CN116219018A - 一种利用cirbp作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，涉及生物检测领域，所述方法步骤包括如下：S1：材料准备，S2：细胞复苏，S3：细胞培养，S4：实验分组，S5：RIP检测PCIRBP调控TP53，该一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，抗体浆表达在胰腺癌的表达显著低于癌旁组织，抗体癌浆核表达和胰腺癌病人的肿瘤大小显著负相关，抗体癌旁浆表达和胰腺癌病人的糖尿病史显著负相关，即无糖尿病史的亚组的抗体浆表达显著更高，抗体癌核高表达的胰腺癌病人的总生存期显著更好，数据库查询目标基因表达高的胰腺癌的生存期显著更好抑癌。

Description

一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体为一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法。
背景技术
RIP技术(RNABindingProteinImmunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定；目标蛋白是一种应激反应蛋白，在应激反应过程中，可以从细胞核迁移到细胞质，此外，目标蛋白还可以从细胞中分泌出来，在细胞外作为损伤相关分子模式发挥功能，促进炎症反应，并在急性和慢性炎症中发挥重要作用。
发明内容
本发明提供了一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，所述方法步骤包括如下：
S1：材料准备，准备试剂细胞培养试剂：胎牛血清，DMEM-高糖培养基，RPMI-1640培养基，青链霉素，PBS磷酸钾缓冲液，Trypsin-EDTA(0.25％)phenol red以及实验耗材6孔板细胞培养板，12孔板细胞培养板，24孔板细胞培养板，48孔板细胞培养板，96孔板细胞培养板，巴氏吸管；
S2：细胞复苏，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出冻存管，迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，一滴一滴地加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上，离心，在低速离心机上，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37℃含CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞沉降速度情况而定；
S3：细胞培养，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出细胞培养瓶，无菌操作，打开瓶盖，吸掉旧培养液，用PBS洗涤细胞一至二次，加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，轻洗细胞皿底部，吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培养箱2-3分钟，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用；
S4：实验分组，检测项目为RIP检测CIRBP调控TP53、、PCR检测CIRBP、TP53、wb、CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1、普鲁士蓝染色、激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS、谷胱甘肽GSH检测、流式凋亡检测、细胞增殖生长曲线检测；
S5：RIP检测P CIRBP调控TP53。
优选的，所述步骤S4中实验流程为：a：细胞裂解液获取；b：磁珠的准备；c：染色质剪切；d：RNA结合蛋白免疫沉淀；e：RNA纯化。
优选的，所述S4中R PCR检测CIRBP、TP53步骤为：样本总RNA提取、三步法荧光定量RT-PCR反应、荧光定量PCR反应、荧光定量RT-PCR数据分析。
优选的，样本总RNA提取步骤为取适当样本材料液氮研磨后加入1000ul Trizol充分裂解，接着转移至2ml离心管中，将2ml离心管振荡2min，其后于15-30℃孵育5min，加入200ul氯仿(按0.2ml氯仿/1ml Trizol)，盖紧管盖，充分振荡15-60s，不大于12000g，2-8℃离心15min，小心吸取上清转移至另一离心管中，切勿吸到中间层，加入500ul异丙醇(按0.5ml异丙醇/1ml Trizol)。
优选的，所述步骤S4中wb检测CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1步骤为：a：收集蛋白样品，SDS-PAGE凝胶配制，样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，上样与电泳，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白；b：转膜(Transfer)，通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短；c：封闭，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜；d：一抗孵育，用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；e：按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，二抗需根据一抗进行选择，用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；f：蛋白检测(Detection ofproteins)，使用BeyoECL Plus等ECL类试剂来检测蛋白，压片可以采用专用的压片暗盒进行，洗片时可以使用X光片自动洗片机；g：凝胶图象分析，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
优选的，所述步骤S4中普鲁士蓝染色步骤为a：95％酒精固定60分钟以上；b蒸馏水洗；c：取2％亚铁氢化钾水溶液和2％盐酸水溶液等份混合，滴在涂片上，10-20分钟d：蒸馏水洗；e：核固红复染；f：水洗，脱水，透明，封固。
优选的，所述步骤S4中激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS步骤为a：MitoTrackerTMRed储存液的配制；b：MitoTracker&trade Red工作液的配制；c：线粒体的荧光标记；d：装载ROS探针；e：MitoSOX加载细胞；f：清洗；g：镜检。
优选的，所述步骤S4中细胞增殖生长曲线检测步骤为a：取各处理组细胞进行下面实验；b：消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×105个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×104个；c：贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测；d：收集各个时间点的细胞(0h，24h，48h，72h)加入CCK-8溶液(碧云天，Cat.No.C0037)，比例为1/10。即100ul培养液加入10ul检测液；e：在孵育4小时后，酶标仪读板，CCK-8检测读取OD450数据。
