CN108721697A - 一种表面复合3d打印壳聚糖的改性脱细胞血管支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种表面复合3D打印壳聚糖的改性脱细胞血管支架及其制备方法，以脱细胞血管作为血管支架，通过特定的反复冻融、超高压条件处理后以及通过选定的酶进行酶消化法的过程处理后，使其可以进一步采用3D打印的方法，将壳聚糖材料打印在所述血管支架的表面并与处理后的血管结合紧密，实现壳聚糖与处理后的血管支架的复合，从而整体得到良好的可塑性、抗张强度和弹性性能。

Description

一种表面复合3D打印壳聚糖的改性脱细胞血管支架及其制备 方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体地涉及一种改性脱细胞血管基质。

背景技术

随着心血管疾病患病率的增加，心血管外科临床上将需要大量血管替代物。组织工程血管具有自我修复和重塑的潜能，提高了远期通畅率，具有较好的应用前景。血管支架的材料可分为非生物体材料和生物体材料。生物体材料分为天然材料和去细胞纤维组织结构材料。脱细胞血管基质属于去细胞纤维组织结构材料，由于将同种异体血管直接移植会出现明显的抗原排斥反应，而抗原性主要来自细胞，因此需要将血管中的细胞去除，得到脱细胞血管基质作为血管替代物或作为组织工程血管支架进一步应用。脱细胞血管基质具有生物相容性好的优点，可用于周围神经的缺损修复，因此越来越受到人们的重视。但是其可塑性、抗张强度和弹性性能不理想，管壁易塌陷，严重限制了其临床应用。

壳聚糖虽然具有良好的生物相容性，体内可降解，但其管状材料存在脆性较高的问题，当管壁较薄时易碎裂塌陷，而管壁制作过厚则会延长吸收时间，使材料滞留体内，对内生神经产生局部压迫作用，且代谢产物呈酸性，会对神经再生产生一定的不利影响，因此单独的壳聚糖材料制成的血管支架也无法应用于临床，而且壳聚糖材料的厚度很难控制。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种改性脱细胞血管支架。本发明的技术方案如下：

一种表面复合3D打印壳聚糖的改性脱细胞血管支架的制备方法，包括以下步骤：

1)将血管进行脱细胞处理，所述脱细胞处理的程序包括反复冻融处理、超高压处理以及酶消化法处理，得到脱细胞血管支架；所述反复冻融包括将血管在1～5℃下预冷0.5～2h、-60～-100℃下冷冻1～3h、水浴复温10-30min反复2-5次；所述超高压处理为200-1000MPa静水压下处理10-30min；所述酶消化法为将血管中细胞压碎，采用DNA酶与RNA酶的溶液冲洗消化；

2)以壳聚糖为主要原料制备3D打印的打印材料；

3)将所述脱细胞血管支架套于3D打印机转动轴上；

4)启动3D打印机和转动轴，在所述脱细胞血管支架的外层表面3D打印壳聚糖层，形成改性脱细胞血管支架

优选的，所述反复冻融处理为在无菌条件下取新鲜血管，去血管外膜后将血管置盛有PBS溶液的离心管中。进一步优选的，入4℃的冰箱中预冷1小时、-80℃冰箱冷冻2h、37℃水浴复温15分钟，上述冻融过程反复进行3次。

优选的，所述超高压处理为4℃500MPa处理20分钟。

优选的，所述酶消化法为将血管中细胞压碎，采用浓度为10-20ug/ml RNase A、100-200ug/ml DNase I组成的溶液冲洗进行消化36-60h，环境温度为35-39℃并在3-7％CO₂环境内搅拌，脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架。

进一步优选的，所述DNase I的浓度为15ug/ml RNase A、所述DNase I的浓度为150ug/ml，在37℃，5％CO₂环境内搅拌进行消化48h。

优选的，所述壳聚糖层的厚度为500nm-1mm。

优选的，所述转动轴以恒定转速转动，转动速率为1-10rpm。

优选的，所述血管选自兔颈动脉、兔腹主动静脉、大鼠腹主动静脉、大鼠颈总动静脉、猪腹主动静脉和/或狗颈总动静脉。

优选的，所述3D打印的基础材料还包括交联剂乙二醛，其中壳聚糖的含量为60-80％。

一种表面复合3D打印壳聚糖的改性脱细胞血管支架，包括脱细胞基质作为血管支架以及3D打印于所述血管支架表面的壳聚糖层。

本发明的有益技术效果如下：

本发明的一种改性脱细胞血管支架的制备方法，以脱细胞血管作为血管支架，通过特定的反复冻融、超高压条件处理后以及通过选定的酶进行酶消化法的过程处理后，使其可以进一步采用3D打印的方法，将壳聚糖材料打印在所述血管支架的表面并与处理后的血管结合紧密，实现壳聚糖与处理后的血管支架的复合，从而整体得到良好的可塑性、抗张强度和弹性性能。

