CN113332308A - 调控hsp90 b1表达量的制剂在制备预防或治疗多囊卵巢综合征药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调控HSP90B1表达量的制剂在制备预防或治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。通过本研究的开展，我们认为HSP90B1参与了PCOS卵巢颗粒细胞增殖，使卵泡内颗粒细胞凋亡减少，从而引起增殖和凋亡的平衡失调，导致窦卵泡闭锁的减少，引起卵巢内多囊性的改变和排卵障碍的发生，HSP90B1可能参与了PCOS发生发展的病理机制，HSP90B1有可能成为PCOS的药物靶标。

Description

调控HSP90 B1表达量的制剂在制备预防或治疗多囊卵巢综合 征药物中的应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及调控HSP90 B1表达量的制剂在制备预防或治疗多 囊卵巢综合征药物中的应用。

背景技术：

自1935年Stein和Leventhal首次报导多囊卵巢综合征(PCOS)以来，科学家们已对这一 疾病进行了近70年的潜心研究，但病因仍然不清，发病机制尚不明确，成为妇科内分泌领域 最为复杂的研究热点之一。大量的致力于临床和实验室研究表明该综合征是一种多种基因参 与、并与卵巢微环境相互作用所致的内分泌代谢紊乱的综合征，目前认为PCOS的病理机制 与高雄激素血症和胰岛素抵抗密切相关，超过70％PCOS妇女合并胰岛素抵抗(IR)，80％患 者有高雄激素血症，其病理生理变化可能与雄激素的生物合成、胰岛素信号传导通路、促性 腺激素的生物活性相关。

卵巢组织是女性生殖腺，承担着产生卵子和合成性激素的重要功能，卵泡发育障碍是 PCOS的一个特征性病理改变，双侧卵巢呈多囊改变足PCOS的形态学特征，其在卵巢皮质中 聚集了大量直径0.5-1.0cm的窦卵泡，无成熟卵泡。何种原因造成卵泡发育异常尚不清楚，已 知卵泡发育是一个由促进卵泡增殖生长或凋亡闭锁的多种因素相互拮抗平衡的复杂过程。近 期大量研究提示，卵巢自身的凋控机制对卵泡的发育或闭锁起主要作用，下丘脑一垂体一卵 巢轴中上游调节机制起丰相对次要作用。卵巢做为卵子发生的唯一场所，其局部蛋白表达及 功能异常将直接影响卵泡发育的结局。因此明确PCOS卵巢组织与正常卵巢组织蛋白表达的差 异并找到参与调控卵泡发育机制的相关蛋白是研究PCOS卵泡发育机制的一个有效切入点，对 最终阐明PCOS病理机制改变有着重要的意义。基于上述观点，我们通过比较PCOS卵巢组 织和正常卵巢组织差异表达的蛋白质，寻找可能与PCOS的发病机制、以及卵泡发育障碍相 关的蛋白质，为预防和治疗多囊卵巢综合征等增加科学依据。

发明内容：

本发明的目的是提供调控HSP90 B1表达量的制剂在制备预防或治疗多囊卵巢综合征药 物中的应用。

优选，干扰HSP90 B1表达降低HSP90 B1表达量的在制备预防或治疗多囊卵巢综合征药 物中的应用。

优选，所述的干扰HSP90 B1表达是通过siRNA干扰HSP90 B1表达，所述的siRNA为：

Hsp90β:5′-GGCAGAGGAAGAGAAAGGUGAGAAA-3′

NC:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′

本发明的第二个目的是提供HSP90 B1作为多囊卵巢综合征药物筛选靶标的应用。

本发明通过实验发现，HSP90B1的异常表达导致颗粒细胞的异常增殖，及凋亡减少。导 致PCOS的异常增生，我们通过干扰及过表达PCOS卵巢颗粒细胞HSP90蛋白，从正反面进 一步验证了HSP90参与PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的负向调节，HSP90B1的异常表达与PCOS患者卵巢的增殖状态有关系，HSP90B1促进卵巢颗粒细胞增殖。因此，通过本研究的开展，我们认为HSP90B1参与了PCOS卵巢颗粒细胞增殖，使卵泡内颗粒细胞凋亡减少，从而引起增殖和凋亡的平衡失调，导致窦卵泡闭锁的减少，引起卵巢内多囊性的改变和排卵障碍的发 生，HSP90B1可能参与了PCOS发生发展的病理机制，HSP90B1有可能成为PCOS的药物 靶标。

附图说明

图1：二维DIGE分析鉴别PCOS与正常卵巢差异表达蛋白；

图2：PCOS组与非PCOS组差异表达蛋白点31个；

图3：(Western blotting，A)检测对照组和多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢组织中HSP90B1、 CALM1、ANXA6和TPM2蛋白的表达。采用免疫印迹法给出了一个具有代表性的结果。PCOS 患者组织中HSP90B1和CALM1升高，ANXA6和TPM2降低。内标采用GAPDH。通过密 度分析定量评估蛋白质表达，数据以靶蛋白与GAPDH的平均比值±标准差表示。n＝5。(C) 用免疫组织化学方法分析鉴定蛋白的表达水平，并用DAB底物进行染色。用细胞计数法对蛋白表达进行定量分析，以阳性细胞数与细胞核数的平均比值±标准差表示，n＝10。

