CN108136076A - 经培养的细胞小叶材料 - Google Patents

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Abstract

本文提供的人工心脏瓣膜可以包括经培养的细胞组织小叶。在一些情况下，人工心脏瓣膜可以包括固定在一起并保持在可扩张管状构件内的多个小叶。该经培养的细胞组织可以通过培养成纤维细胞、平滑肌细胞或其组合形成经培养的细胞的片并在张力下使这些成纤维细胞化学交联来获得。在一些情况下，该经培养的细胞组织可以是径向拉伸的。在一些情况下，该经培养的细胞组织可以是双向拉伸的。

Description

经培养的细胞小叶材料
本申请在2016年9月26日以波士顿科学公司(Boston Scientific SciMed,Inc.)(一家美国国营公司，所有指定国家的申请人)以及Crystal M.Anderson-Cunanan(一名美国公民，所有指定国家的发明人)、和Katherine C.Fazackerley(一名美国公民，所有指定国家的发明人)、和Michael Eppihimer(一名美国公民，所有指定国家的发明人)、和Shannon Smith Kenwood(一名美国公民，所有指定国家的发明人)、和Natalia P.Sushkova(一名美国公民，所有指定国家的发明人)、和Karen Suzanne Lavery(一名美国公民，所有指定国家的发明人)的名义作为PCT国际专利申请进行提交，并且要求2015年10月7日提交的美国临时申请号62/238,222和2016年9月22日提交的美国专利申请号15/272,747的优先权，将其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本文件提供了由经培养的细胞材料制成的小叶。
背景技术
心脏瓣膜手术可用于修复或置换患病心脏瓣膜。例如，当天然心脏瓣膜变窄(通常称为狭窄)时，或当天然瓣膜渗漏或反流时，可以指示心脏瓣膜置换。修复或置换患病心脏瓣膜可以包括例如引入包括与患者异源的生物组织(例如，异种移植物(heterograft或xenograft))的人工心脏瓣膜。用于制造人工心脏瓣膜的常见生物组织是心包组织，通常是牛的或猪的。然而，从干细胞生长活细胞小叶的尝试已证明不足以置换心脏瓣膜。
发明内容
本文提供的人工心脏瓣膜使用经培养的细胞组织作为小叶材料。本文提供的经培养的细胞小叶通过以下方式来产生：培养成纤维细胞、平滑肌细胞或这些细胞的组合形成组织片，使这些经培养的细胞的片在张力下化学交联以固定该片，并且从该经培养的细胞的固定的片切下心脏瓣膜小叶。
在实例1中，人工心脏瓣膜可以包括固定在一起并保持在可扩张管状构件内的多个小叶，其中每个小叶包括径向或双向取向且化学交联的经培养的细胞组织材料。
在实例2中，如实例1所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从成纤维细胞、优选真皮成纤维细胞、更优选牛真皮成纤维细胞培养而来。
在实例3中，如实例1或2所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从平滑肌细胞、优选牛平滑肌细胞培养而来。
在实例4中，如实例1所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从成纤维细胞和平滑肌细胞的混合物培养而来，优选地比例在20:80与80:20之间，优选地该混合物包括牛成纤维细胞和牛平滑肌细胞。
在实例5中，如实例1-4中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织与戊二醛交联。
在实例6中，如实例1-5中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中将这些经培养细胞培养至少3周、优选至少4周、更优选至少5周、并且甚至更优选至少6周。
在实例7中，如实例1-6中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的厚度在50微米与300微米之间、优选75微米与200微米之间。
在实例8中，如实例1-7中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织在500kPa下的伸长百分比在6.5％与8.5％之间。
在实例9中，如实例1-8中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织在1MPa下的伸长百分比在10.5％与13.5％之间。
在实例10中，如实例1-9中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的极限抗拉强度在4MPa与6.5MPa之间。
在实例11中，如实例1-10中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的收缩温度在83.8℃与84.6℃之间。
在实例12中，如实例1-11中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的含水量在80％与88％之间。
在实例13中，如实例1-12中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中这些小叶由径向或双向取向且固定的经培养的细胞材料组成。
在实例14中，形成经培养的细胞小叶的方法可以包括：(a)获得成纤维细胞、平滑肌细胞或其组合；(b)在框架上培养这些细胞以产生经培养的细胞的片；(c)对该经培养的细胞组织的片施加张力；(d)在对该经培养的细胞组织的片施加张力的同时，使该经培养的细胞组织与化学交联剂接触至少10分钟；并且(e)从该片上切下小叶，该小叶包括主体部分和两个管袖状部分。
在实例15中，如实例14所述的方法，其中这些经培养细胞包括比例在20:80与80:20之间的成纤维细胞和平滑肌细胞的混合物。
