CN1131913A - 增加天然组织的交联 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用低浓度交联试剂处理生物组织。

Description

增强天然组织的交联
                  本发明的技术范围
本发明涉及使用交联剂如戊二醛对生物组织如心脏瓣膜进行加工。
                  本发明的背景情况
移植前生物修复组织的制备，通常包括稳定化处理，使它能抵抗以后的体内酶解。这种处理又常包括使组织上或组织内的分子特别是胶原交联。因此，使用了各种醛，包括乙二醛、甲醛和戊二醛。但戊二醛是惯常选用的，部分原因是它可在水溶液的生理pH条件下使用。除了使组织交联外，戊二醛还是良好的清毒剂，并能降低移植后组织的抗原性。
而且，使用戊二醛有助于组织形成较大的热稳定性、较大的柔韧性(与常规交联技术相比)及提高耐久性。
但戊二醛也有细胞毒性——即使用低浓度，也需要漂洗组织以清除残留的戊二醛。在通常用于交联生物组织的浓度——约0.6％V/V，甚至低到成功地使用的0.2％——戊二醛的毒性仍是一个较大的问题。
                      本发明概要
本发明为用低浓度交联剂交联或固定胶原类生物组织，如猪心脏瓣膜提供了一种改进方法。在保持或提高受处理组织的耐久性和柔韧性的同时，降低了交联剂的残留量。
因本加工法使用水传送系统，避免了应用不仅可能有毒而且会使含胶原的物质(即静脉、动脉、心脏瓣膜等)脱水、变性或损坏的有机溶剂，如丙酮。用低浓度戊二醛固定的其它特性包括：(1)分子内交联程度相对地高，提供了比较柔软的组织。对心脏瓣膜说，这意味着改进了它的血液动力学性质；对血管移植物说，这意味着它具有较大的抗扭结性。(2)短链分子内交联(沿胶原链)相对地高，可保护组织以免引起胶原蛋白基质中链的断裂。这是与在高浓度戊二醛交联中占优势的长链分子间交联(胶原链之间)相比而言。(3)抗钙化。生物修复产品如生物修复心脏瓣膜的钙化，是一种有大量作用因素的十分复杂的过程。其中之一是，有残余游离的戊二醛时易于发生钙化。在低浓度戊二醛中固定，通常降低了残留在组织中的戊二醛量。而且，当在组织裂缝附近也趋向出现钙化时，在一定时间中由低浓度交联得到的比较柔软的组织不太可能发生断裂。
本发明适用于大量的血管修复术，于小直径血管更换场合尤其有价值。它在冠状动脉入口分流术操作中有用，特别当病人以前作过冠状动脉更换手术及充分的隐静脉切除或乳房内动脉切除。因按本发明进行的修复术可等于或优于隐静脉移植，所以使用这种修复术会减少对隐静脉切除的需要。它也可应用于系统的微血管更换，如手或足的微血管。
                 图的简短说明
图1.在0.01％和0.05％戊二醛中交联的牛颈动脉抗张强度的比较
图2.在0.0％和0.05％戊二醛中交联的牛颈动脉缝合保持强度的比较
图3.不同固定条件对牛正中动脉抗张强度和缝合保持强度的影响
图4.不同固定条件对牛正中动脉爆裂强度的影响
图5.低浓度戊二醛分子内交联和高浓度戊二醛分子间交联的不同
图6.在0.5％和0.05％戊二醛中交联的小叶的收缩温度比较
图7.电子束辐射对压力下降的影响
图8.电子束对有效孔面积的影响
图9.主动脉根组织的固定时间对其收缩温度的关系
                 本发明的详细说明
按本发明的方法，包括把生物组织暴露在低于约0.1％体积的交联溶液中处理或加工，最好是大约0.01％至0.099％体积的固定溶液中。在本发明的最好增强交联法中，固定溶液是含有戊二醛的缓冲溶液。
这里使用的术语“生物组织”是指可能来自不同动物种的含胶原材料，通常是哺乳动物。这种生物组织通常是适于移植的软组织，如生物修复组织或相似物，但本发明不受此限。具体例子包括，但不限于，心脏瓣膜，特别是猪心脏瓣膜；主动脉根，壁和/或小叶；心包，最好是牛心包或相似物，与来自心包的产品如心包片；来自结缔组织的材料，如硬脑膜，同种移植组织，如主动脉同种移植物和隐静脉旁路移植物；腱、韧带、皮肤片；血管，特别是牛动脉和静脉，及人脐组织，如静脉；骨；及类似物。任何其它已知或将知会适于按本发明加工的生物来源材料，都在本发明的考虑之内。
按本发明，从其来源处移植而来的生物组织可在暴露于交联剂之前以任何合适的方式加工。通常，生物组织被仔细清理，然后用滤过的蛋白水解酶浓溶液消化，因而从生物组织大量去除了抗原组织。在利用天然组织时，清理步骤通常包括从组织剥除外膜及不合需要的脂肪与肌肉组织。
