JP2008529691A - 組織工学によるプロテーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

弁尖に対して動的な圧力差を加えることによって、発達中の心臓弁が動的ひずみにさらされる。流れは最低限に保たれ、灌流システムとしてのみ機能し、発達中の組織に新鮮な栄養分を供給する。標準的な心臓弁は、人間の伏在静脈から分離された細胞がシーディングされた三弁尖の足場に基づいて、培養された。組織の圧縮はステントによって課され、組織内に増大するプレひずみを誘起する。動的な圧力差を介して、組織は動的ひずみにさらされるが、弁尖上のひずみの分布を理解するため、新組織の機械的特性に基づいた有限要素法を用いて、動的ひずみが見積もられる。

Description

本発明は、少なくとも開いた状態の流路を有する組織工学によるプロテーゼの製造方法に係り、特に人間の心臓弁に関する。本発明はまた、バイオリアクタに関する。

このような方法については、特許文献１及び特許文献２に開示されている。特許文献２にはまた、組織のプロテーゼ、特に心臓弁を製造するためのバイオリアクタが開示されている。

バイオリアクタ内の機械的調節は、組織工学によって作製される心臓弁の構成及び構造に大いに影響を与え、従って、その機械的特性に大いに影響を与える。これまでのところ、心臓弁を培養するための方法及びバイオリアクタは、流れに基づいていて、通常の心臓弁の開閉動作を模倣する。このような調節の方法においては、組織形成及び機械的特性が増強されるが、大動脈弁の代わりのような全身的な心臓の圧力弁の代わりとして機能するには尚不十分である。

心臓血管組織工学においては、機械的調節による組織形成の刺激が、成長、回復及び再構築可能な機能的心臓血管構造の発達に役立つということが証明されている。発達する組織を調節する主な方法は、流れとひずみのどちらかまたはその両方を加えることである。過去数年間に、心臓血管構造を成長させるための特定の調節手順を適用する様々なバイオリアクタが開発された。

主な機械的刺激として流れを用いるバイオリアクタとしては、例えば、血管を培養するためのバイオリアクタが、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｃｋ（非特許文献３６）、Ｎａｒｉｔａ外（非特許文献２２）によって開発された。更には、Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ外（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）により、血管並びに心臓弁を成長させるためのパルスデュプリケータシステムが開発され、Ｓｏｄｉａｎ外（非特許文献３０、非特許文献３１）によって、シーディング処置を含むように変更された。主な機械的きっかけとしてひずみを用いるバイオリアクタとしては、例えば、血管を組織工学によって作製するためのバイオリアクタが、Ｎｉｋｌａｓｏｎ外（非特許文献２３、非特許文献２４）、Ｓｅｌｉｋｔａｒ外（非特許文献２９）によって開発された。これらのバイオリアクタにおいては、膨張式シリコーンチューブを介して腔内脈動圧力を加えることによって、組織が動的ひずみにさらされる。Ｎｉｋｌａｓｏｎ外（非特許文献２３、非特許文献２４）が、略５％の動的ひずみを加える一方で、Ｓｅｌｉｋｔａｒ外（非特許文献２９）は、より大きな略１０％のひずみを用いる。心筋組織に対しては、相当するバイオリアクタが、Ｇｏｎｅｎ‐Ｗａｄｍａｎｙ外（非特許文献７）によって開発され、組織が接触するシリコーン球の脈動的な膨張によって、発達する組織に動的ひずみ（０〜１２％）が加えられる。こうしたひずみに基づいたバイオリアクタ内で培養される組織に加えられる流れを、最小限に抑えることが可能であり、培養液の循環または組織自体の動きによって、主に導入する。他の種類のバイオリアクタにおいては、流れ及びひずみの両方を含むことによって、心臓血管構造の生理環境を模倣する。こうしたバイオリアクタは、組織培養及びそれに引き続く機能テストのためのみならず、元々の組織をテストするためにも使用可能である。血管内の生理学的血圧の波形を加えることが可能なバイオリアクタシステムがＭｃＣｕｌｌｏｃｈ外（非特許文献１６）によって開発された。生理的な流れと組み合わせて生理的血圧の波形を加えることが可能なバイオリアクタシステムがＴｈｏｍｐｓｏｎ外（非特許文献３２）によって開発された。ｉｎ‐ｖｉｖｏで縦ひずみに血管がさらされるように、Ｍｉｒｏｎｏｖ外（非特許文献１７）は、動的な縦ひずみを含む生理環境に発達中の血管がさらされるバイオリアクタを開発した。Ｈｉｄｅｂｒａｎｄ外（非特許文献８）、Ｄｕｍｏｎｔ外（非特許文献５）、Ｒｕｔｔｅｎ外（非特許文献２６）が開発したバイオリアクタにおいては、ｉｎ‐ｖｉｖｏで心臓弁の厳密な生理状態を適用することが可能であり、ＭＲＩを用いて弁の機能を可視化できる可能性がある。こうした成果にも関わらず、どの程度、発達中の組織を機械的きっかけにさらすべきなのかということと、どの機械的きっかけが組織の発達に最適であるのかということには未だ疑問が残っている。

組織工学によって作製された構造内の細胞は、細胞外マトリクスの形成を司る。また、機械的調節を介して、この細胞を刺激することが可能であり、より多量の細胞外マトリクスが生成される。機械的きっかけの性質及び強度は別として、培養条件（２次元または３次元の環境）並びに細胞の（表現）型は、機械的負荷に対する細胞の反応に影響を与える（非特許文献３、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献１３、非特許文献２、非特許文献２５、非特許文献１４、非特許文献１２、非特許文献１５、非特許文献６）。人間の伏在静脈の細胞が、人間の心臓の弁尖の組織培養用の細胞源として選択されてきた。これは利用し易い細胞源であるだけでなく、人間の動脈に由来する細胞と比較して機械的きっかけに対してより敏感であるために選択されてきた（非特許文献３、非特許文献２７）。この特定の細胞型に対する最適な調節手順については未だ決定すべきところがあるが、動的ひずみを用いてこの細胞で培養された弁尖等価体において、細胞外マトリクス形成の増加が、実証された（非特許文献１８）。従って、最適な調節手順には、シーディングされた血管細胞によるマトリクス産生を刺激する動的ひずむが含まれるであろうことが仮定される。初期の低せん断応力の環境を、物理的刺激に発達中の組織をさらすことと組み合わせることが、Ｂａｒｒｏｎ外（非特許文献１）により提案されており、初期の組織発達に対して効果的である。弁尖が内皮細胞でシーディングされて、抗血栓性表面層を提供する際には、流れを加えることによるせん断応力が後半段階において重要な役割を果たし始めることが多く、埋め込みに先立って下にある組織を安定化させる（非特許文献２１、非特許文献３５）。