本发明的一个或多个实施例的细节陈述于附图和下文的描述中。本发明的其他特征、目的和优点会从说明书和附图以及权利要求书中显现出来。
附图说明
图1是描绘了使用经培养的细胞组织生产心脏瓣膜的示例性方法的流程图。
图2是示例性人工心脏瓣膜。
图3描绘了经培养的牛真皮成纤维细胞在生长培养基上随时间的生长。
图4说明了用于对经培养的细胞的片施加张力的伸展机。
图5描绘了用于固定双向拉伸的经培养的细胞组织以处理和切割小叶的框架。
图6描绘了用于在伸展和交联之前压平经培养的细胞组织的压板。
图7描绘了用于培养仅有组织的片的示例性设置。
图8描绘了如何切割样品细胞片进行拉伸测试。
图9说明了如何计算应力和应变。
图10A-10D示出了不同经培养的片的特性。
图11A示出了针对Masson’s Trichrome染色的仅有组织的支架的横截面的代表性40X图像。
图11B示出了针对Russell-Movat Pentachrome染色的仅有组织的支架的横截面的代表性40X图像。
图11C示出了在两侧补料3周后，在生物反应器中生长6周后的组织样品。
各个附图中的类似参考符号表示类似元件。
具体实施方式
本文提供的人工心脏瓣膜包括双向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶。人工心脏瓣膜通常使用牛的或猪的心包组织小叶，但是控制这些天然组织的特性可能是困难的。例如，动物的疾病可导致组织特性有缺陷。此外，组织可能具有不均匀的机械性能。另外，证明动物组织没有疾病或符合追踪饲养以产生天然组织的动物的健康状况的某些政府法规可能是困难且昂贵的。另外，疾病在饲养以产生医疗植入体用的生物组织的成群动物中的爆发可能导致用于医疗装置的可用生物组织短缺。
先前从活细胞中生长心脏瓣膜的尝试已证明不足以开发心脏瓣膜小叶的适当机械性能。仅仅使细胞长成小叶的形状不足以产生具有长期体内使用所需的机械和生物学特性的替代心脏瓣膜。然而，如本文所提供的经培养的细胞组织小叶可以始终如一地产生具有适当生物学和机械性能的小叶。在一些情况下，本文提供的经培养的细胞组织小叶可以在生长期间经受径向或双向力。在一些情况下，本文提供的经培养的细胞组织小叶可以在固定期间经受径向或双向力。在一些情况下，经培养的细胞组织可以使用牛真皮成纤维细胞(BDF)和/或平滑肌细胞(SMC)来产生，以在体外产生组织片。达到所需的厚度后，可以将这些片固定并交联以保持所需的细胞外基质(“ECM”)蛋白质结构。心脏瓣膜小叶可从这些片上切下并整合到现有系统中。
如下面将要讨论的，本文提供的培养过程可以产生具有一致厚度和一致机械性能的经培养的细胞的片。在一些情况下，本文提供的径向或双向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶的厚度可以在50微米与300微米之间。在一些情况下，本文提供的径向或双向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶的厚度可以在100微米与200微米之间。在一些情况下，本文提供的径向或双向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶的最大厚度可以在130微米与150微米之间。在一些情况下，经培养的细胞的片可以在张力下生长，并且通过将交联化学品(例如，戊二醛)施用于组织而固定，同时保持该组织连接至用于使该组织生长的框架。在一些情况下，在将交联化学品(例如，戊二醛)施加到组织中之前，可以将经培养的细胞的片置于额外的张力下。
在一些情况下，框架可以向经培养的细胞组织提供径向张力。在一些情况下，经培养的细胞组织可以是双向拉伸的。在一些情况下，通过施加至少0.1N的应力负荷使经培养的细胞组织沿着两条相交的轴线伸展而双向地拉伸经培养的细胞组织。在一些情况下，通过施加0.1N与2N之间的应力负荷使经培养的细胞组织沿着两条相交的轴线伸展而双向地拉伸经培养的细胞组织。在一些情况下，通过施加0.5N与1N之间的应力负荷使经培养的细胞组织沿着两条相交的轴线伸展而双向地拉伸经培养的细胞组织。
可以使经培养的细胞组织在张力下化学交联以防止张力释放后经培养的细胞组织弹回。在一些情况下，本文提供的双向或径向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶在500kPa下的伸长百分比可以在6.5％与8.5％之间。在一些情况下，本文提供的双向或径向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶在1MPa下的伸长百分比可以在10.5％与13.5％之间。在一些情况下，本文提供的双向或径向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶的极限抗拉强度可以在4Mpa与6.5MPa之间。在一些情况下，本文提供的双向或径向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶的收缩温度可以在83.8℃与84.6℃之间。在一些情况下，本文提供的双向或径向拉伸且固定的经培养的细胞组织小叶的含水量可以在80％与88％之间。另外，无论拉伸且固定的经培养的细胞组织的取向如何，这些特性可以是一致的。由于材料特性的一致性，固定的经培养的细胞组织可以提供用于人工心脏瓣膜小叶的可比材料。本文提供的方法、装置和系统可以为人工心脏瓣膜中使用的经培养的细胞组织小叶提供可靠且一致的机械性能。
可以使用任何合适的方法使经培养的细胞的片生长。在一些情况下，可以通过分离成纤维细胞和/或平滑肌细胞并允许其在固定框架内培养3与12周之间来使经培养的细胞的片生长。在一些情况下，框架被布置成基本矩形的构造，使得所得的经培养的细胞的片具有基本矩形的形状。在一些情况下，框架被布置成圆环的构造。在一些情况下，框架适当地是刚性的，使得其适于保持平面构造，尽管在组织生长时有来自组织的收缩力。在一些情况下，可以将压重物和/或夹具施加到框架上以确保其在组织生长期间保持其形状。在一些情况下，框架可以包括纸。在一些情况下，框架可以具有多孔结构以促进组织向内生长。在一些情况下，施加有生长培养基的框架可以施加有成纤维细胞并被置于培养板中以允许成纤维细胞生长。在一些情况下，经培养的片可以基本上由经培养的细胞组成。
