JP6946281B2 - 培養細胞小葉の形成方法 - Google Patents

Description

本出願は、全ての国の指定に対する出願人である米国国内企業のボストン サイエンティフィック サイムド，インコーポレイテッド（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳｃｉＭｅｄ，Ｉｎｃ．）、ならびに全ての国の指定に対する発明者である米国市民のクリスタルＭ．アンダーソン−クナナン（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ−Ｃｕｎａｎａｎ）、および全ての国の指定に対する発明者である米国市民のキャサリンＣ．ファザッカーリー（Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｃ．Ｆａｚａｃｋｅｒｌｅｙ）、および全ての国の指定に対する発明者である米国市民のマイケル エピハイマー（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｐｐｉｈｉｍｅｒ）、および全ての国の指定に対する発明者である米国市民のシャノン スミス ケンウッド（Ｓｈａｎｎｏｎ Ｓｍｉｔｈ Ｋｅｎｗｏｏｄ）、および全ての国の指定に対する発明者である米国市民のナタリアＰ．スシコヴァ（Ｎａｔａｌｉａ Ｐ．Ｓｕｓｈｋｏｖａ）、および全ての国の指定に対する発明者である米国市民のカレン スザンヌ ラヴェリー（Ｋａｒｅｎ Ｓｕｚａｎｎｅ Ｌａｖｅｒｙ）の名義でＰＣＴ国際特許出願として２０１６年９月２６日に出願されているとともに、２０１５年１０月７日に出願された、米国特許仮出願第６２／２３８２２２号明細書、および２０１６年９月２２日に出願された、米国特許出願第１５／２７２７４７号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

本文書は、培養細胞材料から作られる小葉を提供する。

心臓弁手術は、罹患した心臓弁の修復または置換に使用することができる。例えば、心臓弁置換は、一般に狭窄と呼ばれる天然の心臓弁の狭小化が起きている場合、または天然の弁が漏れるもしくは逆流する場合に示唆され得る。罹患した心臓弁の修復または置換は、例えば、患者にとって異種の生体組織（例えば、異種間移植片または異種移植片）を含む人工心臓弁の導入を含み得る。人工心臓弁を作るために使用される一般的な生体組織は、心膜組織、典型的にはウシまたはブタの心膜組織である。しかしながら、幹細胞から生細胞小葉を成長させる試みは、心臓弁の置換には不十分であることが判明している。

本明細書で提供する人工心臓弁には、小葉材料として培養細胞組織が使用される。本明細書で提供する培養細胞小葉は、組織シートを形成するために線維芽細胞、平滑筋細胞、またはこれらの細胞の組み合わせを培養し、シートを固定するために張力をかけながら培養細胞のシートを化学的に架橋し、かつ培養細胞の固定されたシートから心臓弁小葉を切り出すことにより作製される。

例１では、人工心臓弁は、互いにしっかりと固定され拡張可能な管状部材内に保持された複数の小葉を含むことができ、各小葉が、径方向または２軸方向に延伸され化学的に架橋された培養細胞組織材料を含む。

例２では、培養細胞材料が線維芽細胞、好ましくは皮膚線維芽細胞、より好ましくはウシ皮膚線維芽細胞から培養される、例１に記載の人工心臓弁。
例３では、培養細胞材料が平滑筋細胞、好ましくはウシ平滑筋細胞から培養される、例１または２に記載の人工心臓弁。

例４では、培養細胞材料が、好ましくは２０：８０〜８０：２０の比率の、線維芽細胞と平滑筋細胞の混合物、好ましくはウシ線維芽細胞とウシ平滑筋細胞の混合物から培養される、例１に記載の人工心臓弁。

例５では、培養細胞組織がグルタルアルデヒドで架橋される、例１〜４のいずれか１つに記載の人工心臓弁。
例６では、培養細胞が少なくとも３週間、好ましくは少なくとも４週間、より好ましくは少なくとも５週間、更により好ましくは少なくとも６週間培養される、例１〜５のいずれか１つに記載の人工心臓弁。

例７では、培養細胞組織が５０マイクロメートル〜３００マイクロメートル、好ましくは７５マイクロメートル〜２００マイクロメートルの厚さを有する、例１〜６のいずれか１つに記載の人工心臓弁。

例８では、培養細胞組織が５００ｋＰａで６．５％〜８．５％の伸び率を有する、例１〜７のいずれか１つに記載の人工心臓弁。
例９では、培養細胞組織が１ＭＰａで１０．５％〜１３．５％の伸び率を有する、例１〜８のいずれか１つに記載の人工心臓弁。

例１０では、培養細胞組織が４ＭＰａ〜６．５ＭＰａの極限引張強度を有する、例１〜９のいずれか１つに記載の人工心臓弁。
例１１では、培養細胞組織が８３．８℃〜８４．６℃の収縮温度を有する、例１〜１０のいずれか１つに記載の人工心臓弁。

例１２では、培養細胞組織が８０％〜８８％の含水率を有する、例１〜１０のいずれか１つに記載の人工心臓弁。
例１３では、小葉が、径方向または２軸方向に延伸され固定された培養細胞材料からなる、例１〜１２のいずれか１つに記載の人工心臓弁。

例１４では、培養細胞小葉の形成方法が、（ａ）線維芽細胞、平滑筋細胞、またはこれらの組み合わせを得る工程と、（ｂ）培養細胞のシートを作製するために細胞を枠上で培養する工程と、（ｃ）培養細胞組織のシートに張力を付与する工程と、（ｄ）培養細胞組織のシートに張力が付与されたままで、培養細胞組織を化学架橋剤と少なくとも１０分間接触させる工程と、（ｅ）本体部分と２つのスリーブ部分とを備える小葉をシートから切り出す工程とを含むことができる。

例１５では、培養細胞が２０：８０〜８０：２０の比率の線維芽細胞と平滑筋細胞の混合物を含む、例１４に記載の方法。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

培養細胞組織を使用した心臓弁の例示的な作製方法を示すフロー図である。 例示的な人工心臓弁である。 増殖培地上の培養ウシ皮膚線維芽細胞の経時的な増殖を示す図である。 培養細胞のシートに張力を付与するための延伸機を図示する図である。 小葉の処理および切り出しのために２軸方向に張力が付与された培養細胞組織をしっかりと固定するための枠を示す図である。 延伸および架橋の前に培養細胞組織を平坦化するためのプラテンを示す図である。 組織のみのシートを培養するための例示的なセットアップを示す図である。 引張試験のための試料細胞シートの切り出し方法を示す図である。 応力および歪みの計算方法を図示する図である。 異なる培養シートの特性を示す図である。 異なる培養シートの特性を示す図である。 異なる培養シートの特性を示す図である。 異なる培養シートの特性を示す図である。 マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色された組織のみの足場の断面の代表的な４０倍画像を示す図である。 ラッセル・モバット ペンタクローム（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｍｏｖａｔ Ｐｅｎｔａｃｈｒｏｍｅ）染色された組織のみの足場の断面の代表的な４０倍画像を示す図である。 両側に３週間給餌した後、バイオリアクター内で６週間増殖させた後の組織試料を示す図である。