国際公開第２００４／０１８００８号パンフレット 国際公開第２００４／１０１０１２号パンフレット Ｖ．Ｂａｒｒｏｎ、Ｅ．Ｌｙｏｎｓ、Ｃ．Ｓｔｅｎｓｏｎ‐Ｃｏｘ、Ｐ．Ｅ．ＭｃＨｕｇｈ、Ａ．Ｐａｎｄｉｔ、"Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ： ａ ｒｅｖｉｅｗ"、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００３年、第３１巻、ｐ．１０１７‐１０３０ Ｇ．Ｂ．Ｃｈａｐｍａｎ、Ｗ．Ｄｕｒａｎｔｅ、Ｊ．Ｄ．Ｈｅｌｌｕｍｓ、Ａ．Ｉ．Ｓｃｈａｆｅｒ、"Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｙｃｌｉｃ ｓｔｒｅｔｃｈ ｃａｕｓｅｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ"、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０００年、第２７８巻、ｐ．Ｈ７４８‐Ｈ７５４ Ｓ．Ｍ．Ｄｅｔｈｌｅｆｓｅｎ、Ｄ．Ｓｈｅｐｒｏ Ｐ．Ａ．Ｄ’Ａｍｏｒｅ、"Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｖｅｎｏｕｓ ａｎｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、第３３巻、ｐ．４０５‐４１３ Ｎ．Ｊ．Ｂ．Ｄｒｉｅｓｓｅｎ、Ｃ．Ｖ．Ｃ．Ｂｏｕｔｅｎ、Ｆ．Ｐ．Ｔ．Ｂａａｉｊｅｎｓ、"Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｇｕｌａｒ ｆｉｂｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００４年 Ｋ．Ｄｕｍｏｎｔ、Ｊ．Ｙｐｅｒｍａｎ、Ｅ．Ｖｅｒｂｅｋｅｎ、Ｐ．Ｓｅｇｅｒｓ、Ｂ．Ｍｅｕｒｉｓ、Ｓ．Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ、Ｗ．Ｆｌａｍｅｎｇ、Ｐ．Ｒ．Ｖｅｒｄｏｎｃｋ、"Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｏｒｔｉｃ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ"、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｏｒｇａｎｓ、２００２年、第２６巻、ｐ．７１０‐７１４ Ｇ．Ｃ．Ｅｎｇｅｌｍａｙｒ、Ｅ．Ｒａｂｋｉｎ、Ｆ．Ｗ．Ｈ．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｆ．Ｊ．Ｓｃｈｏｅｎ、Ｊ．Ｅ．Ｍａｙｅｒ、Ｍ．Ｓ．Ｓａｃｋｓ、"Ｔｈｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｆｌｅｘｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅ ｔｉｓｓｕｅ"、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００５年、第２６巻、ｐ．１７５‐１８７ Ｍ．Ｇｏｎｅｎ−Ｗａｄｍａｎｙ、Ｌ．Ｇｅｐｓｔｅｉｎ、Ｄ．Ｓｅｌｉｋｔａｒ、"Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃａｒｄｉａｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ"、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００４年、第１０１５巻、ｐ．２９９‐３１１ Ｄ．Ｋ．Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ、Ｚ．Ｊ．Ｗｕ、Ｊ．Ｅ．Ｍａｙｅｒ、Ｍ．Ｓ．Ｓａｃｋｓ、"Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅｓ"、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００４年、第３２巻、ｐ．１０３９‐１０４９ Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ｒ．Ｓｏｄｉａｎ、Ｓ．Ｄａｅｂｒｉｔｚ、Ｊ．Ｗａｎｇ、Ｅ．Ａ．Ｂａｃｈａ、Ｄ．Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ、Ａ．Ｍ．Ｍｏｒａｎ、Ｊ．Ｇｕｌｅｒｅｓｉａｎ、Ｊ．Ｓ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇ、Ｓ．Ｋａｕｓｈａｌ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、Ｆ．Ｊ．Ｓｃｈｏｅｎ、Ｊ．Ｅ．Ｍａｙｅｒ、"Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｖｉｎｇ ｔｒｉｌｅａｆｌｅｔ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ"、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０００ａ、第１０２巻（ｓｕｐｐｌ ＩＩＩ）ｐ．ＩＩＩ４９ Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ａ．Ｋａｄｎｅｒ、Ｃ．Ｂｒｅｙｍａｎｎ、Ｃ．Ｆ．Ｍａｕｒｕｓ、Ｃ．Ｉ．Ｇｕｅｎｔｅｒ、Ｒ．Ｓｏｄｉａｎ、Ｊ．Ｆ．Ｖｉｓｊａｇｅｒ、Ｇ．Ｚｕｎｄ、Ｍ．Ｉ．Ｔｕｒｉｎａ、"Ｌｉｖｉｎｇ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｃｏｎｄｕｉｔｓ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｃｅｌｌｓ"、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ、２００２ａ、第７４巻、ｐ．４６‐５２ Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ｇ．Ｚｕｎｄ、Ｓ．Ｃｈｅｎｇ、Ｓ．Ｍｅｌｎｉｔｃｈｏｕｋ、Ａ．Ｋａｄｎｅｒ、Ｒ．Ｓｏｄｉａｎ、Ｓ．Ａ．Ｋｏｌｂ、Ｍ．Ｔｕｒｉｎａ、"Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ"、ＡＳＡＩＯ ｊｏｕｒｎａｌ、２００２ｂ、第４８巻、ｐ．２３４‐２３８ Ｓ．Ｊｏｃｋｅｎｈｏｅｖｅｌ、Ｇ．Ｚｕｎｄ、Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ａ．Ｓｃｈｎｅｌｌ、Ｍ．Ｔｕｒｉｎａ、"Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： ａ ｎｅｗ ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ"、ＡＳＡＩＯ ｊｏｕｒｎａｌ、２００２年、第４８巻、ｐ．８‐１１ Ｂ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋｉ、Ｊ．Ｂｏｎａｄｉｏ、Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ、"Ｃｙｃｌｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ"、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９年、第１７巻、ｐ．９７９‐９８３ Ｂ．Ｋｉｍ、Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ、"Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｕｎｄｅｒ ｃｙｃｌｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０００年、第１２２巻、ｐ．２１０‐２１５ Ａ．Ａ．Ｌｅｅ、Ｄ．Ａ．Ｇｒａｈａｍ、Ｓ．Ｄ．Ｃｒｕｚ、Ａ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ、Ｗ．Ｊ．Ｋａｒｌｏｎ、"Ｆｌｕｉｄ ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００２年、第１２４巻、ｐ．３７‐４３ Ａ．Ｄ．ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ、Ａ．Ｂ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｃ．Ｅ．Ｓａｒｒａｆ、Ｍ．Ｅａｓｔｗｏｏｄ、"Ｎｅｗ ｍｕｌｔｉ−ｃｕｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｕｂｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｎｄｅｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ" Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００４年、第１０巻、ｐ．５６５‐５７３ Ｖ．Ｍｉｒｏｎｏｖ、Ｖ．Ｋａｓａｙａｎｏｖ、Ｋ．ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ、Ｓ．Ｏｌｉｖｅｒ、Ｊ．Ｓｉｓｔｉｎｏ、Ｒ．Ｍａｒｋｗａｌｄ、"Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｒｅｔｃｈ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ、２００３年、第１４巻、ｐ．３４０‐３４７ Ａ．Ｍｏｌ、Ｃ．Ｖ．Ｃ．Ｂｏｕｔｅｎ、Ｇ．Ｚｕｎｄ、Ｃ．Ｉ．Ｇｕｅｎｔｅｒ、Ｊ．Ｆ．Ｖｉｓｊａｇｅｒ、Ｍ．Ｔｕｒｉｎａ、Ｆ．Ｐ．Ｔ．Ｂａａｉｊｅｎｓ、Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、"Ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅｓ"、Ｔｈｏｒａｃｉｃ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｕｒｇｅｏｎ、２００３年、第５１巻、ｐ．７８‐８３ Ａ．Ｍｏｌ、Ｍ．Ｉ．ｖａｎ Ｌｉｅｓｈｏｕｔ、Ｇ．Ｃ．ｄａｍ ｄｅ Ｖｅｅｎ、Ｓ．Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ、Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ｆ．Ｐ．Ｔ．Ｂａａｉｊｅｎｓ、Ｃ．Ｖ．Ｃ．Ｂｏｕｔｅｎ、"Ｆｉｂｒｉｎ ａｓ ａ ｃｅｌｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００５年、第２６巻、ｐ．３１１３‐３１２１ Ｔ．Ｍｏｓｍａｎｎ、"Ｒａｐｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８３年、第６５巻、ｐ．５５‐６３ Ｇ．Ｂ．Ｎａｃｋｍａｎ、Ｍ．Ｆ．Ｆｉｌｌｉｎｇｅｒ、Ｒ．Ｓｈａｆｒｉｔｚ、Ｔ．Ｗｅｉ、Ａ．Ｍ．Ｇｒａｈａｍ、"Ｆｌｏｗ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ： ａ ｎｅｗ ｍｏｄｅｌ"、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１９９８年、第１２４巻、ｐ．３５３‐３６１ Ｙ．Ｎａｒｉｔａ、Ｋ．Ｈａｔａ、Ａ．Ｕｓｕｉ、Ｍ．Ｕｅｄａ、Ｙ．Ｕｅｄａ、"Ｎｏｖｅｌ ｐｕｌｓｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ‐ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ"、Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００４年、第１０巻、ｐ．１２２４‐１２３３ Ｌ．Ｅ．Ｎｉｋｌａｓｏｎ、Ｊ．Ｇａｏ、Ｗ．Ｍ．Ａｂｂｏｔｔ、Ｋ．Ｋ．Ｈｉｒｓｃｈｉ、Ｓ．Ｈｏｕｓｅｒ、Ｒ．Ｍａｒｉｎｉ、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、"Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ"、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８４巻、ｐ．４８９‐４９３ Ｌ．Ｅ．Ｎｉｋｌａｓｏｎ、Ｗ．Ａｂｏｔｔ、Ｊ．Ｇａｏ、Ｂ．Ｋｌａｇｇｅｓ、Ｋ．Ｋ．Ｈｉｒｓｃｈｉ、Ｋ．Ｕｌｕｂａｙｒａｍ、Ｎ．Ｃｏｎｒｏｙ、Ｒ．Ｊｏｎｅｓ、Ａ．Ｖａｓａｎａｗａｌａ、Ｓ．Ｓａｎｚｇｉｒｉ、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、"Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ａｒｔｅｒｉｅｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｕｒｇｅｒｙ、２００１年、第３３巻、ｐ．６２８‐６３８ Ｃ．Ｊ．Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ、Ｂ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、"Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ： Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｇｆ‐ｂｅｔａ"、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、２０００年、第３６巻、ｐ．３１９‐３２４ Ｍ．Ｃ．Ｍ．Ｒｕｔｔｅｎ、Ｍ．Ｗ．Ｗｉｊｌａａｒｓ、Ａ．Ｍｏｌ、Ｅ．Ａ．ｖａｎ Ｄａｍ、Ｇ．Ｊ．Ｓｔｒｉｊｋｅｒｓ、Ｋ．Ｎｉｃｏｌａｙ、Ｆ．Ｐ．Ｔ．Ｂａａｉｊｅｎｓ、"Ｔｈｅ ｖａｌｖｅ ｅｘｅｒｃｉｓｅｒ： ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ‐ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｏｒｔｉｃ ｖａｌｖｅｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ、２００５年 Ａ．Ｍ．Ｓｃｈｎｅｌｌ、Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ｇ．Ｚｕｎｄ、Ｓ．Ｋｏｌｂ、Ｒ．Ｓｏｄｉａｎ、Ｊ．Ｆ．Ｖｉｓｊａｇｅｒ、Ｊ．Ｇｒｕｎｅｎｆｅｌｄｅｒ、Ａ．Ｓｕｔｅｒ、Ｍ．Ｔｕｒｉｎａ、"Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｖｅｎｏｕｓ ｖｓ． ａｏｒｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ"、Ｔｈｏｒａｃｉｃ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｕｒｇｅｏｎ、２００１年、第４９巻、ｐ．２２１‐２２５ Ａ．Ｓｅｇａｌ、"ＳＥＰＲＡＮ ｕｓｅｒ ｍａｎｕａｌ，ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ ｇｕｉｄｅ"、（蘭国）、Ｌｅｉｄｓｃｈｅｎｄａｍ： Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒｓｂｕｒｅａｕ ＳＥＰＲＡ、１９８４年 Ｄ．Ｓｅｌｉｋｔａｒ、Ｒ．Ａ．Ｂｌａｃｋ、Ｒ．Ｐ．Ｖｉｔｏ、Ｒ．Ｍ．Ｎｅｒｅｍ、"Ｄｙｎａｍｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｇｅｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ"、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０００年、第２８巻、ｐ．３５１‐３６２ Ｒ．Ｓｏｄｉａｎ、Ｔ．Ｌｅｍｋｅ、Ｍ．Ｌｏｅｂｅ、Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ｅ．Ｖ．Ｐｏｔａｐｏｖ、Ｈ．Ｈａｕｓｍａｎｎ、Ｒ．Ｍｅｙｅｒ、Ｒ．Ｈｅｔｚｅｒ、"Ｎｅｗ ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐａｔｃｈｅｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、第５８巻、ｐ．４０１‐４０５ Ｒ．Ｓｏｄｉａｎ、Ｔ．Ｌｅｍｋｅ、Ｃ．Ｆｒｉｔｓｃｈｅ、Ｓ．Ｐ．Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ、Ｐ．Ｆｕ、Ｅ．Ｖ．Ｐｏｔａｐｏｖ、Ｈ．Ｈａｕｓｍａｎｎ、Ｒ．Ｈｅｔｚｅｒ、"Ｔｉｓｓｕｅ‐ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ： ａ ｎｅｗ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｅｌｌ‐ｓｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ"、Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００２ｂ、第８巻、ｐ．８６３‐８７０ Ｃ．Ａ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｐ．Ｃｏｌｏｎ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ、Ｉ．Ｐｏｍｅｒａｎｔｓｅｖａ、Ｂ．Ｄ．ＭａｃＮｅｉｌ、Ｂ．Ｎａｓｓｅｒｉ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、Ｓ．Ｎ．Ｏｅｓｔｅｒｌｅ、"Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ"、Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００２年、第８巻、ｐ．１０８３‐１０８８ Ｈ．Ｕｅｂａ、Ｍ．Ｋａｗａｋａｍｉ、Ｔ．Ｙａｇｉｎｕｍａ、"Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ａｓ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ： Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ‐ｂｅｔａ１ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ‐ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ"、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ， ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７年、第１７巻、ｐ．１５１２‐１５１６ Ｍ．Ｗａｔａｓｅ、Ｍ．Ａ．Ａｗｏｌｅｓｉ、Ｊ．Ｒｉｃｏｔｔａ、Ｂ．Ｅ．Ｓｕｍｐｉｏ、"Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ"、Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９７年、第６１巻、ｐ．９８７‐９９６ Ｍ．Ｗ．Ｗｅｓｔｏｎ、Ａ．Ｐ．Ｙｏｇａｎａｔｈａｎ、"Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅ ｌｅａｆｌｅｔｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｌｏｗ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ"、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００１年、第２９巻、ｐ．７５２‐７６３ Ｃ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｔ．Ｍ．Ｗｉｃｋ、"Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｔｉｓｓｕｅ‐ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ"、Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００４年、第１０巻、ｐ．９３０‐９４１

