CN109513048A - 一种人工生物组织的交联方法 - Google Patents

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张
张一�
程国政
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Abstract

本申请公开了一种人工生物组织的交联方法，所述方法包括：提供人工生物组织和交联剂溶液，其中，交联剂具有亚胺结构；将人工生物组织浸入交联剂溶液中进行交联反应。通过上述方式，本申请能够提高交联后人工生物组织的抗钙化能力。

Description

一种人工生物组织的交联方法
技术领域
本申请涉及生物医疗技术领域，特别是涉及一种人工生物组织的交联方法。
背景技术
随着经济发展和人口老龄化，老年型钙化性主动脉瓣疾病的发病率呈现上升趋势，成为仅次于冠心病和高血压的心血管疾病。我国一项回顾性非随机研究分析提示50岁以上的中老年患者主动脉瓣钙化的发病率达49.38％。随着人口的老龄化，钙化性主动脉瓣狭窄的发病率增加，即将成为我国瓣膜病的首要病因。
1965年，Carpentier首先采用了戊二醛处理生物材料，使生物瓣膜的耐久性有了提高。单独的戊二醛溶液对瓣膜或心包组织进行交联，在一定条件下达到使用范围的力学性能和耐久性，并拥有良好的生物相容性
本申请的发明人在长期的研发过程中，发现天然瓣膜中活体胶原纤维中黏多糖糖蛋白类物质掩盖和阻止胶原与钙、磷结合而形成晶体核心，故很少钙化。但是生物瓣膜经过戊二醛交联后，瓣膜上常常会残留未配对的来自戊二醛的醛基和瓣膜蛋白质组织上的羧基，醛基和羧基易与钙离子结合，导致生物瓣中存在钙化位点，这是引起生物瓣钙化的一个重要原因。
发明内容
本申请主要解决的技术问题是提供一种人工生物组织的交联方法，能够提高交联后人工生物组织的抗钙化能力。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种人工生物组织的交联方法，所述方法包括：提供人工生物组织和交联剂溶液，其中，交联剂具有亚胺结构；将人工生物组织浸入交联剂溶液中进行交联反应。
其中，交联剂溶液为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合液。
其中，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺在交联剂溶液中所占质量分数为0.5g/L～30g/L。
其中，N-羟基琥珀酰亚胺在交联剂溶液中所占质量分数为0.1g/L～10g/L。
其中，交联反应的反应温度为25～45℃。
其中，交联反应的交联压力为0mmHg～40mmHg。
其中，交联反应的交联机械运动幅度为10转/min～100转/min。
其中，交联反应的交联时间为0.5～60天。
其中，人工生物组织为哺乳动物组织。
其中，哺乳动物组织为动物心包、主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣、肺动脉瓣、韧带、皮肤、腹膜、胸膜、跟腱或静脉带瓣管道中的任意一种或至少两种的混合物。
本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请提供一种人工生物组织的交联方法，该交联方法中所用交联剂为亚胺结构类交联剂，相对醛类交联剂，不会产生钙化位点，能够提高交联后人工生物组织的抗钙化能力，同时能够使交联后的人工生物组织具有良好的理化性能和生物相容性。
附图说明
图1是本申请人工生物组织的交联方法第一实施方式的流程示意图；
图2是本申请交联后人工生物组织的最大应力性能参数对比图；
图3是本申请交联后人工生物组织的拉伸强度性能参数对比图；
图4是本申请交联后人工生物组织的弹性模量性能参数对比图；
图5本申请交联后人工生物组织的抗钙化性能参数对比图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本申请进一步详细说明。
本申请提供一种人工生物组织的交联方法，该方法使用非戊二醛类溶液进行交联，克服了戊二醛交联后人工生物组织容易发生钙化的问题。
请参阅图1，图1是本申请人工生物组织的交联方法第一实施方式的流程示意图。在该实施方式中，交联方法包括如下步骤：
S101：提供人工生物组织和交联剂溶液。
其中，人工生物组织为哺乳动物组织，哺乳动物组织为动物心包、主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣、肺动脉瓣、韧带、皮肤、腹膜、胸膜、跟腱或静脉带瓣管道中的任意一种或至少两种的混合物。该方法可应用于主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣和肺动脉瓣等人工生物瓣膜领域。
S102：将人工生物组织浸入交联剂溶液中进行交联反应。
其中，交联剂具有亚胺结构。在该实施方式中，利用非醛类的交联剂对生物组织进行交联，所得交联后生物组织具有良好的理化性能和生物相容性，还能够提高抗钙化性能。
其中，在一实施方式中，交联剂溶液为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液。
具体地，碳化二亚胺(EDC)是一种化学交联剂，常与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺连用，以提高偶联效率。提供预定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混合后溶于水得到交联剂溶液。