把生物组织暴露于交联剂，正如这里所使用的，归入任何使生物组织与交联剂接触的方法。在本发明最好的增强交联法中，把组织暴露于交联剂是指把组织浸泡在交联剂中。
当组织浸在给定浓度的交联剂如醛类，如戊二醛的溶液中时，组织小间隙中的戊二醛浓度将与周围溶液平衡，使组织经历了确实的低浓度交联。但当戊二醛经由一喷雾器传送时，单体的戊二醛是直接沉积在基质的表面，不管汽化前溶液的始浓度怎样，都将是纯戊二醛与组织接触，所以组织中的浓度，如果不是不可能，也是很难控制的。
通常按本发明使用的戊二醛，是得自例如电子显微科学(FortWashington，PA)的商品生物学级别50％溶液，这种合用的商品戊二醛也可以是各种其它级别、纯度和/或浓度。生物学级别的戊二醛通常不需要额外提纯，但可能要把最后的交联溶液通过0.2μ孔的亲水膜滤器以除去任何生物学的污染物。
按本发明，生物组织可暴露于含有戊二醛的合适缓冲液的固定溶液。本发明所使用的合适缓冲液，是那些具有足以保持生理上可接受的pH的缓冲能力、对生物组织不会引起实质性损害和/或不干扰处理过程的缓冲液。代表性的缓冲液包括(但不限于)磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)和有机缓冲液如N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)或吗啉丙磺酸(MOPS)以及包括硼酸盐、重碳酸盐、碳酸盐、卡可酸盐或柠檬酸盐等的缓冲液。最好的固定溶液是低于0.1％V/V戊二醛的柠檬酸盐缓冲液。
按本发明的通常规程，生物组织可在足以引起组织内和组织上的胶原交联的时间和温度条件下暴露于固定溶液。例如，生物组织可从大约4℃到37℃暴露于缓冲的戊二醛溶液，最好约20℃；pH大约6到8，最好约6.3到6.5，时间可大约10天，最好约2到5天。
按本发明，技术熟练的人会认识到，规程中的某些参数可按要实现的特定意图予以变更。这些参数包括(但不限于)戊二醛浓度、溶液组成、pH和离子强度、生物组织暴露于戊二醛的时间和温度、组织对溶液体积的比率以及起始固定时生物组织的结构。因此本发明是不受限制的。
通常，交联的生物组织而后用任何合适的漂洗物洗净。在最好的增强交联法中，漂洗剂是消毒的生理盐水。组织可用许多体积的消毒的生理盐水漂洗近24小时以上，或直到组织中残留的加工化学药品的浓度低于被认为有毒的水平(近1ppm)。
技术熟练的人也会认识到，本发明可包括另外的加工过程。如，交联的生物组织可暴露于一种或多种抗钙化剂、一种或多种生物能垒(bioburden)还原剂、至少一种漂洗溶液以及一种或多种消毒剂或操作规程。而且，像以下更详细地揭示的，按本发明交联的生物组织可在最后消毒以前贮存约一年或更长时间。代表性的另外加工过程更详细地叙述于下。
生物能垒还原
本发明的增强交联法(embodiment)可包括把交联的生物组织暴露于一种或多种生物能垒还原剂，通常约10小时，最好约2到4小时。例如，上面提到的用戊二醛处理的猪心脏瓣膜而后可暴露于约含1％-5％戊二醛、1％-6％甲醛和15％-25％乙醇的缓冲液中。常用的缓冲液包括PBS、HEPES、磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液。
中间体贮存
本发明的增强交联法可包括在最后消毒前把交联的生物组织贮存一年或更长时间。例如，按本发明用戊二醛交联的猪心脏瓣膜可在室温下暂存于用PBS、柠檬酸盐或其相似物缓冲的0.5％戊二醛溶液中。
抗钙化处理
本发明的增强交联法可包括把交联的生物组织暴露于一种或多种设计来降低或抑制移植后钙化作用的试剂。工艺上已知有许多抗钙化试剂。例如，为了降低或抑制钙化，可把交联的生物组织暴露于醇和/或铝盐中。在典型的加工过程中，交联的生物组织被浸在含有大于50％的低级脂肪族醇的溶液中直到足以使生物组织抗钙化，通常大约96小时。要选用低级脂肪族醇(C1到C3)如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。在最好的增强交联法中，所用的醇是乙醇。醇处理的时间长短可由技术熟练的人予以以变更。在本发明的增强交联法中，把生物组织浸在醇处理溶液中作为例证的暴露时间取好在大约24到96小时之间。