图4：pCMV-3×Flag-HSP90过表达载体图；

图5：PCNA和caspase-3在多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢中的表达增加。(A)免疫组 化检测S期相关增殖细胞核抗原(PCNA)。取多囊卵巢综合征(PCOS)患者和正常卵巢组织切片，用抗PCNS抗体(稀释比1:200)染色2h，然后用第二抗体孵育。染色切片用DAB 基质显影，并在光对比显微镜下观察(放大20倍)。显示了一个代表性数据。westernblotting 分析PCNA(B，左图)和caspase-3(C，上图)的表达。免疫印迹用抗PCNA抗体(稀释度 1:500)和抗切割的caspase-3(稀释度1:750)孵育。用GAPDH抗体(稀释度1:5000)检测 内控蛋白GAPDH。显示了一个代表性数据。根据westernblotting分析结果，用密度分析法定 量分析PCNA(B，右图)和caspase-3(C，下图)的表达水平。数据表示为检测到的蛋白质 密度与GAPDH的平均比值±标准差，n＝10。

图6：PCOS卵巢组织细胞凋亡减少，HSP90B1增多。(A)MTT法检测细胞活力，将纯化的Ctrl和PCOS卵巢细胞在RPMI1640培养基中培养一定时间。数据表示为OD值的平均值±标准误差。显示了三个独立数据中的一个。(B)卵巢活检细胞悬液用碘化丙啶(PI)和结合FITC的膜联蛋白V染色。用流式细胞仪对染色细胞进行分析，得到一个有代表性的数据。(C)对凋亡细胞(Annexin V+PI-)进行定量分析，数据以凋亡细胞的平均百分比±标准差表示，n＝10。(D)Western印迹分析HSP90蛋白表达水平。用抗HSP90抗体(稀释1:1000)孵育 印迹，显示一个代表性数据(左图)，用密度分析法定量分析条带密度，数据表示为靶蛋白 与GAPDH的平均比值±标准差，n＝10(右图)。

图7：敲低HSP90B1蛋白表达增加卵巢细胞凋亡。(A)将siRNA转染卵巢细胞24小时，以转染cramble-siRNA的细胞作为对照。转染48小时后，Western印迹分析HSP90B1的表达，以GAPDH抗体作为负载对照。显示了一个代表性数据。(B)用MTT法检测转染siRNA的 细胞活力。数据以平均细胞活力±标准差表示，n＝10。(C)用碘化丙啶(PI)和FITC结合 膜联蛋白V染色，流式细胞术分析细胞凋亡。数据以点图表示，显示了一个代表性数据。(D) 对凋亡细胞进行定量分析，数据以凋亡细胞的平均百分比±标准差表示，n＝10。

图8：HSP90B1蛋白的过度表达降低了卵巢细胞的凋亡。(A)将HSP90质粒转染卵巢细胞 24小时，以空载体转染卵巢细胞作为对照。转染48小时后，Western印迹分析HSP90的表达， 以GAPDH抗体作为负载对照。显示了一个代表性数据。(B)转染HSP90质粒的细胞用MTT 法检测细胞活力。数据以平均细胞活力±标准差表示，n＝10。(C)用碘化丙啶(PI)和annexinv 染色后，流式细胞仪分析转染细胞的凋亡情况。数据以点图形式显示，其中一个数据具有代 表性。(D)对凋亡细胞进行定量分析，数据以凋亡细胞的平均百分比±标准差表示，n＝10。

图9是blast分析结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、材料与方法

1、临床样本的收集

本项目组采用2003年欧洲人类生殖和胚胎与美国生殖医学会的(ESHRE/ASRM)鹿特 丹专家会议推荐的诊断标准：

(1)、稀发排卵或无排卵；

(2)、高雄激素的临床表现和(或)高雄激素血症；

(3)、超声表现为多囊卵巢(一侧或双侧卵巢有12个以上直径为2～9mm的卵泡，和(或) 卵巢体积＞10ml)；

(4)、上述3条中符合2条，并排除其他高雄疾病如先天性肾上腺皮质增生、库兴综合征、 分泌雄激素的肿瘤。

由于PCOS的诊断需要排除其他相关高雄激素性疾病，故由专业研究人员按照鹿特丹专家 会议进行筛选PCOS患者。

病例纳入标准如下：

(1)、符合多囊卵巢综合征的诊断标准；

(2)、年龄在18～45岁之间的女性；

(3)、本次治疗期间未曾使用过其他西药治疗；

(4)、知情同意，志愿受试，并可追踪观察者。

病例排除标准如下：

(1)、不符合多囊卵巢综合征的诊断标准者；

(2)、年龄在18以下或45岁以上的女性，或为妊娠期、哺乳期妇女；

(3)、具有严重的心血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、血液系统疾病、肺脏疾病或影响其 生存的重大疾病，如肿瘤或艾滋病等；

(4)、有精神或法律上的残疾患者；

(5)、肾上腺、甲状腺、垂体等内分泌功能异常的患者；

(6)、怀疑或确有酒精、药物滥用病史的患者；

PCOS组(实验组)入选30例，行腹腔镜下卵巢楔形切除术，取楔形切除的卵巢组织进行 研究；非PCOS组(对照组)选择年龄、体重与PCOS组匹配，月经周期正常，血清性激素及血糖检查均在正常范围、因单侧卵巢肿瘤手术的妇女，行腹腔镜下患侧卵巢肿瘤切除术及健 侧卵巢组织剖探术，取剖视活检的健侧卵巢组织进行研究。实验组及对照组病例来源于广东 省妇幼保健院。收集样本前，征得医院伦理委员会及患者同意，并与患者签署手术同意书。 腹腔镜手术收集卵巢组织样本时，其大小应达到整个卵巢组织的十分之一，在卵巢组织表面 取一块类似金字塔样结构的组织，该组织应包括有颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵母细胞、间质 细胞等各种结构。手术将由广东省妇幼保健院具有IV类腹腔镜执业资格的妇科内分泌主任医 师进行，以确保临床样本收集的准确性及代表性。