本発明の課題は、組織工学によって作製されたプロテーゼの機械的特性を改善することである。

この課題は、少なくとも開いた状態の流路、特に人間の心臓弁を有する組織工学によるプロテーゼの製造方法であり、
‐ バイオリアクタチャンバ内にシーディングされた３次元の足場を配置する段階と、
‐ バイオリアクタチャンバ内に培養液の少なくとも一つの灌流を生じさせ、シーディングされた３次元の足場及び／又はその上に発達中の組織に、栄養を供給する段階であるが、ここで、シーディングされた３次元の足場の流路及び／又はその上に発達中の組織における完成品のプロテーゼの流路に関連する流路は、制限されているか閉じられている段階と、
‐ 組織培養の条件及び／又は段階に応じて、シーディングされた３次元の足場及び／又はその上に成長中の組織に対して、動的な圧力差を与えて、３次元の足場及び／又はその上に発達中の組織に、ひずみを生じさせる段階と、
‐ 制限されたまたは閉じられた流路を完成品のサイズに開く段階と、を備えた方法によって達成される。

従来の流れに基づいた方法とは異なり、本発明は、ひずみに基づいた方法を提供する。３次元の足場及び／又はその上に発達中の組織に、十分なひずみを与えるため、発達中のプロテーゼは、動的な圧力差を加えることによって、動的ひずみにさらされる。ひずみに基づいた方法において、組織工学によって作製されたプロテーゼは、優れた組織の形成と組織化を示し、従って、機械的特性が改善される。バイオリアクタチャンバ内に留まっている期間中に、発達中のプロテーゼの流路を制限するか閉じることによって、適切なひずみを生じさせることが可能である。組織の発達中に制限されたまたは閉じられた流路は、個々のプロテーゼ、特に人間の心臓弁に対する通常の最終的なサイズへと開かれる。例えば、小さな開口部のみが存在するようにすることができ、プロテーゼの一方の側から他方の側への培養液の最低限の灌流のみが許容されるようになる。流路が完全に閉じられている場合には、二つの別個の灌流を提供することが可能であり、発達中のプロテーゼのそれぞれの側に一つずつとなる。心臓弁に対しては、流路の制限を弁尖の接合によって達成してもよい。

