CN103091140A - 一种虾类生殖细胞染色体的制备方法 - Google Patents
一种虾类生殖细胞染色体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103091140A CN103091140A CN2013100004883A CN201310000488A CN103091140A CN 103091140 A CN103091140 A CN 103091140A CN 2013100004883 A CN2013100004883 A CN 2013100004883A CN 201310000488 A CN201310000488 A CN 201310000488A CN 103091140 A CN103091140 A CN 103091140A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immobile liquid
- preparation
- ovary
- cell
- spermary
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种虾类生殖细胞染色体的制备方法,包括以下步骤:秋水仙素培养精巢/卵巢;KCl低渗处理,卡诺氏固定液预固定;后固定液固定,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸;分散精母/卵母细胞,制成细胞悬液;Giemsa磷酸盐缓冲液染色;Motic显微镜下镜检。本发明优点在于:操作简单高效,能够批量制作染色体玻片;可以快速简便的获得足够的染色体样本,获得的样本分散均匀,背景浅,易于观察,得出的染色体数目准确度高;为虾类染色体制备提供了一种简便易行的方法;采用无毒的固定液,减少对制片操作者的伤害。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,是一种虾类生殖细胞染色体的制备方法。
背景技术
把生物工程的新技术用于虾类的遗传育种与品种改良,是水产养殖上的一个发展方向。
经对现有技术的文献检索发现,传统的染色体压片技术所制的染色体标本,破坏了染色体的结构,无法进行更高层次的染色体实验,并且实验初期的掀片过程会损失大量的分裂相染色体,不利于后续实验的开展。钱国英,汪财生等在《实验生物学报》2005年,第38卷第5期,456-460页发表的《日本沼虾染色体制备的比较研究》一文中比较了低渗法与管渗法2种制片技术:低渗法获得的性腺染色体标本,双线期二价体居多,形态清晰,着丝点位置易分辨;管渗法制备的性腺染色体,分散程度不大,镜检困难。低渗法制备的胚胎材料,背景深,分裂相不易找,形态不易观察;管渗法制备的胚胎染色体中期分裂相多,背景浅,分散好,形态清晰,易于观察及后续实验。两种方法都存在一定的缺陷,对材料的要求较高。因此,需要一种操作简单、镜检效果好的虾类生殖细胞染色体制片法以满足虾、蟹研究的快速发展。
中国专利文献CN101974627A公开了一种鱼类卵巢生殖细胞染色体的制备方法,是取活体成熟卵巢并用生理盐水清洗;将卵巢置于含有1μg/ml雌激素的生理盐水中且将卵巢切成小段,置于摇床上室温避光培养1~3h;在培养皿底部涂一层1%琼脂并盛入4%冰醋酸溶液,从所培养的卵巢中取出几粒卵放入4%冰醋酸溶液中,待卵核移动到动物极后将卵核剥离出来,再将卵核周围的卵黄剥掉,将卵核放入装有预冷的卡诺固定液中冷冻过夜,所述卡诺固定液是由甲醇和冰醋酸混合而成,甲醇与冰醋酸的体积比为3:1;再取出冷冻过夜的3~5粒卵核于载玻片上放置10~20秒;然后再将载有卵核的载玻片放入装有染色剂的染缸中避光染色30~45min,纯水避光浸泡载玻片30min后,将盖玻片盖在载玻片上。中国专利文献CN 1828296A公开了一种码绢金龟精巢染色体制作观察方法,属于生物技术领域。本发明的技术方案是以码绢金龟(Maladera sp.)成虫精巢细胞为材料,将金龟子精巢用秋水仙素预处理6~14h,经0.4%KCl溶液低渗30min,甲醇:冰醋酸(3:1)固定30~60min,用Giemsa染色10~20min后,获得的精巢细胞染色体形态清晰,分散性较好。但是关于一种操作简单、镜检效果好的虾类生殖细胞染色体的制备方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种虾类生殖细胞染色体的制备方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:一种虾类生殖细胞染色体的制备方法,包括以下步骤:秋水仙素培养精巢/卵巢;KCl低渗处理,卡诺氏固定液预固定;后固定液固定,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸;分散精母/卵母细胞,制成细胞悬液;Giemsa磷酸盐缓冲液染色;Motic显微镜下镜检。
包括以下步骤:
(1)选取雄性/雌性虾,沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲,摘取精巢/卵巢,放于培养皿内;
(2)将精巢/卵巢用秋水仙素恒温培养,去净秋水仙素;
(3)KCl室温下低渗处理,移去低渗液,随即用卡诺氏固定液混匀进行预固定,所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸;
(4)更换两次卡诺氏固定液,再用后固定液固定一次,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸;
(5)吸弃但不吸干固定液,沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜,使精母/卵母细胞解离分散,制成细胞悬液;
(6)细胞悬液滴在载玻片上,并轻轻吹动使细胞散开,干燥后用Giemsa磷酸盐缓冲液染色,磷酸盐缓冲液冲去染液;
(7)干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。
所述的步骤(2)中将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16℃生化培养箱中恒温培养4h。
所述的步骤(3)中0.1mol/L KCl室温下低渗处理30min。
所述的步骤(4)中间隔1h更换卡诺氏固定液一次,共更换两次。
所述的步骤(4)中采用后固定液固定一次,20min。
所述的步骤(6)中采用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min,其中Giemsa磷酸盐缓冲液中Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20,Giemsa磷酸盐缓冲液pH7.2。
一种虾类生殖细胞染色体的制备方法,包括以下步骤:
