JP2020532397A - 組織工学医療デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、以下の工程を含む、組織工学医療デバイス(TEMD)の作製方法に関する。
・最初に、基質、好ましくはポリグリコール酸(PGA)を含むメッシュ、好ましくは不織PGAメッシュが、ポリマー足場のための開始材料として提供される。代替材料は、それらが十分な細胞の内方成長のために必要な同等の多孔質構造を提供する限り、使用可能である。おそらく、ポリ乳酸(PLA)をさらに含むPGAメッシュもこれらの要求を満たし得る。
・第1のコーティング工程において、メッシュ、好ましくは不織PGAメッシュは、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)の一種であるポリ−4−ヒドロキシ酪酸(P4HB)を含有する第1のコーティング溶液を使ってコーティングされる。好ましくは、第1のコーティング溶液は、P4HBの、例えばテトラヒドロフラン(THF)等の非極性溶媒中の低パーセンテージの溶液であって、P4HB含有量は、好ましくは0.5%〜2%、より好ましくは約1%である。この第1のコーティング工程は、第1のコーティング溶液中でのメッシュの浸漬コーティングによって好ましくは実施されるが、例えば噴霧コーティング等の他のコーティング方法も使用可能である。生分解可能なP4HBは、最終的な産物(細胞外マトリックス以外、以下参照)における、移植直後の血圧に耐えるために必要である機械的安定性をもたらすが、PGAは以下に記載されるようにバイオリアクター段階中に大部分既に分解されている。PLAは、PGAメッシュの代用コーティングとして使用可能である。
・第1のコーティング工程に続いて、コーティングされたメッシュは、好ましくは溶媒を蒸発させるために数時間風乾される。
・作製される組織工学医療デバイスが血管移植片(または、その上/その中に生育させた組織工学心臓弁をさらに含む血管移植片)である場合、コーティングされたメッシュは第1のコーティング工程後に、次いで管または中空円筒に形成される。このために、メッシュは好ましくは例えば要求される寸法を備えた金属製円筒等の型の周囲に巻かれる。次いで、辺縁部は、好ましくは2つの辺縁を重ね合わせ、そして例えばはんだごて使用等で少なくとも60℃、好ましくは約80℃へ重なった辺縁を加熱することによって固定される。これによって、P4HBは融点60度の熱可塑性物質であるので、それ自体融合要素として使用される。このことは、管状ポリマー足場が全部生分解可能な物質から構成されるという利点を有する。管または中空円筒の辺縁固定の方法には、分子間ポリマー結合に加えて、他に糊付け、針通しおよび織りがある。管の直径は可変であり、したがって、開始材料として異なるパッチサイズのメッシュの選択によって、TEVGが移植される対象となる管(血管タイプおよび患者サイズによる)に応じて調整可能である。管状ポリマー足場の望ましい放射状直径は、小児大静脈肺動脈吻合術のための移植片の場合、1.0〜2.5cm、より好ましくは1.2〜1.8cm、最も好ましくは約1.6cmである。
・管状ポリマー足場の場合、第2のコーティング工程が実施される。この第2のコーティング工程において、管状ポリマー足場は、好ましくは低パーセンテージのP4HBを含有する溶液、含有量は好ましくは1〜3%、より好ましくは約2%のP4HB、によりコーティングされる。好ましくは、管状ポリマー足場は、管状ポリマー足場の外側(外皮)表面に沿っているその外側面上にのみコーティングされる。このために、管状ポリマー足場は、好ましくは保持デバイス上に取り付けられる。この第2のコーティング工程は、好ましくは噴霧コーティングによって実施され、好ましくは例えばエアブラシピストル等の噴霧デバイスが使用される。この工程は、コーティングの望ましい厚さに応じて、複数回反復することができる。好ましくは、第2のコーティング工程において、管状ポリマー足場の外側表面の噴霧コーティングは3回実施される。好ましくは、管状ポリマー足場中のP4HBの最終的な含有量は、5%〜95%(w/w)(重量パーセント)、より好ましくは20〜50%、さらにより好ましくは22〜45%、および最も好ましくは24〜32%(w/w)(重量パーセント)である。含有量は、好ましくは第1のコーティング工程の前、そして適用される場合には第2のコーティング工程後に、足場の重量を計量することによって決定される。
・次いで(管状であっても管状でなくても)、コーティング後に、ポリマー足場は、好ましくはエチレンオキシド処理によって滅菌される。アルコール処理および/または放射線処理は、追加または代替の滅菌工程として選択することができる。
・コーティングおよび滅菌後に、ポリマー足場は細胞培養培地中で、播種の前に平衡化目的のために好ましくは12〜72時間、好ましくは後続の細胞接着を促進するためにインキュベーションされる。
本発明による組織工学医療デバイスの作製において、単離および増殖されたヒト細胞を含有する細胞懸濁液は、ポリマー足場へ塗布、すなわちポリマー足場上に播種される。細胞および細胞の担体溶液を含む、かかる細胞懸濁液の作製はさらに以下に記載される。