2、方法

2.1卵巢荧光差异凝胶电泳技术

2.1.1卵巢蛋白的提取及纯化

PCOS组及非PCOS组共60例患者，取出卵巢组织，加入3～5倍体积的裂解缓冲液[7mol /L尿素，2mo l/L硫尿，2％IPG缓冲液(pH 3～10)，40mmol/L Tris，4％CHAPS，100mmol/LDTT]，同时加入蛋白酶抑制剂(1mmol/LPMSF，1.4mmol/LPepstain，2.1mmo l/LLepstain，1mmol/L EDTA)。将样品和裂解液混合物冰上匀浆，11000IU/min×10s×10次，待组织充分粉碎，混悬液移至Eppendorf管中，4℃静止1h，其间每隔20min拿出冲击震荡 约30s，然后40000×g(4℃)离心60min，取上清，分装成30μL，-70℃保存。蛋白浓度用Bradford法测定。

2.1.2蛋白定量

用Ettan^TM2-D Quant Kit试剂盒测定样本蛋白浓度。设置6个标准品管，编号为1-6，分 别加入2mg/ml的BSA0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，再设置待测样品管，加入适 量待测样品(根据Bradford法蛋白定量结果估计样品蛋白含量在1-50mg内)。DU800核酸 /蛋白分析仪测定波长485nm处的吸亮度值，以蒸馏水作为空白对照。根据1-6管标准品的吸 亮度值和BSA含量绘制标准曲线(仪器软件程序自动绘制)，根据标准曲线和蛋白样品的吸 亮度值计算样品蛋白含量(软件自动计算并输出)。

2.1.3CyDye染料标记

将Cydye染料从冰箱中取出，室温放置5min，用二甲基甲酰胺溶解染料，贮液配成1mmol/μl，工作液配成400pmol/μl，将样品稀释至5-10mg/ml，pH调节到8.5。避光冰上放置30min后，加1μl 10mmol/L的赖氨酸，再次避光冰上放置10min终止反应。加入等体积 2×Sample buffer，冰上避光放置10min。荧光染料标记的内标，由样品蛋白各取25μg混合而成，每块胶内标总量为50μg，用Cy2染料进行标记。使用三种特殊的荧光染料Cy2、Cy3、Cy5以蛋白和染料按1μg：8pmol的比例混匀后进行标记反应。

2.1.4双向凝胶电泳

标记好的样品蛋白上样到pH 3-10 NL的24cm非线性IPG胶条，置入EttanTMIPGPhor 进行第一向电泳，具体参数见表2-1。在第二向电泳SDS-PAGE前，对IPG胶条依次用二硫 苏糖醇SDS平衡液、碘乙酰胺SDS平衡液进行平衡，每次平衡各15min。用EttanTM DALTSix电泳仪进行第二向电泳，将平衡好的IPG胶条放置于12.5％的聚丙稀酰胺胶上端，用低熔 点琼脂糖封胶。采用恒定功率，首先每张胶3W，电泳45min，然后，恒定功率每张胶17W 进行电泳，直至溴酚蓝移至胶底部为止。整个双向电泳全程均避光。

表2-1

3、方法

3.1卵巢荧光差异凝胶电泳技术

3.1.1卵巢蛋白的提取及纯化

PCOS组及非PCOS组共60例患者，取出卵巢组织，加入3～5倍体积的裂解缓冲液[7mol /L尿素，2mol/L硫尿，2％IPG缓冲液(pH 3～10)，40mmol/L Tris，4％CHAPS，100mmol/L DTT]，同时加入蛋白酶抑制剂(1mmol/LPMSF，1.4mmol/L Pepstain，2.1mmo l/LLepstain，1mmol/L EDTA)。将样品和裂解液混合物冰上匀浆，11000IU/min×10s×10次，待组织充分粉碎，混悬液移至Eppendorf管中，4℃静止1h，其间每隔20min拿出冲击震荡 约30s，然后40000×g(4℃)离心60min，取上清，分装成30μL，-70℃保存。蛋白浓度用Bradford法测定。

3.1.2蛋白定量

用Ettan^TM2-D Quant Kit试剂盒测定样本蛋白浓度。设置6个标准品管，编号为1-6，分 别加入2mg/ml的BSA0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，再设置待测样品管，加入适 量待测样品(根据Bradford法蛋白定量结果估计样品蛋白含量在1-50mg内)。DU800核酸 /蛋白分析仪测定波长485nm处的吸亮度值，以蒸馏水作为空白对照。根据1-6管标准品的吸 亮度值和BSA含量绘制标准曲线(仪器软件程序自动绘制)，根据标准曲线和蛋白样品的吸 亮度值计算样品蛋白含量(软件自动计算并输出)。