细胞可以来自任何合适的供体。在一些情况下，细胞可以是牛的真皮成纤维细胞和/或平滑肌细胞。成纤维细胞和/或平滑肌细胞可以来自任何合适的动物。在一些情况下，细胞可以是牛的、猪的、马的、山羊的或绵羊的。在一些情况下，细胞可以是人真皮成纤维细胞和/或人平滑肌细胞。在一些情况下，细胞可以从预期患者获得。
图1是描绘了将经培养的细胞组织整合到人工心脏瓣膜中的整个过程的流程图。第一步11使成纤维细胞和/或平滑肌细胞生长成细胞的片30。在一些情况下，细胞可以从真皮活组织检查和动脉切除中获得。在一些情况下，成纤维细胞可以是牛细胞。可以使用本领域已知的任何合适的分离技术从真皮组织样品和动脉中分离成纤维细胞。然后可以扩增经分离的成纤维细胞和/或平滑肌细胞以形成更大的细胞群。可以对成纤维细胞和/或平滑肌细胞进行测试以确保它们没有疾病。然后可以将细胞施加到培养盘中的框架上并生长至少3周。在一些情况下，仅将成纤维细胞培养成片。在一些情况下，将平滑肌细胞培养成片。在一些情况下，将平滑肌细胞和成纤维细胞的组合一起培养以形成片。在一些情况下，经培养的细胞的片可以包括比例在20:80与80:20之间的成纤维细胞与平滑肌细胞。在一些情况下，将成纤维细胞和平滑肌以1:1的比例施加到框架上。
图3描绘了经培养的成纤维细胞随时间的生长。第一行图片包括示出了第2周、第3周和第5周时的胶原和核的染色。底行仅示出了第2周、第3周和第5周时的胶原。在第二周，细胞仍部分附着在转印纸框架上。在第三周，可以将经培养的细胞的片从培养盘中提出。在第三周，经培养的细胞的片的厚度可以在30与50微米之间。在第四周，经培养的细胞的片的厚度可以在90与110微米之间。在第五周，经培养的细胞的片的厚度可以在130与150微米之间。可替代地，可以使用生物反应器形成经培养的细胞的片。
在细胞生长至少3周后获得经培养的细胞的片后，可以在步骤12中在下文描述的双向或径向张力下固定经培养细胞。在步骤13中，从固定的经培养的细胞组织上切下具有预定形状的小叶，并且选择用于在人工心脏瓣膜中使用的合适的小叶，其在下文结合图5和6进行描述。在步骤14中，使用一个或多个切下的小叶来制造人工心脏瓣膜。在步骤15中，可以对人工心脏瓣膜进行检查和/或测试以确保它们符合规格。在一些情况下，可以在检查之前或之后对人工心脏瓣膜进行灭菌。图2描绘了示例性人工心脏瓣膜。在一些情况下，可以将三个包括双向或径向取向且固定的经培养的细胞材料的小叶缝合到框架上和/或彼此缝合以形成人工心脏瓣膜。
本文提供的用于经培养的细胞组织修饰的过程可以使用固定组织步骤中的一步或多步。在一些情况下，当经培养的细胞组织的片附着在生长框上时将其用化学交联剂固定，经培养的细胞组织从或不从生长室(例如，培养皿)中移出。在一些情况下，在使用化学交联剂进行固定之前或期间，可以将经培养的细胞组织的片另外拉伸。在一些情况下，可以任选地将经培养的细胞组织的片切成所需的尺寸或形状以简化组织修饰过程。在一些情况下，经培养的细胞组织的片可以是基本矩形的或基本圆形的。在一些情况下，经培养的细胞组织的初始厚度可以在50与300微米之间。
在一些情况下，在生长过程期间拉伸经培养的细胞片并且在固定过程期间保持该拉伸。在一些情况下，可以对经培养的细胞片施加另外的张力。例如，多个夹持器可以布置在置于框架上的经培养的细胞组织的片周围，并伸展以拉伸经培养的细胞组织的片。图4描绘了示例性组织伸展机400，其可以包括多个力致动器340a、340b、340c和340d，每个力致动器被适配成通过夹持器310a、310b、310c和310d向片的侧面施加应力负荷，每个夹持器被固定到片32的边缘部分。片32可以被定位在框架360上，使得在拉伸后，片32可以被钉到框架360上，使得可以使片在双向拉伸下化学交联。
经培养的细胞组织的经拉伸片可以被捕获在框架上，如图5所示，以保持拉伸进行进一步处理。例如，如图5所示，经拉伸片32可以通过多个钉820被固定在框架上以形成组织-框架组件800。使经拉伸片化学交联以固定生物组织。例如，戊二醛是合适的化学交联剂。在一些情况下，组织-框架组件800可以被置于包括0.6wt％戊二醛的溶液中持续至少10分钟以使经培养的细胞组织化学交联。
图2说明了本文提供的示例性人工心脏瓣膜100，其可以使用包括本文提供的拉伸且固定的经培养的细胞材料的小叶200。图2是连接至部署装置190上的人工心脏瓣膜100的透视图。如所示，人工心脏瓣膜100包括可扩张构件110(例如，编织支架)、三个双向取向且固定的经培养的细胞小叶200、三个将小叶200的管袖状部分216固定到可扩张构件110上的锚定元件120以及固定在人工心脏瓣膜100的血液流入端周围的管状密封件130。为了便于更好的理解，图2没有示出位于管状密封件130下方的部件。锚定元件120可以包括被适配成沿着管袖状部分216的相对侧提供支撑的后腿压缩元件122和夹紧支撑结构126。图2所示的可扩张构件110是编织支架(其也可以被描述为编织锚定元件)，其被适配成在具有较小直径的受限状态与具有较大直径的扩张状态之间转换。可扩张构件110可以是自扩张的、机械扩张的或其组合。在一些情况下，一个或多个不透射线标记可以被固定到本文提供的人工心脏瓣膜上。如所示，可扩张构件110包括不透射线标记112。任何合适的不透射线材料(如铂、钯、金、钽或其合金)均可用作不透射线标记112中的不透射线材料。一个或多个不透射线标记可以与成像系统一起使用，以帮助医生确保将瓣膜置于适当的位置。在一些情况下，本文提供的人工心脏瓣膜包括至少三个不透射线标记。可扩张构件110可以具有任何合适的结构、布置或材料。在一些情况下，可扩张构件110可以包括编织线支架。例如，美国公开号2005/0143809(名称为“用于血管内置换心脏瓣膜的方法和装置(Methods andApparatus for Endovascularly Replacing a Heart Valve)”，并且提交于2004年11月5日，将其通过引用其关于编织线支架的可能结构和材料的披露而并入本文)披露了编织线支架。在一些情况下，可扩张构件110包括形状记忆材料(例如，镍钛合金或钴铬合金)。