種々の図面における類似の参照符号は類似の要素を表す。
本明細書で提供する人工心臓弁は、２軸方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉を含む。人工心臓弁には、典型的には、ウシまたはブタの心膜組織小葉が使用されていたが、これらの天然組織の特性を制御することは困難であり得る。例えば、動物の疾患が、欠陥のある組織特性をもたらす可能性がある。その上、組織が、不均一な機械的特性を有する可能性がある。追加的に、動物組織に疾患がないことを証明することまたは天然組織を産生するために飼育された動物の健康状態を追跡する一定の政府規制を満たすことは、困難でかつコストがかかる可能性がある。追加的に、医学的インプラント用の生体組織を生成するために飼育された動物の群れの間での疾患の流行は、医療用具に使用可能な生体組織の不足を招く可能性がある。

心臓弁を生細胞から成長させる従来の試みは、心臓弁小葉の適切な機械的特性を発展させるには不十分であることが判明している。単に細胞を小葉の形状に成長させるだけでは、長期間の生体内使用に必要とされる機械的および生物学的特性を有する置換用心臓弁を作製するには不十分である。しかしながら、本明細書で提供する培養細胞組織小葉は、適切な生物学的および機械的特性を有する小葉を一貫して作製することができる。場合により、本明細書で提供する培養細胞小葉は、増殖中に径方向または２軸方向の力を受ける可能性がある。場合により、本明細書で提供する培養細胞小葉は、固定中に径方向または２軸方向の力を受ける可能性がある。場合により、培養細胞組織は、生体外で組織シートを作製するためにウシ皮膚線維芽細胞（ＢＤＦ）および／または平滑筋細胞（ＳＭＣ）を使用して作製することができる。所望の厚さに達したところで、これらのシートは、所望の細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）タンパク質構造を保存するために固定および架橋することができる。心臓弁小葉は、これらのシートから切り出され、現在のシステムに組み込まれてもよい。

後述するように、本明細書で提供する培養工程は、均一な厚さと均一な機械的特性とを有する培養細胞のシートを作製することができる。場合により、本明細書で提供する、径方向または２軸方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、５０マイクロメートル〜３００マイクロメートルの厚さを有することができる。場合により、本明細書で提供する、径方向または２軸方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、１００マイクロメートル〜２００マイクロメートルの厚さを有することができる。場合により、本明細書で提供する、径方向または２軸方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、１３０マイクロメートル〜１５０マイクロメートルの最大厚さを有することができる。場合により、培養細胞のシートは、張力下で増殖させ、組織を成長させるために使用される枠に組織が接続されたまま、架橋化学物質（例えば、グルタルアルデヒド）を組織に塗布することにより固定することができる。場合により、架橋化学物質（例えば、グルタルアルデヒド）を組織に塗布する前に培養細胞のシートを更なる張力下に置くことができる。

場合により、枠は、培養細胞組織に径方向の張力を与えることができる。場合により、培養細胞組織には２軸方向に張力を付与することができる。場合により、培養細胞組織には、交差する２つの軸線に沿って培養細胞組織を延伸するために少なくとも０．１Ｎの応力荷重を印加することにより２軸方向に張力が付与される。場合により、培養細胞組織には、交差する２つの軸線に沿って培養細胞組織を延伸するために０．１Ｎ〜２Ｎの応力荷重を印加することにより２軸方向に張力が付与される。場合により、培養細胞組織には、交差する２つの軸線に沿って培養細胞組織を延伸するために０．５Ｎ〜１Ｎの応力荷重を印加することにより２軸方向に張力が付与される。

張力が解放された後の培養細胞組織の反跳を防止するために、張力をかけながら培養細胞組織を化学的に架橋することができる。場合により、本明細書で提供する、２軸方向または径方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、５００ｋＰａで６．５％〜８．５％の伸び率を有することができる。場合により、本明細書で提供する、２軸方向または径方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、１ＭＰａで１０．５％〜１３．５％の伸び率を有することができる。場合により、本明細書で提供する、２軸方向または径方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、４ＭＰａ〜６．５ＭＰａの極限引張強度を有することができる。場合により、本明細書で提供する、２軸方向または径方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、８３．８℃〜８４．６℃の収縮温度を有することができる。場合により、本明細書で提供する、２軸方向または径方向に張力が付与され固定された培養細胞組織小葉は、８０％〜８８％の含水率を有することができる。追加的に、その特性は、張力が付与され固定された培養細胞組織の延伸にかかわらず、均一なものとすることができる。固定された培養細胞組織は、材料特性の一貫性のため、人工心臓弁小葉用に同等の材料を提供することができる。本明細書で提供する方法、装置、およびシステムは、人工心臓弁に使用される培養細胞組織小葉に信頼できかつ一貫した機械的特性を与えることができる。

培養細胞のシートは、任意の好適な方法を使用して増殖させることができる。場合により、培養細胞のシートは、線維芽細胞および／または平滑筋細胞を単離して、線維芽細胞および／または平滑筋細胞が固定枠内で３〜１２週間培養されるようにすることにより増殖させることができる。場合により、枠は、結果として得られる培養細胞のシートが略矩形状を有するように略矩形の構成で配設される。場合により、枠は円環構成で配置される。場合により、枠は、組織が成長するにつれて組織からの収縮力にもかかわらず平面構成を保持するようになされるように適度に剛性がある。場合により、組織の成長中に組織の形状を保持することを確実にするために、重りおよび／またはグリップを枠に付与することができる。場合により、枠は紙を含むことができる。場合により、枠は、組織の内部成長を促進するために多孔質構造を有することができる。場合により、増殖培地が付与された枠は、それに付与された線維芽細胞を有することができ、かつ線維芽細胞の増殖を可能にするために培養用プレートに入れることができる。場合により、培養シートは、本質的に培養細胞からなるものとすることができる。

細胞は、任意の好適なドナー由来のものとすることができる。場合により、細胞は、ウシ皮膚線維芽細胞および／またはウシ平滑筋細胞とすることができる。線維芽細胞および／または平滑筋細胞は、任意の好適な動物由来のものとすることができる。場合により、細胞は、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、またはヒツジのものとすることができる。場合により、細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞および／またはヒト平滑筋細胞とすることができる。場合により、細胞は、意図した患者から得ることができる。