・好ましくはヒト臍帯静脈(血管壁組織)、真皮、包皮、大動静脈、伏在静脈、または末梢動脈のうちの1つに由来する;より好ましくはヒト臍帯静脈に由来する、線維芽細胞;
・好ましくは骨髄、脂肪組織、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯マトリックス、または臍帯血に由来する、間葉系幹細胞;
・好ましくは骨髄に由来する、単核細胞;
・好ましくは血液、羊水、または臍帯血に由来する、内皮前駆細胞;
・好ましくは大動脈、臍帯静脈、または臍帯の他の組織(例えばワルトン膠質)に由来する、筋線維芽細胞
からなる群から好ましくは選択される。
ポリマー足場上への細胞懸濁液の播種後、本発明によってTEMDを作製する方法は、以下の工程を含む。
・播種されたポリマー足場は、バイオリアクター中に置かれ、漸増強度のパルス流動へさらすことによって機械的刺激を与えられる。好ましくは、この「コンディショニング工程」中の機械的刺激は、10〜30日にわたって、好ましくは15〜25日にわたって、最も好ましくは16〜20日にわたって、実施される。バイオリアクターにおける残留継続期間が短すぎる場合、不十分な組織が発達し、残留継続期間が長すぎる場合、導管は収縮し始める(目視管理)。好ましくは、培養培地は、アスコルビン酸、すなわちビタミンCを、好ましくは約0.0225%v/v(体積/体積)含有し、より好ましくは、バイオリアクター中の培養培地は、アスコルビン酸が添加されるということを除いて、細胞増殖中に使用される培養培地と同じとする。本発明の方法の好ましい実施態様によれば、バイオリアクター内部の培養培地は、決まった間隔、好ましくは1週間に2回、交換される。このバイオリアクター段階において播種された足場が生理的条件に耐えるように慣らされまたは調整され、その結果、本発明の組織工学医療デバイスが作製される。バイオリアクター中にTEMDが存在する間に、細胞外マトリックス(ECM)が形成される。細胞性能、したがってTEMD上でのECM形成は、バイオリアクター段階中にモニターされる。このために、さらに以下に列挙されるように、培地組成および乳酸値が管理される。
・次いで、TEMDがバイオリアクターから取り出される。
・バイオリアクターからのTEMDの取り出し後に、TEMDはスタビライザー上に取り付けられる。管状ポリマー足場に基づくTEMDの場合、スタビライザーは好ましくは円柱形状を有する導管スタビライザーである。バイオリアクター段階中、TEMDは収縮する傾向を有し、それはECMの形成に起因する可能性が最も高い。したがって、スタビライザー上への取り付けは、バイオリアクターにおけるコンディショニング段階中に起こった可能性のある「収縮」後に、TEMDを元の形状に回復させるのに有用である。TEMDは次いで、好ましくはスタビライザー上で、静的条件下で、細胞培養培地中で好ましくは12〜36時間インキュベーションされ、ここで、細胞培養培地は、好ましくはバイオリアクター中のものと同じ組成を有する。
・形状回復後に、TEMDは脱細胞化される。脱細胞化中に、例えばTriton−X等の界面活性剤を含む洗浄溶液を使用して、細胞は溶解され、除去される。好ましくは、洗浄溶液は、リン酸緩衝食塩水(PBS)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、Triton X−100、およびデオキシコール酸ナトリウムを含有する。より好ましくは、洗浄溶液は、PBS、0.68mMのEDTA、0.25%(v/v)のTriton X−100、および0.25%(w/w)のデオキシコール酸ナトリウム、を含有する。洗浄溶液のストリンジェンシーは、バイオリアクター段階中に細胞によって生成された細胞外マトリックスは維持されるが、可溶性で望まれない細胞構成要素が除去されるように選択される。
・次いで、TEMDにヌクレアーゼ処理を行う。この酵素分解は、TEMDからのDNAの除去に役立つ。このために、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを使用することができる。好ましくは、ベンゾナーゼがDNA分解のために使用される。最小のDNA残部のみが残ることを確実にするために、残留DNA含有量測定の品質管理工程が、後述のように完成産物に対して実施される。
・本発明によるTEMD作製の最終工程において、TEMDを、すすぎ溶液中、好ましくはPBS中ですすぎ、次いで脱イオン水(ddH2O)中ですすいで、塩を除去する。次いでTEMDは、好ましくは後の使用のためにフィルターキャップ付きの管へ移される。
TEMDのすすぎに続いて、本発明による方法は、好ましくは以下の工程のうちの少なくとも1つ、より好ましくはすべてを含む。
・TEMDから水を除去する、すなわちTEMDを乾燥するために、TEMDに凍結乾燥処理(すなわち冷凍乾燥)を行う。このために、TEMDは、好ましくは汚染のリスクを低減するためにフィルター蓋付きの閉管中で凍結乾燥される。例えば結晶形成に起因する材料の損傷を防止するために、最適な凍結乾燥プログラムが必要である。凍結乾燥は、好ましくは図6のプログラムにより実施される。凍結乾燥は、完全に乾燥した状態でのTEMDの保存を可能にし、保存および輸送をより容易にする。
