CN107290294A - 红细胞渗透脆性检测筛选方法及其应用 - Google Patents

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廖雨琴
刘军权
祝宇翀
文华廷
余凯
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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
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Abstract

本发明提供了一种红细胞渗透脆性检测筛选方法，包括以下步骤：S1、酶标板中加入红细胞渗透脆性检测试验液，在37℃‑40℃的温度下预热1‑2分钟；S2、待测抗凝全血5‑10μl于酶标板的部分区域的装样孔中，混合均匀；S3、在装有待测抗凝全血的部分区域中加入终止红细胞溶血试验液，混合均匀，然后进行离心；S4、移出上清液置于酶标板的另一部分区域的装样孔中；S5、于底液中加入红细胞溶血液，混合均匀；S6、待血液全部溶血后，将加入红细胞溶血试验试验液的部分区域的待检测液与未加入红细胞溶血试验液的另一部分的溶液进行比色。本发明的检测方法具有简单、微量、快速和大样本的优点，减少筛选工作量，快速精确，结果重复性好，能自动计算出实验结果。

Description

红细胞渗透脆性检测筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种红细胞渗透脆性检测筛选方法及其应用，属于医学检测领域。
背景技术
红细胞渗透脆性试验能筛查多种贫血，此法主要检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力，用于遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、阻塞性黄疸等疾病的诊断及珠蛋白生成障碍性贫血等溶血性疾病的检测。珠蛋白生成障碍性贫血原名地中海贫血又称海洋性贫血，是一组遗传性溶血性贫血疾病。由于遗传的基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足所导致的贫血或病理状态。缘于基因缺陷的复杂性与多样性，使缺乏的珠蛋白链类型、数量及临床症状变异性较大。根据所缺乏的珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名和分类。目前，进行海洋性贫血筛选试验多使用传统肉眼观察红细胞溶血率或使用分光光度计比色方法进行测定，操作方法较为繁杂，结果也不客观，检测人员眼睛易疲劳或手工操作比色强度过高而致操作失误致出现临床本可避免的错误结果。临床上进行红细胞渗透脆性试验有MCV法、试管法(手工一管法)和改良红细胞孵育渗透脆性试验(Osmotigility test,OFT)等检测方法。
该方法存在的主要缺陷：1)MCV法需要血象自动分析仪设备，在基层医院很难办到，且结果并非完全可靠；2)试管法每样本需要单独二支试管进行比对；试管法样本与试剂孵育离心后需要将上清转移到另外试管并需要进行两次530nm波长分光光度计比色，然后通过获得的光密度来判断实验结果；3)改良红细胞孵育渗透脆性试验虽然采用微量加样，但是与试剂孵育离心后需要将上清转移到另外酶标板并需要进行两次530nm波长分光光度计比色，然后通过获得的光密度来判断实验结果。以上方法检测后每一样本需要用人工法将光密度值换算成检测结果。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种红细胞渗透脆性检测筛选方法，解决了现有的红细胞渗透脆性试验的需要设备昂贵或操作复杂、需要用人工法将光密度值换算成检测结果的缺陷。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种红细胞渗透脆性检测筛选方法，包括以下步骤：
S1、于n孔的酶标板中加入红细胞渗透脆性检测试验液，在37℃-40℃的温度下预热1-2分钟；
S2、加入不超过n/2份的待测抗凝全血于酶标板的部分区域的装样孔中，混合均匀，继续在37℃-40℃的温度下，保温5-10分钟；
S3、在装有待测抗凝全血的部分区域中加入终止红细胞溶血试验液，混合均匀，然后进行离心，得到上清液和底液；
S4、移出上清液置于酶标板的另一部分区域的装样孔中；
S5、于底液中加入红细胞溶血试验液，混合均匀；
S6、待血液全部溶血后，制成待检测液，将加入红细胞溶血试验液的部分区域的待检测液与未加入红细胞溶血试验液的另一部分的溶液进行比色，读取光密度并计算出最终结果。
可选的，所述步骤S4中还包括：对移出的上清液进行补水至预定体积。
可选的，步骤S1中所述的红细胞渗透脆性检测液包含氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
可选的，步骤S3中所述的终止红细胞溶血液包含氯化钠。
可选的，步骤S5中红细胞溶血液采用皂素制成。
可选的，步骤S3中离心操作的离心速率为(3000-4000)转/分钟，持续5-6分钟。