3.1.3 CyDye染料标记

将Cydye染料从冰箱中取出，室温放置5min，用二甲基甲酰胺溶解染料，贮液配成1mmol/μl，工作液配成400pmol/μl，将样品稀释至5-10mg/ml，pH调节到8.5。避光冰上放置30min后，加1μl 10mmol/L的赖氨酸，再次避光冰上放置10min终止反应。加入等体积 2×Sample buffer，冰上避光放置10min。荧光染料标记的内标，由样品蛋白各取25μg混合而成，每块胶内标总量为50μg，用Cy2染料进行标记。使用三种特殊的荧光染料Cy2、Cy3、 Cy5以蛋白和染料按1μg：8pmol的比例混匀后进行标记反应。

3.1.4双向凝胶电泳

标记好的样品蛋白上样到pH 3-10NL的24cm非线性IPG胶条，置入EttanTMIPGPhor 进行第一向电泳，具体参数见表2-1。在第二向电泳SDS-PAGE前，对IPG胶条依次用二硫 苏糖醇SDS平衡液、碘乙酰胺SDS平衡液进行平衡，每次平衡各15min。用EttanTM DALTSix电泳仪进行第二向电泳，将平衡好的IPG胶条放置于12.5％的聚丙稀酰胺胶上端，用低熔 点琼脂糖封胶。采用恒定功率，首先每张胶3W，电泳45min，然后，恒定功率每张胶17W 进行电泳，直至溴酚蓝移至胶底部为止。整个双向电泳全程均避光。

二、结果

1.分析胶荧光图像扫描

经过荧光差异双向凝胶电泳及Typhoon Imager 9400成像仪对胶进行荧光扫描，利用 ImageQuant TL分析软件观察，不同染料标记的样本呈现不同颜色的图谱(图1)，胶扫描后 得到三张不同颜色的图谱，其中蓝色图谱代表内标，由Cy2标记，见图1C；绿色图谱代表PCOS 实验组蛋白，由Cy3标记，见图1A；红色图谱代表对照组蛋白，由Cy5标记，见图1B。将胶 的Cy3和Cy5通道进行叠加，图1D为得到的叠加后的图像，表达量接近的蛋白点，叠加后呈黄 色，绿色代表PCOS实验组上调的蛋白点，红色代表PCOS实验组表达下调的蛋白点；再将Cy3 标记对照组蛋白，Cy5标记PCOS实验组蛋白，方法同前.。

2.DeCyder 2D软件分析蛋白差异点

制备胶染色后扫描获取图像，使用DeCyder 2D 6.5差异分析软件对DIGE结果进行分析， 经过胶内差异分析和胶间差异分析，PCOS实验组和对照组相比较，共找出了31个差异蛋白点 (见图2)。通过DeCyder 2D 6.5差异分析软件界面，模拟胶点的三维图像和丰度变化曲线， 以图2的2280号差异胶点为例，该图可形象的模拟出蛋白的变化的比值。

3多囊卵巢综合征患者相关差异蛋白质谱分析结果

使用ABI 4800MALDI-TOF/TOF质谱仪对31个差异蛋白点进行鉴定。通过mascot软件 检索SwissProt数据库鉴定蛋白，去除鉴定结果相同的蛋白、表达差异变化倍数上调或下调不 超过1.5倍的蛋白点及未能鉴定出的蛋白质，共鉴定出18种蛋白质，其中13种蛋白质表达 上调，5种蛋白质表达下调，具体蛋白名称可见表1。

表1：卵巢蛋白在正常对照组和多囊卵巢综合征组之间有显著差异。

GANAB:neutralα-glucosidaseAB；HSP90:heat shockprotein 90；SERPINC1:antithrombin-III；CALR: calreticulin；TUBB:tubulin-βchain；SET:protein SET；PTRF:polymerase I andtranscriptrelease factor；

C1QBP:complementcomponent 1Q subcomponent-bindingprotein,mitochondrial；YWHAE:14-3-3protein epsilon；PGRMC1:membrane-associatedprogesterone receptorcomponent 1；VIM:vimentin；CALM1: calmodulin 1；RBP1:retinol-bindingprotein 1；ANXA6:annexinA6；HSPA5:78kDa glucose-regulatedprotein； TPM2:tropomyosinbetachain；LMNA:prelamin-A/C.

4.多囊卵巢综合征患者卵巢组织相关蛋白质WESTERN BLOT及免疫组化结果

同对照组相比，HSP90、CALM1、RBP1和PGRMC1在PCOS组的灰度值均增高，ANXA6、TPM2在PCOS组的灰度值均降低(P<0.05)；我们同时利用免疫组化分析了在HSP90B1、CALM1、RBP1、PGRMC1、ANXA6、TPM2在PCOS组和对照组卵巢组织中的细胞定位， 结果如图所示(图3)。HSP90、CALM1、RBP1、PGRMC1、ANXA6、TPM2广泛表达于卵泡 组织各种细胞的细胞质中，PCOS组卵巢组织中HSP90、CALM1、RBP1、PGRMC1表达量 升高，而ANXA6、TPM2在PCOS卵巢中表达量降低。HSP90、CALM1、RBP1、PGRMC1、 ANXA6、TPM2这6个蛋白质在两组卵巢组织中表达差异情况进一步证实了由蛋白质组学研 究得到的结果。