・さらに、TEMDがパッケージングされる。好ましくは、機械的損傷、汚染および液体または湿度からTEMDを十分に保護するために、凍結乾燥したTEMDは、例えば減菌袋、管、ブリスターパッケージングなどの中で二重パッケージングされる。
・最後に、TEMDに滅菌工程を実施し、これは好ましくはエチレンオキシド処理によって実現される。エチレンオキシドは水と反応し得るので、産物が凍結乾燥されているならば、これはより容易である。代替の滅菌処理はエタノール処理が挙げられる。しかしながら、このより侵襲性である処理方式は、材料損傷をより起こす可能性がある。
複数の品質管理工程がTEMDの作製プロセス中に実施される。したがって、本発明のさらなる態様によれば、TEMDの作製のための方法は、以下の工程のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくはすべてを、さらに含む。
・ポリマー足場中のP4HBの含有量の測定:好ましくは、ポリマー足場中のP4HBの含有量は、20〜50%(w/w)、より好ましくは22〜45%、最も好ましくは24〜32%の範囲である。このために、PGAメッシュは、第1のコーティング工程の前に、次いで第1のコーティング工程の後または適用される場合には第2のコーティング工程の後に計量され、2つの重量は互いに比較される。
・第1のコーティング工程中、次いで適用される場合には、第2のコーティング工程中にも、メッシュ上でのP4HBの均一な沈着を確実にすること:これは、各々のコーティング工程中の目視管理によって確実にされる。
・好ましくは細胞同一性および/または増殖および/または生存力および/または無病原体に関して、ポリマー足場上に播種されるヒト細胞を検査すること:細胞同一性(表現型)は、様々な細胞表面マーカーによるFACS分析を使用して、好ましくはフローサイトメトリーにより検証される。判定基準としては、少なくとも80%のCD90陽性およびCD26陽性の細胞ならびに5%以下のCD90陰性およびCD31陽性の細胞の含有量が挙げられるがこれに限定されない。FACS分析の代わりに、マイクロアレイを使用することができる。
・生存力および増殖:これは倍加時間の測定によって検証される。好ましくは、倍加時間は100時間未満である。ポリマー足場上に播種するために使用される細胞の好ましい最大の継代数は、第三継代細胞(P3)である。
・さらに、細胞は病原体が無いことが検証されなくてはならない(検出限界(LOD)未満)。
・細胞懸濁液の調製中の凝固時間の管理:これは、好ましくはゲル化剤の量の調節によって実施される。トロンビンおよびフィブリノーゲンの組み合わせを使用する場合に、1:1の比が好ましい(単位:mg)。凝固時間のための判定基準は好ましくは5〜8分間である。
・ポリマー足場上に播種されるヒト細胞数の管理:播種される細胞の好ましい数は、ポリマー足場表面面積の1cm2あたり200万〜400万細胞の間、好ましくは1cm2あたり230万〜330万細胞の間であること。
・ポリマー足場へのヒト細胞の均一な塗布の管理:これは、目視管理によって実施される。
・バイオリアクター段階中の培地組成の管理(以下参照):ビタミンC含有量は、好ましくは培地中で0.0225%(v/v)である。バイオリアクター中の培地の好ましい組成は、以下の通りである。A−DMEM(改良型ダルベッコ改変イーグル培地)500ml、ウシ胎仔血清(FBS)50ml(すなわち、9%(v/v))、Glutamax(200mM)5ml(すなわち、1.8mM)、ゲンタマイシン(10mg/ml)0.5ml(すなわち、0.009mg/ml)、ビタミンC(20%)0.63ml(すなわち、0.225%(v/v))。
・バイオリアクター段階中の細胞性能の管理:乳酸は、バイオリアクター段階中の細胞性能のための好ましいマーカーとして使用される。このために、乳酸値は各々の培地交換時に管理される。乳酸値は、第1の培地交換時に少なくとも1.5mmol/l、第2の培地交換時に少なくとも2.5mmol/l、第3の培地交換時に少なくとも3.0mmol/l、第4および第5の培地交換時に少なくとも3.5mmol/lであるべきである。
・バイオリアクター段階中のECM形成の管理:バイオリアクター段階中のECM形成は、例えば質量分析(MassSpec)によって検証される。ヒトプロコラーゲンI型のC末端プロペプチドは、ECM作製中に分離され、細胞によって培地の中へ放出される。したがって、このプロペプチドはバイオリアクター段階中の培地中で検出され、ECM形成の好適なマーカーとして使用することができる。
さらに、好ましくは完成したTEMD、すなわち最終産物に、以下の工程のうちの少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくはすべてを含む品質管理を実施する。
・滅菌性の検証:対象とするレシピエント患者へのTEMDの移植は、滅菌条件下で実施されなくてはならない。特定のバッチからのTEMDサンプルの滅菌状態は、作製プロセスの中の滅菌が信頼でき再現性があることが検証される。
