CN116718768A - 一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒及方法 - Google Patents

一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒及方法。本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒包括用于检测CD324和CD49d的试剂。本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒可以准确鉴定体外分离培养后hAMSCs的纯度，这对羊膜体外分离培养hAMSCs具有重要意义。

Description

一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒及方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，即多能基质细胞源于发育早期的中胚层和外胚层，是一种具有自我复制、归巢和多向分化潜能的成体干细胞。间充质干细胞广泛来源于脂肪、骨髓、脐带、牙髓、胎盘和羊膜等组织，同时涵盖了间质细胞、内皮细胞及上皮细胞等多类细胞的特征。
羊膜含有丰富的母体来源MSC，利用MSC贴壁特性，从羊膜体外分离间充质干细胞多使用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ消化羊膜组织使人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)和人羊膜上皮细胞(hAECs)分散，但是这种分离方法没办法完全除尽人羊膜上皮细胞，导致两种细胞互相掺杂，没办法获得高纯度的hAMSCs或hAECs。
正常情况下，hAMSCs可以通过间充质干细胞表面标志物(CD73、CD90、CD105阳性同时CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR阴性)来鉴定，hAECs可通过免疫荧光染色检测细胞角蛋白-19(CK-19)阳性来鉴定。但是hAECs也有干细胞特性，可以表达间充质干细胞表面标志物，同时免疫荧光染色检测hAMSCs的细胞角蛋白-19(CK-19)也呈阳性，所以间充质干细胞表面标志物和CK-19均无法区别hAMSCs和hAECs。因此，寻找高纯度的鉴定hAMSC的标志物，对鉴定体外分离培养的hAMSC细胞至关重要。
因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒及方法，以解决或改善体外分离培养过程中，分离得到的hAMSCs不易与hAECs区分，不易鉴定是否存在hAECs污染的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测CD324和CD49d的试剂。
优选地，所述用于检测CD324的试剂为CD324荧光抗体；所述用于检测CD49d的试剂为CD49d荧光抗体。
优选地，所述用于检测CD324的试剂为FITCanti-human CD324；所述用于检测CD49d的试剂为FITCanti-human CD49d。
优选地，所述试剂盒还包括用于检测细胞生存状态的试剂。
优选地，所述用于检测细胞生存状态的试剂为7-AAD。
本发明还提出了一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法，其采用下述技术方案：一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法，采用如上所述的试剂盒进行鉴定。
优选地，包括下述步骤：采用流式细胞仪对待鉴定细胞中活细胞的CD324和CD49d的表达水平进行检测。
优选地，所述待鉴定细胞为传代细胞。
优选地，所述待鉴定细胞为P5代细胞。
有益效果：
发明人通过研究发现，CD49d的表达与hAMSCs的纯度呈正相关，CD324的表达与hAECs的纯度呈正相关，进一步确定了可以用于体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染的细胞表面标志物CD324和CD49d，试验验证通过检测CD324和CD49d的相对表达水平可以鉴定体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染。本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒可以准确鉴定体外分离培养后hAMSCs的纯度，这对羊膜体外分离培养hAMSCs具有重要意义。