(1)选取雄性/雌性虾,沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲,避开心脏,摘取精巢/卵巢,放于培养皿内;
(2)将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16℃生化培养箱恒温培养4h,去净秋水仙素;
(3)0.1mol/L KCl室温下低渗处理30min,小心移去低渗液,随即用预冷至4度的卡诺氏固定液混匀进行预固定,所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸;
(4)卡诺氏固定液4度固定间隔1h更换固定液一次,共更换两次,再用预冷至4度的后固定液固定1次,20min,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸;
(5)吸弃但不吸干固定液,小心沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜,用吸管轻轻吹打,使精母/卵母细胞解离分散,制成细胞悬液;
(6)细胞悬液滴在预冷的载玻片上,并轻轻吹动使细胞散开,在酒精灯火焰上微烤,干燥后用体积浓度为15%、pH7.2的Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min,磷酸盐缓冲液慢慢冲去染液;
(7)空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。
本发明优点在于:
1、操作简单高效,缩短样本获得时间,能够批量制作染色体玻片,可以保证各处理组的同步取样同步制片;可以快速简便的获得足够的染色体样本,获得的样本分散均匀,背景浅,易于观察,得出的染色体数目准确度高;也可以应用到其它虾的染色体标本的制备,为虾类染色体制备提供了一种简便易行的方法;
2、采用无毒的固定液,减少对制片操作者的伤害;
3、与传统染色体制片法相比,增加后固定,更利于细胞膨胀染色体铺散;
4、既避免石蜡切片法引起的染色体丢失或形态损坏,又克服压片法在染色体数目多的情况下容易重叠的缺陷。
附图说明
附图1是克氏原螯虾精母细胞染色体40倍镜检。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1精巢生殖细胞染色体的制备
1. 选取个体活泼的雄性克氏原螯虾,重量在35~40g左右,小心沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲,避开心脏,摘取心脏下两肝区间白色肾形的精巢,放于培养皿内。
2. 将精巢用500ug/ml秋水仙素16℃生化培养箱恒温培养4h,后去净秋水仙素。
3. 0.1mol/L KCl室温下低渗处理30min,小心移去低渗液,随即用预冷至4度的卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)混匀进行预固定。
4. 卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)4度固定间隔1h更换固定液一次,共更换2次,再用预冷至4度的后固定液(无水乙醇:冰乙酸=1:1)固定1次,20min。
5.吸弃固定液(不吸干)小心沿精巢纵轴剪开外膜,用吸管轻轻吹打,使精母细胞解离分散,制成细胞悬液。
6.细胞悬液滴在预冷的载玻片上,并轻轻吹动使细胞散开,在酒精灯火焰上微烤,干燥后用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液(pH7.2,Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20)染色30min,磷酸盐缓冲液(pH7.2)慢慢冲去染液。
7.空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察,选择染色体分散较好、形态清晰、数目完整的精母细胞进行显微照相,以便进行核型分析。
镜检效果:请参见附图1,附图1是克氏原螯虾精母细胞染色体40倍镜检照片,在40倍显微镜的情况下,有40.7%的细胞分裂相,染色体清晰可见,可以计数,长度适宜,这些细胞位置分布较为均匀。经计数,克氏原螯虾染色体2n=94。
实施例2卵巢生殖细胞染色体的制备
1. 选取个体活泼的雌性克氏原螯虾,重量在35~40g左右,小心沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲,避开心脏,摘取心脏下黄色Y形的卵巢,放于培养皿内。
2. 将卵巢用500ug/ml秋水仙素16℃生化培养箱恒温培养4h,后去净秋水仙素。
3. 0.1mol/L KCl室温下低渗处理30min,小心移去低渗液,随即用预冷至4度的卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)混匀进行预固定。
4. 卡诺氏固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)4度固定间隔1h更换固定液一次,共更换2次,再用预冷至4度的后固定液(无水乙醇:冰乙酸=1:1)固定1次,20min。
5.吸弃固定液(不吸干)小心沿卵巢纵轴剪开外膜,用吸管轻轻吹打,使卵母细胞解离分散,制成细胞悬液。
6.细胞悬液滴在预冷的载玻片上,并轻轻吹动使细胞散开,在酒精灯火焰上微烤,干燥后用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液(pH7.2,Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20)染色30min,磷酸盐缓冲液(pH7.2)慢慢冲去染液。
7.空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察,选择染色体分散较好、形态清晰、数目完整的卵母细胞进行显微照相,以便进行核型分析。
本发明的优点:
1. 本发明在取样方法上不要剥去组织外的物质,操作简单高效,缩短样本获得时间,并且能够批量制作染色体玻片,可以保证各处理组的同步取样同步制片。
2. 本发明可以快速简便的获得足够的染色体样本,获得的样本分散均匀,背景浅,易于观察,可直接通过光学显微镜观察。得出的染色体数目准确度高。
3. 本发明适当改进或不作改进,也可以应用到其它虾的染色体标本的制备,为虾类染色体制备提供了一种简便易行的方法。
4. 应用本发明方法获得的染色体样本可以用于染色体分析、染色体原位杂交、染色体涂染等与染色体研究有关的染色体标本的制作。
5. 本发明固定液采用的是乙醇:冰乙酸(体积比3:1),传统固定液采用的是甲醇、三氯甲烷,甲醇与三氯甲烷均有毒,对制片操作者伤害很大,采用乙醇代替,可减少伤害。
6. 本发明方法与传统染色体制片法相比,增加后固定,后固定液配方为乙醇:冰乙酸(体积比1:1),冰乙酸百分比与前固定液相比增加,更利于细胞膨胀染色体铺散。