・エンドトキシン含有量の測定:エンドトキシンの量についての判定基準は<0.29EU/mlであり、それは、<0.29EU/パッチ(「EU」=エンドトキシン単位、「パッチ」=直径8mmおよび面積0.5cm2の生検パンチ)に相当する。エンドトキシンは、細菌の外側細胞膜の熱安定性構成要素である。最終産物中のエンドトキシンの存在はプロセス中の細菌汚染についての指標であり、臨床試験において患者の健康を危険にさらす。この試験は、最終産物中において、いずれのかかる細菌性残余物も存在しないことを検証するためにその実施が決定されている。
・マイコプラズマ含有量の測定:マイコプラズマは、細胞培養中に汚染物質として出現し得る非常に小さな細菌である。マイコプラズマは光学顕微鏡検査によって検出不可能であり、場合によっては標準抗生物質に対して耐性があるため、それらは多くの場合検出されないままになり、それぞれの細胞培養の増殖に影響を及ぼしたり悪化させたりすることがある。TEMDの播種のために使用されるヒト細胞培養のマイコプラズマ汚染は、最終産物の汚染をも導き得る。作製プロセスが信頼すべきものであり、いずれのかかる汚染も再現性良く無いこと(検出限界未満(LOD))を検証するために、導管サンプルは、マイコプラズマの存在について定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によって試験される。qPCRのLODは、1血管移植片あたり1000GCマイコプラズマDNA濃度としてヨーロッパ薬局方2.6.7中に記載されている。
・残留DNA含有量の測定:TEMD上に残存するDNAは、対象とするレシピエントにとって健康に危険、または生命を脅かすことさえあり得る。DNAの除去が信頼できて再現性のあるように実施されることを検証するために、異なるバッチの導管サンプル中のDNA含有量はqPCRによって測定される。したがって、残留DNA含有量についての好ましい判定基準は、mg乾燥重量あたり50ng dsDNA未満である。
・残留水分含有量の測定:加水分解を防止し、したがって最終産物の保存可能期間を延ばすために、TEMDは脱細胞化工程後に凍結乾燥される(冷凍乾燥される)。異なるバッチのTEMDサンプル中の水分含有量の測定は、作製プロセスにおける凍結乾燥が信頼でき再現性があることを検証するために実行される。好ましくは、残留水分含有量は5%未満である。
・ポリマー含有量の測定:ポリマー分析は、ポリマーの含有量、比、および/または分子サイズ(鎖長)が、本発明による方法によって作製されたTEMDの様々なバッチにわたって一定かどうか測定することを可能にする。好ましくは、完成した脱細胞化TEMDは、20〜75%(w/w)のP4HB、より好ましくは30〜60%のP4HB、最も好ましくは40〜50%(w/w)のP4HBの含有量、および好ましくは0〜30%のPGA、より好ましくは10〜20%のPGA、最も好ましくは15〜18%のPGA、の含有量を有する。
・ヒドロキシプロリン含有量の測定:コラーゲンは、本発明による最終的なTEMDのECM組織における重要な構造構成要素である。他のタンパク質とは異なって、コラーゲンはアミノ酸であるヒドロキシプロリン(HYP)を含有する。したがって、コラーゲン含有量は、様々なバッチのTEMD中のHYP含有量の定量化によって測定することができる。これは、様々なバッチにわたる作製プロセス間の信頼でき再現性のあるECM作製を保証するはずである。ヒドロキシプロリン含有量についての好ましい判定基準は、5μg/mgを超えるものである。
・様々なECMマーカータンパク質によるタンパク質含有量の測定であって、好ましくはフィブロネクチン、コラーゲンα−2(I)鎖、コラーゲンα−2(VI)鎖のタンパク質の含有量が測定される。さらに、好ましくは、様々な脱細胞(decell)マーカーのタンパク質含有量が測定され、それは好ましくはスーパーオキシドジスムターゼ、60S酸性リボソームタンパク質P2、インテグリンα5である。最終的なTEMD産物は、タンパク質の特徴的な分布を含む。必要とするおよび/または必要としないタンパク質は、ペプチドの質量分析(LC−MS/MS)および特定の基準ペプチドの使用によって定量化される。必要とするタンパク質、すなわちECMマーカーの検出は、3つの非常に豊富なタンパク質であるフィブロネクチン、コラーゲンα−2(I)鎖、コラーゲンα−2(VI)鎖のペプチドフラグメントの測定によって代表的には行われる。この測定手段によって、これらの構造的ECMタンパク質の含有量は、TEMDの種々のバッチにわたって一定で再現性があることが検証される。前記ECMタンパク質の含有量の判定基準は、以下の通りである:フィブロネクチンの含有量は少なくとも100fmol/μg、および/またはコラーゲンα−2(I)鎖の含有量は少なくとも200fmol/μg、および/またはコラーゲンα−2(VI)鎖の含有量は少なくとも5fmol/μg。