在一些情况下，如所示，人工心脏瓣膜100包括三个经培养细胞小叶200。在一些情况下，本文提供的人工心脏瓣膜可以具有任何合适数量的经培养的细胞小叶，如两个、三个、四个、五个或更多个小叶。在一些情况下，经培养的细胞小叶200彼此固定。在一些情况下，经培养的细胞小叶200可以通过一条缝合线(未示出)或多条缝合线彼此固定。经培养的细胞小叶200可以沿每个小叶的主体部分的边缘缝合。在一些情况下，本文提供的人工心脏瓣膜可以包括单行缝合线，其可以被适配成使渗漏最小化、使缝的宽度最小化和/或使经皮插入期间替代性心脏瓣膜的轮廓最小化。在一些情况下，本文提供的人工心脏瓣膜可以包括多行缝合线。
在一些情况下，可以压平经培养的细胞片。例如，压板系统可以用来压平经培养的细胞片。在一些情况下，框架可以与压板一起使用以便压平经培养的细胞，从而在固定之前进一步提供更一致的厚度。底板的尺寸可以被设置成适合在组织固定框架内，并且顶部压板可以被扩展成包括与底板相同尺寸的扁平矩形板。顶部压板可以是程序控制的，以便将其压缩到固定厚度。可替代地，可以使用垫片来限制使用机械方法可移动的压板的行进。两者都达到相同的结果，以将可移动压板的行进量限制到固定的距离，由此提供具有固定厚度的组织。在一些情况下，底部压板可以是可移动压板，而顶部压板是固定的。压平过程可以在单独的位置进行，如上所示，或者被集成到BAT固定装置中。压板材料可以是医疗级或食品级塑料或耐腐蚀不锈钢或适用于腐蚀环境同时仍允许清洁的其他材料。在一些情况下，高度抛光且光滑的不锈钢可以用作压板表面以抵抗特征(例如，模线、机器线等)从压板到组织的任何转印/压印。
仅有组织的片：
在一些情况下，本文提供的小叶可以排除外源性材料。在下文讨论的一些情况下，可以使用生物材料支架来生产包括生物材料支架和经培养的细胞的复合小叶材料。仅有组织的片可以帮助规避引起免疫反应，但缺乏外源性生物材料支架意味着片必须依靠单独的经培养的细胞来提供机械完整性的适当平衡。如下文所讨论的，本文提供的经培养的细胞片(具有和不具有外源性生物材料支架)提供了用作本文提供的心脏瓣膜中的小叶所需的机械性能。
例如，通过将细胞置于标准细胞培养条件(37℃和5％CO2)下并使其在补充有100μM抗坏血酸的标准生长培养基中生长来产生仅有组织的片。细胞到一周达到汇合，这之后将培养基更换为实验培养基条件(下表1)。对于每次给料实验培养基都是新鲜的，并且在所有条件下每周更换三次。在第6周和第12周，将构建体从培养物中取出并在0.6％戊二醛中固定至少24小时，然后取样分析。
复合组织片：
在一些情况下，本文提供的小叶可以包括外源性材料，如生物材料支架。生物材料支架可以使用任何合适的技术使用任何合适的材料来制造。电纺是一种用于产生纤维状聚合物网状支架的方法，其可以用于模拟ECM并作为细胞的有吸引力的环境。可以调整如厚度、纤维直径和对齐等材料特性以产生期望的结果。PLGA和PVDF是两种针对生物医学应用的已成功电纺并且目前已以各种形式通过FDA批准的聚合物。PVDF是不可生物降解的，但已显示可支持细胞生长。PLGA是目前用于多种生物医学应用的常见生物可吸收材料。也考虑了用于复合组织片的其他类型的支架。
实验结果
使用BDF、SMC或BDF/SMC共培养物开发了仅有组织的片和包括生物材料支架的片。每种条件都是针对两个不同的终点一式两份地生长，如表1-3中所详述。在每个终点，将片固定在0.6％戊二醛中。取少量样品进行细胞和ECM组分的组织学分析，其中特别感兴趣的是胶原。为了评估如极限强度等机械性能，取至少两个样品进行拉伸测试。
对于仅有组织的支架，在补充有抗坏血酸的生长培养基中生长的单细胞类型(仅BDF或仅SMC)的条件被认为是基线对照。对于组织-聚合物混合条件，在没有细胞的相同条件下维持另外的设置。
表1：仅有组织的片条件
表2：组织-PVDF支架混合物
表3：组织-PLGA支架混合物
使用本领域已知的技术分离真皮成纤维细胞和动脉平滑肌细胞。将细胞在标准条件下在补充有10％FBS、1％NEAA、1％anti-anti的DMEM中在5％CO2下在37℃下培养。
通过在100mm培养皿中以12,000个细胞/cm2接种细胞(BDF、SMC或BDF/SMC 1:1共培养物)来产生仅有组织的片。从棉蛋白印迹转印纸上切下圆形薄框，放入细胞培养皿中并用灭菌的不锈钢六角螺母压低。框架可以提供防止细胞片收缩的结构、以及用于处理片而不损坏细胞的抓握部。如有必要，这些框架可以很容易地从片上移除。
图7说明了用于培养仅有组织的片的设置。装置包括培养皿710、细胞720、纸框730和六角螺母740。使用六角螺母740来压低纸框730。纸框730用作细胞720的支撑件，其防止片随着片变厚而收缩，并且提供用于在从板上移除时进行处理的抓握部。
将细胞置于标准细胞培养条件(37℃和5％CO2)下并使其在补充有100μM抗坏血酸的标准生长培养基中生长。细胞到一周达到汇合，这之后将培养基更换为实验培养基条件(错误！未找到参考源。)。对于每次给料实验培养基都是新鲜的，并且在所有条件下每周更换三次。在第6周和第12周，将构建体从培养物中取出并在0.6％戊二醛中固定至少24小时，然后取样分析。更详细的方案提供于附录C中。
标记为“生物反应器”的另外条件用BDF/SMC 1:1共培养物接种并使其与上述相同的方式在150mm细胞培养板中生长3周。三周后，将组织片从塑料上剥离并转移到保持室中，该保持室允许培养基进入支架的两侧。在生长六周时(在培养塑料中三周，并且在保持室中三周)，将片取出并固定在0.6％戊二醛中用于分析。
