CN106404478A - 一种改良血液染色体核型制片方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及遗传学技术领域，公开了一种改良血液染色体核型制片方法，包括低渗离心后沉淀转移到1.5毫升离心管，用3：1固定液固定三次(6000rpm，2分钟)，及加入适量乙酸滴片。本发明在现有技术的基础上，采用转移至1.5毫升离心管6000rpm离心2分钟的方法，操作简单，缩短了试验时间，减少了试剂用量，降低了试验成本，避免了甲醇和乙酸这些有毒试剂对试验操作人员和环境的危害，在滴片时加入10％的乙酸，可以使细胞和染色体快速增大，提供了一种快速、试验效率高，稳定性好，操作简单，环境友好的改良血液染色体核型制片方法。

Description

一种改良血液染色体核型制片方法
技术领域
本发明涉及遗传学技术领域，尤其涉及了一种改良血液染色体核型制片方法。
背景技术
染色体核型技术主要应用在细胞遗传传统的核型分析中，近年发展的FISH技术也需要在良好的染色体核型技术上才能做出准确的判断。为了使染色体彼此铺开而又能清楚地显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获的细胞做一系列预处理，其目的是使染色体的状态更适合于分析和研究的需要。从收获到制片需经过加纺缍体抑制剂、低渗处理、固定、滴片等几个主要环节。
1952年，美籍中国学者徐道觉在一次偶然的失误中发现低渗液有助于染色体的铺展，这一方法学上的革新是细胞遗传学史上的一个重要的转折点。
固定是将组织、细胞或其它成分选择性固定于某一特定阶段的过程，固定的目的在于提高染色体结构的可见性和显示染色体形态的细节。
滴片时的温度和湿度会影响到染色体的分散，大部分细胞遗传学实验室已配备了恒温恒湿仪以更好地提高滴片质量。
目前，外周血染色体核型分析已成为优生必检的一个项目，而胎儿血或新生儿脐带血核型分析也在临床中多有开展，但目前广泛使用的经典染色体制片方法中，需要用大量的固定液，并用大型的离心机，而且很多实验室的滴片质量很不稳定，因细胞生长不良或温湿度不合适，经常会出现有染色体在胞浆中无法逸出，核型偏小，染色体偏短、或染色体分散过度，无法准确计数核型的情况，极大地影响了显带效率和分析质量。此外，经典法中大量的甲醇和乙酸的使用，威胁了试验操作人员的身体健康，也给环境造成了危害。
发明内容
本发明针对经典染色体核型制片技术操作时间较长，需要使用较多甲醇和乙酸、滴片时质量不稳定的缺点，提供了一种改良血液染色体核型制片方法，该种方法操作更为快速，可以大大减少甲醇和乙酸用量，且可以快速增大细胞和核型体积。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种改良血液染色体核型制片方法，包括如下步骤：
A.取培养后的血液标本于15毫升离心管，在低渗后加入固定液1500rpm离心后，将沉淀从15毫升离心管转移至1.5毫升离心管；
B.加入固定液至1.5毫升，充分混匀，用离心机6000rpm离心2分钟；
C.吸去上清液，重复两次步骤B；
D.吸去上清液，加入固定液至500～1500微升，混匀；
E.加入乙酸，每100微升血液标本中加入8～12微升的乙酸，混匀后滴片。
染色体样本浸入低渗液中，渗透压低于细胞内渗透压，水分迅速进入细胞，使细胞膨胀，染色体铺展，使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，从而获得良好的染色体分裂象，有利于后续试验结果的观察，确保检测结果的准确性。固定液能迅速穿透细胞，将细胞固定并维持染色体结构的完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。最后加入乙酸是使细胞快速膨胀，核型增大变长。
加入乙酸，混匀后滴片，乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失，实际使用中，可根据预实验结果调整乙酸量以适应于不同的待检样品。
作为优选，步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为2～3：1。低渗液渗透压低于细胞内液，水分迅速进入细胞，使其膨胀，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，获得分散良好的染色体分裂相。固定液能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。将其沉淀吸至1.5毫升离心管中，可以减少固定液用量。
作为优选，步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为3：1。
作为优选，步骤A中，血液标本为外周血标本或胎儿血标本。
作为优选，步骤A中，血液标本为生长不良的胎儿血标本。
作为优选，步骤D中，沉淀样本中加入固定液至800微升。
作为优选，步骤E中，每100毫升的样本中加入10微升的乙酸。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：本发明在现有技术的基础上，对传统染色体核型制片技术进行改进，采用1.5毫升离心管代替15毫升的离心管，来完成固定过程，节约了甲醇和乙酸两种实验试剂，降低了实验成本。并利用6000rpm离心2分钟，取代了传统方法的1500rpm 10分钟，缩短了反应时间；在滴片时加入适量乙酸，使细胞快速膨胀、染色体铺展，为一些生长不良的标本提供了快速可行的解决方案。本发明的一种改良血液染色体核型制片技术方法，降低了实验劳动强度，实验操作人员可减少接触有毒试剂，保护了试验操作人员的身体健康，也减少了有毒试剂对环境的影响。
具体实施方式
实施例1
一种改良血液染色体核型制片方法，包括如下步骤：
A.取培养后的胎儿血标本于15毫升离心管，在低渗后加入固定液1500rpm离心后，将沉淀从15毫升离心管转移至1.5毫升离心管；