7. 使用本发明方法,既避免石蜡切片法引起的染色体丢失或形态损坏,又克服压片法在染色体数目多的情况下容易重叠的缺陷。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种虾类生殖细胞染色体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:秋水仙素培养精巢/卵巢;KCl低渗处理,卡诺氏固定液预固定;后固定液固定,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸;分散精母/卵母细胞,制成细胞悬液;Giemsa磷酸盐缓冲液染色;Motic显微镜下镜检。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)选取雄性/雌性虾,沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲,摘取精巢/卵巢,放于培养皿内;
(2)将精巢/卵巢用秋水仙素恒温培养,去净秋水仙素;
(3)KCl室温下低渗处理,移去低渗液,随即用卡诺氏固定液混匀进行预固定,所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸;
(4)更换两次卡诺氏固定液,再用后固定液固定一次,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸;
(5)吸弃但不吸干固定液,沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜,使精母/卵母细胞解离分散,制成细胞悬液;
(6)细胞悬液滴在载玻片上,并轻轻吹动使细胞散开,干燥后用Giemsa磷酸盐缓冲液染色,磷酸盐缓冲液冲去染液;
(7)干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(2)中将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16℃生化培养箱中恒温培养4h。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(3)中0.1mol/L KCl室温下低渗处理30min。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(4)中间隔1h更换卡诺氏固定液一次,共更换两次。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(4)中采用后固定液固定一次,20min。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(6)中采用体积浓度为15% Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min,其中Giemsa磷酸盐缓冲液中Giemsa原液与磷酸盐缓冲溶液体积比为3:20,Giemsa磷酸盐缓冲液pH7.2。
8.一种虾类生殖细胞染色体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)选取雄性/雌性虾,沿头胸甲后缘中心剪开头胸甲,避开心脏,摘取精巢/卵巢,放于培养皿内;
(2)将精巢/卵巢用500ug/ml秋水仙素16℃生化培养箱恒温培养4h,去净秋水仙素;
(3)0.1mol/L KCl室温下低渗处理30min,小心移去低渗液,随即用预冷至4度的卡诺氏固定液混匀进行预固定,所述的卡诺氏固定液为体积比3:1的无水乙醇和冰乙酸;
(4)卡诺氏固定液4度固定间隔1h更换固定液一次,共更换两次,再用预冷至4度的后固定液固定1次,20min,所述的后固定液为体积比1:1的无水乙醇和冰乙酸;
(5)吸弃但不吸干固定液,小心沿精巢/卵巢纵轴剪开外膜,用吸管轻轻吹打,使精母/卵母细胞解离分散,制成细胞悬液;
(6)细胞悬液滴在预冷的载玻片上,并轻轻吹动使细胞散开,在酒精灯火焰上微烤,干燥后用体积浓度为15%、pH7.2的Giemsa磷酸盐缓冲液染色30min,磷酸盐缓冲液慢慢冲去染液;
(7)空气中自然干燥后置于Motic显微镜下镜检观察。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2013100004883A CN103091140A (zh) | 2013-01-04 | 2013-01-04 | 一种虾类生殖细胞染色体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2013100004883A CN103091140A (zh) | 2013-01-04 | 2013-01-04 | 一种虾类生殖细胞染色体的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103091140A true CN103091140A (zh) | 2013-05-08 |
Family
ID=48203984
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2013100004883A Pending CN103091140A (zh) | 2013-01-04 | 2013-01-04 | 一种虾类生殖细胞染色体的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103091140A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107219104A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-09-29 | 华中农业大学 | 一种克氏原螯虾染色体的制备方法 |
CN109883797A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-14 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种简易的凤鲚染色体制备的方法 |
CN111024660A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-04-17 | 南阳师范学院 | 一种快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法 |
CN112014189A (zh) * | 2020-09-17 | 2020-12-01 | 北京市化工职业病防治院(北京市职业病防治研究院) | 一种用于微核和染色体试验的制片方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102251024A (zh) * | 2011-04-21 | 2011-11-23 | 中国海洋大学 | 一种激光显微切割染色体标本制作液及其应用 |