通过切割PVDF和PLGA条并将其置于未涂覆的培养皿中，用无菌六角螺母将其压低，并且将其预浸泡在生长培养基中，除去培养基并接种细胞来制备组织-聚合物支架片。条宽0.5英寸。PVDF条至少2英寸长。将PVDF条在置于培养皿中之前在121℃下高压灭菌15分钟。将PVDF条在生长培养基中浸泡两小时，而将PLGA条在生长培养基中浸泡30分钟。按照制造商的说明书，将PLGA条在70％中浸泡四4小时并在培养皿中用PBS彻底冲洗，然后用无菌六角螺母压低并浸泡在生长培养基中。具有最小直径的对齐支架的PGLA条在暴露于乙醇后立即收缩，并且所有材料已经用完。较大直径的对齐支架收缩地慢得多。根据制造商的建议，从剩余的支架上切下新的PGLA条并且在两个载玻片之间压平的同时进行灭菌。
将BDF以覆盖条而不会溢流到板中的足够小的体积以高浓度(100,000个细胞/ml)接种到条上。将细胞孵育三小时，并且然后小心地除去过量的培养基。针对SMC重复相同的过程。孵育三小时后，用15ml补充有100μM抗坏血酸的生长培养基充满培养皿。
将经接种支架置于标准细胞培养条件(37℃和5％CO2)下。在每次更换之前，立即为生长培养基补充100μM抗坏血酸，每周三次。每周将支架转移到新鲜未处理的平板上以防止细胞桥接附着在塑料上。在第5周和第8周，将构建体从培养物中取出并在0.6％戊二醛中固定至少24小时，然后取样分析。
测试仅有组织的片和和组织-聚合物支架片的试样的拉伸强度。通过将条切割成4.5x 25mm的尺寸来制备用于拉伸测试的每个试样。将条置于含预热PBS的锥形管中。将这些管保持在37℃的水浴中直至测试前。使用数字测微计在沿着标距长度的三个位置测量每个条的厚度并输入Excel中。使用Excel计算平均厚度，在提示进入Bluehill软件时输入。使用数字卡尺测量样品的宽度并且将宽度也输入软件中。
图8说明了如何切割条以进行拉伸测试。如红色圆圈所指示，使用数字测微计在沿着标距长度的三个点处进行厚度测量。通过粘合细粒度砂纸来修改握持面，以便更好地抓握组织标本。将测试条装入气动夹具中并以25mm的标距长度设定。使样品伸展直到预负荷为0.1MPa。从预循环(5个循环，从0.1MPa到1.0MPa)开始捕获数据，并在失效时(定义为80％峰值负荷)结束捕获数据。将收集的数据输出到Excel中进行分析。仅使用5个预循环后以0.1MPa开始的测试数据进行分析。
使用活检穿孔器从每个组织或组织-聚合物混合片收集直径10mm的样品进行组织学分析。在福尔马林中固定后，将样品装入组织学盒中进行微波组织处理。将样品置于100％乙醇并搅拌并加热至68℃持续四分钟。用异丙醇代替乙醇，并且将样品搅拌并加热至74℃持续四分钟。将盒置于预热的石蜡中，并在80℃下微波处理七分钟。
组织处理后，将样品切成两半以产生两个半圆。将每一半都垂直置于模具中，使得平边沿着底部。将样品包埋在石蜡中，并且然后在-20℃冰箱中冷却准备进行用切片机切片。将经石蜡包埋的样品保持冷冻(无论是在冰箱中还是在冷板上)进行切片。切取5μm厚的切片并将其置于设定在40℃的水浴中的去离子水中。每个载玻片至少有两个切片漂浮在载玻片上并风干过夜。染色前，将载玻片在60℃烘箱中烘烤过夜。
进行Masson’s Trichrome和Russell-Movat Pentachrome染色以评估每个支架横截面的ECM组分。将载玻片脱蜡并通过一系列二甲苯和分级乙醇步骤再水化。对载玻片进行染色，脱水并使用EcoMount安装介质盖上盖玻片。表4详述了每种染色方案的配色方案。
表4：Masson’s Trichrome和Russel-Movat Pentachrome的具体染色着色指南。
Masson’s Trichrome Russell-Movat
肌纤维 红色 红色
纤维蛋白 粉色 红色
胶原 蓝色 黄色
核 蓝色或黑色 黑色
弹性蛋白； N/A 黑色
糖胺聚糖 N/A 蓝色
使用Olympus BX45显微镜使载玻片可视化，并且使用Insight Spot 6相机和Spot5.1软件照相。使用2X放大率收集整个横截面的图像，并且然后使用Photoshop拼接在一起。使用40X放大率拍摄更详细的图像以收集每个横截面内的代表性样品。
在分析期间，出于列出的原因，将下表5中列出的数据排除在研究之外。
用于运行Instron机械测试仪的Bluehill 2软件实时收集试样长度和负荷变化的数据。在测试每个样品之前，用户输入样品尺寸：厚度、宽度和标距长度。根据这些信息，软件计算出横截面积，将其也用于计算力和应力数据。图9说明了使用的数据计算。如所示，负荷、加速度和ΔL表示由Bluehill软件测量的参数，而厚度和宽度是用户输入的参数。将应力和应变数据导出到Excel中，在其中进行进一步的计算。此项研究的生理相关性的和特别感兴趣的区域在0.5Mpa与1.0MPa之间。表6详细说明了本研究中使用的参数。使用Excel中的“平均值(average)”函数来计算每组的平均值，并且使用“标准差值(stddev.p)”函数来计算标准差。
表5：使用Excel进行的从应力和应变数据外推信息的计算
下文给出了仅有组织的支架的机械和组织学分析。使每个时间点的一个样本分裂进行分析。切下最少两个试样对每个样品进行机械测试。
应该注意的是，BDF HG样品在三周后从细胞培养板上脱离下来，并继续漂浮在培养基中，使它能够接近来自两侧的培养基。其他条件保持与组织培养塑料接触，直到它们在预定的终点被去除，从而允许随着它们变厚较少的培养基接近片的底。针对这种条件存在组织学评估，但没有机械数据。
表6：沿着每个试样的长度在三个不同点如通过数字测微计测量的支架厚度(μm)。将每个样品组的数据合并，并作为平均值和标准差给出。
图10A描绘了每个试样的在三个不同点如通过数字测微计测量的支架厚度(μm)。将每个样品组的数据合并，并作为平均值+/-标准差给出。所有条件都示出了从6周到12周厚度增加，其中共培养物条件在每个时间点最厚。
表7：作为由Bluehill软件记录的最高应力确定的UTS(MPa)。将每个样品组的数据合并，并作为平均值和标准差给出。