B.加入固定液至1.5毫升，充分混匀，用离心机6000rpm离心2分钟；
C.吸去上清液，重复两次步骤B；
D.吸去上清液，加入固定液至500微升，混匀；
E.加入乙酸，每100微升胎儿血标本中加入8微升的乙酸，混匀后滴片。
步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为2：1。
本实施例的实验结果：选用胎儿血标本，20个核型中计数不合格的只有1个，约为5％。而传统法选用胎儿血标本制片，20个核型中由于过于染色体分布太过分散，计数不合格的核型达8个，约为40％。说明用本实施例可以使核型更为完整。
实施例2
一种改良血液染色体核型制片方法，包括如下步骤：
A.取培养后的不良的胎儿血标本于15毫升离心管，在低渗后加入固定液1500rpm离心后，将沉淀从15毫升离心管转移至1.5毫升离心管；
B.加入固定液至1.5毫升，充分混匀，用离心机6000rpm离心2分钟；
C.吸去上清液，重复两次步骤B；
D.吸去上清液，加入固定液至1500微升，混匀；
E.加入乙酸，每100微升不良的胎儿血标本中加入12微升的乙酸，混匀后滴片。
步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为3：1。
本实施例的实验结果：选用不良的胎儿血标本，核型面积增大，染色体变长，易于分析。而传统法选用不良的胎儿血标本制片，核型过小，且在胞浆中无法逸出，很难分析。
实施例3
一种改良血液染色体核型制片方法，包括如下步骤：
A.取培养后的胎儿血标本于15毫升离心管，在低渗后加入固定液1500rpm离心后，将沉淀从15毫升离心管转移至1.5毫升离心管；
B.加入固定液至1.5毫升，充分混匀，用离心机6000rpm离心2分钟；
C.吸去上清液，重复两次步骤B；
D.吸去上清液，加入固定液至800微升，混匀；
E.加入乙酸，每100微升胎儿血标本中加入10微升的乙酸，混匀后滴片。
步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为3：1。
本实施例的实验结果：选用胎儿血标本，20个核型中平均重叠条数只有0.8.条，分散度更均匀。而传统法选用胎儿血标本制片，20个核型中平均重叠染色体条数为1.6条，大大影响了分析质量。可见本实施例的方法更利于做出准确的分析。
实施例4
一种改良血液染色体核型制片方法，包括如下步骤：
A.取培养后的胎儿血标本于15毫升离心管，在低渗后加入固定液1500rpm离心后，将沉淀从15毫升离心管转移至1.5毫升离心管；
B.加入固定液至1.5毫升，充分混匀，用离心机6000rpm离心2分钟；
C.吸去上清液，重复两次步骤B；
D.吸去上清液，加入固定液至900微升，混匀；
E.加入乙酸，每100微升胎儿血标本中加入9微升的乙酸，混匀后滴片。
步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为2.5：1。
本实施例的实验结果：选用胎儿血标本，细胞沉淀增多，核型量增多，可以进行分析和计数。而传统法选用胎儿血标本制片，一例胎儿血标本，生长不良，用传统法制片核型非常少，难以达到计数量，而用改良法后计数达标，分析达标。
实施例5
一种改良血液染色体核型制片方法，包括如下步骤：
A.取培养后的外周血标本于15毫升离心管，在低渗后加入固定液1500rpm离心后，将沉淀从15毫升离心管转移至1.5毫升离心管；
B.加入固定液至1.5毫升，充分混匀，用离心机6000rpm离心2分钟；
C.吸去上清液，重复两次步骤B；
D.吸去上清液，加入固定液至1000微升，混匀；
E.加入乙酸，每100微升外周血标本中加入10微升的乙酸，混匀后滴片。
步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为3：1。
本实施例的实验结果：选用外周血标本，核型更为完整，更易于分析和计数。而传统法选用外周血标本制片核型过于分散，用全自动扫描系统扫片中计数不合格的有一半以上。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种改良血液染色体核型制片方法，其特征在于：包括如下步骤：
A.取培养后的血液标本于15毫升离心管，在低渗后加入固定液1500rpm离心后，将沉淀从15毫升离心管转移至1.5毫升离心管；
B.加入固定液至1.5毫升，充分混匀，用离心机6000rpm离心2分钟；
C.吸去上清液，重复两次步骤B；
D.吸去上清液，加入固定液至500～1500微升，混匀；
E.加入乙酸，每100微升血液标本中加入8～12微升的乙酸，混匀后滴片。
2.根据权利要求1所述的一种改良血液染色体核型制片方法，其特征在于：步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为2～3：1。
3.根据权利要求1所述的一种改良血液染色体核型制片方法，其特征在于：步骤A中，低渗所用低渗液为0.075M的氯化钾溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液，甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为3：1。
4.根据权利要求1所述的一种改良血液染色体核型制片方法，其特征在于：步骤A中，血液标本为外周血标本或胎儿血标本。
5.根据权利要求1所述的一种改良血液染色体核型制片方法，其特征在于：步骤A中，血液标本为生长不良的胎儿血标本。
6.根据权利要求1所述的一种改良血液染色体核型制片方法，其特征在于：步骤D中，沉淀样本中加入固定液至800微升。
7.根据权利要求1所述的一种改良血液染色体核型制片方法，其特征在于：步骤E中，每100毫升的样本中加入10微升的乙酸。
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