CN104897903B

CN104897903B - 一种亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒

Info

Publication number: CN104897903B
Application number: CN201510288260.8A
Authority: CN
Inventors: 张玲
Original assignee: TIANJIN KINGMED MEDICAL DIAGNOSTICS INSTITUTE CO LTD
Current assignee: Tianjin Jinyu Medical Laboratory Co., Ltd.
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN104897903A

Abstract

本发明属于医学诊断领域，提供了一种亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒，其包括以下溶液：(1)2％结晶紫溶液，(2)0.0004M美蓝溶液，(3)含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液。

Description

一种亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒

发明领域

本发明属于医学诊断领域，具体的说，本发明提供了一种亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒。

背景技术

地中海贫血(简称地贫)是一组遗传性疾病。其发病机制是合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失导致血红蛋白结构异常，这种含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低，寿命缩短，可以提前被人体的肝脾等破坏，导致贫血甚至发育异常。组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链，分别由其相应的基因编码，这些基因的缺失或点突变可造成各种肽链的合成障碍，通常将地贫分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中以α和β地贫较为常见。地中海贫血的常用检测方法为血常规结合血红蛋白电泳以及亨氏小体(Heinz Body)检测。

亨氏小体(Heinz Body)是附着于红细胞上的变性珠蛋白小体,由于不稳定血红蛋白容易氧化变性沉淀,形成不溶性的亨氏小体(Heinz Body)，所以不稳定血红蛋白病又称为先天性亨氏小体(Heinz Body)贫血症,特别是当病人的红细胞加入乙酰苯肼过氧化试剂在体外孵育后，红细胞内便大量生成亨氏小体(Heinz Body)，其可作鉴定不稳定血红蛋白的指标之一。现行亨氏小体(Heinz Body)的标准检测方法如全国临床检验操作规程第3版174页—175页所示，使用5g/L耐尔蓝乙醇溶液或10g/L结晶紫生理盐水液对亨氏小体染色。该方法缺点在于：(1)染色液配制中固体不易溶解，难以配制较高浓度的溶液，会影响染色效果；(2)显微镜下亨氏小体观察困难，容易造成漏检；(3)G6PD缺乏者，检测中会呈现假阳性。

针对上述问题，发明人发现使用较低渗的盐水配制溶液能将细胞涨大，同时亨氏小体(Heinz Body)也涨大，这样在镜下可见折光性强颗粒粗大更易辨认；并使用甲醇软化溶解结晶紫配制出2％的结晶紫溶液，有效的提高了染色效果；此外，本发明使用美兰溶液和亚硝酸钠孵育处理血液，由亚硝酸钠将血红蛋白氧化成高铁血红蛋白后，再由美兰还原成血红蛋白，在此过程中，G6PD缺乏时，高铁血红蛋白不能被还原，从而避免可G6PD缺乏者的假阳性问题。

发明内容

一方面，本发明提供了一种亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒，包括2％结晶紫溶液。

进一步的，该亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒，包括以下溶液：

(1)2％结晶紫溶液，

(2)0.0004M美蓝溶液，

(3)含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液。

另一方面，本发明提供了(1)2％结晶紫溶液，(2)0.0004M美蓝溶液和(3)含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液在制备亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒中的应用。

试剂盒中各溶液的制备方法如下：

各溶液的制备方法为：

1)2％结晶紫液：

取2g结晶紫置研钵内研碎磨细转入烧杯中，逐滴加入甲醇分析纯数滴，边滴边观察，待结晶紫开始软化稀释后慢慢注入0.78％NaCl溶液100ml边研边溶，室温下或加热使之全部溶解，然后过滤选用，

2)0.0004M美蓝溶液：

美蓝150mg放于研钵中加少量水研磨,并加热37℃，使其尽量全溶，加水至100ml滤过，取滤液10ml用0.78％NaCl稀释至100ml，或者取0.4M浓缩美蓝1ml再加0.78％NaCl溶液6.5ml稀释备用，室温中可保存一个月，

3)含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液：

取亚硝酸钠1.25g和葡萄糖5g加蒸馏水加至100ml混匀备用，在2-8℃可保存一个月；

试剂盒的使用方法如下：

a)取已先配制好的反应液体：0.0004M美兰与含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液等量混合后,用0.78％氯化钠1:17稀释即为反应液；

b)取一支小试管，加200μl或3-4滴反应液，再加入1滴或50ul血液，混合，于37℃恒温水浴箱孵育3-5小时，加入2％结晶紫液6-10μl，混匀，5分钟后取1滴混悬染液检体于载玻片上加盖玻片1-3分钟后油镜观察；