图10B描绘了来自针对每个样品组合并的数据的以MPa计的极限拉伸强度(UTS)，并以平均值+/-标准差给出。除共培养物条件外，所有样品均示出了从6到12周强度增加，遵循与测量的厚度相同的趋势。在第6周共培养物示出了总体测量的最高的UTS，而BDF HG在第12周示出了测量的最高的UTS。
表8：在0.5MPa和1.0MPa下测量的应变，作为％给出。将每个样品组的数据合并，并作为平均值和标准差给出。
图10C描绘了在0.5MPa和1.0MPa下的应变。将每个样品组的数据合并，并作为平均值+/-标准差给出。所有样品从6到12周测量的应力均增加，显示弹性增加。SMC CM条件示出了最具弹性的行为。
表9：在0.5Mpa和1.0MPa下作为两点之间的斜率计算的切向模量(MPa)。将每个样品组的数据合并，并作为平均值和标准差给出。
图10D描绘了在0.5Mpa和1.0MPa下作为两点之间的斜率计算的切向模量(MPa)。将每个样品组的数据合并，并作为平均值+/-标准差给出。从第6周到第12周几乎没有变化。SMC CM示出了最低的模量，因此该组的行为最具弹性。
图11A示出了针对Masson’s Trichrome染色的仅有组织的支架的横截面的代表性40X图像。片的区域越成熟，示出的胶原沉积越多，从第6周到第12周增加。在第12周BDF HG样品示出了更对称的染色，其中在每侧中间是胶原，两侧是细胞生长，而在第12周共培养物条件似乎示出了最密集的胶原沉积。与BDF或共培养物条件相比，两种SMC条件都示出了更少的胶原染色。
图11B示出了针对Russell-Movat Pentachrome染色的仅有组织的支架的横截面的代表性40X图像。支架的生长方向从左向右，其中每张图片右手侧的细胞生长是最新的。片的区域越成熟，示出的胶原沉积越多，特别是在第12周的时间点。除胶原外，SMC对照和SMC CM在第12周还产生了糖胺聚糖。在第12周BDF HG样品示出了更对称的染色，其中在每侧中间是胶原，两侧是细胞生长，
图11C示出了在两侧补料3周后，在生物反应器中生长6周后的组织样品。顶行表示Russell-Movat Pentachrome染色，并且底行表示Masson’s Trichrome染色。进入培养基有助于增加支架的厚度，然而，胶原沉积并没有显著增加。两种染色都指示与生长附着在组织培养塑料上的样品相比，横截面的对称性更大，表明生长在两个方向上都发生。
使用BDF、SMC和BDF/SMC 50:50共培养物在体外产生仅有组织的支架。还使这些细胞经受不同的培养基补充剂以支持生长和胶原沉积。在所有条件下，厚度和ECM产量从第六周到第十二周增加。五种条件都成功地生长到达到UTS>1MPa。共培养物条件在第6周示出了4.08+/-0.40的最大UTS，与由Cytograft产生的组织片相当(5.13+/-0.91)。BDF HG条件在第12周示出了最高的强度(3.26+/-0.38)，并且总体第二高。
尽管总体趋势是强度(UTS)随着厚度增加而增加，但是最厚的两片(共培养物第12周和生物反应器第6周)未测量为最强。共培养物条件从第6到第12周的时间点强度下降；第12周的片表现出从片底部到顶部的更明显的胶原比细胞梯度。测量酶活性的进一步分析将有助于确定MMP(胶原酶)是否由细胞分泌并降解胶原结构，从而随时间影响其特性。生物反应器条件在第6周更接近于第12周共培养物的厚度，显示厚度加速增加。此片由较大比例的细胞比胶原组成，并且表现出所有条件最弱的机械性能(UTS<1MPa)。胶原与总厚度的比例可能比单独的厚度更好地指示材料强度。重复这种条件并且生长到更长的时间点将显示胶原的产生是否随时间增加并且强度是否提高。
进入细胞片两侧的培养基通过允许细胞继续从顶侧和底侧向外生长来增加厚度，如通过第12周HG和第6周生物反应器条件所证明的。三周后将BDF HG片从组织培养塑料中提出，从而允许更好地进入两侧的培养基。组织学染色支持两侧都有生长，因为横截面显示在每侧中央是胶原，两侧是新细胞生长。生物反应器条件(其也是在第三周后在顶部和底部补料)示出了相同的生长模式。鉴于BDF HG片漂浮在培养基中，生物反应器条件被束缚在保持室中，并且在每一侧补充培养基。尽管生物反应器条件没有经受任何机械刺激，但是通过将片悬浮在保持室中而产生的固有张力可能足以改变ECM沉积，如应力纤维的产生增加或对齐的诱导。
SMC CM和BDF对照条件在每个时间点都是两种最弱的条件。Russell-Movat染色显示，SMC CM样品具有比其他条件更多的GAG含量，这可能有助于它们的行为更具弹性，如通过切向模量所测量的。根据此量度两种最刚性的条件是共培养物和BDF HG，也是最厚的两种。有趣的是，SMC对照示出了比BDF对照更大的强度，但是几乎相同的切向模量，尽管它们的细胞类型和ECM组成不同。
当叠加应力-应变曲线时，所有条件在初始脚趾状(toe)区域内都是相似的，这些区域包括在0.5MPa和1.0MPa之间的感兴趣的区域，可能是因为胶原纤维未卷曲。一旦纤维完全伸展，曲线在5％应变之前进入线性区域，在其中斜率变为恒定率并且条件之间的差异变得更加明显。BDF HG和培养物应力-应变曲线几乎完全相同，SMC和BDF对照也是如此。SMCCM条件具有最浅的斜率，并且是最具弹性的，而BDF HG和共培养物是最刚性的。在时间点之间每个组内没有明显的差异。
为了适应更多的测试条件，每个时间点的重复次数限制为一次，从而限制数据源。应该缩小条件并重复研究以提高统计显著性。共培养物条件示出了比单独的任一种细胞类型更有前途的机械性能，并且HG培养基与其他处理相比示出了提高的强度。应该用HG培养基测试共培养物条件以确定任何增加的益处。两种片条件都由作为对GAG染色呈阳性的单细胞类型SMC组成，而BDF条件主要为胶原。改变接种的BDF与SMC的比例可以通过影响分泌的EMC组分的组合来改变支架的特性。研究不同比例的这两种细胞类型的作用可以允许调整体外生长的组织片的机械性能的能力，从而扩大这种系统的潜在应用。