本发明提供了一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法。具备以下有益效果：
该一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，抗体浆表达在胰腺癌的表达显著低于癌旁组织，抗体癌浆核表达和胰腺癌病人的肿瘤大小显著负相关，抗体癌旁浆表达和胰腺癌病人的糖尿病史显著负相关，即无糖尿病史的亚组的抗体浆表达显著更高，抗体癌核高表达的胰腺癌病人的总生存期显著更好，数据库查询目标基因表达高的胰腺癌的生存期显著更好抑癌。
附图说明
图1为本发明实验原理图示意图；
图2为本发明检测结合位置引物设计示意图；
图3为本发明检测原始数据及分析示意图；
图4为本发明3个样品中RIP CIRBP扩增的模板量示意图；
图5为本发明RIP CIRBP扩增电泳图示意图；
图6为本发明CIRBP扩增曲线示意图；
图7为本发明CIRBP溶解曲线示意图；
图8为本发明TP53扩增曲线示意图；
图9为本发明TP53溶解曲线示意图；
图10为本发明原始数据及计算示意图；
图11为本发明细胞低温敏感性增殖率示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-11，本发明实施例提供一种技术方案：一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，所述方法步骤包括如下：
S1：材料准备，准备试剂细胞培养试剂：胎牛血清，DMEM-高糖培养基，RPMI-1640培养基，青链霉素，PBS磷酸钾缓冲液，Trypsin-EDTA(0.25％)phenol red以及实验耗材6孔板细胞培养板，12孔板细胞培养板，24孔板细胞培养板，48孔板细胞培养板，96孔板细胞培养板，巴氏吸管；
S2：细胞复苏，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出冻存管，迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，一滴一滴地加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上，离心，在低速离心机上，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37℃含CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞沉降速度情况而定；
S3：细胞培养，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出细胞培养瓶，无菌操作，打开瓶盖，吸掉旧培养液，用PBS洗涤细胞一至二次，加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，轻洗细胞皿底部，吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培养箱2-3分钟，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用；
S4：实验分组，检测项目为RIP检测CIRBP调控TP53、、PCR检测CIRBP、TP53、wb、CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1、普鲁士蓝染色、激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS、谷胱甘肽GSH检测、流式凋亡检测、细胞增殖生长曲线检测；
S5：RIP检测P CIRBP调控TP53。
所述步骤S4中实验流程为：a：细胞裂解液获取；b：磁珠的准备；c：染色质剪切；d：RNA结合蛋白免疫沉淀；e：RNA纯化。
所述S4中R PCR检测CIRBP、TP53步骤为：样本总RNA提取、三步法荧光定量RT-PCR反应、荧光定量PCR反应、荧光定量RT-PCR数据分析。
样本总RNA提取步骤为取适当样本材料液氮研磨后加入1000ul Trizol充分裂解，接着转移至2ml离心管中，将2ml离心管振荡2min，其后于15-30℃孵育5min，加入200ul氯仿(按0.2ml氯仿/1ml Trizol)，盖紧管盖，充分振荡15-60s，不大于12000g，2-8℃离心15min，小心吸取上清转移至另一离心管中，切勿吸到中间层，加入500ul异丙醇(按0.5ml异丙醇/1ml Trizol)。
所述步骤S4中wb检测CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1步骤为：a：收集蛋白样品，SDS-PAGE凝胶配制，样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，上样与电泳，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白；b：转膜(Transfer)，通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短；c：封闭，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜；d：一抗孵育，用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；e：按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，二抗需根据一抗进行选择，用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；f：蛋白检测(Detection of proteins)，使用BeyoECL Plus等ECL类试剂来检测蛋白，压片可以采用专用的压片暗盒进行，洗片时可以使用X光片自动洗片机；g：凝胶图象分析，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
所述步骤S4中普鲁士蓝染色步骤为a：95％酒精固定60分钟以上；b蒸馏水洗；c：取2％亚铁氢化钾水溶液和2％盐酸水溶液等份混合，滴在涂片上，10-20分钟d：蒸馏水洗；e：核固红复染；f：水洗，脱水，透明，封固。
所述步骤S4中激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS步骤为a：MitoTrackerTM Red储存液的配制；b：MitoTracker&trade Red工作液的配制；c：线粒体的荧光标记；d：装载ROS探针；e：MitoSOX加载细胞；f：清洗；g：镜检。
所述步骤S4中细胞增殖生长曲线检测步骤为a：取各处理组细胞进行下面实验；b：消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×105个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×104个；c：贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测；d：收集各个时间点的细胞(0h，24h，48h，72h)加入CCK-8溶液(碧云天，Cat.No.C0037)，比例为1/10。即100ul培养液加入10ul检测液；e：在孵育4小时后，酶标仪读板，CCK-8检测读取OD450数据。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述方法步骤包括如下：