一実施例の目標は、最小化させた流れと組み合わせて動的ひずみを用いることにより細胞外マトリクスの形成を刺激して、人間の心臓の弁尖を培養する基本的概念を構築することである。現状で用いられる心臓弁の組織培養用の調節方法は、脈動流を与えることに集中していて、組織をひずませることは行われないかまたは限定されているため、本発明は新規の方法となる。この目的のため、新規バイオリアクタシステムである心臓拡張期パルスデュプリケータ（Ｄｉａｓｔｏｌｉｃ Ｐｕｌｓｅ Ｄｕｐｌｉｃａｔｏｒ，ＤＰＤ）が開発され、閉じた弁尖上に動的な圧力差を加えることによって、心臓の弁尖に動的ひずみを伝える。このようなバイオリアクタシステムに対する要求は、１）使用時の単純性、２）培養液及び培養器の空間を節減するための小型化、３）生体適合性のある物質の使用、４）長期間にわたる無菌性の維持、５）加えられた弁の内側（ｔｒａｎｓｖａｌｖｕｌａｒ）の圧力をモニタリング及び制御する能力、である。本研究においては、ステント弁という幾何学的形状が用いられるので、成長中の組織及び治癒中の組織に共通して、組織の圧縮はリジッドなステントによって課され、圧縮誘起されたプレひずみが組織の圧縮として弁尖中に広がる。培養液は、ＤＰＤ中を低速（４ｍｌ／ｍｉｎ）で循環し、発達中の組織に酸素及び新鮮な栄養分を提供し、排出物を除去する。

人間の心臓弁の組織培養に対するひずみに基づいた方法の実現可能性が示される。ＤＰＤ中の動的ひずみ及びステントによって圧縮誘起されたプレひずみにさらされた弁尖の組織形成及び機械的特性を、圧縮誘起されたプレひずみのみにさらされた弁尖と比較した。後者の弁尖は、動的な圧力差を与えずに、低速で培養液を循環させ、ＤＰＤ中で培養した。対照用として、圧縮が課されておらず、負荷のかけられていない矩形にされた弁尖組織等価体を用いた。弁の足場は、ノンウーブンのＰＧＡの繊維メッシュから作成され、Ｐ４ＨＢでコーティングされた。フィブリンを、人間の伏在静脈細胞に対する担体として使用し、足場全体にわたる一様な細胞の分布を確実にし、機械的調節に適した小型の構造にした（非特許文献１９）。圧縮誘起されたプレひずみのレベル、並びに、ＤＰＤ中に加えられた動的な弁の内側の圧力によって生じた弁尖中のひずみの分布を見積もったが、後者においては数値解析を用いた。

一実施例において、制限されたまたは閉じられた流路は、完成品のプロテーゼの流路よりも、少なくとも２０％、好ましくは５０％以上小さい。流路を流れる補償的な流れが最小またはゼロに保たれているのであれば、動的な圧力パルスが、３次元の足場上にまたは発達中の組織上に、よりひずみを発生させる。流路の制限が、個々の弁尖上の接合領域という手段によって形成される場合には、流路は、頻繁にまたは時々、弁を開くのに差し支えないように選択される。

更なる変形例においては、少なくとも一つの灌流は少なくとも５０ｍｌ／ｍｉｎ未満であり、好ましくは５ｍｌ／ｍｉｎ未満である。灌流は最小限に保たれ、３次元の足場の開口部及び／又は発達中の組織の開口部は、この小さな灌流が開口部を通って流れるのだけに十分なサイズにされることが望ましく、圧力差の生成には僅かな影響しか有さない。

少なくとも一つの灌流が実質的に脈動を有さないと更に有利である。プロテーゼを介する通常の流れの振る舞いを模倣することがないことが望ましい。ローラーポンプを使用する場合には、このポンプの通常の動作の影響のみが存在し、追加的な脈動は存在しない。流れは実質的に一定に保たれることが望ましい。

更なる実施例においては、圧力差は初め実質的にゼロであり、その後、平均のピーク圧力差にまで上昇し、その後、３次元の足場及び／又はその上に発達中の組織がバイオリアクタチャンバ内に留まっている期間の終わりに向けて減少する。初め、組織は、実質的なひずみなしで発達する時間を与えられる。その後、ひずみの平均の分布が上昇し、一定時間後に平均のピーク圧力差に達する。その後、バイオリアクタ内に留まっている期間の終わりに向けて、減少する。

２４時間に対して平均化された、平均のピーク圧力差は２５ｍｍＨｇ超であり、好ましくは４５ｍｍＨｇ超である。これによって、組織の形成及び組織化を増強する顕著な量のひずみが提供されることが確実になる。

更に、バイオリアクタ内に留まっている期間の３０〜７０％、好ましくは４５〜５５％である時間周期に対しての平均の圧力差は実質的にゼロとすることが可能である。このような時間周期により、３次元の足場上で発達するための十分な時間が組織に与えられる。

他の実施例によると、２４時間に対して平均化された平均のピーク圧力差は、バイオリアクタ内に留まっている期間の６０％経過後、好ましくは７０％経過後に達成される。上述のように、組織形成及び組織化におけるひずみに基づく影響は、バイオリアクタ内に留まっている期間の後半に生じる。

特定の時間周期、好ましくは２４時間に対して調節された圧力差を用いることが可能であり、この時間周期内での個々のひずみ分布を生じさせる。圧力差は、時間周期毎の平均の圧力差に関してのみ調節させることも可能であるが、個々の時間周期内で調節させることも可能であり、平均の圧力差が増加する。

動的な圧力差は０．１から１０Ｈｚ、好ましくは１Ｈｚの周波数を有することが可能である。動的な圧力差は、平均的な心臓のシーケンスと同じ様な周波数を有するが、プロテーゼを介する流れは模倣されず、この周波数でプロテーゼ中のひずみが与えられる。

本発明は更に、少なくとも開いた状態の流路、特に人間の心臓弁を有する組織工学によるプロテーゼの製造用バイオリアクタであり、
‐ シーディングされた３次元の足場を挿入するためのバイオリアクタチャンバと、
‐ バイオリアクタチャンバ内に培養液の少なくとも一つの灌流を生じさせるための少なくとも一つの灌流手段と、
‐ シーディングされた３次元の足場及び／又はその上に発達中の組織に対して動的な圧力差を加えて、３次元の足場及び／又はその上に発達中の組織にひずみを発生させる追加的な加圧手段と、を備え、
加圧手段は、バイオリアクタチャンバと流れがつながっている圧縮及び減圧管を有するバイオリアクタをターゲットにしている。

灌流手段及び追加的な加圧手段は互いに独立であることが好ましく、通常は動脈を有さない少なく一つの灌流に重ねて、動的な圧力差が加えられる。培養液が汚染されないように、管の外側から圧力パルスが加えられる。管は圧縮可能であり、圧力が解放された後には初期形状に戻る。

好ましい実施例において、圧縮及び減圧管の少なくとも一部分は、該一部分の外側表面を取り囲むシリンダ中に配置されていて、シリンダは該シリンダ中に圧縮流体、好ましくは空気を流すためのポートを有する。シリンダはリジッドな物質から作成されることが好ましく、十分な圧力を、シリンダと管との間の空間内に与えることが可能になる。

磁気バルブをシリンダのポートと流れつながっているように提供することが可能であり、シリンダ中への圧縮流体の流れを制御する。また、磁気バルブは、シリンダの外の流体の流出を制御することも可能である。一定に供給される圧力は、磁気バルブによって調節され、シリンダ内に所定の圧力が存在するようになる。これによって、圧力の調節が容易になり、コスト効率が高い。

更に、コンプライアンスチャンバをバイオリアクタと流れがつながっているように提供することが可能であり、圧力差による培養液の変位を補償する。特に、発達中のプロテーゼの下に、ある程度の培養液が移される。灌流が最低限の分のみであるので、培養液の容量の移された分は、コンプライアンスチャンバによって補償されなければならない。圧力が解放された後で、移された培養液はコンプライアンスチャンバの外から流出して、バイオリアクタチャンバの個々の部分に流入する。培養液の全体の流速は増大しない。

更なる実施例において、バイオリアクタチャンバは、それぞれが圧力センサを備えた第１部分及び第２部分を有し、第１部分と第２部分との間には、３次元の足場及び／又はその上に発達中の組織を保持するための保持手段が配置されている。この二つのセンサを用いて、発達中のプロテーゼの一方の側から他方の側への圧力差を測定可能である。

以下では、本発明の一実施例について詳細に説明する。しかしながら、下記の説明は本願特許請求の範囲を制約するものではない。特許請求の範囲は、そのもっとも広い意味において理解されるものである。