在本发明的另一种增强交联法中，抗钙化剂可包括多价金属阳离子，如铝盐或铁盐。例如，交联的生物组织可浸在含有0.1M到0.001M AlCl3溶液中到足以使生物组织抗钙化。
按本发明，交联的生物组织可贮存在醇戊二醛溶液中，最好它的量足以维持钙化抑制和/或消毒。例如，生物组织可贮存于缓冲的含有戊二醛的醇溶液中，通常醇含量大于60％，最好约60％和80％之间，戊二醛含量低于0.5％，最好约0，2％到0.5％之间。
而后，可把抑制钙化和/或交联的生物组织安放或包装在容器中。按本发明最好的增强交联法，生物组织于生理盐水中，在最终消毒前，被包装和密封在它的最后容器中。最好的包装是指放在适宜于消毒、贮存和/或运送的容器中。
容器可是玻璃或多聚体塑料构造的，如聚丙烯、聚乙烯和/或环氧树脂。本发明不受所用容器和密封类型的限制，其它材料以及混合体、融合体和/或共聚体都可用。
交联的、包装的生物组织可像下面指出的那样消毒或在消毒前贮存约一年或更长时间。按本发明，贮存包括长期贮存如6个月、12个月或约5年及更长时间。
消毒
按本发明方法，也可包括组织的消毒。这里所用的“消毒”是指把生物组织暴露于消毒用的加速电子束，即电子束。组成电子束的粒子束最好包含有定向的轰击(只从一个方向轰击)与单侧或多侧照射。按本发明交联的生物组织可以消毒，最好在包装后。合适的消毒规程包括(但不限于)X线或γ辐射、电子束辐射及相似物。交联组织的最好消毒法是把包装在生理盐水中的生物组织暴露于加速的电子下。例如，生物组织可经受电子束辐射到剂量约25KGy或约1-10分钟，依材料大小而定。
电子束加工优于常规γ辐射主要是，能量被应用时的加工速度或高速率可以控制，这常使消毒的费用变得较低。
按本发明，生物组织是通过它暴露于足以有效消毒的电子束进行处理的。另外，本发明提供的电子束辐射消毒的生物组织显示出增强了效能特性。按本发明的方法和组织具有减少感染危险和不需要无菌操作规程的额外优点。而且，本发明方法加工组织使用的试剂较少，需要的加工较少，为劳力、试剂、时间和人员提供的费用较低。
电子束辐射消毒有效地避免了使用有毒的消毒化学药品。而且，电子束消毒所需的辐射量不会使生物组织明显降解，因此提供了更耐久的移植组织。
γ辐射的剂量率接近每分钟110grays，电子束的剂量率接近每分钟7800grays。所以，就γ辐射说，暴露时间显然较长，低剂量需要延长有效消毒时间。与γ辐射截然不同，电子束照射所含的高剂量率促进氧气扩散到生物组织中去，扩散的速度不足以参与可能有助于组织和多聚体降解的自由基形成反应。这在那些包括把生物组织于辐射前放进容器中的增强交联法特别有利，因为可使组织和容器中的多聚体降解减到最小程度。
而且，电子束比γ射线高的剂量率允许有较高的消毒加工速率，一般要高一个数量级。
相对而言，γ辐射穿透同一材料的能力接近10倍于10MeV电子。
γ射线引起被消毒材料原子内部电子的激发。另一方面，电子束提供高能电子到材料表面，接着材料表面的电子穿入物质，依次使其后的电子运动。
因为电子束的剂量率相对地高，氧不能以参与可导致材料降解的氧化反应所需的速率扩散到材料中去。
而且，包装和组织中降解的防止，允许组织作最终消毒，即组织的消毒是在它最后的密封的包装中进行。这样，本发明避免了对费用昂贵的无菌操作技术的需要，提供了无菌保证，只要包装完整直到组织准备应用时。
当高能电子穿透表面时，它们与材料原子中的电子发生撞击，后者依次反冲如撞击使更多的电子运动。所以由相对地少的穿透表面的电子，在材料中产生了大量电子贮存能量，主要靠离子和自由基的产生。这过程称作集结(buildup)，在这过程中，从材料表面下的深处传送着较高剂量的电子，在材料表面上原有的电子束及其反冲电子不再产生电离作用。
按本发明，电子束辐射量足以消毒生物组织，而在有些增强交联法中电子束辐射量足以消毒包装在其最后容器中的生物组织。技术熟练的人会认识到并能决定适合于特定组织和基于所用加速剂特性的消毒剂量和时间。
通常，生物组织一侧暴露于电子束直到辐射的消毒剂量被吸收。吸收的辐射剂量以KGy表示。1KGy等于每kg材料贮存1000焦耳能量。例如，生物组织受照射的剂量可达到接近25KGy或更多。
消毒效果可容易地用常规的微生物学技术测定，例如包括用合适的生物指示剂测定每一批受照射的生物组织，或将组织与培养基接触并温育以测定组织的消毒情况。剂量也可用放射色谱染色薄膜测定。这种薄膜，通常在γ射线场合，通过参考国家标准被校准。