CN102766692A (zh) * | 2012-07-17 | 2012-11-07 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 一种点篮子鱼染色体的制备方法 |
-
2013
- 2013-01-04 CN CN2013100004883A patent/CN103091140A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102251024A (zh) * | 2011-04-21 | 2011-11-23 | 中国海洋大学 | 一种激光显微切割染色体标本制作液及其应用 |
CN102766692A (zh) * | 2012-07-17 | 2012-11-07 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 一种点篮子鱼染色体的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
钱国英等: "日本沼虾染色体制备的比较研究(简报)", 《实验生物学报》, vol. 38, no. 5, 31 October 2005 (2005-10-31), pages 456 - 460 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107219104A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-09-29 | 华中农业大学 | 一种克氏原螯虾染色体的制备方法 |
CN109883797A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-14 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种简易的凤鲚染色体制备的方法 |
CN111024660A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-04-17 | 南阳师范学院 | 一种快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法 |
CN112014189A (zh) * | 2020-09-17 | 2020-12-01 | 北京市化工职业病防治院(北京市职业病防治研究院) | 一种用于微核和染色体试验的制片方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102183394A (zh) | 一种洋水仙根尖染色体制片的方法 | |
CN103091140A (zh) | 一种虾类生殖细胞染色体的制备方法 | |
CN103695557A (zh) | 一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法 | |
CN102564821B (zh) | 一种梅花茎尖染色体制片方法 | |
CN102492767A (zh) | 一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法 | |
CN105961251A (zh) | 一种耐低氧团头鲂的构建方法及分析 | |
CN104585091A (zh) | 日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法和四倍体杂交鱼的应用 | |
CN103451148A (zh) | 人正常支气管上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途 | |
Cetera et al. | Cultivation and live imaging of Drosophila ovaries | |
CN106550909A (zh) | 锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 | |
CN107937444A (zh) | 体细胞克隆犬的方法 | |
Wu et al. | An artificial multiple triploid carp and its biological characteristics | |
CN107318719B (zh) | 锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法及雌核发育草鱼的应用 | |
CN107219104A (zh) | 一种克氏原螯虾染色体的制备方法 | |
CN104006997B (zh) | 一种赖草属植物根尖染色体制片方法 | |
CN115067277B (zh) | 一种三倍体翘嘴鲌的培育方法 | |
CN103308361A (zh) | 一种染色体制片方法 | |
CN104513807A (zh) | 从血液中分离、培养细胞的方法及进行克隆非人动物的方法 | |
CN116465702A (zh) | 一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法 | |
Awodiran et al. | Cytogenetic study and serum protein characterization of Clarias gariepinus (Burchell, 1822) and Heterobranchus bidorsalis (Geoffroy Saint-Hillaire, 1809) in South western Nigeria | |
CN104855321A (zh) | 一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法 | |
Penrad-Mobayed et al. | Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes | |
CN104390824A (zh) | 一种蚯蚓血细胞涂片的制作方法 | |
Monaco et al. | Nucleoprotein cytochemistry during oogenesis in a unisexual fish, Poecilia formosa | |
CN111323286B (zh) | 一种利用小分子抑制剂sp600125制备染色体标本的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130508 |