以上我们的研究则发现了HSP家族的一种蛋白质：HSP90B1在PCOS患者卵巢组织中高 表达，是正常对照组的1.94倍，之后的Western blot及免疫组化的结果与蛋白质组学结果一致。 HSP90 B1是我们在PCOS患者卵巢组织发现的一种新的蛋白质，作为分子伴侣，HSP90 B1对 PCOS的发生发展起什么作用？HSP90 B1与PCOS的卵巢多囊样改变、高雄激素血症、以及胰 岛素抵抗有联系吗？HSP90 B1与PCOS的病理生理机制有关联吗？HSP90 B1可能成为PCOS 的药物靶标吗？我们对此很有兴趣，为了研究HSP90在PCOS发生发展中的作用机制，进一步 明确HSP90 B1在PCOS卵巢局部对细胞增殖、凋亡的影响，我们在PCOS卵巢颗粒细胞中干扰 (SiRNA)HSP90 B1以及过表达HSP90 B1，观察卵巢颗粒细胞凋亡情况，对HSP90B1在 PCOS卵巢颗粒细胞的表达、及病理机制进行初步研究。

实施例2：

一、材料与方法

取PCOS组(实验组)及非PCOS组(对照组)卵巢组织石蜡切片各10例，进行免疫组化等研究；收集就诊于广东省妇幼保健院生殖中心的PCOS患者卵泡液，原代分离培养PCOS卵巢颗粒细胞。

实验方法

1细胞实验部分

1.1卵巢颗粒细胞分离与培养

穿刺收集的卵泡液，以200g离心10分钟，弃去上清，用0.01mol/LPBS重悬细胞，200g 离心10分钟收集细胞。加入适量的0.25％胰蛋白酶-0.052mol/L EDTA消化液，37℃消化10 分钟。加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。200g离心10分钟，弃上清。用PBS重悬细胞，然后将悬液小心地加至等体积的Ficoll淋巴细胞分离液液面上，400g离心20分钟。用一次性吸管小心地将两层液体间的细胞层收集到另一试管，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基洗涤细胞一次，用同样的培养基重悬后，细胞计数，按3×10⁵/孔的密度接种至6孔板中，37℃5％CO₂培养箱中培养过夜，第二天换液，将未贴壁细胞洗去，换上新的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养。

1.2HSP90B1过表达质粒转染

分离48h后的颗粒细胞，用PBS洗两遍，每孔加入1.5ml无血清DMEM/F12培养基，取2μg质粒溶于250μl Opti-MEM培养基中，混匀后静置，记为管A。取6μlLipofectamineTM2000 溶于250μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟，记为管B。将B管加入至A 管中，颠倒混匀，室温静置20分钟，滴加至6孔板孔中，轻轻上下左右倾斜培养板以混匀液 体，37℃、5％CO2培养箱中培养。4小时后吸去转染液，加入2ml新鲜的含10％胎牛血清的 DMEM/F12培养基，继续培养。

1.3MTT检测细胞增殖

细胞提前一天消化成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，分到96孔板，每 孔100ul，即每孔细胞为5×10³个，每种共9孔。分别在24、48和72小时后分别加入MTS试剂，比例为1：10，即100μl培养液加入10μl检测液。37℃孵育4h后，酶标仪检测490nm 吸光值。

1.4细胞凋亡检测

1)无EDTA胰酶消化并收集细胞，PBS清洗细胞二次。

2)用1倍的Binding Buffer重悬细胞为1×106个细胞/毫升。

3)取100ul上述悬液至流式管中。

4)分别加入5ulAnnexinV和5ul 7-AAD。

5)混匀，室温避光孵育15min。

6)加入400ul的Binding Buffer混匀后1小时内进行流式检测。

2、蛋白检测部分

2.1收细胞蛋白

1)配细胞裂解液：120μl RIPA/孔(35mm孔)。

2)标记好带扣的EP管，准备冰盒、细胞刮、烧杯、负压吸引器等。

3)把细胞板放在斜面冰上操作。彻底吸干培养基(吸2次)，每孔加入120μl RIPA(含 血清的细胞先用4℃预冷的PBS洗2遍)。用细胞刮刮细胞，收集到相应的EP管内(EP管置于专用的冰盒里)。操作时注意不要把冰溅入细胞孔内。

4)超声(打断基因组DNA，避免样本太粘稠影响上样。)超声强度37％，0.8s/次。用双蒸水洗3次探头，擦干。每个EP管的样本有效超声3次。已超声的蛋白应及时做WesternBlotting，特别是检测磷酸化蛋白。无特殊情况，测磷酸化蛋白必须当天做WesternBlotting， 剩余的样本储存于-20℃。

2.2蛋白定量(Bradford法)

操作步骤：

1)将2ug/ul的BSA倍比稀释成0.25ug/ul、0.5ug/ul、1ug/ul、2ug/ul四个浓度梯度。

2)将样本稀释5倍。

3)向1.5mlEP管中加入标准试剂和样本各20ul，取20ul ddH2O做空白对照，再加入500ul 考马斯亮蓝G250，混匀，静置反应3-5min。

4)向96孔板中加入270ul反应液，用酶标仪在595nm处检测样本的吸亮度。

5)标准品扣除试剂空白后作标准曲线，样本扣除试剂空白后进行定量。

6)根据标准曲线算出样本浓度，将所有样本稀释成最低浓度。

2.3Western Blot检测蛋白表达

收集细胞蛋白后，采用10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶测目的蛋白，SDS-PAGE电泳后将蛋 白转至PVDF膜上，5％脱脂牛奶封闭后，将相应的一抗Caspase3{(CST,cst9662),1:750}, Calmodulin{(Abcam,ab45689),1:5000},HSP90{(CST,cst4877),1:1000},ANXA6{(Abcam, ab196942),1:1000},TPM2{(Abcam,ab180866),1:1000},4℃孵育过夜后，用TBST每次7分钟 洗两次后，用相应的稀释好的二抗(HRP标记二抗，1:3000,Forevergen)室温下孵育1～2h 后，用TBST每次7分钟洗三次后，进行化学发光显影(ECL，Forevergen)。用ImageJ分 析目标条带的光密度值。以GAPDH{(Transgen,HC301)，1:5000}作为内参照，比较不同处 理后上述蛋白表达的差异。