《弁尖組織の作製》
〈心臓弁の足場〉
三弁尖の心臓弁の足場がＦａｓｔａｃｒｙｌ（登録商標）のステント上に作成された。Ｆａｓｔａｃｒｙｌの粉末及び流体（ＰＭＭＡ及びＭＭＭＡ、Ｖｅｒｔｅｘ‐ｄｅｎｔａｌ、蘭国）を混合し、型に注ぎ、３０分間で重合させた。完全に重合した後に、ステントを型から外した。接合領域を含む解剖学的形状の弁尖は、ノンウーブンのポリグリコール酸のメッシュ（ＰＧＡ；厚さ１．０ｍｍ、比重６９ｍｇ／ｃｍ^３；Ｃｅｌｌｏｎ、ルクセンブルク）から切り出された。上述の非特許文献９に開示されているように、弁尖をポリ‐４‐ヒドロキシ酪酸塩（Ｐ４ＨＢ；ＭＷ １×１０６、ＴＥＰＨＡ社、米国ケンブリッジ）の薄膜層でコーティングした。溶媒を蒸発させる前に、弁尖を、三弁尖の心臓弁の形状のテフロン（登録商標）の型の上に配置した。Ｆａｓｔａｃｒｙｌのステントを上部に配置した。溶媒の作用によって、ステントの表面層を溶解して、弁尖をステントに固定した。溶媒を蒸発させた後に、ステントを含む弁の足場を型から取り外した（図１ａ、１ｂ）。更に、弁の足場を真空下で一晩乾燥させて、溶媒の残留物を除去し、その後で、エチレン酸化物を用いて滅菌した。弁尖は、弁の密閉性を確実にするために接合部を含む。

〈シーディング処置〉
人間の大伏在静脈から採取され、通常の細胞培養法を用いて拡大させた細胞を使用した（非特許文献２７）。この細胞を培養する培養液は、ＤＭＥＭ Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｇｉｂｃｏ、米国）から成り、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）、１％のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ、米国）及び０．１％のゲンタマイシン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）を添加した。シーディング及びそれに引き続く組織培養に用いられる培養液は０．３％のゲンタマイシンと、追加的なＬ‐アスコルビン酸２‐リン酸塩（０．２５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、米国）とを含み、細胞外マトリクスの産生を促進する。シーディングの前に足場を培養液中に一晩置いて、タンパク質の堆積により細胞の付着を容易にする。細胞担体としてフィブリンを用いて、弁尖ごとにシーディングを行った（非特許文献１９）。簡潔に説明すると、細胞は、無菌トロンビン溶液（１０ＩＵ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、米国）中に保持されて、溶液の容量は、足場の空隙容量の半分（０．５×長さ×幅×厚さ）に等しい。トロンビン中の細胞は、等量の無菌フィブリノゲン溶液（１０ｍｇのタンパク質／ｍｌの培養液；Ｓｉｇｍａ、米国）と混合されて、足場上に滴下された。フィブリン溶液は足場によって回収されて、フィブリンゲルの重合によって内部に残留する。弁尖は、ｃｍ^２毎に４〜５（または６〜７）百万の細胞の密度で足場にシーディングされる。シーディングされた弁の足場は、ＤＰＤ中に配置される前に、培養器中で２０分間で重合することができた（３７℃、５％のＣＯ_２）。

《心臓拡張期パルスデュプリケータ（ＤＰＤ）》
〈ＤＰＤの説明〉
ＤＰＤ（Ｄｉａｓｔｏｌｉｃ Ｐｕｌｓｅ Ｄｕｐｌｉｃａｔｏｒ）は、弁が培養されるバイオリアクタ（Ａ）と、培養液容器（Ｂ）とから成る。これらは二本の平行な管の組（Ｃ）を介して互いに接続されていて、管はローラーポンプ（Ｄ）を通過する。上方の管の一部は、ポリカーボネートのシリンダ（Ｅ）中に配置されたより太いチューブから成る。磁気バルブ（Ｆ）を介して、圧縮空気をこのシリンダ中に放出することが可能であり、チューブを圧縮及び減圧させて、弁尖上の圧力の変化を生じさせる。バイオリアクタ上に配置されたシリンジ（Ｇ）は、コンプライアンスチャンバとして機能する。弁尖の上流と下流の圧力は圧力センサ（Ｈ）を用いてモニタリングされる。

ＤＰＤは図２ａに示されるような二つの構成要素から成る。即ち、弁が培養されるバイオリアクタ（高さ＝９ｃｍ、直径＝６ｃｍ）と、同様の寸法の培養液容器とであり、どちらもポリカーボネート（ＫＵＢＲＡ Ｋｕｎｓｔｓｏｆｆｅｎ、蘭国）から作成されている。バイオリアクタ自体は二つの部分から成り、弁の可視化用のガラス窓（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ ＢＶ、蘭国）を含む上部部分と、下部部分とであり、互いにねじ込むことが可能である。シリコーンリング（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅｎ、蘭国）を用いて、全ての構成要素を密封する。バイオリアクタ及び培養液容器は二本の平行なシリコーンの管の組（Ｒｕｂｂｅｒ、蘭国）を介して接続される。ポリプロピレンのコネクタ部分を用いて、管を固定する。チューブの組はどちらも、ローラーポンプ（Ｍａｓｔｅｒ°ｅｘｒ、ＣｏｌｅＰａｒｍｅｒ、米国）を通過する。上部の管の組の一部は、ポリカーボネートのシリンダ中に配置されたより太いシリコーンチューブから成り、圧力下での空気に耐性のあるように管に対して適切な接続部を備える（Ｆｅｓｔｏ、蘭国）。圧縮空気管は圧縮空気タップに接続されている（７ｂａｒ）。気圧は２ｂａｒに下げられ、比例磁気バルブ（Ｆｅｓｔｏ、蘭国）を通過して、ポリカーボネートのシリンダ内に通じる。ＤＰＤ全体はエチレン酸化物によって滅菌され、ローラーポンプと一緒に、培養器内に配置される。図２ｂに示すように、通常サイズの培養器の一つの棚には、６つまでＤＰＤを配置可能である。

〈ＤＰＤの機能〉
略７５ｍｌの培養液が循環しており、非常に低速（４ｍｌ／ｍｉｎ）のローラーポンプを介して、培養液容器からバイオリアクタを通過して培養液容器に戻り、発達中の弁組織に新鮮な栄養分を届け、発達中の弁組織から排出物を除去する。滅菌フィルタ（０．２μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、独国）が培養液容器のふたに配置されて、循環している培養液を酸化する。略２５ｍｌの培養液がバイオリアクタ及び管の組の中に存在していて、残りの５０ｍｌは培養液容器中に存在していて容易に交換可能である。弁尖上に動的な圧力差を与えるため、ポリカーボネートのシリンダ中のシリコーンチューブを、比例磁気バルブからの空気によって、圧縮及び減圧する。弁尖上に発生させた弁の内側（ｔｒａｎｓｖａｌｖｕｌａｒ）の圧力は、ＬａｂＶｉｅｗソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて、プログラム可能な多重ＩＯカードにより制御される。圧力波の波形及び周波数は、弁の内側の圧力を最適にするようにプログラムされる。バイオリアクタの下方部分に接続されたシリンジには１０ｍｌの培養液と４０ｍｌの空気が充填され、コンプライアンスチャンバとして機能する。バイオリアクタの下方部分及び上方部分の両方に接続された圧力センサ（ＢＤ、ベルギー）を用いて、（心室側での）上流の圧力と、（動脈側での）下流の圧力とを測定する。同一の多重ＩＯカード及びソフトウェアを用いて、動的な圧力差をモニタリング及び記録可能である。

〈無菌性及び生体適合性〉
無菌性が数週間にわたって維持されることを証明するため、ＤＰＤをエチレン酸化物で滅菌し、ゲンタマイシンを加えずに、７５ｍｌの培養液を充填した。システムは３週間にわたって完全に機能した。テスト期間中、ゲンタマイシンなしの培養液で満たした培養フラスコを対照用に用いた。培養液容器中の培養液、並びに、培養フラスコ中の培養液の２／３を３〜４日毎に交換した。培養液の汚染を顕微鏡でチェックして、また使うまでの間−２０℃で保存した。

ＤＰＤで使用される物質が心臓弁の培養に適したものであることと、有毒成分が放出されていないこととを保証するため、無菌性テスト中に保存した培養液を用いて、生体適合性テストを実施した。人間の伏在静脈の細胞を２４のウェルプレートにシーディングし（３００００細胞／ウェル）、一晩置いて、通常の細胞培養液の培養器中で付着及び散布させた。翌日、通常の細胞培養液を、ＤＰＤで循環させた無菌性テストの培養液と、対照用培養液に交換した（テストグループ毎に５つのウェル）。最初の４回の培養液の交換の後に保存された培養液、並びに、培養フラスコからの対照用培養液を使用した。細胞をその後三日間成長させた後で、ＭＴＴテスト（非特許文献２０）を用いて、細胞の代謝活性を、生存能力の指標として求めた。簡潔に説明すると、溶液中のＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ、米国）（ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌ）を培養液中に希釈させて、細胞に加える。培養器中に３７℃、５％のＣＯ_２で一時間置いた後では、代謝活性な細胞は、ＭＴＴ塩を、細胞内部に位置する紫色の結晶に変換していた。１０％のギ酸（Ｓｉｇｍａ、米国）を含むイソプロパノール（ＶＭＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国）を細胞に加えて、紫色の結晶を放出及び溶解して、溶液の光学密度を求めた。結果は、対照を１００％に設定して、対照に対するパーセンテージで表す。