本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法简单易行、成本低，通过开发和研制体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染的鉴定产品(试剂盒)，可以方便快速、准确、大批量地鉴定体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染，对临床治疗等应用具有重要意义，填补了现有技术中相关内容的空白。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：
图1为体外分离培养的P5代hAMSCs的细胞形态显微镜图；
图2为体外分离培养的P5代hAECs的细胞形态显微镜图；
图3为体外分离培养的P5代hAMSCs和hAECs的细胞形态显微镜图(hAECs的占比5％)；
图4为体外分离培养的P5代hAMSCs和hAECs的细胞形态显微镜图(hAECs的占比10％)；
图5为体外分离培养的P5代hAMSCs和hAECs的细胞形态显微镜图(hAECs的占比20％)；
图6为体外分离培养的P5代hAMSCs和hAECs的细胞形态显微镜图(hAECs的占比50％)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明针对目前体外分离培养hAMSCs过程中存在的体外分离培养得到的hAMSCs可能会被hAECs掺杂、不易实现hAMSCs和hAECs的区分的问题，提供一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒，试剂盒包括用于检测CD324和CD49d的试剂。
其中，CD324也称为E-cadherin、cadherin-1和UVO，属于钙粘蛋白超家族的成员，是一种钙依赖性跨膜细胞粘附糖蛋白，由4个胞外钙粘素重复序列组成，胞内部分高度保守。CD324广泛表达于结肠、子宫、肝脏、角质细胞、大脑、心脏、肌肉、肾脏和胰腺的上皮细胞以及红系细胞中，其完整功能对于上皮组织极性和结构完整性的建立和维持至关重要。CD324在连接细胞时优先以亲同性方式与自身相互作用，因此可能有助于异质细胞类型的分类。
CD49d是一种膜糖蛋白，整合素α4链。CD49d在T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、胸腺细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、NK细胞、树突状细胞和超过95％的人羊膜间充质干细胞上广泛表达，但在正常红细胞、血小板或中性粒细胞上不表达。CD49d参与单核细胞向炎症内皮部位的转运，并在细胞间相互作用和细胞粘附到细胞外基质中发挥作用。CD49d参与淋巴细胞迁移、T细胞活化和造血干细胞分化。
本发明人通过研究发现，CD49d和CD324的表达与hAMSCs和hAECs的纯度呈正相关，进一步确定了可以用于体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染的细胞表面标志物CD324和CD49d，试验验证通过检测CD324和CD49d的相对表达水平可以鉴定体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染。本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒可以准确鉴定分离培养后hAMSCs的纯度，这对羊膜体外分离培养hAMSCs具有重要意义。
本发明优选实施例中，用于检测CD324的试剂为CD324荧光抗体；用于检测CD49d的试剂为CD49d荧光抗体。
本发明优选实施例中，用于检测CD324的试剂为FITC anti-human CD324；用于检测CD49d的试剂为FITC anti-human CD49d。
本发明优选实施例中，试剂盒还包括用于检测细胞生存状态的试剂。
本发明优选实施例中，用于检测细胞生存状态的试剂为7-AAD。7-AAD用于检测细胞死活的染料特异性好，灵敏度高，可以准确区分细胞死活。
本发明还提出了一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法，采用如上所述的试剂盒进行鉴定。
本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法简单易行、成本低，可以方便、快速、准确、大批量地鉴定体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染，对hAMSCs的临床治疗等应用具有重要意义，填补了现有技术中相关内容的空白。
本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法的优选实施例中，包括下述步骤：采用流式细胞仪对待鉴定细胞中活细胞的CD324和CD49d的表达水平进行检测。通过采用流式细胞仪对待鉴定细胞中活细胞的CD324和CD49d的表达水平进行(定量)检测，再结合细胞的生存状态，根据判定标准即可实现体外培养的hAMSCs中hAECs的污染情况。优选地，判断标准可为：若待鉴定活细胞的CD324阳性率≤4、CD49d阳性率≥70％，则待鉴定活细胞中hAECs污染的程度小于5％(即体外培养的hAMSCs中hAECs的比例小于5％)。