3、免疫组化部分

(1)、脱蜡和水化

脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。

1)组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；

2)无水乙醇中浸泡5min；

3)95％乙醇中浸泡5min；

4)70％乙醇中浸泡5min；

(2)、PBS洗两次各5min。

(3)、用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H₂O₂，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。

(4)、抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。煮沸热修复，电炉或者水浴锅 加热，0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右，放入组织切片加热10～15min，加热 完毕用自来水冷却至室温，方能将切片取出。

(5)、PBS洗5min。

(6)、滴加5％BSA封闭液，室温封闭15分钟。甩去多余液体，不洗。

(7)、滴加一抗，4℃过夜(4℃过夜后在室温复温45min)。

(8)、PBS洗3次每次2min。

(9)、滴加聚合HRP标记抗兔子/小鼠IgG二抗，室温孵育1h。

(10)、PBS洗3次每次2min。

(11)、DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)，观察至目的信号深背景颜色浅时立即用蒸馏水终止。

(12)、苏木素复染20s，蒸馏水洗2次每次2min。

(13)、脱水：把切片放入50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇中脱水，每次2min。

(14)、透明：将切片放入100％二甲苯10min透明。

(15)、中性树脂50ul封片，室温保存。

4、分子实验部分

4.1转染siRNA干扰HSP90B1对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的影响。

4.1.1合成干扰序列

Hsp90β:5′-GGCAGAGGAAGAGAAAGGUGAGAAA-3′

NC:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′

4.1.2细胞转染程序：

细胞分组：空白组、siNC组(转染siNC)、siHSP90B1(转染siRNA)组，转染前一天，6-7×10⁵细胞接种在6孔板上，2ml含FBS和抗生素的DMEM细胞培养基。在250μl的 Opti-MEM无血清培养基加入20pmol siRNA，柔和混匀；用250μl Opti-MEM稀释2.5μl Lipofectamine2000 Reagent试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释好的siRNA和 Lipofectamine 2000Reagent试剂混合，轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成 siRNA/Lipofectamine 2000Reagent复合物。将100μl siRNA/Lipofectamine 2000 Reagent复合物 加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。细胞在CO2培养箱中 37℃温育4h后换回新鲜培养基继续培养48h。弃上清，收集细胞，提取总蛋白，western blot 检测HSP90B1的表达情况。验证HSP90B1干扰片段的干扰效率，再用于后续实验，后续转 染实验步骤同上。

4.2构建HSP90b1过表达载体，检测过表达HSP90B1对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的影响。

准备载体，构建含HSP90的pCMV-3×Flag-HSP90过表达载体。(pCMV-3×Flag质粒图 谱如图4所示)

4.2.1双酶切PCDH-CMV-EF1-GFP载体

酶切体系如下，在1个无菌的1.5mlEP管中分别配制双酶切体系：分别为：ddH2O共36ul， 10×BSA共5ul，10×NEBuffer共5ul，PCDH-CMV-EF1-GFP载体共2ul，NheI酶共1ul，NotI 酶共1ul，总共50ul，37℃酶切2h。第二步进行酶产物回收，采用DNA凝胶回收试剂盒，酶切回收产物取3ul跑琼脂凝胶电泳鉴定。

4.2.2目的片段与载体连接：

向0.2mlEP管中加入以下试剂(其中T4DNALigase酶购于NEB公司)，分别为：ddH2O共4ul，酶切回收的PCR产物(HSP90B1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)共10ul，酶切 回收的PCDH-CMV-EF1-GFP载体共3ul，10×Ligase Buffer共2ul，T4DNALigase共1ul，总 共20ul。室温连接1h。同时做阴性对照，以水代替基因与载体连接。

4.2.3连接产物的转化

冰浴中将连接产物分别加入至50μl Tran5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min， 42℃水浴热休克90s。快速将管转移至冰浴中，冰浴2min。分别加入500μl LB培养基，混匀， 37℃、150g振荡培养40min。将150ul菌液涂布于含氨苄青霉素(Amp 100μg/ml)的LB平 板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。

4.2.4菌落PCR鉴定阳性克隆

因为阴性对照平板没长一个菌，而连接的平板长有很多菌，从中挑7个菌落。我们从平 板上面各接7个菌落于20ul ddH2O中混匀打散菌落；PCR鉴定所挑取菌落。同时，以空载体 作为模板设置一组PCR作为阴性对照。PCR条件为：94℃持续10分钟，94℃再30秒，58℃持续30秒，72℃持续3min，30个循环，之后72℃持续10分钟，置于4℃冰箱保存。PCR 产物以含溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，最后以测序结果为准。