其中，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)在交联剂溶液中所占质量分数为0.5g/L～30g/L，例如0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L或30g/L，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在交联剂溶液中所占质量分数为0.1g/L～10g/L，例如0.1g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。
配制好交联剂溶液后，将生物组织浸入交联剂溶液中进行交联。其中，可以在一定压力下进行交联，例如，可以将生物组织绷紧在预定器件上，给其一个拉伸力。交联压力为0mmHg～40mmHg，例如0mmHg、5mmHg、10mmHg、15mmHg、20mmHg、25mmHg、30mmHg、35mmHg、40mmHg，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。通过施加一定的压力，能够加快交联速度，提高交联度。
其中，可以在一定机械运动下进行交联。交联机械运动幅度为10转/min～100转/min，例如10转/min、20转/min、30转/min、40转/min、50转/min、60转/min、70转/min、80转/min、90转/min、100转/min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。通过进行机械运动，能够使生物组织的各个部分交联的更均匀。
其中，应当在预定的温度范围内进行交联，交联温度为25～45℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。若温度太低则交联速度太慢，温度太高会损坏生物组织。
其中，设定好交联条件后，根据生物组织的类型、产品对交联度的要求等选择交联时间，交联时间为0.5～60天，例如0.5天、1天、2天、4天、8天、12天、16天、20天、24天、32天、40天、48天或60天，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。
交联结束后，根据需要进行性能测试、保存等。
下面，将通过几组具体实验例对本申请的方案进行说明、解释，但这些实验例仅是一些示例性方案，不应用来限制本申请的范围。其中，实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照标准要求所规定的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。
其中，下述实验例中应用到了一些行业参考标准，具体标准内容请参阅相关文件说明，其中包括：
GB/T 528-2009硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的测定标准；
EP130015心包交联度检测试验方案(X1版)标准；
YY/T 1449.3-2016心血管植入物人工心脏瓣膜第3部分：经导管植入式人工心脏瓣膜标准；
GB/T 14233.1-2008中5.2.2的检验方法标准；
GB/T16886.5-2003中8.2的方法标准；
TP13010标准。
下面以牛心包膜为例进行试验，具体地，将采集的牛心包膜剥去大块脂肪、肌肉和结缔组织，清洗掉血渍后放入4℃生理盐水中，低温保存以备试验用。对心包进行精细挑选和清洗后随机分成两组，分别用于试验例和对比例。
对比例
将挑选好的牛心包膜浸入浓度为0.625％的戊二醛(GA)溶液中进行交联反应。
试验例
将挑选好的牛心包膜浸入浓度为0.1mol/L的EDC/NHS混合溶液中进行交联反应。
其中，对比例和试验例的交联温度、交联压力、交联时间等参数均相同。
交联反应结束后，对交联后的牛心包膜进行性能测试。
第一、力学性能的测试与对比
分别取对比例溶液和试验例溶液中的牛心包各1片，按照GB/T528-2009硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的测定标准进行测试，用激光切割机将试样裁剪成哑铃状，每种交联处理心包裁切为20个试样，以供后续测试。
应用伺服材料力学试验机，室温下，设定试验长度10mm，以200mm/min匀速纵向单轴拉伸测试。系统软件自动同步采集和记录，其中包括最大应力，拉伸强度，弹性模量等指标。以其中6个试样所得数据进行对比分析，具体请参阅图2-4，图2是本申请交联后人工生物组织的最大应力性能参数对比图；图3是本申请交联后人工生物组织的拉伸强度性能参数对比图；图4是本申请交联后人工生物组织的弹性模量性能参数对比图。
试验结果表明，从柱状图上可以看出EDC交联试验的力学性能测试数值均高于戊二醛(GA)交联试验的力学性能。
第二、交联指数测试
分别取对比例溶液和试验例溶液中的牛心包各1片，用生理盐水，60rpm/min震荡漂洗3次，每次5分钟。按照MPI13019标准冻干后，称取0.2g剪碎备用。每种交联处理心包的供试样数量3个。同时设立新鲜牛心包冻干作为空白对照，0.2g纯化水作为阴性对照，0.2g牛血清白蛋白作为阳性对照。
按照EP130015心包交联度检测试验方案(X1版)标准对交联度进行测试，测试结果见表1。
表1：本申请对比例与试验例的交联度结果
分组 交联度(％)
对比例 58.10％
试验例 57.60％
试验结果表明，相同的交联时间后，戊二醛交联效果略优于EDC的交联效果，但两者不具有统计学差异(P＜0.05)。
第三、耐久性测试
取试验例溶液交联固定的牛心包，用生理盐水，60rpm/min震荡漂洗3次，每次5分钟，按临床试验样品制备的要求缝制瓣膜4个；按照《YY/T 1449.3-2016心血管植入物人工心脏瓣膜第3部分：经导管植入式人工心脏瓣膜》标准进行测试。每2500万次疲劳测试后评价外观和流体动力学测试。至少通过5000万次测试。
试验结果如下：
1)外观：经过200×106次耐久性测试后，瓣叶均出现不同程度的磨损，但未出现瓣叶撕裂、瓣叶膨大分层、未出现不完全吻合及过度变形等异常现象。