《組織培養および機械的調節》
組織形成を比較するため、また、ひずみに基づいた方法の実現可能性を示すため、弁尖組織の三つの実験グループを培養した。第１グループは、矩形にした弁尖組織等価体を含む。第１グループは細胞培養フラスコ内で、４週間にわたって無菌状態で培養され、制約なく圧縮可能であり、負荷がかけられていない対照として用いた。第２及び第３グループは、全てＤＰＤ中で培養された弁尖から成る。直接ＤＰＤ中に配置した後で、全ての弁尖は、低速（４ｍｌ／ｍｉｎ）の培養液の循環にさらされて、発達中の組織に新鮮な栄養分を供給した。弁尖を、ステントによって課される圧縮によるプレひずみ（ｐｒｅｓｔｒａｉｎ）及び連続的な培養液の循環にさらして、４週間にわたって培養した（グループ２）。更に、プレひずみ及び連続的な培養液の循環に加えて、弁尖を１Ｈｚで動的ひずみにさらした（グループ３）。弁の上流及び下流の圧力、並びに、動的な弁の内側の圧力を、３時間毎に記録した。グループ３の弁尖は、２週間、３週間及び４週間にわたって培養された。培養液容器中の培養液、並びにグループ１の培養フラスコ中の培養液の２／３は３から４日毎に交換された。

《組織形成の評価》
〈定性的組織分析〉
４週間後、全てのグループの組織形成を組織学によって分析した。代表的な小片を、リン酸緩衝ホルマリン（Ｆｌｕｋａ、米国）中に固定して、パラフィン中に埋め込んだ。５μｍの厚さに切片を切り、一般的な組織形態学用にはヘマトキシリン‐エオシン（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）染色によって調べ、コラーゲン形成用にはトリクロームマッソン（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｍａｓｓｏｎ）染色によって調べた。コラーゲンを調べるのは、コラーゲンが細胞外マトリクスの主な耐負荷成分だからである。

〈機械的テスト〉
一軸引張テストによって、４週間の培養後の３つのグループの培養された弁尖組織の円周方向のストリップの機械的特性を求めた。新鮮なストリップの厚さの測定は現実的に困難であるため、厚さは、代表的な組織学的切片から決定した。一軸引張テスタ（モデル４４１１、Ｉｎｓｔｒｏｎ、ベルギー、１０Ｎの負荷セルを装備）を用いて、毎秒１．７％の一定のひずみ速度により、応力‐ひずみ曲線を得た。機械的特性の時間発展を理解するため、２週間及び３週間の培養後の動的ひずみのかけられた弁尖の円周方向のストリップの機械的特性についても、求めた。

《弁尖中のひずみの見積もり》
ステントによって課される圧縮による弁尖中のプレひずみの量を見積もるため、培養後のステント中の弁尖と、ステントから解放した後の弁尖のサイズの違いを求めた。ステント中では初め膨れた形状を有していた弁尖は、新組織が自由に圧縮されるため、培養中にまっすぐになった。最初弁尖の円周方向のサイズは２３ｍｍであったが、完全にまっすぐになった弁尖においてはサイズが２０ｍｍに減少し、培養中に弁尖が１３％も自由に圧縮することが可能であると示された。４週間後に、プレひずみおよび培養液の循環にさらされた弁のステントから弁尖を解放した後で、弁尖の円周方向のサイズを測定した。この測定されたサイズを、２０ｍｍという最大限にまっすぐにされたサイズで割ることによって、弁尖中のプレひずみの量を計算した。引き続いて、この値を１から引いて、１００％でかけることによって、プレひずみのパーセンテージ表示の量を得た。

有限要素解析を用いて、加えられた動的な弁の内側の圧力によって生じた弁尖中の動的ひずみの量及び分布を見積もった。ステント弁の幾何学的形状の有限要素メッシュを図３に示す。図３に示される配置は、応力がないものとされ、対称性から、弁尖の１／２のみを有限要素解析において使用した。対称エッジにおいては、法線方向の節の変位が抑制された。一方、固定エッジにおいては、節の変位は全て０に設定された。自由エッジにおいては、近接する弁尖の接合をモデリングするため、接触表面を定義した。その後、弁の内側の圧力ｐｔｖを、弁尖の下流の表面に加えた。本研究においては、有限要素パッケージであるＳＥＰＲＡＮを使用した（非特許文献２８）。

弁組織は、非圧縮性の一般化されたネオフッキアン（Ｎｅｏ‐Ｈｏｏｋｅａｎ）物質としてモデリングした：
σ＝−ｐｌ＋Ｇ（Ｂ−ｌ） （１．１）
ここで、σはコーシー応力、ｐは静水圧、ｌは単一テンソル、Ｇは物質のせん断弾性率である。左コーシーグリーン変形テンソルはＢ＝Ｆ・Ｆ^Ｔと定義され、ここで、Ｆは変形勾配テンソルである。弁尖組織の（起こり得る）非線形的な振る舞いを記述するため、Ｇに対して以下の式を用いた：
Ｇ＝Ｇ_０（ｌ_１（Ｂ）／３）^ｎ （１．２）
ここで、Ｇ_０及びｎは物質のパラメータで、ｌ_１（Ｂ）＝ｔｒａｃｅ（Ｂ）はＢの第一不変量である。パラメータｎを用いて、非線形性の度合いを制御する。即ち、ｎ＞０だと、ひずみ硬化が生じ、ｎ＜０だと、ひずみ軟化が生じ、ｎ＝０だと古典的ネオフッキアン（Ｎｅｏ‐Ｈｏｏｋｅａｎ）モデルが得られる。２週間、３週間及び４週間の培養後の動的ひずみにさらされた弁尖組織の一軸引張テストがうまくいかなくなる前の、平均の結果に構成則（式１・１）をフィッティングすることによって、物質のパラメータが得られた。

〔結果〕
《ＤＰＤ》
試験した培養液（ダークグレーのバー）を、１００％に設定した対照用培養液（ライトグレーのバー）と比較した。対照と比較すると、全ての場合で、代謝活性は８０〜１００％であった。従って、ＤＰＤを生体適合性があるとみなすことができる。エラーバーは標準誤差を表す。

ＤＰＤ中を循環させた抗生物質なしの培養液は、テスト期間全体にわたって、巨視的または微視的な汚染の兆候を何ら示さなかった。システムは取り扱いが簡単であり、培養液の交換中の汚染の危険性が最小限であった。無菌性テストの間の最初の４回の培養液の交換に対して実施した生体適合性テストの結果を、図４に示す。４つの試験された培養液で培養された細胞の代謝活性は、対照と比較して、全て８０〜１００％の範囲内であり、ＤＰＤは生体適合性があり人間の心臓弁の培養に適していることを示している。

《動的にひずませる手順》
弁の内側の圧力の代表的な曲線を培養中に測定し、図５に示す。ＤＣオフセットの定義、周期的な弁の内側の圧力差、動的な弁の内側の圧力差が示されている。永久的な弁の内側の圧力が弁尖上に存在しているが、これをＤＣオフセットと称し、弁の上流と下流との圧力差の平均値である。周期的な弁の内側の圧力は、ピーク・トゥ・ピークの弁の内側の圧力値として定義される。弁の内側の圧力の最大値は、ＤＣオフセットと周期的弁の内側の圧力とを含み、加えられた動的な弁の内側の圧力と称される。

動的な弁の内側の圧力を毎日平均化してみると、最初の２週間の培養中で、動的な弁の内側の圧力が０から８０ｍｍＨｇへと徐々に上昇した。最後の２週間の培養では、圧力は低下したが、これは足場のサポート機能の低下であると予想され、略３７ｍｍＨｇで一定に保たれた。