図１は、培養細胞組織を人工心臓弁に組み込む全工程を示すフロー図である。第１のステップ１１の線維芽細胞および／または平滑筋細胞は、細胞シート３０に成長させる。場合により、皮膚生検および動脈切除により細胞を得ることができる。場合により、線維芽細胞はウシ細胞とすることができる。線維芽細胞は、当技術分野で公知の任意の好適な単離技術を使用して皮膚組織試料および動脈から単離することができる。次いで、単離された線維芽細胞および／または平滑筋細胞は、より大きな細胞集団を形成するように拡張させることができる。線維芽細胞および／または平滑筋細胞に疾患のないことを確認するために線維芽細胞および／または平滑筋細胞を試験することができる。次いで、培養トレイ内の枠に細胞を付与し、少なくとも３週間増殖させることができる。場合により、線維芽細胞のみがシート状に培養される。場合により、平滑筋細胞がシート状に培養される。場合により、平滑筋細胞と線維芽細胞の組み合わせが一緒に培養されてシートを形成する。場合により、培養細胞のシートは、２０：８０〜８０：２０の比率の平滑筋細胞に対する線維芽細胞を含み得る。場合により、線維芽細胞および平滑筋は１：１の比率で枠に付与される。

図３は、培養線維芽細胞の経時的な増殖を示している。１段目の写真は、２週間目、３週間目、および５週間目のコラーゲンおよび核を示す色素を含む。下段は、２週間目、３週間目、および５週間目のコラーゲンのみを示している。２週間目に、細胞はまだ一部が転写紙枠に付着している。３週間目に、培養細胞のシートを培養トレイから持ち上げることができる。３週間目に、培養細胞シートの厚さは３０〜５０マイクロメートルとすることができる。４週間目に、培養細胞シートの厚さは９０〜１１０ミクロンとすることができる。５週間目に、培養細胞シートの厚さは１３０〜１５０ミクロンとすることができる。代替的に、培養細胞のシートは、バイオリアクターを使用して形成することができる。

少なくとも３週間の細胞増殖後に培養細胞シートを得た後に、以下で説明する２軸方向または径方向の張力をかけながら培養細胞をステップ１２で固定することができる。ステップ１３では、固定された培養細胞組織から、所定の形状を有する小葉が切り出され、図５および図６に関連して以下に説明する、人工心臓弁で使用するのに好適な小葉が選択される。ステップ１４では、切り出された小葉の１つまたは複数を使用して人工心臓弁が製作される。ステップ１５では、人工心臓弁が仕様を満たすことを確認するために人工心臓弁を検査および／または試験することができる。場合により、検査前または検査後に人工心臓弁を滅菌することができる。図２は、例示的な人工心臓弁を示している。場合により、人工心臓弁を形成するために、２軸方向または径方向に延伸され固定された培養細胞材料を含む３つの小葉を枠におよび／または互いに縫合することができる。

培養細胞組織改変のために本明細書で提供する工程は、組織を固定する１つまたは複数のステップを使用することができる。場合により、培養細胞組織のシートは、増殖室（例えば、ペトリ皿）から培養細胞組織を移動させるかまたは移動させずに、増殖枠に付着させたときに化学架橋剤で固定される。場合により、培養細胞組織のシートには、化学架橋剤を使用した固定前または固定中に追加的に張力を付与することができる。場合により、培養細胞組織のシートは、組織改変工程を簡略化するために所望の大きさまたは形状に任意選択で切り出すことができる。場合により、培養細胞組織のシートは、略矩形または略円形とすることができる。場合により、培養細胞組織は、５０〜３００マイクロメートルの初期厚さを有することができる。

場合により、培養細胞シートは、増殖工程中に張力が付与され、かつ固定工程中にその張力を保持する。場合により、培養細胞シートに更なる張力を印加することができる。例えば、複数の把持具は、培養細胞組織のシートに張力を付与するために、枠上に配置され延伸される培養細胞組織のシートの周囲に配設することができる。図４は、各々が把持具３１０ａ、３１０ｂ、３１０ｃ、および３１０ｄを介してシートの側部に応力荷重を印加するようになされ、各々がシート３２の縁部分にしっかりと固定される、複数の力アクチュエータ３４０ａ、３４０ｂ、３４０ｃ、および３４０ｄを含むことができる、例示的な組織延伸機４００を示している。シート３２は、枠３６０上に位置決めすることができ、その結果、張力付与後に、２軸方向に張力をかけながらシートを化学的に架橋できるようにシート３２を枠３６０にステープル止めすることができる。

更なる処理のために張力を保持するために、張力が付与された培養細胞組織のシートを、図５に示すような、枠上に捕捉することができる。例えば、図５に示すように、張力が付与されたシート３２は、組織−枠アセンブリ８００を作り出すために複数のステープル８２０により枠上にしっかりと固定することができる。張力が付与されたシートは、生体組織を固定するために化学的に架橋される。例えば、グルタルアルデヒドは好適な化学架橋剤である。場合により、組織−枠アセンブリ８００は、培養細胞組織を化学的に架橋するために、０．６重量％のグルタルアルデヒドを含む溶液中に少なくとも１０分間配置することができる。

図２は、本明細書で提供する張力が付与され固定された培養細胞材料を含む小葉２００を使用できる、本明細書で提供する例示的な人工心臓弁１００を図示している。図２は、展開装置１９０に接続された人工心臓弁１００の斜視図である。図示のように、人工心臓弁１００は、拡張可能部材１１０（例えば、編組ステント）と、２軸方向に延伸され固定された３つの培養細胞小葉２００と、小葉２００のスリーブ部分２１６を拡張可能部材１１０にしっかりと固定する３つのアンカー要素１２０と、人工心臓弁１００の血液流入側端部の周りにしっかりと固定された管状シール１３０とを含む。より理解し易くするために、図２は、管状シール１３０の真下に位置する構成要素を示していない。アンカー要素１２０は、支柱脚圧縮要素１２２と、スリーブ部分２１６の互いに対向する側に沿って支持を与えるようになされた挟持支持構造１２６とを含むことができる。図２に示す拡張可能部材１１０は、より小さな直径を有する規制状態とより大きな直径を有する拡張状態との間で移行するようになされる編組ステント（編組アンカー要素として説明することもできる）である。拡張可能部材１１０は、自己拡張型のもの、機械的拡張型のもの、またはこれらの組み合わせとすることができる。場合により、本明細書で提供する人工心臓弁に１つまたは複数の放射線不透過性マーカをしっかりと固定することができる。図示のように、拡張可能部材１１０は、放射線不透過性マーカ１１２を含む。放射線不透過性マーカ１１２における放射線不透過性材料として、任意の好適な放射線不透過性材料（白金、パラジウム、金、タンタル、またはこれらの合金など）を使用することができる。１つまたは複数の放射線不透過性マーカは、弁が適切な箇所に設置されたことを医師が確認するのに役立つように撮像システムと共に使用することができる。場合により、本明細書で提供する人工心臓弁は、少なくとも３つの放射線不透過性マーカを含む。拡張可能部材１１０は、任意の好適な構造、配置、または材料を有することができる。場合により、拡張可能部材１１０は、編組ワイヤステントを含むことができる。例えば、編組ワイヤステントの可能な構造および材料の開示について参照により本明細書に組み込まれる、「血管を介して心臓弁を置換する方法および装置（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ａ Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ）」という表題の、２００４年１１月５日に出願された、米国特許出願公開第２００５／０１４３８０９号明細書は、編組ワイヤステントを開示している。場合により、拡張可能部材１１０は、形状記憶材料（例えば、ニッケル−チタン合金またはコバルト−クロム合金）を含む。