照射引起的生物组织的降解也可用熟知的和常规的试验和标准测定，如收缩温度Ts的降低、对酶作用如胶原酶的敏感性、降解产物如胶原片段的可抽提性、及物理性质如抗张强度的降低。
按本发明的通常规程，生物组织可在足以引起其内部和表面的胶原交联的时间和温度条件下暴露于固定溶液。例如，生物组织可从大约4℃到37℃暴露于缓冲的戊二醛溶液，最好约20℃；pH约6到8，最好6.3到6.5；时间大约10天，最好约2到5天。
前面提到的步骤结合起来产生的修复术比用其它加工法产生的修复术，具有更大的强度和柔韧性、抗原性低及更便于使用。
长期贮存
在本发明的另一增强交联法，按本发明交联的生物组织可包装在近0.5％戊二醛溶液中。用无菌技术，生物组织可用消毒的生理盐水(0.9％NaCl)彻底漂净。生理盐水漂洗的目的是降低组织表面和组织间隙中残留的戊二醛浓度，这样使在病人体内发生有毒反应的机会降到最小。生物组织可放入塑料或多聚体容器中，注满消毒的生理盐水，加盖或密封。产品加盖应是长期密封，在移植前才能开封。
本发明提供考虑到在强度、柔韧性、低抗原性方面改进的生物组织。这些特性是特别令人期望的，这是由于移植生物组织步骤的紧迫性以及身体产生排斥的可能性。就有些生物组织的移植步骤说，生物组织必须抗扭结、有好的缝合穿孔性与迅速封闭缝孔的性能。缝合保持强度即抗张力的能力，必须高。另外，移植物须有高的抗爆裂能力以承受可能的高收缩压，以及抗动脉瘤形成。强度不够和/或抗原性高的移植物对病人可有潜在致命性。
按本发明提出的修复术可包装成试剂盒，最好是消毒的湿包装在0.9％NaCl溶液中。选择这种附加成分对技术熟练程度较差者是合适的。
例子
例1.从当地加工场所(牛、猪、羊等)取得新鲜组织(如血管、心脏、心脏瓣膜或心包)并收在冰冷的生理盐水(0.9％NaCl)中。组织或立即分割成小块或放进新鲜的消毒生理盐水中冷藏过夜。从所要的组织仔细除去不需要的组织如动物脂肪、骨骼肌、心肌、骨、气管等，然后再用新鲜的消毒生理盐水漂洗并浸泡其中。
虽然本技术以各种浓度戊二醛进行了操作，但接近0.03％V/V的戊二醛提供了防辐射性质，并且交联时间适合于所制造时间表内的时间。
配10l、50mM柠檬酸盐缓冲的0.03％(V/V)戊二醛的步骤如下：
(1)50mM柠檬酸盐缓冲液按下列配方制备(10l)：
取9.0l消毒的无离子水
加140.0g柠檬酸钠、5.0g柠檬酸单碱和38.6gNaCl
加消毒的无离子水到溶液体积达到10.0l。
(2)取9.0l步骤(1)制备的50mM柠檬酸盐缓冲液
加6.0ml 50％生物学级戊二醛
加步骤(1)制备的50mM柠檬酸盐缓冲液到溶液体积达到10.0l。
(3)用HCl或NaOH把溶液pH调到6.4.0±0.05
然后在室温下(20-25℃)把组织浸在戊二醛溶液中进行交联反应。如收缩温度曲线所示(见图9)，随固定时间行进，交联数量增加。溶液中戊二醛浓度随着被组织耗用于形成聚戊二醛交联物而下降。所以可期望，在整个交联反应始终，间隙中充满了固定溶液。因为大多数交联较早地形成，建议在反应开始后约8小时更换溶液，以后每日换一次。
把组织暴露于戊二醛溶液进行加工的时间范围从大约24到120小时，依溶液中戊二醛浓度而定。一般，戊二醛浓度高所需固定时间短，戊二醛浓度低所需固定时间长。对0.03％溶液说，暴露近72小时足以使组织间隙内的交联密度达到最大。这需要收缩温度接近80-89℃，依所用组织类型而定。
当交联反应结束时，把组织浸没在含有2％(V/V)戊二醛、3％(V/V)甲醛和20％(V/V)乙醇的消毒溶液中。这种多成分消毒液在漂洗和包装前减少了任何残留在组织上的生物能垒。
然后用足够的消毒生理盐水彻底漂净组织，使存在的加工化学药品减到最少。这通常需要用40或50l，洗40小时以上。漂洗时间应注意掌握，因为残余物从组织扩散是依赖时间的现象。在最后漂净后，把组织放进消毒的容器中(瓣膜罐、血管移植物小瓶等)，并注满消毒的生理盐水。而后把包装长期密封。
注意：用多成分消毒液对生物能垒还原过程后的组织实施的所有操作，应该尽可能无菌进行，使电子束消毒前的污染程度减到最小。
例2.为了评估不同浓度戊二醛对牛颈动脉血管修复物物理性质的影响，进行了二个相同的实验。
动脉放在冷的消毒生理盐水(0.9％NaCl)中。从血管组织剥去外部组织如脂肪、骨、软骨、结缔组织等。用柠酸盐缓冲的无花果蛋白酶溶液消化动脉以除去平滑肌组织中指定的部分。把动脉彻底漂净并分别放进二个含有戊二醛准备使组织中胶原成分交联的罐中。一个罐含有50mM柠檬酸盐缓冲的0.01％戊二醛；另一个罐含有50mM的柠檬酸盐缓冲的0.05％戊二醛。动脉在0.01％溶液中交联近5天，在0.05％溶液中交联近2天，交联反应完成后，所有动脉放入50mM柠檬酸盐缓冲的2％戊二醛溶液中消毒。