《組織形成の評価》
〈組織学〉
Ｈ＆Ｅおよびトリクロームマッソンで染色した切片（図６）は、負荷のかけられていない矩形の弁尖組織等価体（図６ｃ、６ｆ）と比較すると、弁尖中の優れた組織形成を示した（図６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｅ）。動的ひずみを追加して培養した弁尖組織（図６ａ、６ｄ）は、プレひずみのみにさらされた弁尖（図６ｂ、６ｅ）と比較すると、より一様であり、またより密であることが見て取れる。４週間の培養後には、プレひずみまたは追加的な動的ひずみを用いて培養した場合のどちらにおいても、弁尖中にコラーゲンが識別可能であった（図６ｅ、６ｄ）。イメージ中のバーは３５０μｍを表す。動的にひずませた弁尖（ａ、ｄ）及びプレひずみのみにさらした弁尖（ｂ、ｅ）は、負荷のかけられていない弁尖組織等価体と比較すると、優れた組織発達を示した。動的にひずませた弁尖組織は、プレひずみのみにさらされた弁尖と比較して、より一様であり、またより密であるように見受けられる。青色に染色されたコラーゲンが、弁尖中に識別可能である（ｄ、ｅ）。

〈機械的テスト〉
４週間の培養後の全てのグループの代表的な応力‐ひずみ曲線を図７ａに示す。負荷のかけられていない弁尖等価体が線形な振る舞いを示した一方で、圧縮誘起のプレひずみにさらされた弁尖は、追加的な動的ひずみがあってもなくても、より組織のような非線形な振る舞いを４週間の培養後に示した。培養時間の増加に伴う機械的特性の時間発展を、動的ひずみにさらされた弁尖に対して、図７ｂに示す。２週間の培養後では、機械的振る舞いは線形であり、足場のような振る舞いを表している。３週間及び４週間の培養後では、組織はより非線形な機械的振る舞いを示し、組織の寄与を表している。

《弁尖中のひずみの見積もり》
〈プレひずみ〉
４週間の培養後のプレひずみのみにさらされた弁尖中のプレひずみの量は、最大限に弁尖がまっすぐになっているものとして、３〜５％の間で変化することが示された。

〈動的ひずみ〉
構成則（式１．１）は、一軸引張テストの結果に、非常に良くフィットした。表１．１には、有限要素モデルに対する入力パラメータ、フィットの絶対誤差の平均、３７ｍｍＨｇの弁の内側の圧力差に基づく、２週間、３週間及び４週間の培養後の動的ひずみの平均の見積もりがまとめられている。２週間後には８％であった弁尖中の動的ひずみの平均は、４週間の培養後には略２０％に増加した。４週間の培養後の弁尖中の動的ひずみの分布が図８ａ、８ｂ、８ｃに示されている。図８ａ及び８ｂには、それぞれ、上流と下流の表面における、弁尖中のひずみの分布が示されている。図８ｃには、弁尖中の全体的な動的ひずみの範囲の見積もりが示されている。

表１．１： ２週間、３週間及び４週間の培養後の動的にひずまされた弁尖の有限要素分析に対する入力パラメータのまとめ。パラメータｎは、２週間の培養後の弁尖に対して線形な振る舞いが観測されたために、０に設定された。更に、一軸引張テストの結果に対する構成則（式１．１）のフィットの絶対誤差の平均、そして、結果として見積もられた動的ひずみの平均が示されている。

〔議論〕
組織形成の機械的刺激は、心臓血管構造の組織工学において周知の方法であり、組織の形成及び組織化が改善される。バイオリアクタシステムにおいては、流れに基づいたものから、ひずみに基づいたものまで、多様な調節方法が採用されており、体内の生理環境を厳密に模倣するものもある。血管の組織工学においては、流れに基づいた方法、並びにひずみに基づいた方法が用いられる。しかしながら、心臓弁の組織工学においては、流れに基づいた方法しか開示されてきていない。調節手順は複数の因子に依存し、例えば、機械的きっかけに対する細胞の表現型及び細胞源（つまり動物または人間）の感度、使用する足場、足場から細胞への機械的きっかけの転移、機械的きっかけの強度及び種類が挙げられる。

ＰＧＡ／Ｐ４ＨＢの三弁尖の心臓弁の足場（図１ａ、１ｂ）上に細胞担体としてフィブリンを用いてシーディングした人間の伏在静脈細胞から培養した人間の心臓の弁尖の組織工学に形式が与えられた。この特定の細胞型は、人間の動脈由来の細胞と比較して、機械的刺激に対してより敏感であり、本願発明者は、培養中の周期的なひずみの組織形成に対する大きな影響について以前報告した（非特許文献１８）。この以前の研究においては、ひずみを大きくすると、細胞外マトリクス形成の量が増加した。組織発達の初期段階において、流れは全く必要とされないが、後続段階において、弁尖が内皮細胞でシーディングされるとすぐに、重要な役割を果たし始める可能性がある。流れは、内皮細胞によるシグナル伝達を介して組織を安定化させ、後続の着床に対して組織を準備する。本研究においては、人間の心臓の弁尖を組織工学によって作製するためのひずみに基づいた方法が開示される。発達中の心臓の弁尖を動的ひずみにさらすため、弁尖上に圧力差を与えることによって、心臓の拡張期を模倣する。新規バイオリアクタである心臓拡張期パルスデュプリケータ（ＤＰＤ）（図２ａ、２ｂ）はこの目的のために開発され、量が増加していく動的ひずみに発達中の組織をさらすことが可能である。動的ひずみを加えることに加えて、ステントの幾何学的形状によって課された組織の圧縮によって、本研究において培養された弁尖はプレひずみにもさらされた。流れは低速（４ｍｌ／ｍｉｎ）に保たれ、単に組織に新鮮な栄養分を十分に与え排出物を除去するためだけのものとして機能した。ＤＰＤは、非常に扱い易く、バルブ毎の全培養液の量がたった７５ｍｌで小型であり、生体適合性があることが証明され（図４）、長期にわたって無菌性が維持可能である。

プレひずみのみ、または追加的な動的ひずみにもさらされた弁尖の組織形成のどちらと比較しても、矩形の負荷のかけられていない弁尖組織等価体は、４週間の培養後の組織形成が劣る傾向があることが示された（図６）。動的ひずみにさらされた弁尖の組織は、プレひずみのみにさらされた弁尖と比較して、より一様でありより密であるように見えるが、これは、組織学による定性的な観察のみによるものである。動的ひずみにさらされた弁尖の機械的特性（図７ａ、７ｂ）は、時間とともに非線形的で組織のような振る舞いが増加することを示し、これは組織及びコラーゲンの量の増加を示している。４週間の培養後、負荷のかけられていない矩形の形状にされた弁尖組織等価体は線形な振る舞いを示したが、これは足場の振る舞いを表している。プレひずみのみにさらされた弁尖、並びに、追加的な動的ひずみにもさらされた弁尖は、４週間の培養後に非線形的な振る舞いを示したが、これは、負荷のかけられていない弁尖組織等価体と比較して、弁尖中に発見された組織の量が多いことに関係している。ＤＰＤ中の連続的な培養液の循環も、おそらく組織形成の改善に寄与しているものと考えられる。

プレひずみのみであっても、豊富な量の組織が生じることは明らかである。プレひずみは、３から５％の範囲内であると見積もられ、これだけでも既に最適化された組織形成には十分であり得る。しかしながら、動的ひずみは、組織の組織化を更に増強し、更に、足場及び組織のある種の変形によって弁尖の膨らんだ形状を維持するために価値のあるツールである。更に、ステントなしの人間の心臓弁の組織工学による作製に向けての将来的な応用に対しては、ステントがない弁においてプレひずみが非常に小さいので、動的ひずみが一層重要になるものと考えられる。