(2)脉动流测试过程中瓣膜开闭：2个EDC交联的瓣膜在耐久性测试过程中处于正常的工作状态。
(3)功能性测试：2个瓣膜在耐久性试验过程中有效开口面积，均符合YY/T1449.3-2016和ISO5840-3:2013的要求。总返流比和跨瓣压差整体呈降低趋势。
试验结果表明经过耐久性试验的瓣膜功能保持良好，显示EDC交联牛心包耐久性测试合格，EDC交联可行。
第四、还原物质测试
分别取对比例溶液和试验例溶液中的牛心包各1片，用生理盐水，60rpm/min震荡漂洗3次，每次15分钟。漂洗完成后进行理化检测。
按照GB/T 14233.1-2008中5.2.2的标准方法进行检验；检验所用高锰酸钾溶液浓度为[(KMnO4)＝0.002mol/L]，检验结果详见表2。
表2：本申请对比例与试验例的还原物质检测结果
试验结果表明，EDC交联牛心包中还原物质含量远远低于戊二醛交联牛心包中还原物质含量。
第五、细胞毒性测试
分别取对比例溶液和试验例溶液中的牛心包各1片，经冻干、EO灭菌和强制解析后，取4g做细胞毒性检测，平行做3个重复。
按0.2g/ml浸提比例，在(37±1)℃，(24±2)h浸提条件下制备试验液。浸提介质：含血清的细胞培养液。取试验液，按GB/T16886.5-2003中8.2的方法进行。检测结果详见表3，细胞毒性判断标准详见表4。
表3：本申请对比例与试验例的细胞活力检测结果
组别 X±SD 细胞活力％
空白对照 0.480±0.043 100.0％
阴性对照 0.448±0.018 93.3％
阳性对照 0.028±0.005 5.9％
100％样品浸提液 0.361±0.006 75.2％
75％样品浸提液 0.403±0.016 83.9％
50％样品浸提液 0.403±0.016 83.9％
25％样品浸提液 0.411±0.009 85.6％
表4：细胞毒性判定标准
细胞活力 细胞毒性等级
1 100％ 0级
2 75～99％ 1级
3 50～74％ 2级
4 25～49％ 3级
5 ≤24％ 4级或5级
试验结果表明，EDC交联样品，在试验室环境生产，经冻干、EO灭菌和强制解析(EO残留合格)后，细胞活力为75.2％，细胞毒性检测为1级，符合接受标准。
第六、抗钙化试验
分别取对比例溶液和试验例溶液中的牛心包，选取厚度在0.2～0.3mm的牛心包，用激光切割机裁剪成10mm×10mm的小块，每种样品裁剪30小片。戊二醛处理样品放入灭菌液中进行灭菌处理备用。EDC处理样品经冻干并透析袋包装后，进行环氧乙烷灭菌备用。分组和样品量详见表5。
表5本申请对比例和试验例抗钙化样品处理条件
按照TP13010方案进行大鼠皮下植入，测试结果详见表6和图5，图5本申请交联后人工生物组织的抗钙化性能参数对比图。
表6本申请对比例和试验例抗钙化试验结果
试验结果表明，EDC交联的牛心包样品钙磷平均含量均明显小于戊二醛交联的心包样品，且有统计学差异(p＜0.05)。且EDC交联心包样品的钙含量低于0.84％，EDC交联心包样品的磷含量低于1.94％。
综上，EDC完全可以代替戊二醛对牛心包进行交联固定，并可以应用于人工心脏瓣膜。且本申请只使用EDC溶液进行交联，不引入醛类交联剂，从源头上防止出现因醛类引起的钙化风险。
以上方案，本申请提供一种人工生物组织的交联方法，该交联方法中所用交联剂为亚胺结构类交联剂，相对醛类交联剂，不会产生钙化位点，能够提高交联后人工生物组织的抗钙化能力，同时能够使交联后的人工生物组织具有良好的理化性能和生物相容性。
以上所述仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述方法包括：
提供人工生物组织和交联剂溶液，其中，所述交联剂具有亚胺结构；
将所述人工生物组织浸入所述交联剂溶液中进行交联反应。
2.根据权利要求1所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述交联剂溶液为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合液。
3.根据权利要求2所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺在所述交联剂溶液中所占质量分数为0.5g/L～30g/L。
4.根据权利要求2所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述N-羟基琥珀酰亚胺在所述交联剂溶液中所占质量分数为0.1g/L～10g/L。
5.根据权利要求1所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述交联反应的反应温度为25～45℃。
6.根据权利要求1所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述交联反应的交联压力为0mmHg～40mmHg。
7.根据权利要求1所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述交联反应的交联机械运动幅度为10转/min～100转/min。
8.根据权利要求1所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述交联反应的交联时间为0.5～60天。
9.根据权利要求1所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述人工生物组织为哺乳动物组织。
10.根据权利要求9所述的人工生物组织的交联方法，其特征在于，所述哺乳动物组织为动物心包、主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣、肺动脉瓣、韧带、皮肤、腹膜、胸膜、跟腱或静脉带瓣管道中的任意一种或至少两种的混合物。
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