本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法的优选实施例中，待鉴定细胞为传代细胞。发明人通过试验发现，相比于原代hAMSCs，传代后的hAMSCs具有更高的CD49d表达水平；同样的，相比于传代前的低纯度hAECs，传代后的hAECs具有更高的CD324表达水平。试验结果表明，CD49d在传代后的hAMSCs中相较于原代的低纯度hAMSCs均为高表达，在hAECs中不表达，适合用于鉴定hAMSCs的生物标志物；CD324在传代后的hAECs中相较于传代前的低纯度hAECs均为高表达，在hAMSCs中不表达，适合作为鉴定hAECs的生物标志物。
本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法的优选实施例中，待鉴定细胞为P5代细胞。下面通过具体实施例对本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒及方法进行详细说明。
下面实施例中，所采用的试剂见下表1：
表1
实施例1
本实施例的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒包括下述试剂：7-AADViability Staining Solution、FITC anti-human CD324和FITC anti-human CD324。
本实施例的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法包括下述步骤：
(1)羊膜间充质干细胞原代分离培养
将羊膜光滑(无血丝)的一面朝下平铺在150mm平皿底部，浸没于50mL清洗液中，用镊子将朝上一面连接的绒毛膜及血块撕下，直至羊膜无明显血丝，呈白色透明状。更换新的150mm平皿，用镊子捏住羊膜反复清洗3-5次，直至羊膜表面无明显血丝与血块；清洗结束后，更换新的150mm平皿，加入约50mL清洗液，使羊膜完全浸没在清洗液中至少10min。
将清洗干净的羊膜转移至新的150mm平皿中使用生理盐水漂洗，用剪刀分离成约2cm×2cm的小块，将剪碎的羊膜组织块转移至500mL血清瓶内加入等体积的Tryple Select溶液，置于恒温摇床在37℃，200rpm/min消化60-120min以释放羊膜上皮细胞。TrypleSelect消化完成后将血清瓶内组织倒入100目钢筛进行过滤，再用无菌镊将羊膜转移至装有生理盐水的150mm平皿用镊子漂洗2-3次以去除Tryple Select溶液。清洗后将羊膜转回血清瓶中。
将胶原酶IV工作液(胶原酶IV0.5-5mg/mL、Dnase I20-80U/mL)加加到血清瓶中，置于恒温摇床37℃，200rpm/min消化1-3h，直到无肉眼可见的组织时，加入等体积的生理盐水溶液终止消化，用移液管反复轻轻吹打混匀3-5次，将终止消化后的细胞悬液用100μm的细胞筛网过滤，去除没有消化完全的组织，分装至50mL离心管中，450g离心10min。弃上清，用30mL左右生理盐水重悬沉淀物，再次450g离心5min。弃上清，将所有细胞合并至一处，用适量MSC完全培养基重悬沉淀物，定量体积，混匀。用AO/PI染色法进行细胞计数后按照20000-30000活细胞/cm2接种至培养瓶，置于37℃、5.0％的二氧化碳培养箱中培养。
P0代每隔2天换液一次，将要换液的细胞从二氧化碳培养箱中取出，弃掉培养容器中的培养上清，补加新的MSC完全培养基。换液后，在倒置显微镜下观察，融合度大于80％时进行收集传代或冻存擦操作。
(2)羊膜间充质干细胞的传代培养
在倒置显微镜4倍镜下，细胞融合度大于80％时进行传代，去上清加入10-20mL生理盐水清洗细胞表面1次，弃尽生理盐水，向培养瓶中加入Tryple select，使其均匀覆盖瓶底部，常温条件下消化3-10min。轻轻摇晃后肉眼观察到细胞剥落呈流沙状或在镜下观察细胞呈圆球状后表明消化完成。向每个培养瓶中加入不少于Tryple select1倍体积的生理盐水终止消化。将培养瓶中所有的液体转移至50mL离心管中，并使用适量生理盐水清洗培养瓶，再将液体转移到上述离心管中，450g离心5min。离心结束后，弃上清后将所有细胞合并至一处，用适量MSC完全培养基重悬沉淀物，定量体积，混匀。用AO/PI染色法进行细胞计数后按照8000-12000活细胞/cm2接种至多个培养瓶内，置于37℃、5.0％的二氧化碳培养箱中培养。
(3)羊膜间充质干细胞的冻存