本发明采用3D打印机配合转动轴，通过3D打印的方法，以及结合特定的脱细胞处理过程和壳聚糖打印材料的配比，不仅能够将壳聚糖材料与通过本发明方法处理后的脱细胞血管支架复合，而且通过控制转动棒的转动速率以及3D打印时间控制壳聚糖层的厚度为500nm-1mm的合适厚度，不仅能够有效改善脱细胞血管支架性能，增强其强度和韧性，避免血管塌陷，起到1+1大于2的效果，而且可以合理控制壳聚糖层的厚度，特别是壳聚糖层可以与脱细胞血管有非常好的复合性从而使得壳聚糖层对内层的脱细胞血管支架的改性作用更好更稳定。

进一步的，本发明利用了配合壳聚糖的特定交联剂乙二醛，实现了更好的交联效果，并保证了壳聚糖与血管支架的复合。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的解释。

实施例1

实验对象为兔颈动脉，本实施例的一种改性脱细胞血管支架的制备方法包括以下步骤：

首先在无菌条件下取新鲜血管，去血管外膜后将血管置盛有PBS溶液的离心管中，入4℃的冰箱中预冷1小时、-80℃冰箱冷冻2h、37℃水浴复温15分钟，上述冻融过程反复进行3次。超高静水压(4℃冷方压)处理20分钟(超高压范围500MPa)，将血管中细胞压碎，结合DNase I 15ug/ml RNase A、150ug/ml DNase I的溶液中冲洗(37℃，5％CO2环境内搅拌)进行消化48h，脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架。

对脱细胞效果及血管性能进行检测，所述检测包括HE染色、透射电镜、扫描电镜，通过组织学和超微结构观察上述实验方法制备血管的脱细胞效果及血管胶原支架结构破坏情况。

HE染色、透射电镜、扫描电镜测试结果：血管支架中未见明显细胞碎片，血管表面无内皮细胞覆盖，支架表面粗大的胶原纤维束结构保存完好，材料结构致密。证明上述方法血管处理后残留细胞碎片少，血管支架结构完整。

然后脱细胞血管复合3D打印壳聚糖，以70％的壳聚糖、30％的交联剂为原料制备3D打印的基础材料，选择直径为1mm的圆柱形金属棒作为支撑携带工具，将兔脱细胞血管套于所述金属棒上，伸入3D打印机中，将金属棒的另一端固定于3D打印机转动轴上；

开启3D打印机和转动轴，转动轴可带动金属棒以恒定的速率转动，在转动过程中3D打印机将壳聚糖均匀的打印于脱细胞血管表面，打印的厚度为0.05mm，得到改性兔脱细胞血管支架。

测试得到改性兔脱细胞血管支架的生物力学(50％压缩强度、抗张强度、线保留强度)、孔隙率、生物相容性，具体数据如表1所示。

抗张强度：无菌条件下将材料剪切成宽度约5mm的环状,将其剪开后得到以血管周径为纵轴的条状材料。以游标卡尺测定其厚度长度及宽度后将条状材料两端固定于样品夹。滑块牵动样品夹以0.5mm/s速度反向运动,直至样本断裂，重复测量每种材料各10个样品并记录每次材料断裂时的张力。

缝线保留强度(N/针)：以5/0聚丙烯缝线固定于血管管壁侧缘,缝线距边缘约1mm。将两缝线两端固定于样品夹，牵动样品夹以0.5mm/s速度反向运动，记录每次材料撕裂时的张力。

50％压缩强度：将管壁直径压缩50％时的压力

表1

	改性血管
		最大载荷(N)	20
抗张强度(MPa)	4.5
		缝线保留强度(N/针)	1.5
孔隙率	10um
		50％压缩强度(g)	300

细胞毒性检测：

将0.5g脱细胞血管支架用无菌剪刀尽可能的剪碎浸泡在5ml的DMEM培养液中，于37℃静置48h，离心(1200g，20min)、取上清液、0.2um滤器过滤后测定体积。按照《医疗器械生物学评价》，体外细胞毒性试验的方法进行试验，采用兔骨髓间充值干细胞作为实验用细胞。将兔第三代间充质干细胞消化、离心、重悬，以2×10³/孔接种于96孔板内，每孔加培养基100μL，待细胞贴壁后加入三组神经组织浸提液并设对照，于37℃、5％CO2孵箱中培养，于共培养1、3、5、7天时进行MTT法检测，每组细胞设6孔重复。用酶联免疫检测仪490nm波长测定四组的吸光度，比较各组细胞的增值率。细胞相对增殖率＝(试验组的吸光度值/对照组的吸光度值)×100％。