図示のように、場合により、人工心臓弁１００は、３つの培養細胞小葉２００を含む。場合により、本明細書で提供する人工心臓弁は、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の小葉などの、任意の好適な数の培養細胞小葉を有することができる。場合により、培養細胞小葉２００は、互いにしっかりと固定される。場合により、培養細胞小葉２００は、縫合糸（図示せず）または複数の縫合糸により互いにしっかりと固定することができる。培養細胞小葉２００は、各小葉の本体部分の縁部に沿って縫合することができる。場合により、本明細書で提供する人工心臓弁は、漏れを最小限に抑え、継ぎ目の幅を最小限に抑え、かつ／または経皮挿入時の置換用心臓弁の輪郭を最小限に抑えるようになされ得る、単一の縫合糸の線を含むことができる。場合により、本明細書で提供する人工心臓弁は、縫合糸の多数の線を含むことができる。

場合により、培養細胞のシートは平坦化することができる。例えば、プラテンシステムは、培養細胞のシートを平坦化するために使用することができる。場合により、枠は、固定前により一貫した厚さを更に提供するために培養細胞を平坦化するプラテンと一緒に使用することができる。下プレートは、組織固定枠内に収まるような寸法とすることができ、かつ上プラテンは、拡張させることができ、下プラテンと同じ大きさの平坦な矩形プレートを含む。上プラテンは、一定の厚さに圧縮するようにプログラム制御することができる。代替的に、機械的方法を用いて可動プラテンの移動を制限するためにスペーサを使用することができる。両方とも同じ結果を達成して、可動プラテンの移動量を一定の距離に制限し、それにより、一定の厚さの組織を提供する。場合により、下プラテンは、上プラテンが固定された可動プラテンとすることができる。平坦化工程は、上に示したように、別のステーションで行うか、またはＢＡＴ固定装置に組み込むことができる。プラテン材料は、医療グレードもしくは食品グレードのプラスチックまたは耐腐食性ステンレス鋼または洗浄をなお許容しながら腐食環境で使用するのに好適な他の材料とすることができる。場合により、高度に研磨された平滑なステンレス鋼は、プラテンから組織への特徴（例えば、型ライン、機械ラインなど）の転写／インプリントに抗するプラテン表面として使用することができる。

組織のみのシート
場合により、本明細書で提供する小葉は、外因性材料を除外することができる。後述する場合により、生体材料足場は、生体材料足場と培養細胞とを含む複合小葉材料を作製するために使用することができる。組織のみのシートは、免疫応答の誘発を回避するのに役立ち得るが、外因性生体材料足場の欠如は、シートが、機械的完全性の適切なバランスを提供するのに培養細胞のみに依存せざるを得ないことを意味する。後述するように、本明細書で提供する培養細胞シートは、外因性生体材料足場のある場合と無い場合の両方で、本明細書で提供する心臓弁における小葉として使用するのに必要な機械的特性を提供する。

例えば、標準的な細胞培養条件（３７℃および５％ＣＯ_２）で細胞を収容し、１００μＭアスコルビン酸を添加した標準的な増殖培地で細胞を増殖させることにより組織のみのシートを作製した。細胞は１週間で集密に達し、この時点で、培地を実験培地条件に変更した（以下の表１）。給餌毎に実験培地を新たに作り、全ての条件において週３回交換した。６週間目および１２週間目に、構築物を培養物から取り出して、分析のために試料を採取する前に少なくとも２４時間０．６％グルタルアルデヒドで固定した。

複合組織シート
場合により、本明細書で提供する小葉は、生体材料足場などの、外因性材料を含むことができる。生体材料足場は、任意の好適な技術を用いて任意の好適な材料を使用して作ることができる。電界紡糸法は、ＥＣＭを模倣するとともに細胞にとって魅力的な環境として機能するように使用できる、線維状ポリマーメッシュ足場を生成するために使用される１つの方法である。厚さ、線維直径および整列性などの材料特性は、所望の結果をもたらすように調整されてもよい。ＰＬＧＡおよびＰＶＤＦは、生物医学的用途のために首尾良く電界紡糸されかつ種々の形式で現在ＦＤＡ承認されている２つのポリマーである。ＰＶＤＦは、非生分解性であるが、細胞増殖を支持することが示されている。ＰＬＧＡは、多数の生物医学的用途で現在使用されている一般的な生体吸収性材料である。複合組織シート用の他の種類の足場も考慮される。

実験結果
ＢＤＦ、ＳＭＣまたはＢＤＦ／ＳＭＣ共培養物を使用して、生体材料足場を含む組織のみのシートおよびシートを成長させた。表１〜表３で詳細に示すように、異なる２つの終点に対して各条件を２連で成長させた。各終点において、シートを０．６％グルタルアルデヒドで固定した。細胞およびＥＣＭ成分の組織学的分析用に特定の目的のコラーゲンと共に少量の試料を採取した。極限強度などの機械的特性を評価するために、最低２つの試料を引張試験用に採取した。

組織のみの足場について、アスコルビン酸を添加した増殖培地で単一の細胞型（ＢＤＦのみまたはＳＭＣのみ）を増殖させる条件は、ベースライン対照と見なされる。組織−ポリマーハイブリッド条件について、細胞なしの同一条件で追加のセットを維持した。

当技術分野で公知の技術を使用して皮膚線維芽細胞および動脈平滑筋細胞を単離した。１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％ａｎｔｉ−ａｎｔｉを添加したＤＭＥＭにおいて３７℃で５％ＣＯ_２の標準的な条件で細胞を培養維持した。

１００ｍｍペトリ皿中において１２，０００細胞／ｃｍ^２（ＢＤＦ、ＳＭＣ、またはＢＤＦ／ＳＭＣの１：１の共培養物）で細胞を播種することにより組織のみのシートを生成した。綿製のウェスタンブロット転写紙から円形状の薄い枠を切り出し、細胞培養皿に入れ、滅菌したステンレス鋼製の六角ナットを使用して押し下げた。枠は、細胞シートが収縮するのを防止する構造と、細胞を損傷させずにシートを取り扱うためのグリップとを提供することができる。これらの枠は、必要に応じてシートから簡単に除去することができる。

図７は、組織のみのシートを培養するためのセットアップを図示している。このセットアップは、ペトリ皿７１０と、細胞７２０と、紙枠７３０と、六角ナット７４０とを含む。六角ナット７４０は、紙枠７３０を押し下げるために使用される。紙枠７３０は、プレートから除去する際の取り扱いのためのグリップを提供するだけでなく、シートがより厚くなるにつれてシートが収縮するのを防止する、細胞７２０用の支持体としての役割を果たす。