可选的，步骤S6中比色操作优先的波长为530nm。
可选的，步骤S6中，使用酶标阅读仪同时读取光密度D1(加红细胞溶血试验试验液部分区域的装样孔结果)和D2(加红细胞溶血试验试验液后另一部分区域装样孔的结果)，并按下公式计算出溶血率百分比：
本发明还公开了一种的红细胞渗透脆性检测筛选方法作为血液检测方法的应用，用于检测海洋性贫血。
(三)有益效果
本发明提供的一种红细胞渗透脆性检测筛选方法，其具有以下优点：
本发明提供的检测方法具有简单、微量、快速和大样本的优点，减少筛选工作量，实验快速精确，实验结果重复性好，能自动计算出实验结果。
附图说明
图1为本发明操作步骤流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中红细胞渗透脆性检测试验液的配制：用一个100ml容量瓶上放一个小漏斗，将母液倒入漏斗中，用纯水洗净装母液的管和总盖，将管内余液倒入100ml容量瓶中，然后加纯化水于100ml容量瓶中，准确至100ml刻度，混匀后即为试验液。
终止红细胞溶血试验液的配制：将终止红细胞溶血试验母液倒入100ml容量瓶中，加入纯化水100ml，混匀后即为终止红细胞溶血液试验液。
红细胞溶血试验液的配制：将红细胞溶血液试验母液倒入100ml容量瓶中，加入纯化水60ml，混匀后，即为红细胞溶血液试验液。
稀释液：开瓶后直接使用。
产品有效期：红细胞渗透脆性检测试验液和终止红细胞溶血试验液配制后，可在室温保存。红细胞溶血试验液在2℃～8℃保存。试剂开瓶后有效期为3个月。
本发明公开了一种的红细胞渗透脆性检测筛选方法作为血液检测方法的应用，用于检测海洋性贫血。
本发明提供的一种红细胞渗透脆性检测筛选方法(见图1)，包括以下步骤：
S1、于n孔的酶标板中加入红细胞渗透脆性检测试验液，在37℃-40℃的温度下预热1-2分钟；
S2、加入不超过n/2份的待测抗凝全血于酶标板的部分区域的装样孔中，混合均匀，继续在37℃-40℃的温度下，保温5-10分钟；
S3、在装有待测抗凝全血的部分区域中加入终止红细胞溶血试验液，混合均匀，然后进行离心，得到上清液和底液；
S4、移出上清液置于酶标板的另一部分区域的装样孔中；
S5、于底液中加入红细胞溶血试验液，混合均匀；
S6、待血液全部溶血后，制成待检测液，将加入红细胞溶血试验液的部分区域的待检测液与未加入红细胞溶血试验液的另一部分的溶液进行比色，读取光密度并计算出最终结果。
需要说明的是，本发明中酶标板可采用48孔酶标板，一次可检测的样品不超过24份。
其中，所述步骤S4中还包括：对移出的上清液进行补水至预定体积。
其中，步骤S1中所述的红细胞渗透脆性检测液包含氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
其中，步骤S3中所述的终止红细胞溶血液包含氯化钠。
其中，步骤S5中红细胞溶血液采用皂素制成。
其中，步骤S3中离心操作的离心速率为(3000-4000)转/分钟，持续5-6分钟。
其中，步骤S6中比色操作优先的波长为530nm。
其中，步骤S6中，使用酶标阅读仪同时读取光密度D1(加红细胞溶血试验试验液部分区域的装样孔结果)和D2(加红细胞溶血试验试验液后另一部分区域装样孔的结果)，并按下公式计算出溶血率百分比：
本发明中的仪器包括：
PT-3502G酶标阅读仪(北京普天新桥技术有限公司)，用于检测；
MPC2000 96孔板离心机(北京鼎昊源科技有限公司产品)；
ZW-A微量振荡仪(常州高德仪器制造有限公司产品)；
HH-420数显三用恒温水箱(常州市万丰仪器制造有限公司产品)。
下面通过实施例进行具体说明
1)对象：实验组选取当天检测红细胞渗透脆性试验阳性样本20例，对照组选取当天送检的体检中心健康人群样本20例(排除溶血性及其他贫血性疾病)EDTA-K2抗凝血1ml，分别与上述常规方法进行比对验证并统计分析。
2)THal确认基因检测：α-THal基因用GAP-PCR法检测，β-THal基因用反向点杂交(PDB)法检测。
3)诊断标准：根据《血液病诊断及疗效标准》电泳法结果诊断α珠蛋白生成障碍性贫血时HbA2临界值为≤26％，β珠蛋白生成障碍性贫血时HbA2临界值为≤38％，以基因检测为金标准。
其中，溶血率参考值：溶血率％：>65％为正常溶血率；<55％为溶血率降低；56-64％为轻度降低。
统计学处理：采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。离群值的判断方法依照CLSI C28-A3文件，疑似离群值和相邻值之差(D)与数据全距(R)之比(D/R)≥1/3判断为离群值。采用Dixon法剔除离群值后，使用Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验。各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
实施例1：
实验操作方法：
1、取48孔酶标板一块，加入红细胞渗透脆性检测试验液0.5ml，放37℃预热1分钟。
2、加入待测抗凝全血5μl(每块48孔板加入待测样本最多24份)立即混匀，继续放在37℃保温5分钟。