S1：材料准备，准备试剂细胞培养试剂：胎牛血清，DMEM-高糖培养基，RPMI-1640培养基，青链霉素，PBS磷酸钾缓冲液，Trypsin-EDTA(0.25％)phenol red以及实验耗材6孔板细胞培养板，12孔板细胞培养板，24孔板细胞培养板，48孔板细胞培养板，96孔板细胞培养板，巴氏吸管；
S2：细胞复苏，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出冻存管，迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，一滴一滴地加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上，离心，在低速离心机上，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37℃含CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞沉降速度情况而定；
S3：细胞培养，将水浴锅预热至37℃，用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等，取出细胞培养瓶，无菌操作，打开瓶盖，吸掉旧培养液，用PBS洗涤细胞一至二次，加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，轻洗细胞皿底部，吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培养箱2-3分钟，轻拍培养瓶壁使大部分细胞脱落，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用；
S4：实验分组，检测项目为RIP检测CIRBP调控TP53、、PCR检测CIRBP、TP53、wb、CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1、普鲁士蓝染色、激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS、谷胱甘肽GSH检测、流式凋亡检测、细胞增殖生长曲线检测；
S5：RIP检测P CIRBP调控TP53。
2.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤S4中实验流程为：
a：细胞裂解液获取；
b：磁珠的准备；
c：染色质剪切；
d：RNA结合蛋白免疫沉淀；
e：RNA纯化。
3.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述S4中RPCR检测CIRBP、TP53步骤为：样本总RNA提取、三步法荧光定量RT-PCR反应、荧光定量PCR反应、荧光定量RT-PCR数据分析。
4.根据权利要求3所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：样本总RNA提取步骤为取适当样本材料液氮研磨后加入1000ul Trizol充分裂解，接着转移至2ml离心管中，将2ml离心管振荡2min，其后于15-30℃孵育5min，加入200ul氯仿(按0.2ml氯仿/1ml Trizol)，盖紧管盖，充分振荡15-60s，不大于12000g，2-8℃离心15min，小心吸取上清转移至另一离心管中，切勿吸到中间层，加入500ul异丙醇(按0.5ml异丙醇/1ml Trizol)。
5.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤S4中wb检测CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1步骤为：
a：收集蛋白样品，SDS-PAGE凝胶配制，样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，上样与电泳，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白；
b：转膜(Transfer)，通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短；
c：封闭，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜；
d：一抗孵育，用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；
e：按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，二抗需根据一抗进行选择，用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟，共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数；
f：蛋白检测(Detection of proteins)，使用BeyoECL Plus等ECL类试剂来检测蛋白，压片可以采用专用的压片暗盒进行，洗片时可以使用X光片自动洗片机；
g：凝胶图象分析，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
6.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤S4中普鲁士蓝染色步骤为a：95％酒精固定60分钟以上；b蒸馏水洗；c：取2％亚铁氢化钾水溶液和2％盐酸水溶液等份混合，滴在涂片上，10-20分钟d：蒸馏水洗；e：核固红复染；f：水洗，脱水，透明，封固。
7.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤S4中激光共聚焦检测线粒体活性氧ROS步骤为a：MitoTrackerTMRed储存液的配制；b：MitoTracker&trade Red工作液的配制；c：线粒体的荧光标记；d：装载ROS探针；e：MitoSOX加载细胞；f：清洗；g：镜检。
8.根据权利要求1所述一种利用CIRBP作为胰腺癌诊断及治疗分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤S4中细胞增殖生长曲线检测步骤为a：取各处理组细胞进行下面实验；b：消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×105个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×104个；c：贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测；d：收集各个时间点的细胞(0h，24h，48h，72h)加入CCK-8溶液(碧云天，Cat.No.C0037)，比例为1/10。即100ul培养液加入10ul检测液；e：在孵育4小时后，酶标仪读板，CCK-8检测读取OD450数据。
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