標準的な細胞培養条件（３７℃および５％ＣＯ_２）で細胞を収容し、１００μＭアスコルビン酸を添加した標準的な増殖培地で細胞を増殖させた。細胞は１週間で集密に達し、この時点で、培地を実験培地条件に変更した（エラー！参照元が見つからない（Ｅｒｒｏｒ！ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｏｕｒｃｅ ｎｏｔ ｆｏｕｎｄ））。給餌毎に実験培地を新たに作り、全ての条件において週３回交換した。６週間目および１２週間目に、構築物を培養物から取り出して、分析のために試料を採取する前に少なくとも２４時間０．６％グルタルアルデヒドで固定した。より詳細なプロトコルは、付録Ｃにおいて提供される。

「バイオリアクター」と表記された追加の条件では、ＢＤＦ／ＳＭＣの１：１の共培養物を播種し、１５０ｍｍ細胞培養用プレートにおいて上記と同様に３週間増殖させた。３週間後に、プラスチックから組織シートを剥離して、足場の両側への培地アクセスを可能にする保持室内に移した。成長６週間目に（培養用プラスチック内で３週間、保持室内で３週間）、分析のためにシートを取り出して０．６％グルタルアルデヒドで固定した。

組織−ポリマー足場シートは、ＰＶＤＦおよびＰＬＧＡストリップを切り出し、それらを非被覆ペトリ皿に入れ、滅菌した六角ナットでそれらを押し下げ、増殖培地にそれらを事前浸漬し、培地を除去し、細胞を播種することにより作った。ストリップは幅が１．３ｃｍ（０．５インチ）であった。ＰＶＤＦストリップは長さが最小５ｃｍ（２インチ）であった。ペトリ皿に入れる前に、ＰＶＤＦストリップを１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。増殖培地にＰＶＤＦストリップを２時間浸漬し、その一方で、増殖培地にＰＬＧＡストリップを３０分間浸漬した。製造業者の指示通りに、ＰＬＧＡストリップを７０％エタノールに４時間浸漬し、滅菌した六角ナットで押し下げて増殖培地に浸漬する前にペトリ皿中のＰＢＳで十分にすすいだ。最小直径の整列した足場を有するＰＧＬＡストリップは、エタノールに曝されると直ちに収縮し、全ての材料が使い果たされた。より大きな直径の整列したＰＧＬＡ足場は、よりゆっくりと収縮した。製造業者の提案通りに、２枚のスライドガラスの間で平坦化しながら、新たなＰＧＬＡストリップを残りの足場から切り出して滅菌した。

プレートを溢れさせることなくストリップを覆うのに十分な少量でＢＤＦを高濃度（１００，０００細胞／ｍｌ）でストリップ上に播種した。細胞を３時間インキュベートし、次いで、余分な培地を注意深く除去した。ＳＭＣに対して同じ工程を繰り返した。３時間のインキュベーション後に、１００μＭアスコルビン酸を添加した１５ｍｌの増殖培地で皿を溢れさせた。

標準的な細胞培養条件（３７℃および５％ＣＯ_２）で、播種された足場を収容した。週に３回、各変更の直前に増殖培地に１００μＭアスコルビン酸を添加した。細胞がプラスチックへの付着の橋渡しをするのを防止するために、１週間毎に足場を新たな未処理プレートに移した。５週間目および８週間目に、構築物を培養物から取り出して、分析のために試料を採取する前に少なくとも２４時間０．６％グルタルアルデヒドで固定した。

組織のみの試験片および組織−ポリマー足場シートに対して引張強度の試験を行った。引張試験用の各試験片は、ストリップを４．５×２５ｍｍの大きさに切り出すことにより調製された。予め加温したＰＢＳを含むコニカルチューブにストリップを入れた。これらのチューブは、試験の直前まで３７℃の水浴中に保持された。ゲージ長に沿った３箇所においてデジタルマイクロメータを使用して各ストリップの厚さを測定してエクセル（Ｅｘｃｅｌ（登録商標））に入力した。要求されたときにブルーヒル（Ｂｌｕｅｈｉｌｌ（登録商標））ソフトウェアに入力すべき、平均厚さを算出するためにエクセル（Ｅｘｃｅｌ（登録商標））を使用した。デジタルノギスを使用して試料の幅を測定し、同じくソフトウェアに入力した。

図８は、引張試験のためのストリップの切り出し方法を図示している。厚さの測定は、赤丸印で示す、ストリップのゲージ長に沿った３点においてデジタルマイクロメータを使用して行われた。組織片に対する良好なグリップを提供するために、微細グリットのサンドペーパを接着することによりグリップ面を修正した。空気圧グリップに試験ストリップを装填し、２５ｍｍのゲージ長でセットした。予荷重が０．１ＭＰａになるまで試料を延伸した。事前サイクル（０．１ＭＰａ〜１．０ＭＰａまでの５サイクル）で開始し、破断（８０％ピーク荷重として定義される）で終了するまでデータを取得した。収集されたデータは、分析のためにエクセル（Ｅｘｃｅｌ（登録商標））にエクスポートされた。５回の事前サイクル後に０．１ＭＰａで始まる試験データのみを分析に使用した。

組織学的分析用に、生検パンチを使用して各組織または組織−ポリマーハイブリッドシートから直径１０ｍｍの試料を採取した。ホルマリンで固定後、マイクロ波組織処理用の組織学カセットに試料を装填した。１００％エタノール中に試料を入れ、６８℃に加熱して４分間撹拌した。エタノールをイソプロピルアルコールに置換し、試料を７４℃に加熱して４分間撹拌した。予熱したパラフィン中にカセットを入れ、８０℃で７分間マイクロ波処理した。

組織処理後に、２つの半円部を作製するために試料を半分に切断した。平坦な縁が下部に沿うように各半部を型に垂直に入れた。パラフィンで試料を包埋し、次いで、ミクロトームでの切片化のための準備として−２０℃の冷凍庫で冷却した。切片化のために冷凍庫内または冷却プレート上のいずれかで、パラフィン包埋された試料を低温に保った。厚さ５μｍの切片を切り出し、４０℃に設定した水浴中の脱イオン水に入れた。スライド１枚につき少なくとも２つの切片をスライド上に浮かせ、一晩風乾した。染色前に、６０℃のオーブンでスライドを一晩焼成した。

各足場断面のＥＣＭ成分を評価するために、マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色およびラッセル・モバット ペンタクローム（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｍｏｖａｔ Ｐｅｎｔａｃｈｒｏｍｅ）染色を行った。一連のキシレンおよび段階的エタノールステップを通じてスライドを脱パラフィン化および再水和した。スライドを染色し、脱水し、エコマウント（ＥｃｏＭｏｕｎｔ）封入剤によりスライドを覆った。表４は、染色プロトコルの各々に対する配色の詳細を示している。

オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＸ４５顕微鏡を使用してスライドを可視化し、インサイト・スポット（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｓｐｏｔ）６カメラおよびスポット（Ｓｐｏｔ）５．１ソフトウェアを使用して画像を撮影した。２倍の倍率を使用して断面全体の画像を収集し、次いで、フォトショップ（登録商標）（ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（登録商標））を使用して互いに接合した。各断面における代表試料を採取するために、４０倍の倍率を使用してより詳細な画像を撮影した。

分析の際に、以下の表５に提示したデータは、列挙した理由により研究から除外された。

インストロン機械試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｅｒ）を作動させために使用したブルーヒル（Ｂｌｕｅｈｉｌｌ（登録商標））２ソフトウェアは、試験片の長さと荷重の変化のデータをリアルタイムで収集した。各試料を試験する前に、使用者は、試料の寸法（すなわち、厚さ、幅、およびゲージ長）を入力した。この情報から、ソフトウェアが断面積を算出し、このソフトウェアは力および応力データを算出するためにも使用された。図９は、使用されるデータ計算を図示している。図示のように、荷重、加速度およびΔＬは、ブルーヒル（Ｂｌｕｅｈｉｌｌ（登録商標））ソフトウェアにより測定されたパラメータを表し、その一方で、厚さおよび幅は、使用者が入力したパラメータである。応力および歪みのデータがエクセル（Ｅｘｃｅｌ（登録商標））にエクスポートされ、エクセル（Ｅｘｃｅｌ（登録商標））で、更なる計算が行われた。生理学的関連性の領域およびこの研究に関して特に注目される領域は、０．５ＭＰａ〜１．０ＭＰａである。表６は、この研究で使用されたパラメータを詳細に示している。各群の平均値を算出するためにエクセル（Ｅｘｃｅｌ（登録商標））の「平均（ａｖｅｒａｇｅ）」関数を使用し、標準偏差を算出するために「標準偏差（ｓｔｄｄｅｖ．ｐ）」関数を使用した。

組織のみの足場の機械的および組織学的分析を以下に提示する。１時点につき１つの試料を分析のために分割した。各試料の機械的試験のために、最低２つの試験片を切り出した。

ＢＤＦ ＨＧ試料が、３週間後に細胞培養用プレートから剥がれ、培地に没して浮遊し続け、両側からの培地へのアクセスを与えたことに留意するべきである。他の条件は、それらが所定の終点で除去されるまで組織培養プラスチックとの接触を維持し、シートが厚くなるにつれてシートの下面へのより少ない培地アクセスを可能にした。この条件に対する組織学的評価はあるが、機械的データはない。

図１０Ａは、試験片毎に３つの異なる点においてデジタルマイクロメータにより測定される足場の厚さ（μｍ）を示している。データは、試料群毎にプールされており、平均値±標準偏差として示される。全ての条件が６週間から１２週間までの厚さの増加を示しており、共培養条件では各時点での厚さが最も厚い。

図１０Ｂは、各試料群に対してプールされかつ平均±標準偏差として示されたデータからのＭＰａ単位での極限引張強度（ＵＴＳ）を示している。共培養条件を除いて、全ての試料が、測定した厚さと同じ傾向をたどり、６週間から１２週間にわたって強度の増加を示した。６週間目における共培養物は、全体として測定された最も高いＵＴＳを示し、その一方で、ＢＤＦ ＨＧは１２週間で測定された最も高いＵＴＳを示した。

図１０Ｃは、０．５ＭＰａおよび１．０ＭＰａでの歪みを示している。データは、試料群毎にプールされ、平均値±標準偏差として示される。全ての試料は、６週間から１２週間にわたって測定した応力が増加し、弾性の増加を示した。ＳＭＣ ＣＭ条件は最も弾性的な挙動を示す。

図１０Ｄは、０．５ＭＰａおよび１．０ＭＰａでの２点間の傾きとして算出した、接線弾性率（ＭＰａ）示している。データは、試料群毎にプールされ、平均値±標準偏差として示される。６週間から１２週間にわたってはほとんど変化がない。ＳＭＣ ＣＭは最も低い弾性率を示し、したがって、群のうち最も弾性的な挙動を示す。

図１１Ａは、マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色された組織のみの足場の断面の代表的な４０倍画像を示している。シートのより成熟した領域は、６週間から１２週間にわたって増加する、より多くのコラーゲン沈着を示す。１２週間目のＢＤＦ ＨＧ試料は、中央におけるコラーゲンが両側の細胞増殖に隣接した、より対称的な染色を示し、その一方で、１２週間目における共培養条件は、最も高密度のコラーゲン沈着を示すように思われる。どちらのＳＭＣ条件も、ＢＤＦまたは共培養条件に比べて少ないコラーゲン染色を示す。

図１１Ｂは、ラッセル・モバット ペンタクローム（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｍｏｖａｔ Ｐｅｎｔａｃｈｒｏｍｅ）染色された組織のみの足場の断面の代表的な４０倍画像を示している。足場の成長の方向は、左から右に向かい、最も新しい細胞増殖が各写真の右側に見られる。シートのより成熟した領域は、特に１２週間の時点で、より多くのコラーゲン沈着を示す。１２週間目におけるＳＭＣ対照およびＳＭＣ ＣＭは、コラーゲンに加えてグリコサミノグリカンの産生を実証する。１２週間目におけるＢＤＦ ＨＧ試料は、中央におけるコラーゲンが両側の細胞増殖に隣接した、より対称的な染色を示す。

図１１Ｃは、両側に３週間給餌した後、バイオリアクター内で６週間成長させた後の組織試料を示している。上行は、ラッセル・モバット ペンタクローム（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｍｏｖａｔ Ｐｅｎｔａｃｈｒｏｍｅ）染色を表しており、かつ下行は、マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）を表している。培地へのアクセスは、足場の厚さを増加させるのに役立っているが、コラーゲン沈着の大幅な増加は生じない。両方の染色は、組織培養プラスチックに付着させ成長させた試料に比べて断面のより高い対称性を示し、成長が両方向で起こっていることを示す。

ＢＤＦ、ＳＭＣ、およびＢＤＦ／ＳＭＣの５０：５０の共培養物を使用して組織のみの足場を生体外で生成した。これらの細胞はまた、増殖およびコラーゲン沈着を支持するために異なる培地添加物に曝された。全ての条件において、厚さおよびＥＣＭ産生は、６週間から１２週間にわたって増加した。ＵＴＳ＞１ＭＰａを達成するために、５つの条件を首尾良く成長させた。共培養条件は、サイトグラフト（Ｃｙｔｏｇｒａｆｔ）社により作製された組織シート（５．１３±０．９１）と同等である、最も大きなＵＴＳ（４．０８±０．４０）を６週間目に示した。ＢＤＦ ＨＧ条件は、１２週間目で最も高い強度（３．２６±０．３８）を示し、かつ全体で２番目に高い強度を示した。