实验结果显示实验组与对照组无明显差异，证实其无细胞毒性物质残留。

实施例2

实验对象为大鼠腹主动静脉，本实施例的一种改性脱细胞血管支架的制备方法包括以下步骤：

首先无菌条件下取新鲜血管，去血管外膜后将血管置盛有PBS溶液的离心管中，入4℃的冰箱中预冷0.5小时、-60℃冰箱冷冻1h、37℃水浴复温10分钟，上述冻融过程反复进行4次。超高静水压(4℃冷方压)处理20分钟(超高压范围800MPa)，将血管中细胞压碎，结合DNase I20ug/ml RNase A、200ug/mlDNase I的溶液中冲洗(37℃，5％CO₂环境内搅拌)进行消化48h，脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架。

对脱细胞效果及血管性能进行检测，所述检测包括HE染色、透射电镜、扫描电镜。同样的，血管支架中未见明显细胞碎片，血管表面无内皮细胞覆盖，支架表面粗大的胶原纤维束结构保存完好，材料结构致密。证明上述方法血管处理后残留细胞碎片少，血管支架结构完整。

然后脱细胞血管复合3D打印壳聚糖，以壳聚糖的含量为75％为原料制备3D打印的基础材料，选择直径为8mm的圆柱形金属棒作为支撑携带工具，将鼠脱细胞血管套于所述金属棒上，伸入3D打印机中，将金属棒的另一端固定于3D打印机转动轴上；开启3D打印机和转动轴，转动轴可带动金属棒以恒定的速率转动，在转动过程中3D打印机将壳聚糖均匀的打印于脱细胞血管表面，打印的厚度为0.5mm，得到改性鼠脱细胞血管支架。

测试得到的改性鼠脱细胞血管支架的生物力学性能(50％压缩强度、抗张强度、线保留强度)、孔隙率，具体数据如表2所示。

表2

	改性血管
		最大载荷(N)	25
抗张强度(MPa)	4.0
		缝线保留强度(N/针)	3.5
孔隙率	10um
		50％压缩强度(g)	200

采用实施例1类似的细胞毒性检测，实验结果显示实验组与对照组无明显差异，证实其无细胞毒性物质残留。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种表面复合3D打印壳聚糖的改性脱细胞血管支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将血管进行脱细胞处理，所述脱细胞处理的程序包括反复冻融处理、超高压处理以及酶消化法处理，得到脱细胞血管支架；所述反复冻融处理包括将血管在1～5℃下预冷0.5～2h、-60～-100℃下冷冻1～3h、水浴复温10-30min反复2-5次；所述超高压处理为200-1000MPa静水压下处理10-30min；所述酶消化法为将血管中细胞压碎，采用DNA酶与RNA酶的溶液冲洗消化；

2)以壳聚糖为主要原料制备3D打印的打印材料；

3)将所述脱细胞血管支架套于3D打印机转动轴上；

4)启动3D打印机和转动轴，在所述脱细胞血管支架的外层表面3D打印壳聚糖层，形成改性脱细胞血管支架。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述反复冻融处理为在无菌条件下取新鲜血管，去血管外膜后将血管置盛有PBS溶液的离心管中，入4℃的冰箱中预冷1小时、-80℃冰箱冷冻2h、37℃水浴复温15分钟，上述冻融过程反复进行3次。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述超高压处理为4℃500MPa处理20分钟。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述酶消化法为将血管中细胞压碎，采用浓度为10-20ug/ml RNase A、100-200ug/ml DNase I组成的溶液冲洗进行消化36-60h，环境温度为35-39℃并在3-7％CO₂环境内搅拌，脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述DNase I的浓度为15ug/ml RNaseA、所述DNase I的浓度为150ug/ml，在37℃，5％CO₂环境内搅拌进行消化48h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述壳聚糖层的厚度为500nm-1mm。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述转动轴以恒定转速转动，转动速率为1-10rpm。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述血管选自兔颈动脉、兔腹主动静脉、大鼠腹主动静脉、大鼠颈总动静脉、猪腹主动静脉和/或狗颈总动静脉。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述3D打印的基础材料还包括交联剂乙二醛，其中壳聚糖的含量为60-80％。

10.一种表面复合3D打印壳聚糖的改性脱细胞血管支架，其特征在于包括脱细胞基质作为血管支架以及3D打印于所述血管支架表面的壳聚糖层。