然后，鉴定组织样品的径向抗张强度和缝合保持强度。径向抗张强度试验包括切割一段交联的颈动脉，作纵向切口，及在一种器械如Instron上径向牵拉组织直到破裂。缝合保持强度试验包括在离组织样品横截面切割边缘特定距离处插入一圈外科缝线，如5-0 PTFE浸透的聚酯缝线。例如，这距离即咬合长度大约3mM。在一种器械如Instron上牵拉缝线直到组织断裂。抗张强度和缝合保持强度试验的结果分别表示在图1和图2。
抗张强度试验结果显示，没有组织强度的明显差别可归因于固定溶液浓度的改变。看似宽大的误差条带是由在生物组织中找到的内在差别引起。
特别是，缝合保持强度显出一种倾向，在第一批和第二批中，两种浓度的强度都较低。这最可能是酶促消化过程不同的结果。每次无花果蛋白酶溶液的活性都稍有不同。换句话说，可能为第二批制备的消化溶液的酶活性比为第一批制备的稍高。不管怎样，同一批内的强度差别可忽略不计。
例3  作了一个实验以评估不同浓度戊二醛对牛正中动脉血管修复物一些物理性质的影响。组织如例2所述加工到交联前一步。消化过的动脉分别放进三个交联罐。罐1含有50mM柠檬酸盐缓冲的0.01戊二醛；罐2含有50mM柠檬酸盐缓冲的0.075％戊二醛；罐3含有50mM柠檬酸盐缓冲的2.0％戊二醛。动脉在每一个固定罐中留存到交联反应完成或大约4天。待交联反应完成，从罐1和罐2各取出一半动脉分别放入50mM柠檬胶盐缓冲的2％戊二醛溶液中消毒。另一半动脉留存在原溶液中。24小时后，所有动脉各放入含有40％乙醇的玻璃瓶中并加盖。然后每组样品经受下列试验：径向抗张强度、缝合保持强度和爆裂强度。
图3显示本实验每种条件下加工的组织的径向抗张强度和缝合保持强度非常相似。两种极端条件(0.01％和2.0％)的特别有趣，因为其数据代表较低的终极范围。这数据否定了工业中持有的关于高浓度固定导致高的热稳定性以致导致高强度的非常普遍的看法。这些结果与图6的收缩温度数据一样，显示情况不是那样。0.01％/2％组的抗张强度比其它组稍低的现象被认作一种假象。期望以后用2％戊二醛的处理要说有什么不同，就是将会强化组织而不是削弱它。
图4显示爆裂强度试验结果。血管修复物样品用水充胀到它爆裂，爆裂时的内部压力记作爆裂强度。再次看一下极端条件的情形，结果几乎是相同的，虽然低戊二醛试验组把戊二醛浓度定在常规2％交联的1/200。
例4  图5是由低戊二醛产生的短链分子内交联形成与高-戊二醛固定产生的长链分子间交联形成的简化表示。这图形有助于显示，在分子内交联存在时，胶原链可保持较多的完整性，即使肽键因暴露于辐射而断裂。
通过测量给定样品的收缩温度或变性温度，可以分析组织的交联密度。用低戊二醛交联的组织形成较高的分子内交联密度，这可用其收缩温度比常规固定的组织高表示。这种相互关系被用0.5％和0.05％戊二醛分别交联的二组十五个猪主动脉瓣膜小叶所揭示。收缩温度由差别扫描量热法测定，结果包括在图6中。
例5  实验显示，暴露于电子束辐射的戊二醛交联的组织表现出血液动力学行为特性增强，如柔韧性。柔韧性提高的证据，由测定血流经过心脏瓣膜时的压力下降(从心脏瓣膜的流入一侧到流出一侧的压力变化)提供，如图7所示；也由测定有效孔面积，即血流穿过部分的面积所显示，如图8。这些试验揭示，心脏瓣膜暴露于电子束辐射结果使小叶此未受辐射的有较大程度变软而更易打开。这对接受瓣膜移植者提供了短期和长期的好处，因为较大的有效孔面积具有较大的心脏输出量，所以提高了心脏活动效率，降低了发生瓣膜尖破裂导致最后钙化和瓣膜故障的倾向。
8个心脏瓣膜由戊二醛交联如例1所示并暴露于电子束辐射。比较心脏瓣膜受电子束辐射前后血流经过心脏瓣膜时的压力下降。图7表明用稳态体外流量测试仪测试时压力下降减少了。作参考的无障碍直管的压力下降是0。
图8比较了心脏瓣膜用电子束辐射前后的有效孔面积，显示出电子束辐射后有效孔面积增加。
有效孔面积的测定是通过把试验瓣膜放在脉搏重复试验计(PulseDuplicator)系统中做的。脉搏重复试验计通过测定含有试验瓣膜的模拟心脏内关键位置上的压力和流速计算许多与瓣膜相关的功能。
有效孔面积(EOA)定义如下：
      FOA＝Qrms/(51.6VΔP)，以cm2表示。