在倒置显微镜4倍镜下，细胞融合度大于80％时进行传代，去上清加入10-20mL生理盐水清洗细胞表面1次，弃尽生理盐水，向培养瓶中加入Tryple select，使其均匀覆盖瓶底部，常温条件下消化3-10min。轻轻摇晃后肉眼观察到细胞剥落呈流沙状或在镜下观察细胞呈圆球状后表明消化完成。向每个培养瓶中加入不少于Tryple select1倍体积的生理盐水终止消化。将培养瓶中所有的液体转移至50mL离心管中，并使用适量生理盐水清洗培养瓶，再将液体转移到上述离心管中，450g离心5min。离心结束后，弃上清后将所有细胞合并至一处，用适量MSC完全培养基重悬沉淀物，定量体积，混匀。均匀取适量细胞悬液用AO/PI染色法进行细胞计数，剩余细胞悬液450g离心5min，去上清。根据细胞计数结果，向细胞沉淀中加入配制好的商用CS10细胞冻存液重悬，使细胞浓度达到200万细胞/mL，混匀，按照1mL/支的规格分装至2mL冻存管中，标注细胞批号、冻存规格等信息。将分装完成的细胞冻存管使用程序降温仪进行冻存，结束后将细胞制剂通过干冰转移至液氮罐中保存。
(4)羊膜间充质干细胞的复苏
从液氮罐中取出羊膜间充质干细胞冻存管，在37℃的水浴锅中解冻，在冻存管内细胞悬液处于冰水混合物时取出，移入预加有5mL MSC培养基的15mL离心管混匀，400g离心5min；去上清，加入1mL MSC培养基，轻轻吹打混匀，均匀取适量细胞悬液用AO/PI染色法进行细胞计数，剩余细胞悬液450g离心5min，去上清。根据细胞计数结果，在细胞沉淀内加入适量MSC培养基重悬，进行后续操作。
(5)用DxFLEX流式细胞仪检测hAMSCs
将四批次的P5代(细胞形态显微镜图如图1所示)共4组hAMSCs制成细胞悬液后，均匀取适量细胞悬液用AO/PI染色法进行细胞计数，剩余细胞悬液450g离心5min，去上清。根据细胞计数结果，在细胞沉淀内加入适量PBS重悬，使其最终的浓度为1×107个细胞/mL。取100μL(1×106个细胞)各组细胞悬液分至3支1.5mL EP管内，分别标记为阴性管、CD324管和CD49d管。阴性管不加任何抗体；CD324管加入对应体积(1×106个细胞：5μL抗体)的7-AAD和CD324；CD49d管加入对应体积(1×106个细胞：5μL抗体)的7-AAD和CD49d。加样后震荡混匀，在室温下避光孵育15min。孵育完成后，所有管加入1mL PBS，300g离心5min，弃上清。向各管加入250μL PBS重悬细胞，振荡混匀，上机检测。
将阴性管、CD324管和CD49d管依次放入进样槽进行样品检测和分析。样品分析时先根据FSC和SSC排除细胞碎片、圈出主细胞群，再通过7-AAD排除死细胞；通过阴性组在主细胞群中画出活细胞、CD324和CD49d的阴性门，在CD324组中即可查看CD324阳性细胞在活细胞中的占比；在CD49d组中即可查看CD49d阳性细胞在活细胞中的占比。抗体信息如下：
用于检测细胞死活的染料为：7-AAD Viability Staining Solution；
用于检测CD324的抗体为：FITC anti-human CD324；
用于检测CD49d的抗体为：FITC anti-human CD49d。
hAMSCs流式结果如表2所示
表2四批hAMSCs CD324和CD49d的流式检测结果
(6)用DxFLEX流式细胞仪检测购买的商品化hAECs
将购买的商品化的hAECs进行传代培养，传代至不同代次(P5代hAECs的细胞形态显微镜图如图2所示)，并分别收获足够的hAECs冻存以备使用，三批次共4组hAECs制成细胞悬液后，均匀取适量细胞悬液用AO/PI染色法进行细胞计数，剩余细胞悬液450g离心5min，去上清。根据细胞计数结果，在细胞沉淀内加入适量PBS重悬，使其最终的浓度为1×107个细胞/mL。将细胞悬液各取100μL(1×106个细胞)分至2支1.5mL EP管内，分别标记为阴性管、CD324管和CD49d管。阴性管不加任何抗体；CD324管加入对应体积(1×106个细胞：5μL抗体)的7-AAD和CD324；CD49d管加入对应体积(1×106个细胞：5μL抗体)的7-AAD和CD49d。加样后震荡混匀，在室温下避光孵育15min。孵育完成后，所有管加入1mL PBS，300g离心5min，弃上清。向各管加入250μLPBS重悬细胞，振荡混匀，上机检测。
将阴性管、CD324管和CD49d管依次放入进样槽进行样品检测和分析。样品分析时先根据FSC和SSC排除细胞碎片、圈出主细胞群，再通过7-AAD排除死细胞；通过阴性组在主细胞群中画出活细胞、CD324和CD49d的阴性门，在CD324组中即可查看CD324阳性细胞在活细胞中的占比；在CD49d组中即可查看CD49d阳性细胞在活细胞中的占比。抗体信息如下：
用于检测细胞死活的染料为：7-AAD Viability Staining Solution；
用于检测CD324的抗体为：FITC anti-human CD324；
用于检测CD49d的抗体为：FITC anti-human CD49d。
hAECs流式结果如表3所示：
表3三批hAECs CD324和CD49d的流式检测结果
(7)体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染的鉴定