一般的な傾向は厚さと共に強度（ＵＴＳ）が増加したことであるが、最も厚い２つのシート（共培養１２週間およびバイオリアクター６週間）が、最も強度があるものとは測定されなかった。共培養条件は、６週間時点から１２週間時点にわたって強度が減少した。１２週間目のシートは、シートの下面から上面までの細胞に対するコラーゲンのより明白な勾配を実証した。酵素活性を測定する更なる分析は、ＭＭＰ（コラゲナーゼ）が細胞により分泌され、コラーゲン構造を分解し、経時的にその特性に影響を及ぼすかどうかを判断するのに役立つ。６週間目におけるバイオリアクター条件は、１２週間の共培養物の厚さに酷似しており、厚さの加速度的な増加を示した。このシートは、コラーゲンに対する細胞のより大きな比率からなり、全ての条件（ＵＴＳ＜１ＭＰａ）の最も弱い機械的特性を実証した。全体の厚さに対するコラーゲンの割合は、厚さのみに比べて材料強度のより良い指標である可能性が高い。この条件の繰り返し、およびより長い時間点にわたる増殖は、コラーゲン産生が経時的に増加し強度が高まるかどうかを示す。

細胞シートの両側の培地へのアクセスは、１２週間のＨＧ条件および６週間のバイオリアクター条件で実証されるように、細胞が上面側および下面側から外方に増殖し続けるのを可能にすることにより厚さを増加した。ＢＤＦ ＨＧシートは、３週間後に組織培養プラスチックから持ち上がり、両側での培地へのより良いアクセスを可能にした。組織学的染色は、断面が、両側の新たな細胞増殖に隣接した中央におけるコラーゲンを示すので、両側で増殖が生じることを裏付ける。３週間後に上面と下面にも給餌された、バイオリアクター条件では、同じ増殖パターンを示した。ＢＤＦ ＨＧシートが培地中に浮遊していたのに対して、バイオリアクター条件では保持室内に繋留され、かつ培地は各側で添加された。バイオリアクター条件は機械的刺激に曝されなかったが、保持室内にシートを懸架することにより発生した固有の張力が、張線維の産生の増加または整列の誘導などの、ＥＣＭ沈着を変化させるのに十分であったかもしれない。

ＳＭＣ ＣＭおよびＢＤＦ対照条件は、各時点で最も弱い２つの条件であった。ラッセル・モバット（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｍｏｖａｔ）染色は、ＳＭＣ ＣＭ試料が他の条件よりも多くのＧＡＧ含量を有し、このことが、接線弾性率で測定されるように、試料のより弾性的な挙動に寄与し得ることを示した。この手段による最も硬い２つの条件は、共培養およびＢＤＦ ＨＧであり、最も厚い条件のうちの２つであった。興味深いことに、ＳＭＣ対照は、ＢＤＦ対照よりも強度が高いが、異なる細胞型およびＥＣＭ組成物にもかかわらず、ほとんど同じ接線弾性率を示す。

応力−歪み曲線を重ね合わせたときに、全ての条件は、おそらくコラーゲン原線維がカールしていなかったので、０．５ＭＰａ〜１．０ＭＰａの関心領域を含む、初期トー領域では同様である。線維を完全に伸張させた時点で、曲線が５％歪み前の線形領域に入り、ここで、傾きが定率で変わり、条件間の違いがより明確になる。ＢＤＦ ＨＧおよび培養物の応力−歪み曲線は、ＳＭＣおよびＢＤＦ対照のように、ほぼ同一である。ＳＭＣ ＣＭ条件は、傾きが最も浅く、最も弾性的であり、その一方で、ＢＤＦ ＨＧおよび共培養は最も硬い。各群内の時点間に視認できる違いがない。

より多くの試験条件に対応するために、反復試験は１時点につき１回に制限され、データ源を制限した。条件を絞り込み、統計学的有意性を高めるために研究を繰り返さなければならない。共培養条件は、いずれかの細胞型単独よりも有望な機械的特性を示し、かつＨＧ培地は、他の処理と比較して向上した強度を示した。共培養条件は、利益の増加を確認するためにＨＧ培地を用いて試験しなければならない。単一の細胞型としてＳＭＣから成る両方のシート条件はＧＡＧに対して陽性に染色され、その一方で、ＢＤＦ条件は主にコラーゲンであった。播種されたＢＤＦ対ＳＭＣの比率を変更することは、分泌されたＥＭＣ成分の組み合わせに影響を及ぼすことにより足場の特性を変化させる可能性がある。異なる比率でのこれらの２つの細胞型の効果を研究することにより、生体外で成長させた組織シートの機械的特性を調整することが可能となり得、したがって、そのようなシステムの潜在的用途が広がる。

電界紡糸ＰＶＤＦは、細胞が厚みを有する（表面上およびその周囲にコラーゲン密度の高いシートとなる）ように増殖することを可能にした。引張試験中に、これらは最終的に異なる２層に層間剥離された。応力−歪み曲線（付録Ｇ）は、抵抗の大部分が細胞層によりもたらされたので初期のより硬い挙動を示した。細胞層が破断したときに、足場により荷重が引き取られるまで応力の僅かな低下があった。足場上の細胞により特徴付けられる曲線は、組織のみの足場において生成された曲線と同等であった。１〜４ＭＰａにおける１５〜２０％歪みでの破断。足場のいくつかの領域に細胞がより密集していたので、データのばらつきは不均一な細胞被覆に起因するものである可能性が高い。細胞が材料の外形を辿ってより３次元的に増殖するので、細胞増殖の真の断面を得ることはより困難であった。組織のみのシートと同様に、反復試験の数を増やすために足場条件を絞り込まなければならない。バイオリアクター条件のために使用される増殖室はまた、足場をしっかりと固定しかつ細胞増殖の一貫性を高めるためのより平坦な表面をもたらすのに役立ち得る。

機械的データは、組織を生体外で成長させ得るとともに組織が定量可能な機械的特性を備えた細胞外マトリックスを生成し得ることを示唆している。外因性足場なしに成長させた組織のみのシートは、更に所望の特性を満たすように操作でき得る一貫した特性を備えるように成長させた。これらの知見に基づいた更なる研究が、細胞型または培地処方などのパラメータを変更することにより組織特性を高めるために行われ得る。これらの特性を操作する方法についてより良く理解することは、この材料の潜在的な使用範囲を広げるのに役立ち得る。