附图简述

图1为使用本发明试剂盒的阳性检测结果图，

图2为使用本发明试剂盒的阴性检测结果(正常对照)图。

具体实施方式

1、材料：

1.1对象：对2014年3月送检本中心初筛地中海贫血的3653例样本检出的543份可疑结果与地贫基因检测结果进行验证统计分析：其中静止性α-地贫36例、标准型α-地贫257例、中间型α-地贫22例、β-地贫162例、β复合α-地贫66例，已排除缺铁性贫血患者69例，变异血色素29例，对照取体检中心样本正常组100例。同时取经基因检测验证为假阳性(G6PD缺乏)的亨氏小体染色阳性样本(染色方法如全国临床检验操作规程第3版174页—175页所示)10份以验证本发明排除假阳性的效果。

1.2仪器：OLYPUS显微镜、37℃恒温水浴箱

1.3试剂：

按发明内容中所述方法配制的1.25％亚硝酸钠溶液+5％葡萄糖、0.0004M美蓝溶液、2％结晶紫溶液。

1.4方法：

1.4.1 EDTA-K2抗凝血2.0ml，采用贝克曼COULTER全自动血细胞分析仪作血常规分析。

1.4.2 Hb成份分析：EDTA-K2抗凝血2ml，采用美国Helena公司全自动快速电泳系统(SPIFE)，于pH 8.6琼脂糖凝胶电泳，在碱性条件下琼脂凝胶，由于各种Hb具有不同的等电点，可分离出各种Hb区带,进行定性或定量检测各种Hb区带，同时进行Heinz小体试验(主要用于a地贫的鉴别)。

1.4.3 Thal基因检测：GAP-PCR检测3种常见的缺失型α-Thal基因(--SEA、-a3.7与-a4.2)，试剂由亚能公司提供，采用PCR结合反向点杂交法检测β-珠蛋白基因17个位点的18种突变，试剂由深圳益生堂生物公司提供。

1.4.4 判断标准：根据《血液病诊断及疗效标准》电泳法结果诊断a-地中海贫血时HbA2临界值为≤2.6％；诊断β-地中海贫血时HbA2临界值为≥3.8％，以基因检测为金标准。

1.5结果

1试剂配制结果：

使用本发明的方法检测人员在半小时内成功完成了2％结晶紫溶液的配制，而按照全国临床检验操作规程第3版174页—175页所述的方法(直接溶解)，检测人员两小时后仍然没能完全溶解2％的结晶紫。

2各样品检测结果

灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阳性)＝364/(364+17)×100％＝95％。

相同检测人员以现有亨氏小体检测方法(如全国临床检验操作规程第3版174页—175页所示)检测上表中的各样本，1-5组的检出率分别是78％、96％、91％、88％和98％，证明了本发明的方法的检测灵敏度优于现有方法。

以本发明的方法检测经基因检测验证为假阳性的亨氏小体染色阳性样本(全国临床检验操作规程第3版174页—175页所示)10份，结果9份为阴性，证明本发明可以有效排除G6PD缺乏导致的假阳性问题。

Claims

1.一种亨氏小体(Heinz Body)检测试剂盒的制备方法，该试剂盒包括以下溶液：

(1)2％结晶紫溶液，

(2)0.0004M美蓝溶液，

(3)含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液；

其中各溶液的制备方法为：

1)2％结晶紫溶液：

2g结晶紫置研钵内研碎磨细转入烧杯中，逐滴加入甲醇分析纯数滴，边滴边观察，待结晶紫开始软化稀释后慢慢注入0.78％NaCl溶液100ml边研边溶，室温下使之全部溶解，然后过滤选用；

2)0.0004M美蓝溶液：

美蓝150mg放于研钵中加少量水研磨,并加热37℃，使其尽量全溶，加水至100ml滤过，取滤液10ml用0.78％NaCl稀释至100ml，或者取0.4M浓缩美蓝1ml再加0.78％NaCl溶液6.5ml稀释备用，室温中可保存一个月；

3)含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液：

取亚硝酸钠1.25g和葡萄糖5g加蒸馏水加至100ml混匀备用，在2-8℃可保存一个月。

2.权利要求1的制备方法，其中所述试剂盒的使用方法如下，

a)取已先配制好的反应液体：0.0004M美兰与含1.25％亚硝酸钠和5％葡萄糖的溶液等量混合后，用0.78％氯化钠1:17稀释即为反应液；

b)取一支小试管，加200μl或3-4滴反应液，再加入1滴或50ul血液，混合，于37℃恒温水浴箱孵育3-5小时，加入2％结晶紫液6-10μl，混匀，5分钟后取1滴混悬染液检体于载玻片上加盖玻片1-3分钟后油镜观察。