必要としないタンパク質、すなわち脱細胞マーカーの含有量は、スーパーオキシドジスムターゼ、60S酸性リボソームタンパク質P2、インテグリンα−5の代表的な非ECMタンパク質および/またはそれらのペプチドフラグメントの定量化により測定される。この測定において、これらのタンパク質の含有量は特定の閾値未満であるはずであり、これによって脱細胞化が達成されたことが示される。これにより、一定で再現性のある脱細胞化を検証することができる。前記脱細胞マーカータンパク質の含有量の判定基準は、以下の通りである:スーパーオキシドジスムターゼの含有量は3fmol/μg未満、好ましくは2fmol/μg未満、および/または60S酸性リボソームタンパク質P2の含有量は3fmol/μg未満、好ましくは2fmol/μg未満、および/またはインテグリンα−5の含有量は3fmol/μg未満、好ましくは2fmol/μg未満。
細胞の単離および増殖:
ヒト臍帯(n=3)を、チューリッヒの州倫理委員会(スイス)[KEK−ZH−2009−0095]に基づくインフォームドコンセントにより満期産後に採取し、確立されたプロトコール(非特許文献13)に従って、静脈線維芽細胞の単離のために処理した。臍帯静脈を外科的に単離し、解剖用はさみを使用して小さな組織片を切り取った。組織片を滅菌ペトリディッシュ上に置き、30±5分間放置して底部へ接着させた。培養培地を穏やかに添加し、3日目または4日目毎に変えた。単離細胞の第1の増殖のために使用した好ましい培地組成は、以下の通りである:A−DMEM(改良型ダルベッコ改変イーグル培地)500ml、ウシ胎仔血清(FBS)50ml、Glutamax(200mM)5ml、ゲンタマイシン(10mg/ml)1.25ml。37℃で5%CO2の加湿インキュベーター条件下でおよそ1〜2週間のインキュベーションした後、最初の細胞増生後に、組織片を除去した。
図2は、本発明の第1の例示的実施態様に記載の血管移植片(または、それに/その中に接合した弁移植片を含む血管移植片)の作製に関し、第2のコーティング工程だけでなく第1のコーティング工程(図示されない)後の管状ポリマー足場の形成と融着、およびマウント上への管状ポリマー足場の固定を示す。足場基質(足場パッチ)を、不織ポリグリコール酸(PGA)メッシュ(比重60〜80mg/cm3;Confluent Medical Technologies、Warkwick、米国)で製作した。使用足場パッチは、元は6cm×9cmの長方形形状を有していた。各々のPGAメッシュを、規定された2工程の手順でコーティングした。最初に、PGAメッシュを、P4HB(非極性溶媒テトラヒドロフラン(シグマ アルドリッチ、スイス)の低パーセンテージ溶液の溶液中1%のポリ−4−ヒドロキシ酪酸(P4HB;TEPHA,Inc.、米国))中に浸漬し、数時間の空気乾燥によって溶媒を蒸発させた。次に、必要とする寸法、すなわち放射状直径1.6cmの金属製円筒の周囲にメッシュを巻き、PGAメッシュを管形状にした。コーティングされたPGAメッシュの重なり部/辺縁部を、はんだごてを使用して80℃へ加熱し融合した。次いで管を保持デバイス上に取り付け、複数の工程にわたり噴霧デバイス(エアブラシピストル)を使用し、外側にP4HBの低パーセンテージ溶液(テトラヒドロフラン中で2%)をコーティングした。第2のコーティング工程後に、管状ポリマー足場を長さ8cmに縮めた(後のバイオリアクター中での設置に使用される保持デバイスのサイズへ、管状ポリマー足場のサイズを適合させるため)。ポリマー足場の最終組成、すなわちPGA対P4HBの比を、P4HBによるコーティングの前後にポリマー足場を計量し決定した。
ポリマー足場のプレインキュベーション/平衡化後に、単離されたヒト線維芽細胞を、220万〜330万の細胞/cm2の密度で、足場の上へ播種した。
次いで、播種されたポリマー足場をバイオリアクター中の保持デバイス上に置き、アスコルビン酸(ビタミンC)の添加によって富化した上述と同じ細胞培養培地中で、次の21±4日にわたって漸増的強度のパルス流動にさらした。バイオリアクター段階中のコンディショニングは、すべての種類のTEMDの作製に適用可能である。
インキュベーション後に、実施例1のTEVGを脱細胞化した。脱細胞化中、以下のように構成される洗浄溶液を使用して、細胞を溶解し、除去した。
図6に、凍結乾燥のための好ましいプログラムを図示する。このプログラムは、例えば結晶形成に起因する材料の損傷を防止する。最終的な産物を滅菌バッグ中に二重パッケージングし、外部の会社(QMedics)においてエチレンオキシド処理により滅菌した。この凍結乾燥工程は他のタイプのTEMDの作製にも適用可能である。
最終産物、すなわち脱細胞化され、凍結乾燥および滅菌されたTEVGに、以下の工程に基づき品質管理を行った:滅菌性の検証;エンドトキシン含有量の検証;マイコプラズマ含有量の検証;残留DNAの検証;残留水分含有量の検証;ポリマー含有量の検証;ヒドロキシプロリン含有量の検証;タンパク質含有量の検証:フィブロネクチン、コラーゲンα−2(I)鎖、コラーゲンα−2(VI)鎖、脱細胞マーカー(スーパーオキシドジスムターゼ、60S酸性リボソームタンパク質P2、インテグリンα5);顕微鏡分析による厚さの測定(乾燥したもの/水で戻したもの);縫合糸保持力試験;引張強さ試験。これらの品質管理工程は他のタイプのTEMDの作製にも適用可能である。
