂；
所述步骤5)中裂解液，其成分为6wt.% SDS、200 mmol/L NaCl、200 mmol/L Tris、20mmol/L EDTA，并且所述加入裂解液的体积为所述肠壁黏液菌群混合液体积的5~7倍，裂解温度为70℃，裂解时间为30~60 min，得到含核酸的裂解液。
2.根据权利要求1所述一种制备鱼类肠壁黏液菌群DNA的方法，其特征在于，所述的蓖麻油替换为橄榄油或茶籽油。
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