細胞のみの培養シート
以下は、細胞のみを使用した組織工学的シートのセットアップのための一般的なプロトコルである。細胞は、以下に提供する細胞培養培地プロトコルに従って調製される。外因性足場は使用しない。組織シートが収縮するのを防止するのに十分な構造を提供するために、枠をゲルブロット転写紙から切り出すことができる。事前に枠をオートクレーブ処理することができる。使用する細胞は、ＢＤＦ、ＳＭＣ、またはＢＤＦとＳＭＣの１：１の共培養物である。場合により、ＢＤＦおよびＳＭＣの他の比率を使用することができる。場合により、他の細胞が使用される。細胞播種用プレートを調製するために、図７に示すように枠をＰ１００ペトリ皿に入れ、覆うのに十分な培地に事前浸漬した（紙は非常に吸収性があり、これは細胞を播種する前に平坦化するのに役立つ）。場合により、余分な培地を吸引除去することは、破片を除去するのに役立ち得る。枠の内側の領域との重なりを避けて、枠を押し下げたままにするために、ボルトを紙上に配置することができる。場合により、播種する細胞は、解凍後に少なくとも１回継代して増殖させた細胞である。１００μＭアスコルビン酸を添加した増殖培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％ａｎｔｉ−ａｎｔｉ）に１２，０００細胞／ｃｍ^２で細胞を蒔くことができる。場合により、播種から１週間後に、追加の処理を加えることができる。細胞にはグルコースを一定間隔で給餌することができる。典型的な給餌スケジュールは週に３回であるが、高濃度グルコース条件では、後の時点でより頻繁な変化または追加の培地が必要となることがある。場合により、プレートから枠を剥がすことができるまでに最低３週間かかる。場合により、特に困難な取り扱い（すなわち、管状に巻く）を要する任意の用途では、枠は、置床された後の少なくとも４週間まで剥がされない。枠が剥がされた後に、重りが除去されてもよい。プレートからシートを持ち上げるときに、培地が最初に除去される場合には、枠が細胞から剥がれる可能性は低い。ＰＢＳで２〜３回、または培地のピンク色が視認できなくなるまでシートを洗浄することができる。次いで、分析の準備をする前に、０．６％グルタルアルデヒド溶液でシートを少なくとも一晩固定することができる。

「バイオリアクター」と表記された追加の条件では、ＢＤＦ／ＳＭＣの１：１の共培養物を播種し、１５０ｍｍ細胞培養用プレートにおいて上記と同様に３週間増殖させた。３週間後に、プラスチックから組織シートを剥離して、足場の両側への培地アクセスを可能にする保持室内に移した。成長６週間目に（培養用プラスチック内で３週間、保持室内で３週間、シートを取り出し、分析のために０．６％グルタルアルデヒドで固定した。

細胞培養培地プロトコル
細胞培地プロトコルは、事前に調製されるかまたは新たに調製され得る、基礎培地を使用する。基礎培地を作るために、以下の成分を合わせ、０．２２μｍの膜を備えた真空フラスコを使用して滅菌濾過することができる。２００ｍＭアスコルビン酸のストック溶液もまた、事前に調製することができる。場合により、２００ｍＭアスコルビン酸のストック溶液は、４℃で最大３週間保存することができる。３週間後に、２００ｍＭアスコルビン酸のストック溶液は、経時的な活性の喪失のために廃棄され得る。２００ｍＭアスコルビン酸のストック溶液は、使用直前に培地に加えることができる。事前に調製される場合、基礎培地は、表１４に提示した成分を含むことができる。１００μＭの最終濃度で使用される２００ｍＭのアスコルビン酸溶液を調製するために、５７９ｍｇの粉末を秤量して、１０ｍｌの滅菌水に溶解させることができ、そして、４℃での保存のために溶液を１５ｍｌコニカルチューブ内へと濾過滅菌した。１０ｍＭ（２０Ｘ）の最終濃度で使用される２００ｍＭのＣｕＳＯ_４ストック溶液を調製するために、２４．９７ｇの粉末を秤量して、５００ｍｌの滅菌水に溶解させることができ、そして、５００ｍｌフィルタユニットを使用して溶液を滅菌し、４℃で保存した。新たに調製される場合、基礎培地は、表１５に提示した成分を含むことができる。

一般的な細胞培養
ＢＤＦおよびＳＭＣなどの、細胞は、上述した細胞培養培地を使用して維持することができる。場合により、実験セットアップに細胞を播種する前に、通気孔付き細胞培養用Ｔフラスコ中で細胞を増殖培地中に維持することができる。培地は定期的に（例えば、週に３回）交換することができ、かつ細胞は約８０％の集密で継代することができる。継代プロトコルは、（ａ）０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いてプレートから細胞を剥がすステップと（ＳＭＣは典型的には約１分で迅速に剥がれ、その一方で、ＢＤＦは通常５〜７分かかるが、集密度に応じてより長くなる場合がある）、（ｂ）細胞を凝集させ得る、激しいタッピングまたは過度の撹拌を回避するステップと、（ｃ）増殖培地（トリプシンの体積×２）に細胞を再懸濁し、１５０ｘｇで最大１０分間遠心分離するステップと、（ｄ）上清を吸引除去し、新鮮培地に再懸濁するステップを含むことができる。典型的な分裂は、一連の継代に対して１：４〜１：１２の間である。細胞は、標準条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ_２）でインキュベートすることができる場合により、実験セットアップのために細胞を計数し所望の濃度に再懸濁してもよい。

本発明の多くの実施形態を説明してきた。それでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修正が行われ得ることが理解されるであろう。よって、他の実施形態も以下の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (11)

1. 培養細胞小葉の形成方法であって、
   （ａ）線維芽細胞、平滑筋細胞、またはこれらの組み合わせを得る工程と、
   （ｂ）培養細胞組織のシートを作製するために細胞を枠上で培養する工程と、
   （ｃ）前記培養細胞組織のシートに張力を付与する工程と、
   （ｄ）前記培養細胞組織のシートに張力が付与されたままで、前記培養細胞組織を化学架橋剤と少なくとも１０分間接触させる工程と、
   （ｅ）本体部分と２つのスリーブ部分とを備える小葉を前記シートから切り出す工程とを含み、
   前記培養細胞組織を張力をかけながら化学的に架橋することで、張力が解放された後の培養細胞組織の反跳が防止され、
   前記小葉は、外因性生体材料足場を含まない組織のみの培養細胞組織を含む、方法。
2. 培養細胞が２０：８０〜８０：２０の比率の線維芽細胞と平滑筋細胞の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記培養細胞組織が化学架橋剤であるグルタルアルデヒドで架橋される、請求項１に記載の方法。
4. 培養細胞が少なくとも３週間培養される、請求項１に記載の方法。
5. 前記培養細胞組織が５０マイクロメートル〜３００マイクロメートルの厚さを有する、請求項１に記載の方法。
6. 前記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
7. 前記皮膚線維芽細胞がウシ皮膚線維芽細胞である、請求項６に記載の方法。
8. 前記培養細胞組織が平滑筋細胞を含む細胞から培養される、請求項１に記載の方法。
9. 前記平滑筋細胞がウシ平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
10. 培養細胞が少なくとも５週間培養される、請求項１に記載の方法。
11. 請求項１に記載の方法によって人工心臓弁を形成する、人工心臓弁の製造方法。

Images