4.2.5对鉴定正确的菌落溶液进行扩增培养

加入含有相应抗生素的3ml LB培养液中37℃过夜培养，提取其质粒，采用高纯质粒小 量提取试剂盒。用1.5mlEP管收集1ml菌液，12000g离心1min，去上清。加入250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，重悬菌体。加入250μl溶液Ⅱ，温和反复颠倒混匀6次，室温放置2min。 加入350μl溶液Ⅲ，温和反复颠倒混匀6次。12000g离心10min，小心吸去上清至DNA纯化 柱中，空柱12000g离心3min。将柱取出置于新的1.5mlEP管中，加入50μl无菌水(60℃预 热)，静置2min，12000g离心1min，收集管底质粒，质粒测序。

4.2.6测序结果(因每次测序长度为700bp左右，共分4次测序，其中分两次拼接)，具 体如SEQ ID NO.2所示。

4.2.7 BLAST结果如图9所示。

结论：HSP90B1基因已成功插入到PCDH-CMV-EF1-GFP载体中，测序序列正确，Blast结果与PubMED上100％完全一致，可用于后续实验。由此获得含HSP90的 pCMV-3×Flag-HSP90过表达载体，质粒图谱如图4所示，即为图4中的 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。

统计学分析

所有数据均采用SPSS 17.0处理。临床样本进行治疗前后比较时，采用配对t检验进行统计 分析。细胞实验多组之间进行比较时，选用单因素ANOVA进行统计学分析；两组比较时，选 用独立样本t检验。P<0.05表示有统计学差异。

三、实验结果

1.PCOS卵巢组织卵巢中cleaved caspase 3及增殖细胞核抗原(S phase relatedproliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。

1.1组织样本caspase3及PCNA检测

选取10例PCOS患者卵巢组织进行研究，提取总蛋白，用Western blot检测caspase3的 蛋白表达量，结果显示(图5)PCOS组中cleaved caspase3的表达量较正常组要低，表明PCOS 卵巢组织中细胞凋亡量要少于正常组。分别用免疫组化法及Western blot检测PCNA表达， 免疫组化结果表明：PCOS中PCNA的表达较正常组增加(红棕色)，因为PCNA与细胞增 殖程度相关，PCNA的表达量增加表明PCOS中细胞增殖较正常组增多。Western blot检测组 织显示，PCOS组织中PCNA的表达量较正常组要高，结果与免疫组化的结果一致。GAPDH 为内参，两组caspase3及PCNA灰度进行统计，PCOS组明显高于对照，具有统计学意义。 误差线代表标准误，P<0.05。(图5)

2.HSP90B1对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的影响

应用siRNA干扰原代培养的PCOS卵巢颗粒细胞表达HSP90，以及构建过表达载体，在颗 粒细胞上过表达HSP90B1，MTT法检查颗粒细胞生长情况，流式细胞仪检测颗粒细胞的凋亡 情况。

2.1体外分离培养PCOS卵巢颗粒细胞

收集PCOS病人的卵泡液，分离培养卵巢颗粒细胞。在相差显微镜明场下观察细胞生长情 况，待细胞分布均匀，呈索性，状态良好，处于对数生长期时，开始试验。

2.2PCOS与对照组卵巢颗粒细胞的增殖及凋亡情况比较，PCOS与对照组卵巢颗粒细 胞的HSP90 B1表达情况比较(图6)。

在2-D DIGE检测的差异蛋白表达中已经显示，HSP90 B1在PCOS卵巢组织的表达水平 升高。此次我们在体外原代分离培养的PCOS卵巢颗粒细胞中再次进行验证。MTT法及流式 细胞仪检测PCOS卵巢颗粒细胞增殖及凋亡情况。提取细胞总蛋白并定量，以GAPDH作为内参，western blot检测HSP90的表达量。结果显示，PCOS卵巢颗粒细胞增殖较快，凋亡明显降低，PCOS卵巢颗粒细胞的HSP90 B1表达明显升高。对western blot检测结果进行灰度扫描分析，结果显示PCOS组与对照组比较有统计学意义(图6)。Annexin V-PI试剂盒检 测细胞凋亡，使用流式细胞仪分析如图所示。AnnexinV-FITC(+)PI(-)为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC(+)PI(+)为晚期凋亡细胞。根据结果所示分析，与对照组相比，PCOS组凋 亡细胞减少。

2.3siRNA干扰HSP90对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的影响。

将以上siRNA转染入原代培养的PCOS卵巢颗粒细胞内24h后，western blot检测HSP90 的蛋白表达水平。结果显示，正常未转染组HSP90的表达水平较高，转染siRNA后，PCOS 卵巢颗粒细胞内的HSP90明显降低，说明两个干扰片段均能有效干扰HSP90的表达。在转 染24h HSP90后进行MTT法及流式细胞仪检测，生长曲线结果显示：干扰HSP90蛋白后，颗粒细胞的增殖速率较干扰前降低，流式细胞仪检测结果显示干扰HSP90蛋白后，PCOS的颗粒细胞的凋亡程度增加，siRNA转染的细胞较对照组细胞凋亡率有统计学意义(图7)。 说明siRNA干扰HSP90可诱导PCOS卵巢颗粒细胞的凋亡。