这里Qrms＝绝对压力下降时期中所得的均方根流速，以ml/sec表示；ΔP＝平均绝对压力下降，以mmHg表示。
经照射的组织心脏瓣膜中增强的血液动力学背后的理论，包含了使保持胶原三股螺旋完整的分子键的破坏。本技术提供的分子内交联，在胶原的结构框架被辐射削弱时，起着增强胶原骨架的作用。在有足够的分子内交联的情况下，25KGy的剂量将蛋白质骨架削弱到足以使组织更柔韧，还改进了组织功能。
每次都得到相似结果，这二种实验都是可重复的。确切的机制还不知道，理论上推测胶原分子内发生了断裂反应。当组织经受电子束辐射时，把胶原链维持在一起的键出现断裂。无论如何，分子内戊二醛交联存在似乎使胶原分子的一级结构保持完整，因此保持了软化组织的完整性。
例6  对辐射作为生物组织的消毒方法的主要批评是它影响产品的长期耐久性。美国食品和药物管理局(FDA)通常要组织瓣膜证明能在加速的耐磨测试仪上经受2亿次心搏周期。这相当于约5年实际时间。在将来某时，可能需要3亿8千万次心搏周期的同样试验。
作了电子束辐射对组织瓣膜抗磨性影响的测定实验。测试了4组瓣膜：
组1在0.03％戊二醛中交联；在0.5％戊二醛中贮存。(电子束负对照)。
组2在0.03％戊二醛中交联；漂洗除去残留物；在0.9％NaCl中贮存；电子束清毒，25KGy。
组3在0.03％戊二醛中交联；经抗钙化加工处理；漂洗除去残留物；在0.9％NaCl中贮存；电子束消毒，25KGy。
组4在0.5％戊二醛中交联；漂洗除去残留物；在0.9％NaCl中贮存；电子束消毒，25KGy(浓度负对照)。实验结果列于表1。这些结果清楚指出，经体外3亿8900万次心搏周期的试验证明，与对照瓣膜(组1和组4)相比，组织瓣膜暴露于电子束辐射对耐久性没有消极影响。事实上，有最好的耐磨数据的组是经抗钙化处理后暴露于电子束的组。
表1  3亿8900万次心搏周期的加速磨损试验结果
  处理  瓣膜数        异常情况概要
  组1     4    6个大洞(＞1mm)2个小洞(≤1mm)小叶上有2个大裂缝(2-6mm)1个小磨损1个瓣膜无可看到的磨损
  组2     4    2个大洞5个小洞1个小磨损1个瓣膜无可看到的磨损
  组3     6    3个小洞4个瓣膜无可看到的磨损
  组4     3    3个洞(0.5-3mm)2个瓣膜无可看到的磨损
例7  血管移植修复物，例如动脉，剥去其外膜、脂肪和肌肉组织并以活化的蛋白酶消化。剥离和清理过的动脉用琥珀酸酐在控制的碱性pH下处理使在动脉表面产生负电荷。带负电的动脉然后可用浓度范围从大约0.05％到5％戊二醛的柠檬酸盐缓冲液交联以固定和强化。最好浓度低于0.01％。按本发明，根据用低浓度和高浓度戊二醛交联的移植产品的定性比较评估，低浓度戊二醛通常产生较软和较柔韧的产品。定性地来说，用低浓度戊二醛交联会增强移植产品的柔韧性，这可用评估移植物曲率半径来证明，在低浓度戊二醛中固定的产品的曲率半径比在高浓度戊二醛中固定的小。
然后，固定的移植物可用浓度范围大约1％到4％的戊二醛消毒，最好约2％。
由这些步骤结合起来生产出的修复物提高了强度、耐久性、柔韧性和减少血栓形成。
本发明中消化步骤包含用活化的蛋白酶从移植物表面除去抗原物质。已经知道利用蛋白水解酶无花果蛋白酶作为制备血管的清理步骤的一部分，现在的方法通过使用活化的蛋白酶提供了从天然移植修复物更有效地清除抗原组织的手段。消化后剩留的是胶原基质。
例8  收获后，移植物用蛋白酶消化除去抗原物质，最好用活化的蛋白酶。在最好的增强交联法中，活化的蛋白酶是无花果蛋白酶，更好是加半胱氨酸激活的经过滤的无花果蛋白酶浓缩液。在最好的增强交联法中，所用的缓冲液是由柠檬酸和柠檬酸钠组成的，虽然可以用其它缓冲液。
本发明操作中使用的无花果蛋白酶的特定量依赖于所用无花果蛋白酶的活性，因为酶活化水平的变化是常事。为了解决所用无花果蛋白酶活性水平不同的问题，制造移植物需要的无花果蛋白酶的准确用量通常每次都要调整，使移植的制造达到恒定的体积活性(constant volumetricactivity)。即，决定移植物生产期间所用的无花果蛋白酶特定用量，通常需要评估无花果蛋白酶活性与按指定的活性，调整所用无花果蛋白酶的用量。按本发明通常使用的无花果蛋白酶的浓度，共计大约20l反应器容积加入无花果蛋白酶近65g。在最好的增强交联法中，消化溶液的无花果蛋白酶活性大约9.8mmol NPZG/l-min。