実施例1のTEVGの移植は、縫合結紮によってIVC(下大静脈)および肺動脈へ吻合することによって実施される。縫合糸の機械的安定性したがって安全性を評価するために、縫合糸保持力試験を実施した。このために、縫合糸(ポリプロピレン5/0縫合糸に相当する、直径0.14mmのステンレス鋼から作製された糸)を、デバイスの1つの壁を通して、水で戻したTEVGサンプルの端から2mm挿入して、半ループを形成させる(図8A参照)。縫合糸を100mm/分の速度で牽引し、デバイスを通して縫合糸を牽引するのに必要な力を記録した(機器は以下のものを使用した:ロードセル、インストロン、2530−437;万能試験機、インストロン、5944)。7つのTEVGの縫合糸保持の強度が測定され、デバイスを通して縫合糸を牽引するのに平均で0.82±0.25N(82gに相当する)の力を加えなければならなかった(図8B参照)。上述の機械的安定性の評価は他のタイプのTEMDの作製にも適用可能である。
本発明の第2の例示的な実施態様に基づいて、三尖弁足場を不織PGAメッシュから作製し、連続縫合によってニチノール製洞ステントの中へ最終的に組み込んだ(図20中で示すように)。PGA足場を1%P4HBでコーティングし、一晩乾燥し、EtOH、Pen−Strep(ペニシリン−ストレプトマイシン;10’000U/ml)、およびアムホテリシンにより滅菌した。最終的に、PGA足場を、1%Pen−Strep溶液、1%Glutamax、10%FBSおよびビタミンC130mg(500mlあたり)を補った改良型DMEMを含む最適化された増殖培地により37℃で一晩インキュベーションした。
本発明の第2の例示的な実施態様に基づいて、PGA足場を切断し(円形または条片)、1%P4HBでコーティングした。一晩乾燥後に、パッチを、金属ステンレス鋼リングの上へ縫合し(図21に示すように)、EtOH、Pen−Strep、およびアムホテリシンで滅菌した。次に、パッチを、1%Pen−Strep溶液、1%Glutamax、10%FBSおよびビタミンC130mg(500mlあたり)を補った改良型DMEMを含む、最適化された増殖培地により37℃で一晩インキュベーションした。その後、細胞担体としてフィブリンを使用して、ヒト皮膚線維芽細胞を、パッチの上へ播種した。播種後に、パッチを小さな培地ジャー中に置き、培地の分布を促進するために旋回振盪機を使用し、4週間培養した。パッチの作製のためにも、ビタミンCまたはTGF−βを培地中の任意の補足物として使用し、ECM作製を促進した。実施例1に記載のように、脱細胞化プロセスを実施した。
Claims (18)
- 組織工学医療デバイスの作製方法であって、以下の工程:
A.)ポリマー足場を提供する工程であって、前記ポリマー足場が、ポリグリコール酸を含む基質、およびポリ−4−ヒドロキシ酪酸を含むコーティングを含む、工程;
B.)単離および増殖された細胞を含有する細胞懸濁液を前記ポリマー足場へ塗布し、それによって播種されたポリマー足場を作製する工程;
C.)前記播種されたポリマー足場をバイオリアクター中に設置し、漸増的強度のパルス流動へさらすことによって機械的に刺激し、それによって細胞外マトリックスを含む組織工学医療デバイスを形成する工程;
D.)前記組織工学医療デバイスを導管スタビライザー上に取り付け、静的条件下で細胞培養培地中においてインキュベーションする工程;
E.)前記組織工学医療デバイスを界面活性剤を含む洗浄溶液中で脱細胞化する工程;
F.)前記組織工学医療デバイスをヌクレアーゼ処理する工程;
G.)前記組織工学医療デバイスをすすぐ工程、
を含む、方法。 - 工程A.)が、以下の工程:
ポリマー足場のための基質としてのポリグリコール酸を含むメッシュを提供する工程;
第1のコーティング工程において、ポリ−4−ヒドロキシ酪酸を含有する溶液で、好ましくは浸漬コーティングによって、前記メッシュをコーティングする工程;
好ましくはエチレンオキシド処理によって、前記ポリマー足場を滅菌する工程;および
好ましくは前記ポリマー足場を、細胞培養培地中で好ましくは12〜72時間インキュベーションする工程、
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。 - 前記組織工学医療デバイスが、血管移植片であり、前記第1のコーティング工程後かつ滅菌の前に、以下の工程:
前記コーティングされたメッシュを管へ成形し、好ましくははんだごてを使用して少なくとも60℃、好ましくは約80℃へ好ましくは加熱することによって、好ましくは前記メッシュの辺縁を固定し、それによって管状ポリマー足場を形成する工程;
第2のコーティング工程において、好ましくは噴霧コーティングによって、ポリ−4−ヒドロキシ酪酸を含有する溶液で、前記管状ポリマー足場を、好ましくは前記管の外側上だけに、コーティングする工程、
を含むことを特徴とする、請求項2に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。 - 工程B.)において、前記細胞懸濁液中に含有される前記細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、単核細胞および内皮前駆細胞からなる群から選択されるヒト細胞であり、前記細胞が、好ましくは骨髄、血液、脂肪組織、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯マトリックスおよび臍帯血からなる群から選択されるソースに由来し、前記細胞懸濁液中の前記細胞が、より好ましくはヒト線維芽細胞、最も好ましくはヒト臍帯静脈に由来するヒト線維芽細胞であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。