2.3过表达HSP90B1对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的影响。

将带有荧光标记的载体转入293T细胞，包装成有活性的病毒颗粒，在感染颗粒细胞后， 通过荧光的表达量估算成功干扰病毒的细胞数量，及成功过表达HSP90蛋白的颗粒细胞数量。 结果显示，大部分的颗粒细胞带有绿色荧光，说明大部分的颗粒细胞过表达HSP90B1蛋白。 WB验证也表明HSP90的表达量较未感染及空载体的要高，表明HSP90B1过表达成功。将 HSP90过表达载体转染入原代培养的PCOS卵巢颗粒细胞内24h后，western blot检测HSP90 的蛋白表达水平。结果显示，正常未转染过表达载体组HSP90的表达水平较低，而转染过表 达载体后，PCOS卵巢颗粒细胞内的HSP90明显增加，说明干扰片段能有效增加HSP90的表 达量。检测卵巢颗粒细胞过表达HSP90B1后细胞的凋亡率。生长曲线结果显示过表达 HSP90B1后的PCOS的颗粒细胞的增殖速率增加。流式检测表明过表达HSP90B1的颗粒细 胞的凋亡程度降低。以上结果提示HSP90B1的过表达导致颗粒细胞的异常增殖、凋亡减少。 可见：HSP90B1抗PCOS卵巢颗粒细胞凋亡，促进颗粒细胞的异常增生(图8)。

以上结果提示HSP90B1的异常表达导致颗粒细胞的异常增殖，及凋亡减少。导致PCOS 的异常增生，我们通过干扰及过表达PCOS卵巢颗粒细胞HSP90蛋白，从正反面进一步验证 了HSP90参与PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的负向调节，HSP90B1的异常表达与PCOS患者卵巢 的增殖状态有关系，HSP90B1促进卵巢颗粒细胞增殖。因此，通过本研究的开展，我们认为 HSP90B1参与了PCOS卵巢颗粒细胞增殖，使卵泡内颗粒细胞凋亡减少，从而引起增殖和凋 亡的平衡失调，导致窦卵泡闭锁的减少，引起卵巢内多囊性的改变和排卵障碍的发生，HSP90B1可能参与了PCOS发生发展的病理机制，HSP90 B1有可能成为PCOS的药物靶标。

序列表

<110> 广东省妇幼保健院

<120> 调控HSP90 B1表达量的制剂在制备预防或治疗多囊卵巢综合征药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2412

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga 60

gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 120

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 180

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 240

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 300

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 360

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 420

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 480

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 540

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 600

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 660

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 720

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 780

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 840

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 900

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 960

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 1020

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1080

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1140

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1200

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac 1260

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1320

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1380

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1440

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1500

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1560

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1620

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1680

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1740

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1800

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1860

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1920

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1980

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 2040

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2100

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2160

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2220

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2280

gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2340

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2400

gatgaattgt aa 2412

<210> 2

<211> 3278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgaagttg ggggaaatag cagagctcgt ttagtgaccg tcagatcgcc tggagacgcc 60

atccacgctg ttttgacctc catagaagat tctagagcta gcgccaccat gagggccctg 120

tgggtgctgg gcctctgctg cgtcctgctg accttcgggt cggtcagagc tgacgatgaa 180

gttgatgtgg atggtacagt agaagaggat ctgggtaaaa gtagagaagg atcaaggacg 240

gatgatgaag tagtacagag agaggaagaa gctattcagt tggatggatt aaatgcatca 300

caaataagag aacttagaga gaagtcggaa aagtttgcct tccaagccga agttaacaga 360

atgatgaaac ttatcatcaa ttcattgtat aaaaataaag agattttcct gagagaactg 420

atttcaaatg cttctgatgc tttagataag ataaggctaa tatcactgac tgatgaaaat 480

gctctttctg gaaatgagga actaacagtc aaaattaagt gtgataagga gaagaacctg 540

ctgcatgtca cagacaccgg tgtaggaatg accagagaag agttggttaa aaaccttggt 600

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gcagaaaaga ggctgaatct tctccatttg ttgagcgact tctgaaaaag ggctatgaag 1800

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aagatgataa aacagttttg gatcttgctg tggttttgtt tgaaacagca acgcttcggt 2280

cagggtatct tttaccagac actaaagcat atggagatag aatagaaaga atgcttcgcc 2340

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cggccgcgaa ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc 2580

acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa cgggtgccta gagaaggtgg 2640

cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg 2700

ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc 2760

gccagaacac agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct 2820

acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc 2880

tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt 2940

ccggcgctcc cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg 3000

cttgctcaac tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg 3060

tgaccggcgc ctacgctaga cgccaccatg gagagcgacg agagcggcct gcccgccatg 3120

gagatcgagt gccgcatcac cggcaccctg aacggcgtgg agttcgagct ggtgggcggc 3180

ggagagggca cccccaagca gggccgcatg accaacaaga tgaagagcac caaaggcgcc 3240

ctgaccttca gcccctacct gctgagccac gtgatggg 3278

Claims (4)

1.调控HSP90 B1表达量的制剂在制备预防或治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的调控HSP90 B1表达量是干扰HSP90B1表达，降低HSP90 B1表达量的制剂在制备预防或治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的干扰HSP90 B1表达是通过siRNA干扰HSP90 B1表达，所述的siRNA为：

Hsp90β:5′-GGCAGAGGAAGAGAAAGGUGAGAAA-3′

NC:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

4.HSP90 B1作为预防或治疗多囊卵巢综合征药物筛选靶标的应用。

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