BR112020004090A2

BR112020004090A2 - método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, dispositivo médico de engenharia de tecidos e uso do dispositivo médico de engenharia de tecidos

Info

Publication number: BR112020004090A2
Application number: BR112020004090-8A
Authority: BR
Inventors: Simon P. Hoerstrup; Maximilian Y. Emmert; Frank Baaijens; Anita Driessen-Mol
Original assignee: Universität Zürich
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2020-10-13
Also published as: AU2018326326A1; CA3074536A1; EP3678714A1; ES2943332T3; PL3678714T3; US20210060208A1; CN111050813A; AU2018326326B2; DK3678714T3; EP3678714B1; JP2020532397A; US11684697B2; CN111050813B; PT3678714T; WO2019042961A1; JP7209377B2

Abstract

A presente invenção refere-se a um dispositivo médico de engenharia de tecidos, bem como a um método para a produção do referido dispositivo médico, compreendendo as seguintes etapas: fornecer uma estrutura polimérica compreendendo uma malha compreendendo ácido poliglicólico e um revestimento compreendendo poli-4-hidroxibutirato; aplicação de uma suspensão de células contendo preferencialmente células humanas à estrutura polimérica; colocação da estrutura polimérica semeada em um biorreator e estimulação mecânica por exposição a um fluxo pulsátil de intensidade incremental, formando assim uma matriz extracelular; montagem do enxerto em um estabilizador de conduto e incubação em meio de cultura celular; descelularização do enxerto numa solução de lavagem; tratamento de nuclease do enxerto; e enxágue do enxerto. A invenção compreende ainda e várias etapas do controle de qualidade do dispositivo médico de engenharia de tecidos.

Description

“MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM DISPOSITIVO MÉDICO DE ENGENHARIA DE TECIDOS, DISPOSITIVO MÉDICO DE ENGENHARIA DE TECIDOS E USO DO DISPOSITIVO MÉDICO DE ENGENHARIA DE TECIDOS” Domínio técnico

[0001] A presente invenção refere-se à produção de um dispositivo médico manipulado por tecidos para uso em aplicações terapêuticas, como intervenções de substituição de tecidos, especialmente para aplicações cardiovasculares. O dispositivo médico compreende uma estrutura híbrida de uma estrutura sintética biodegradável e uma matriz extracelular manipulada por tecidos cultivada a partir de células humanas ou animais.

Técnica anterior

[0002] Construções com engenharia de tecidos são úteis como próteses no reparo ou substituição de tecidos ou órgãos danificados. Na cirurgia cardiovascular, há uma grande demanda por enxertos, adesivos e válvulas para substituir tecidos defeituosos devido a distúrbios congênitos ou, por exemplo, calcificação e degeneração. Os materiais atualmente utilizados para reparo de tecidos moles são enxertos sintéticos não degradáveis ou tecidos fixados de origem alo- /xenogênica e, portanto, inerentemente associados à degeneração disfuncional progressiva, ao risco de transmissão de doenças e à falta de capacidade regenerativa. Esses inconvenientes limitam seu uso mais amplo em populações de pacientes mais jovens ou requerem várias reoperações. As construções de polímero sintético não degradável trazem o risco de infecção, calcificação ou inflamação após o implante. Polímeros sintéticos degradáveis têm sido amplamente utilizados como estruturas de cultura de tecidos;

no entanto, fragmentos de polímeros degradáveis podem causar reações inflamatórias. Alternativamente, estruturas de géis ou malhas de colágeno não humano (por exemplo, bovino ou murino) demonstram resistência limitada à tração e acarretam o risco de contaminação ou reações imunogênicas após O implante em um paciente humano.