- 工程B.)において、単離および増殖された細胞を含有する前記細胞懸濁液が、前記管状ポリマー足場の内側表面へのみ塗布されることを特徴とする、請求項3に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。
- 工程B.)において、少なくとも50万〜500万細胞/cm2、好ましくは200万〜400万細胞/cm2、より好ましくは220万〜330万細胞/cm2が、前記ポリマー足場上に播種されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。
- 工程B.)において塗布される前記細胞懸濁液が、以下の工程:
好ましくは線維芽細胞、間葉系幹細胞、単核細胞および内皮前駆細胞からなる群から選択されるヒト細胞である前記細胞を単離する工程であって、前記細胞が好ましくは骨髄、血液、脂肪組織、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯マトリックス、臍帯血からなる群から選択されるソースに由来し、最も好ましくは前記細胞がヒト臍帯静脈に由来するヒト線維芽細胞である、工程;
前記単離細胞を好ましくは少なくとも1つの培養容器中で5〜8日間増殖させる工程;
前記単離細胞を採取する工程;
好ましくはゲル化剤を含む、より好ましくはフィブリノーゲンおよび精製トロンビンを含む細胞担体溶液を前記単離細胞に添加することによって、細胞懸濁液を形成する工程であって、ここで好ましくは、精製フィブリノーゲンを前記単離細胞へ最初に添加し第1の細胞懸濁液を形成し、次いで、前記第1の細胞懸濁液に精製トロンビンを添加し、後に工程B.)における前記ポリマー足場への塗布に前記細胞懸濁液として供される第2の細胞懸濁液を形成することにより前記細胞懸濁液を形成する、工程、
のうちの少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、そして最も好ましくはすべてを含む方法によって調製されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。 - 前記方法が、前記組織工学医療デバイスをすすぐ工程後に、以下の工程:
前記組織工学医療デバイスを凍結乾燥する工程;
前記組織工学医療デバイスをパッケージングする工程;
前記組織工学医療デバイスを好ましくはエチレンオキシド処理によって滅菌する工程、
のうちの少なくとも1つ、より好ましくは2つ以上、そして最も好ましくはすべてを、さらに含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。 - 前記方法が、工程中の品質管理の以下の工程:
前記ポリマー足場中のP4HBの含有量を測定する工程であって、ここで、前記ポリマー足場中のP4HBの含有量の判定基準が、前記ポリマー足場中のP4HBの前記含有量が、5〜95%(w/w)、好ましくは20〜50%、より好ましくは22〜45%、最も好ましくは24〜32%の範囲内である、工程;
前記ポリマー足場の前記メッシュ上でのP4HBの均一な沈着を確実にする工程;
細胞同一性、増殖、生存率および無病原体に関して、前記ポリマー足場上に播種される細胞を播種の前に検査する工程;
前記細胞懸濁液の凝固時間を管理する工程;
前記ポリマー足場上に播種される前記細胞の数を管理する工程;
前記ポリマー足場への前記細胞の均一な塗布を管理する工程;
前記バイオリアクター中の培地組成を管理する工程;
前記バイオリアクター中の各々の培地交換時に乳酸値を管理する工程;
前記バイオリアクター中の細胞外マトリックスの形成を、好ましくは質量分析によって、好ましくは好適なマーカーとしてヒトプロコラーゲンI型のC末端プロペプチドを使用することによって、管理する工程、
のうちの1つまたは複数、好ましくはすべてをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。 - 前記ポリマー足場上に播種される前記細胞の、播種前の前記品質管理中に、前記細胞同一性がフローサイトメトリーにより測定され、および/または、増殖能が倍加時間の測定によって求められ、前記倍加時間についての好ましい判定基準が100時間未満である、請求項9に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。
- 前記方法が、少なくとも1つの、前記完成した組織工学医療デバイスの品質管理の工程をさらに含むことを特徴とする方法であって、ここで、前記完成した組織工学医療デバイスに対して、以下の品質管理の工程:
滅菌性を検証する工程;
エンドトキシン含有量を測定する工程;
マイコプラズマ含有量を測定する工程;
残留DNA含有量を測定する工程;
残留水分含有量を測定する工程;