弁尖に加えられた動的ひずみの量を理解するため、動的ひずみの分布を見積もった。所定の動的な弁の内側の圧力においては、動的ひずみの量は、弁尖の物質の性質によって決まる。培養中、ＤＰＤ中で、弁の内側の圧力はモニタリングされた（図５）。理論的には、動的ひずみの量は、弁尖上のマーカーによってモニタリング可能であり、引き続いてひずまされている弁尖を画像化し、これに画像分析が続く。これは時間がかかり、現実的には難しい方法であるので、本願発明者は、有限要素分析によって弁尖中の動的ひずみを見積もることにした。発達中の弁尖の物質のパラメータは、一軸引張テストが上手くいかなくなる前の平均の結果に構成則（式１．１）をフィッティングすることによって決定され、有限要素分析に対するインプットとして用いられた。将来的な使用に対する例としての本研究で培養された弁尖中の動的ひずみの平均は、２週間の培養時での８％から４週間の培養時での２０％までで異なると見積もられた（図８ａ、８ｂ、８ｃ、表１．１）。加えられた動的な弁の内側の圧力は同様なものであったが、見積もられた動的ひずみは２から３週間の間に増加していて、これは、３週間の培養後にせん断弾性率が低くなっていることから示されるように、足場のサポートが低下したことを示しており、組織の剛性が低下している。ステント弁の幾何学的形状に対して、本研究で加えられた動的ひずみの量は、プレひずみを考慮すると、組織形成の最適化に対して大き過ぎたかもしれないが、ＤＰＤ中で大きな動的負荷を加えることが可能であると示された。現状としては、弁尖中のひずみは後で決定されるが、心臓拡張期パルスデュプリケータ（ＤＰＤ）の最適化に向けた将来的な研究は、培養中に直接組織のひずみを決定し、この特徴をフィードバックループ中にまとめて、ひずみの強さを制御する非侵襲性の方法の開発に向けられている。

有限要素分析においては、初め、応力フリーな弁尖の配置が仮定されるが、これは、弁尖が培養中の圧縮を示すような完全に正しいものではない。弁尖の物質の性質は、一様かつ等方的なものであると仮定されるが、主に円周方向のプレひずみ及び弁尖中の局所的な動的ひずみの分布により、特定の培養期間後には当てはまらない。従って、ＤＰＤ中で培養される弁尖は、円周方向及び半径方向の両方に対して機械的にテストされ、非等方的な性質の可能性が識別される。非等方的な性質の場合には、有限要素分析に対して、非特許文献４に説明されているような拡張モデルを用いることが望ましい。

弁の足場の底面図。 弁の足場の上面図。 ＤＰＤ及びその機能の概略図。 同時に使用される６ＤＰＤシステムの写真。 ステント弁の幾何学的形状の有限要素メッシュ。対称性から、弁尖の１／２のみを有限要素解析において使用する。幾何学的形状のこの部分は２２４個の６面体要素を用いて離散化されている。 無菌性テスト中にＤＰＤ中を循環した培養液の最初の４回の交換における培養された細胞の代謝活性のグラフ。 弁の培養中に測定された弁の内側の圧力の代表的な曲線。 Ｈ＆Ｅで染色された４週間の培養後の弁尖組織の代表的な切片。 Ｈ＆Ｅで染色された４週間の培養後の弁尖組織の代表的な切片。 Ｈ＆Ｅで染色された４週間の培養後の弁尖組織の代表的な切片。 トリクロームマッソンで染色された４週間の培養後の弁尖組織の代表的な切片。 トリクロームマッソンで染色された４週間の培養後の弁尖組織の代表的な切片。 トリクロームマッソンで染色された４週間の培養後の弁尖組織の代表的な切片。 ４週間の培養後の、負荷のかけられていない弁尖組織等価体と、プレひずみにさらされた弁尖と、追加的な動的ひずみにさらされた弁尖との応力‐ひずみ曲線。 動的にひずまされた弁尖に対する機械的特性の時間発展。 ３７ｍｍＨｇの動的な弁の内側の圧力差が加えられた弁尖の上流の表面における、４週間の培養後の動的ひずみの分布のグラフ。グレイスケールは動的ひずみの量を％表示で表す。 ３７ｍｍＨｇの動的な弁の内側の圧力差が加えられた弁尖の下流の表面における、４週間の培養後の動的ひずみの分布のグラフ。グレイスケールは動的ひずみの量を％表示で表す。 弁尖中に見出された全体的な動的ひずみの相対量及び平均値を示すヒストグラム。

符号の説明

Ａ バイオリアクタ
Ｂ 培養液容器
Ｃ 管の組
Ｄ ローラーポンプ
Ｅ シリンダ
Ｆ 磁気バルブ
Ｇ シリンジ
Ｈ 圧力センサ

Claims (16)

1. 少なくとも開いた状態の流路、特に人間の心臓弁を有する組織工学によるプロテーゼの製造方法であり、
   バイオリアクタチャンバ内にシーディングされた３次元の足場を配置する段階と、
   前記バイオリアクタチャンバ内に培養液の少なくとも一つの灌流を生じさせ、前記シーディングされた３次元の足場及び／又前記シーディングされた３次元の足場上に発達中の組織に、栄養を供給する段階であるが、ここで、前記シーディングされた３次元の足場の流路及び／又は前記シーディングされた３次元の足場上に発達中の組織における完成品のプロテーゼの流路に関連する流路は、制限されているか閉じられている段階と、
   組織培養の条件及び／又は段階に応じて、前記シーディングされた３次元の足場及び／又は前記シーディングされた３次元の足場上に成長中の組織に対して、動的な圧力差を与えて、前記３次元の足場及び／又は前記３次元の足場上に発達中の組織に、ひずみを生じさせる段階と、
   前記制限されたまたは閉じられた流路を完成品のサイズに開く段階と、を備えた方法。
2. 前記プロテーゼは弁尖を有する心臓弁であり、前記流路の制限は前記弁尖の接合によって達成される請求項１に記載の方法。
3. 前記制限されたまたは閉じられた流路は、前記完成品のプロテーゼの流路よりも、少なくとも２０％、好ましくは５０％小さい請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
4. 前記少なくとも一つの灌流は少なくとも５０ｍｌ／ｍｉｎ未満であり、好ましくは５ｍｌ／ｍｉｎ未満である請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記少なくとも一つの灌流は実質的に脈動を有さない請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記圧力差は初め実質的にゼロであり、その後平均のピーク圧力差にまで上昇し、その後前記３次元の足場、及び／又は、前記３次元の足場上に発達中の組織が前記バイオリアクタチャンバ内に留まっている期間の終わりに向けて減少する請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
7. ２４時間に対して平均化された平均のピーク圧力差は２５ｍｍＨｇ超であり、好ましくは４５ｍｍＨｇ超である請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記バイオリアクタチャンバ内でに留まっている期間の３０〜７０％、好ましくは４５〜５５％である時間周期に対しての平均の圧力差は実質的にゼロである請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
9. ２４時間に対して平均化された平均のピーク圧力差は、前記バイオリアクタチャンバ内に留まっている期間の６０％経過後、好ましくは７０％経過後に達成される請求項８に記載の方法。
10. 時間周期、好ましくは２４時間毎の調節された圧力差を用いて、前記時間周期内でそれぞれのひずみ分布を生じさせる請求項９に記載の方法。
11. 前記動的な圧力差は０．１から１０Ｈｚ、好ましくは１Ｈｚの周波数を有する請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 少なくとも開いた状態の流路、特に人間の心臓弁を有する組織工学によるプロテーゼの製造用バイオリアクタであり、
    シーディングされた３次元の足場を挿入するためのバイオリアクタチャンバと、
    前記バイオリアクタチャンバ内に培養液の少なくとも一つの灌流を生じさせるための少なくとも一つの灌流手段と、
    前記シーディングされた３次元の足場及び／又は前記シーディングされた３次元の足場上に発達中の組織に対して、動的な圧力差を加えて、前記３次元の足場及び／又は前記３次元の足場上に発達中の組織に、ひずみを発生させる追加的な加圧手段と、を備え、
    前記加圧手段は、前記バイオリアクタチャンバと流れがつながっている圧縮及び減圧管を有するバイオリアクタ。
13. 前記圧縮及び減圧管の少なくとも一部分は、該一部分の外側表面を取り囲むシリンダ中に配置されていて、前記シリンダは該シリンダ中に圧縮流体、好ましくは空気を流すためのポートを有する請求項１２に記載のバイオリアクタ。
14. 磁気バルブが前記シリンダのポートと流れがつながっているように提供されていて、前記シリンダ中への圧縮流体の流れを制御する請求項１３に記載のバイオリアクタ。
15. コンプライアンスチャンバが前記バイオリアクタと流れがつながっているように提供されていて、圧力差による培養液の変位を補償する請求項１２から請求項１４のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
16. 前記バイオリアクタチャンバは、それぞれが圧力センサを備えた第１部分及び第２部分を有し、前記第１部分と前記第２部分との間には、前記３次元の足場及び／又は前記３次元の足場上に発達中の組織を保持するための保持手段が配置されている請求項１２から請求項１５のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。