3、5分钟后加入终止红细胞溶血试验液0.5ml，混匀，3000转/分钟，离心5分钟。
4、先用移液枪分别取上清液各100μl按顺序加入本板对应的另外24孔中，补充水至200μl/孔。然后将剩余的上清液吸弃(切勿搅动试管底的红细胞)。
5、在原孔中分别加入红细胞溶血试验液200μl/孔，混匀，待血液全部溶血(透明红色)后，酶标板用酶联比色仪进行比色。
6、比色方法：选择波长为530nm，空白调零，同时读取光密度D1(加红细胞溶血试验液前24孔结果)和D2(加红细胞溶血试验液后24孔结果)。通过酶标阅读仪的自动计算功能设制计算公式进行结果自动换算。
7、按下公式计算出溶血率百分比，将对应编号结果代入下计算公式。
实施例2：
实验操作方法：
1、取48孔酶标板一块，加入红细胞渗透脆性检测试验液0.5ml，放40℃预热2分钟。
2、加入待测抗凝全血5μl(每块48孔板加入待测样本最多24份)立即混匀，继续放在40℃保温10分钟。
3、5分钟后加入终止红细胞溶血试验液0.5ml，混匀，4000转/分钟，离心6分钟。
4、先用移液枪分别取上清液各100μl按顺序加入本板对应的另外24孔中，补充水至200μl/孔。然后将剩余的上清液吸弃(切勿搅动试管底的红细胞)。
5、在原孔中分别加入红细胞溶血试验液200μl/孔，混匀，待血液全部溶血(透明红色)后，酶标板用酶联比色仪进行比色。
6、比色方法：选择波长为530nm，空白调零，同时读取光密度D1(加红细胞溶血试验液前24孔结果)和D2(加红细胞溶血试验液后24孔结果)。通过酶标阅读仪的自动计算功能设制计算公式进行结果自动换算。
7、按下公式计算出溶血率百分比，将对应编号结果代入下计算公式。
本发明的实施例1中结果为：20例实验组与20对照组红细胞渗透脆性试验分别用不同设备及不同加样方式同时检测，筛查两种方法结果一致，正常患者和对照组结果一致(见表1和表2)，各组间比值结果无显著性差异(t＝1.6355，P＞0.01)。
表1 阳性标本和阴性标本PH8.6琼脂电泳验证结果
表2 20例红细胞溶血率降低患者基因型
综上所述，通过实施例1、2可以看出，本发明提供的检测方法具有简单、微量、快速和大样本的优点，减少筛选工作量，实验快速精确，实验结果重复性好，能自动计算出实验结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此即限制本发明的专利保护范围，凡是运用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、于n孔的酶标板中加入红细胞渗透脆性检测试验液，在37℃-40℃的温度下预热1-2分钟；
S2、加入不超过n/2份的待测抗凝全血于酶标板的部分区域的装样孔中，混合均匀，继续在37℃-40℃的温度下，保温5-10分钟；
S3、在装有待测抗凝全血的部分区域中加入终止红细胞溶血试验液，混合均匀，然后进行离心，得到上清液和底液；
S4、移出上清液置于酶标板的另一部分区域的装样孔中；
S5、于底液中加入红细胞溶血液，混合均匀；
S6、待血液全部溶血后，制成待检测液，将加入红细胞溶血试验试验液的部分区域的待检测液与未加入红细胞溶血试验液的另一部分的溶液进行比色，读取光密度并计算出最终结果。
2.如权利要求1所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，所述步骤S4中还包括：对移出的上清液进行补水至预定体积。
3.如权利要求1所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，步骤S1中所述的红细胞渗透脆性检测试验液包含氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
4.如权利要求1所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，步骤S3中所述的终止红细胞溶血试验液包含氯化钠。
5.如权利要求1所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，步骤S5中红细胞溶血试验液采用皂素制成。
6.如权利要求1所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，步骤S3中离心操作的离心速率为(3000-4000)转/分钟，持续5-6分钟。
7.如权利要求1所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，步骤S6中比色操作优先的波长为530nm。
8.如权利要求7所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法，其特征在于，步骤S6中，使用酶标阅读仪同时读取光密度D1(加红细胞溶血试验试验液部分区域的装样孔结果)和D2(加红细胞溶血试验试验液后另一部分区域装样孔的结果)，并按下公式计算出溶血率百分比：
9.一种如权利要求1至8任意一项权利要求所述的红细胞渗透脆性检测筛选方法作为血液检测方法的应用，用于检测海洋性贫血。
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