ポリマー含有量を測定する工程;
ヒドロキシプロリン含有量を測定する工程;
タンパク質含有量測定する工程であって、好ましくは細胞外マトリックスタンパク質、より好ましくはフィブロネクチン、コラーゲンα−2(I)鎖、コラーゲンα−2(VI)鎖からなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも1つの含有量の測定によって;および/または、脱細胞マーカータンパク質、より好ましくはスーパーオキシドジスムターゼ、60S酸性リボソームタンパク質P2、インテグリンα5からなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも1つの含有量の測定によって行われる、工程;
好ましくは光学的分析によって、好ましくは顕微鏡分析によって、好ましくは乾燥形態および/または水で戻した形態で、厚さを測定する工程であって、ここで、前記脱細胞化された組織工学医療デバイスの厚さのための判定基準が、好ましくは乾燥形態で0.1〜20mm、好ましくは乾燥形態で0.1〜0.6mmおよび/または水で戻した形態で0.15〜25mm、好ましくは水で戻した形態で0.15〜0.7mmの範囲、より好ましくは乾燥形態で0.3〜0.4μmおよび/または水で戻した形態で0.35〜0.5mmの範囲である、工程;
縫合糸保持力試験の工程であって、ここで、好ましくは判定基準が、前記組織工学医療デバイスが0.5Nを超えて耐えることである、工程;
引張強さ試験の工程であって、ここで、好ましくは判定基準が、前記組織工学医療デバイスが0.5MPaを超えて耐えることである、工程;
破壊圧力試験の工程であって、ここで、好ましくは判定基準が、前記組織工学医療デバイスが150mmHgを超える圧力に耐えることである、工程;
のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくはすべてが実施される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの作製方法。 - 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法によって作製された、組織工学医療デバイス。
- 前記組織工学医療デバイスが、血管移植片、弁移植片、または組織パッチを含む群から選択されることを特徴とする、請求項12に記載の組織工学医療デバイス。
- 組織工学医療デバイスであって、好ましくは請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法によって作製され、前記組織工学医療デバイスが、P4HBを含有するコーティングを含むPGAメッシュを含むポリマー足場、および前記ポリマー足場上に成長した細胞外マトリックスを含有するということ、ならびに、前記組織工学医療デバイスが、以下の特色:
0.29EU/ml未満のエンドトキシン含有量;
検出限界未満のマイコプラズマ含有量;
mg乾燥重量あたり50ng dsDNA未満の残留DNA含有量;
5%未満の残留水分含有量;
0〜30%のPGA含有量および30〜75%(w/w)のP4HB含有量;
5μg/mgを超えるヒドロキシプロリン含有量;
少なくとも100fmol/μgのフィブロネクチン含有量、および/もしくは少なくとも200fmol/μgのコラーゲンα−2(I)鎖の含有量、および/もしくは少なくとも5fmol/μgのコラーゲンα−2(VI)鎖の含有量;ならびに/または3fmol/μg未満のスーパーオキシドジスムターゼの含有量、および/もしくは3fmol/μg未満の60S酸性リボソームタンパク質P2の含有量、および/もしくは3fmol/μg未満のインテグリンα−5の含有量;、
0.15〜700μmの厚さ;
少なくとも0.5Nの縫合糸保持力;
少なくとも0.5MPaの引張強さ;
150mmHgを超える破壊圧力、
のうちの1つまたは複数、好ましくはすべてを含むということを特徴とする、前記医療デバイス。 - ヒトまたは動物の患者における心血管の置換移植片としての、好ましくは大静脈肺動脈吻合術のための置換物としての、好ましくは左心低形成症候群の有るヒト小児患者における、請求項12〜14のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの使用。
- 請求項12〜14のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイスの、心血管系の欠陥の有る、ヒトまたは動物の患者における、好ましくはヒト小児患者における、心臓弁としてのまたはパッチとしての請求項15に記載の使用。
- ヒトまたは動物の身体の、好ましくはヒト小児患者の、心血管性疾患の治療における使用のための、請求項12〜14のいずれか一項に記載の組織工学医療デバイス。
- ヒトまたは動物の患者における大静脈肺動脈結合の欠陥の治療における、好ましくはヒト小児患者における左心低形成症候群の治療における使用のための、請求項17に記載の組織工学医療デバイス。
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