电纺PVDF允许细胞在表面上和周围生长成厚的胶原致密片。在拉伸测试期间，这些最终分层成两个不同的层。应力-应变曲线(附录G)显示最初的行为更刚性，因为大部分阻力由细胞层提供。由于细胞层失败，应力轻微下降，直到支架将负荷担起。由支架上的细胞表征的曲线与在仅有组织的支架中产生的曲线相当：在1与4MPa之间在15％–20％应变下失效。数据的变化可能是由于细胞涂层不均匀，因为支架的一些区域更密集地充满细胞。细胞生长的真正横截面获得起来要难得多，因为细胞遵循材料的轮廓，以更具三维的方式生长。与仅有组织的片一样，应该缩小支架条件以扩大重复次数。用于生物反应器条件的生长室也可能有助于固定支架并允许表面更扁平以增加细胞生长的一致性。
机械数据表明组织可以在体外生长并且产生具有可量化的机械性能的细胞外基质。在没有外源性支架情况下生长的仅有组织的片生长具有一致的特性，可以进一步对其进行操纵以达到所需的特征。可以基于这些发现进行进一步的研究以通过改变参数(如细胞类型或培养基配方)来增强组织特性。更好地理解如何操纵这些特性可能有助于扩大此材料的潜在使用范围。
仅有细胞的经培养的片：
以下是仅使用细胞设置组织工程化片的一般方案。根据下文提供的细胞培养基方案制备细胞。没有使用外源性支架。可以从凝胶印迹转印纸上切下框架，以便提供足够的结构以防止组织片收缩。可以对框架提前高压灭菌。使用的细胞是BDF、SMC或BDF和SMC的1:1共培养物。在一些情况下，可以使用其他比例的BDF和SMC。在一些情况下，使用其他细胞。为了准备用于细胞接种的平板，将框架置于p100培养皿中，如图7所示，并且预浸泡在足够覆盖的培养基中(纸非常吸水，并且这将有助于在接种细胞之前将其压平)；在一些情况下，吸取多余的培养基可以帮助清除碎片。可以将螺栓置于纸上以保持框架压低，从而避免与框架内部的区域重叠。在一些情况下，接种的细胞是在解冻后已经生长并传代至少一次的细胞。可以将细胞以12,000个细胞/cm2在补充有100uM抗坏血酸的生长培养基(DMEM、10％FBS、1％NEAA、1％抗-抗(anti-anti))中铺板。在一些情况下，接种后1周可以加入另外的处理。细胞可以定期给予葡萄糖。典型的补料时间表是每周三次，但是高葡萄糖条件在稍后的时间点可能需要更频繁的更换或另外的培养基。在一些情况下，在框架能够从平板上脱离之前，需要至少三周。在一些情况下，直到铺板后至少四周框架才脱离，尤其是对于需要艰难操作(即滚压成管)的任何应用而言。框架脱离后，可以将压重物移除。当将片从平板中提出时，如果首先除去培养基，则框架不太可能与细胞脱离。可以用PBS将片洗涤2-3次，或者直到来自培养基的粉红色不再可见为止。然后将片在0.6％戊二醛溶液中固定至少一夜，然后准备进行分析。
标记为“生物反应器”的另外条件用BDF/SMC 1:1共培养物接种并使其与上述相同的方式在150mm细胞培养板中生长3周。三周后，将组织片从塑料上剥离并转移到保持室中，该保持室允许培养基进入支架的两侧。在生长六周时(在培养塑料中三周，并且在保持室中三周)，将片取出并固定在0.6％戊二醛中用于分析。
细胞培养基方案：
细胞培养基使用基础培养基，其可以提前制备或新鲜制备。可以将以下组分组合并使用具有0.22μm膜的真空瓶进行无菌过滤以制备基础培养基。也可以提前制备200mM抗坏血酸原液。在一些情况下，可以将200mM抗坏血酸原液在4℃下保存长达三周。三周后，由于随时间丧失活性，可以将200mM抗坏血酸原液丢弃。200mM抗坏血酸原液可以在使用前立即加到培养基中。在提前制备时，基础培养基可以包括表14中提供的组分。为了制备待以100uM的终浓度使用的200mM抗坏血酸溶液，可以称取579mg粉末并将其溶解于10ml无菌水中，并且将溶液过滤灭菌到15ml锥形管中以在4℃下储存。为了制备待以10mM(20X)的终浓度使用的200mM CuSO4原液，可以称取24.97g粉末并将其溶解于500ml无菌水中，并且使用500ml过滤器装置对溶液进行灭菌并在4℃下储存。在新鲜制备时，基础培养基可以包括表15中提供的组分。
表14：基础培养基
培养基 组分
生长 DMEM、10％FBS、1％NEAA、1％ANTI-ANTI
HG HG DMEM、10％FBS、1％NEAA、1％ANTI-ANTI
表15：实验培养基
培养基 组分
对照 生长培养基+100μM AA
CM 生长培养基+20％HPAFF II CM+100μM AA
HG HG培养基+100μM AA
Copper 生长培养基+10mM CuSO4+100μM AA
一般细胞培养：
可以使用上文讨论的细胞培养基来维持细胞，如BDF和SMC。在一些情况下，在将细胞接种到实验设置中之前，可以将细胞维持在生长培养基中的通气细胞培养T型烧瓶中。培养基可以定期更换(例如，每周三次)，并且细胞可以按当大约80％的汇合度传代。传代方案可以包括以下步骤：(a)用0.25％胰蛋白酶-EDTA使细胞从平板上脱离(SMC通常快速脱离大约1分钟，而BDF通常需要5-7分钟，但可能更长，这取决于汇合度)；(b)避免苛刻的敲击或过度的搅拌，这可能使细胞团聚；(c)将细胞重悬于生长培养基中(2x体积的胰蛋白酶)并以150x g离心10分钟；(d)吸出上清液重悬于新鲜的培养基中，对于常规传代，典型的分裂在1:4与1:12之间。可以将细胞在标准条件(例如，37℃、5％CO2)下孵育。在一些情况下，可以对细胞进行计数并使其重悬到所需的浓度以用于实验设置。
已经描述了本发明的许多实施例。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可做出诸多改变。因此，其他实施例在以下权利要求书的范围内。

Claims (35)

1.一种人工心脏瓣膜，包括固定在一起并保持在可扩张管状构件内的多个小叶，每个小叶包括径向或双向取向且化学交联的经培养的细胞组织材料。
2.如权利要求1所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从成纤维细胞、优选真皮成纤维细胞、更优选牛真皮成纤维细胞培养而来。
3.如权利要求1或权利要求2所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从平滑肌细胞、优选牛平滑肌细胞培养而来。