消化时，温度和pH应予监控。在一个增强交联法中，温度应在30℃和50℃之间的范围内，最好40℃±2℃。pH应在5和7之间，最好6.3±0.1。所用的消化时间不是严格的，但应该足以除去任何抗原物质，通常2-3小时足够。然后移植物应在蒸馏水中漂洗几次。在最好的增强交联法中，移植物漂洗4次。消化在一终止浴锅中结束，最好是含有NaCl的终止浴锅。在最好的增强交联法中，NaCl浓度是0.1％.然后，移植物再漂洗，最好4次。
例9  用止血钳把一根动脉悬挂在环形架上。用清洁剪刀剥去动脉的外膜、防脂和肌肉组织。把动脉放入安置在冰上装有0.9％NaCl的清洁烧杯中。重复这个步骤到所有动脉剥除好。
用缝线结札旁支，用三重外科结尽可能结札得紧靠重要动脉。剪去近结地方的过多旁支。在所有旁支部结札好后，把动脉从环形架上取下。
用0.9％NaCl溶液装满一个大注射器，路厄注射器尖端接上合适的渗漏测试计用止血钳夹紧动脉的一端，把注射器的尖端插进动脉的另一端。用一只手把注射器尖端牢固地接到动脉的末端，慢慢地把生理盐水注入动脉腔探查渗漏情况。用3-0、4-0或5-0缝线封闭一切漏隙。用缝线打三重外科结。不断缝合动脉漏隙到注射器在适度压力下无渗漏。缝好的动脉放入装有0.9％NaCl溶液安置在冰上的清洁烧杯中。重复这些操作到所要数量的动脉都缝好。
溶解420g柠檬酸钠和14.4g柠檬酸于水中，把体积调整到21l。如必要，测pH并调整到6.3。柠檬酸盐总浓度是71.3mM，钠盐95.4％、酸4.6％。
用17.32无花果蛋白酶缓冲液装满反应器，打开搅拌器。把加热盘管放进罐内，打开热水开始加热缓冲液到40℃。把缝好的软管倒钩装置(threaded hose barb fittings)插入动脉，用线札牢。用这个装置把动脉连接于移植物多支管上(graft manifold)。把一些移植物多支管相互连接并用3/8“×2”不锈钢小钉把它们附着在支持器上，放进反应器中。开始用泵以1.05l/min流速抽吸每一个移植物多支管。在反应器温度稳定在40时，加入活化的无花果蛋白酶浓溶液。
制备无花果蛋白酶浓溶液相当于85g Sigma乳汁粉/l。把2.8l无花果蛋白酶缓冲液放入安置在40℃振动水浴中的烧瓶内。约需65g无花果蛋白酶粉。无花果蛋白酶粉溶于40℃缓冲液中并通过一个5micronGelman Acro 50A滤器过滤。
量取2.68l过滤的酶浓液并放入烧瓶中，安置在40℃水浴中。称取6g L-半胱氨酸加到酶浓液中使之活化。5分钟后，把酶浓液加进反应器开始消化。消化进行2.5小时，温度保持在40℃±2℃；监控pH，应保持在6.3±0.1。
定时检查动脉，排除过多扭结，让液流平均分布通过移植物多支管。动脉在20分钟内由粉红色变为银灰色。消化期间，动脉管腔稍有扩大，长度增加约35％。消化结束，用水充分洗4次。
停浴时(for the stop bath)，溶解20g NaCl于20l H20中。关掉泵和搅拌器。打开排水阀让罐流空。关闭排水阀并用20 lH2O注满反应器。打开泵和搅拌器让其平衡几分钟。重复操作洗4次。
关掉泵和搅拌器并打开排水阀让罐流空。关闭排水阀并用停浴溶液注满反应器。打开泵和搅拌器，停浴持续15-20分钟使任何残余的酶失活。反应器排水。进行4次清洗。
溶解1680.2gNaHCO3于水中并稀释到20l。关掉泵和搅拌器，把最后的洗涤液排出罐外。用20l.NaHCO3溶液注满反应器。打开泵和搅拌器，让其平衡15分钟。
称取142.8g琥珀酸酐。将1/2酸酐加到平衡15分钟后的反应器中，让晶体分散在溶液中，搅拌使它们混溶。30分钟后加另一半酸酐，操作要费60-90分钟。到所有晶体溶解，溶液中不再产生气泡时操作完成，停止泵和搅拌器，排水。重复操作洗4次。
量取8.0l H2O放入清洁的大玻璃瓶中.称取112.0g柠檬酸钠和4.0g柠檬酸加到该瓶中。在该瓶中放进一磁力搅棒。把该瓶放在搅拌盘上，搅拌到所有固体溶解。柠檬酸盐浓度应是50mM，由95.2％柠檬酸纳和4.8％柠檬酸组成。
量取1.6ml50％戊二醛加到仍在搅拌盘上的柠檬酸盐缓冲液中。让溶液平衡10-15分钟。测试pH并用6M NaOH或6M HCl调整到所需的6.40±0.05。
把一清洁的固定罐放在排气罩下，把一固定架放进固定罐中(一般每批2罐)把0.01％戊二醛溶液从大玻璃瓶转移到固定罐中。保持交联条件近120小时，定时即每24小时更换戊二醛溶液。