取两批P5代hAMSCs和同一hAECs制成细胞悬液，定容后均匀取各组适量细胞悬液用AO/PI染色法进行细胞计数，剩余细胞悬液450g离心5min，去上清。根据细胞计数结果，在细胞沉淀内加入适量PBS重悬，使其最终的浓度为1×107个细胞/mL。将两者混合形成含0％、5％、10％、20％和50％hAECs的两批各5组(共10组)细胞混合液(含5％、10％、20％和50％hAECs的混合细胞的细胞形态显微镜图分别如图3-6所示)，各取100μL(1×106个细胞)分至3支1.5mLEP管内，分别标记为阴性管、CD324管和CD49d管。阴性管不加任何抗体；CD324管加入对应体积(1×106个细胞：5μL抗体)的7-AAD和CD324；CD49d管加入对应体积(1×106个细胞：5μL抗体)的7-AAD和CD49d。加样后震荡混匀，在室温下避光孵育15min。孵育完成后，所有管加入1mL PBS，300g离心5min，弃上清。向各管加入250μL PBS重悬细胞，振荡混匀，上机检测。
将阴性管、CD324管和CD49d管依次放入进样槽进行样品检测和分析。样品分析时先根据FSC和SSC排除细胞碎片、圈出主细胞群，再通过7-AAD排除死细胞；通过阴性组在主细胞群中画出活细胞、CD324和CD49d的阴性门，在CD324组中即可查看CD324阳性细胞在活细胞中的占比；在CD49d组中即可查看CD49d阳性细胞在活细胞中的占比。抗体信息如下：
用于检测细胞死活的染料为：7-AADViability Staining Solution；
用于检测CD324的抗体为：FITC anti-human CD324；
用于检测CD49d的抗体为：FITC anti-human CD49d。
流式结果如表4所示：
表4两批混合细胞CD324和CD49d的流式检测结果
通过数据可以发现，随着混合细胞悬液中hAECs占比的增加，CD324的阳性率呈线性上调，CD49d的阳性率呈线性下调。结合表2和表3的结果，显示体外分离培养的hAMSCs表面抗体的表达水平满足下述标准：CD324阳性率≤4％；P5代hAMSCs的CD49d阳性率≥70％。
综上所述：本发明通过流式实验，本发明首次证明CD324和CD49d可以用于鉴定体外分离培养的hAMSCs是否有hAECs污染，当有约5％的hAECs细胞污染hAMSCs细胞时，即可由流式检测结果判定出hAECs对hAMSCs的污染情况，说明本发明的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法可较好地检测出体外分离培养的hAMSCs中掺杂的hAECs含量，实现hAMSCs中是否含有hAECs的鉴别。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非限制于本发明。领域内技术人员针对本发明可以进行修改、等同替换、改进等，但其均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测CD324和CD49d的试剂。
2.根据权利要求1所述的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒，其特征在于，所述用于检测CD324的试剂为CD324荧光抗体；
所述用于检测CD49d的试剂为CD49d荧光抗体。
3.根据权利要求2所述的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒，其特征在于，所述用于检测CD324的试剂为FITCanti-humanCD324；
所述用于检测CD49d的试剂为FITCanti-humanCD49d。
4.根据权利要求1所述的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测细胞生存状态的试剂。
5.根据权利要求3所述的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的试剂盒，其特征在于，所述用于检测细胞生存状态的试剂为7-AAD。
6.一种区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行鉴定。
7.根据权利要求6所述的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法，其特征在于，包括下述步骤：
采用流式细胞仪对待鉴定细胞中活细胞的CD324和CD49d的表达水平进行检测。
8.根据权利要求7所述的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法，其特征在于，所述待鉴定细胞为传代细胞。
9.根据权利要求8所述的区分羊膜间充质干细胞和上皮细胞的方法，其特征在于，所述待鉴定细胞为P5代细胞。
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