4.如权利要求1所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从成纤维细胞和平滑肌细胞的混合物培养而来，优选地比例在20∶80与80∶20之间，优选地该混合物包括牛成纤维细胞和牛平滑肌细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织与戊二醛交联。
6.如权利要求1-5中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中将该经培养的细胞培养至少3周、优选至少4周、更优选至少5周、并且甚至更优选至少6周。
7.如权利要求1-6中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的厚度在50微米与300微米之间。
8.如权利要求1-7中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织在500kPa下的伸长百分比在6.5％与8.5％之间。
9.如权利要求1-8中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织在1MPa下的伸长百分比在10.5％与13.5％之间。
10.如权利要求1-9中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的极限抗拉强度在4MPa与6.5MPa之间。
11.如权利要求1-10中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的收缩温度在83.8℃与84.6℃之间。
12.如权利要求1-11中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的含水量在80％与88％之间。
13.如权利要求1-12中任一项所述的人工心脏瓣膜，其中这些小叶由径向或双向取向且固定的经培养的细胞材料组成。
14.一种形成经培养的细胞小叶的方法，该方法包括：
a)获得成纤维细胞、平滑肌细胞或其组合；
b)在框架上培养这些细胞以产生经培养的细胞的片；
c)对该经培养的细胞组织的片施加张力；
d)在对该经培养的细胞组织的片施加张力的同时，使该经培养的细胞组织与化学交联剂接触至少10分钟；并且
e)从该片上切下小叶，该小叶包括主体部分和两个管袖状部分。
15.如权利要求14所述的方法，其中这些经培养的细胞包括比例在20∶80与80∶20之间的成纤维细胞和平滑肌细胞的混合物。
16.一种人工心脏瓣膜，包括固定在一起并保持在可扩张管状构件内的多个小叶，每个小叶包括径向或双向取向且化学交联的经培养的细胞组织材料。
17.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从成纤维细胞培养而来。
18.如权利要求17所述的人工心脏瓣膜，其中这些成纤维细胞是真皮成纤维细胞。
19.如权利要求18所述的人工心脏瓣膜，其中这些真皮成纤维细胞是牛真皮成纤维细胞。
20.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从包括平滑肌细胞的细胞培养而来。
21.如权利要求20所述的人工心脏瓣膜，其中这些平滑肌细胞是牛平滑肌细胞。
22.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞材料从成纤维细胞和平滑肌细胞的混合物培养而来。
23.如权利要求22所述的人工心脏瓣膜，其中这些成纤维细胞和成纤维细胞的比例在20∶80与80∶20之间。
24.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织与戊二醛交联。
25.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中将这些经培养的细胞培养至少3周。
26.如权利要求25所述的人工心脏瓣膜，其中将这些经培养的细胞培养至少5周。
27.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的厚度在50微米与300微米之间。
28.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织在500kPa下的伸长百分比在6.5％与8.5％之间。
29.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织在1MPa下的伸长百分比在10.5％与13.5％之间。
30.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的极限抗拉强度在4MPa与6.5MPa之间。
31.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的收缩温度在83.8℃与84.6℃之间。
32.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中该经培养的细胞组织的含水量在80％与88％之间。
33.如权利要求16所述的人工心脏瓣膜，其中这些小叶由径向或双向取向且固定的经培养的细胞材料组成。
34.一种形成经培养的细胞小叶的方法，该方法包括：
(a)获得成纤维细胞、平滑肌细胞或其组合；
(b)在框架上培养这些细胞以产生经培养的细胞的片；
(c)对该经培养的细胞组织的片施加张力；
(d)在对该经培养的细胞组织的片施加张力的同时，使该经培养的细胞组织与化学交联剂接触至少10分钟；并且
(e)从该片上切下小叶，该小叶包括主体部分和两个管袖状部分。
35.如权利要求34所述的方法，其中这些经培养的细胞包括比例在20∶80与80∶20之间的成纤维细胞和平滑肌细胞的混合物。
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