从反应器移走移植物多支管。用清洁剪刀剪下一段尺侧副动脉分叉点的远端的动脉。把动脉放入一个装有击矿质水的烧杯中。重复这一步到所有动脉都从移植物多支管移走。
从烧杯取出一块移植物。使移植物沿长度方向充分拉长。把移植物放在合适大小的轴柄(mandrel)上使它沿长度方向充分拉长。把带着移植物的轴柄放进在固定罐中的固定架某一个位置上。重复这些操作到所有移植物放到轴柄上并放进固定罐。记下进罐时间并盖罐。
当移植物在固定溶液中存放24小时时，制备一批新鲜的0.01％戊二醛溶液并转到一个清洁的固定罐中。把整个固定架(包括移植物)由原固定罐转到新鲜的二醛溶液罐。排弃旧的戊二醛液。把装有新鲜戊二醛的罐放在排气罩下。盖固定罐。每隔24小时后更换溶液。
量取7.68l去矿质水并放入一个清洁的大玻璃瓶中。称取112.0g柠檬酸钠和4.0g柠檬酸加到大玻璃瓶中。把大玻璃瓶放在搅拌盘上并搅拌到所有固定溶解。柠檬酸盐浓度应是50mM，由95.0％柠檬酸钠和4.8％柠檬酸组成。
量取320ml 50％戊二醛并加到仍在搅拌盘上的柠檬酸盐缓冲液中，让溶液平衡10-15分钟。测试pH并用6M NaOH或6M HCl调整到所需的6.40±0.05。在消毒前把戊二醛溶液转到一个清洁的固定罐中。
固定近120小时后，把移植物转到2％戊二醛溶液中。把固定罐放在排气罩下。盖固定罐。让移植物留在2％戊二醛中4-5小时。
例10  生物组织的生产如下：
各组织瓣膜在20℃暴露中于柠檬酸盐(pH6.4)或HEPES(pH7.4)缓冲的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％戊二醛中2、4、5、7、9或10天。
然后交联的生物组织在含有2％戊二醛、3％甲醛和20％乙醇的缓冲液的多成分消毒液中开始消毒。开始消毒的生物组织经乙醇(60％乙醇)抽提，也可选用包括0.1M AlCl3，在生理盐水中洗24小时。
而后，把生物组织包装进生理盐水中，暴露于电子束辐射进行终末消毒。
在本发明通过说明书和例子叙述一些细节时，应懂得本发明容许各种修改和变换，不限于前述特定增强交联法。应该懂得，这些特定的增强交联法，不是要限制本发明，相反，而是打算包括所有属于本发明精神和范围的修改、等价物和替换物。

Claims (20)

1、一种处理生物组织的方法，包括把生物组织暴露在低于约0.2％体积的交联溶液中。
2、根据权利要求1所述方法，交联溶液是戊二醛。
3、根据权利要求1所述方法，交联溶液是0.01-0.099％体积的戊二醛。
4、根据权利要求1所述方法，生物组织是胶原材料。
5、根据权利要求4所述方法，生物组织选自牛心包、猪主动脉瓣、硬脑膜、人脐静脉、从各种哺乳动物来源的血管组织和心脏瓣膜同种移植物组成的一类物体。
6、根据权利要求1所述方法，还包括把交联的生物组织暴露于生物能垒还原剂。
7、根据权利要求1所述方法，还包括把交联的生物组织暴露于抗钙化剂。
8、根据权利要求7所述方法，包括把交联的生物组织暴露于选自至少一种铝盐、一种含有至少50％乙醇的溶液组成的抗钙化溶液或二者结合的钙化溶液。
9、根据权利要求1所述方法，还包括消毒交联的生物组织。
10、根据权利要求6所述方法，还包括消毒交联的生物组织。
11、根据权利要求8所述方法，还包括消毒交联的生物组织。
12、根据权利要求9所述方法，消毒交联的生物组织包括把交联的生物组织暴露于电子束粒子轰击。
13、一种稳定的生物组织，包括将生物组织暴露低于约0.2％重量交联溶液，收缩温度约80℃-90℃。
14、一种用于组织移植的制备方法，包括把组织暴露在低于约0.2％体积的交联溶液和消毒交联组织。
15、一种包装组织的方法，包括暴露组织在低于0.02％体积的交联溶液。
16、一种生物组织，包括生物组织暴露在低于0.2％体积的交联溶液。
17、根据权利要求16所述的生物组织，包括生物组织暴露在约0.01％至0.099％体积的戊二醛。
18、一种处理生物组织的方法，包括暴露生物组织在约0.01％-0.099％体积的戊二醛。
19、一种处理生物组织的方法，包括暴露生物组织于从约0.01％至0.099％体积的戊二醛与暴露生物组织在至少一种铝盐、一种含有至少50％乙醇的抗钙化溶液或二者结合的抗钙化溶液。
20、一种生物组织，包括生物组织暴露于约0.01％至0.099体积的戊二醛。
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