[0003] As matrizes de ancoragens biodegradáveis são usadas para formar a base de qualquer abordagem de engenharia de tecidos in vitro, agindo como uma matriz temporária para proliferação celular e deposição da matriz extracelular até que a estrutura seja substituída pelo novo tecido. Enquanto o substituto vivo projetado se desenvolve, a estrutura biocompatível deve se degradar idealmente sem deixar restos no corpo. O PGA é mais comumente usado porque se degrada em um momento previsível e se transforma em componentes biocompatíveis (geralmente). Além disso, a alta porosidade das malhas de PGA permite uma boa difusão, neovascularização e infiltração celular ?, Infelizmente, as malhas de PGA são biodegradadas rapidamente em poucas semanas e, portanto, não podem suportar forças mecânicas exercidas sobre os materiais ou orientar a forma da construção de bioengenharia por períodos de cultivo mais longos **. Como resultado, polímeros híbridos foram projetados para combinar a memória de forma e a estabilidade mecânica de polímeros de degradação lenta com as propriedades de degradação rápida de polímeros, como o PGA º, Por exemplo, combinações de PGA com polímeros como (poli- 4-hidroxibutirato) P4HB, PLA ou PGA foram exploradas [*'] Diferentemente do PGA, que é sintetizado quimicamente, o P4HB é produzido naturalmente por microrganismos, o que dificulta sua síntese '. Após a implantação no corpo, o P4HB se degrada principalmente por hidrólise produzindo 4HB, um componente normal do corpo dos mamíferos *. Em 1998 Shinoka et al. relataram o implante cirúrgico de enxertos vasculares manipulados por tecidos em cordeiros, nos quais foram construídas ancoragens a partir de células autólogas semeadas em enxertos de PGA *.

[0004] Para a engenharia de válvulas cardíacas e de tecidos vasculares, o uso de malhas de PGA revestidas com P4HB, ou seja, a combinação da característica termoplástica de P4HB com a alta porosidade das malhas de PGA, tem sido investigada intensivamente, com resultados promissores in vitro e em estudos pré-clínicos 12 Em 2006, Hoerstrup et al. forneceram a primeira evidência de artérias pulmonares funcionais e vivas projetadas a partir de células vasculares semeadas em ancoragens de PGA/P4HB em um modelo de cordeiro em crescimento *.

[0005] Embora tentativas preliminares com enxertos xenogênicos e alogênicos descelularizados tenham demonstrado apenas um repovoamento limitado de células hospedeiras em ensaios pré-clínicos e clínicos, o conceito de válvulas cardíacas com engenharia de tecidos, vivas e autólogas com capacidade de autorreparo e remodelação foi proposto como uma alternativa promissora para superar tais limitações.

[0006] Seguindo a abordagem da engenharia de tecidos in vitro, a fabricação bem-sucedida de substituições cardiovasculares vivas autólogas semelhantes às suas contrapartes nativas depende de três elementos principais: 1) células autólogas que se assemelham a suas contrapartes nativas em termos de fenótipo e funcionalidade, 2) uma matriz temporária suportada biocompatível que promove a força do tecido até que a matriz extracelular produzida pelas células autólogas garanta a funcionalidade por si só; e 3) condições de cultura que permitam a formação e a maturação do tecido por condições in vitro semelhantes a um ambiente fisiológico, ou seja, estímulos adequados bioquímicos (por exemplo, fatores de crescimento) e físicos (por exemplo, carregamento mecânico cíclico) que apoiem a formação de tecidos in vitro e in situ. No entanto, esse conceito “clássico” de engenharia de tecidos, que compreende procedimentos complexos de várias etapas, como cultura de células, expansão celular, semeadura em ancoragens, cultura de biorreator in vitro e coordenação de implantação com tempo crítico dos delicados enxertos autólogos projetados vivos exige intensos esforços logísticos e financeiros.

[0007] Além de alguns estudos-piloto ocasionais baseados em válvulas cardíacas descelularizadas 14,15, nenhuma evidência sistêmica de que o conceito de manipulação de tecidos de válvulas cardíacas possa ser aplicado na rotina clínica foi relatada até o momento.

[0008] O documento EP 1 315 796 divulga a produção de uma artéria com engenharia de tecidos a partir de células que são semeadas e cultivadas em estruturas de polímeros degradáveis (ver também *º). No entanto, aqui é necessária uma biópsia do destinatário pretendido do vaso autólogo.

[0009] Portanto, é desejável fornecer um método para produzir um grande número de dispositivos médicos de engenharia de tecidos disponíveis no mercado, especialmente enxertos cardiovasculares, que não requerem biópsia humana ou animal do destinatário pretendido como material inicial, mas baseiam-se em uma fonte de células humanas ou animais homólogas, segura, estabelecida, controlada e abundantemente disponível. Vantajosamente, o dispositivo médico projetado para engenharia de tecidos deve ter um prazo de validade prolongado e deve estar disponível em uma grande variedade de tamanhos e formas. O produto previsto deve ser, de preferência, completamente biodegradável, permitir o repovoamento rápido pelas células do hospedeiro para chegar a um tecido semelhante ao nativo, permitir a capacidade de autorreparo e regeneração e, principalmente, ser passível de crescimento somático. Sumário da invenção

[0010] A presente invenção propõe uma abordagem inovadora de produção de matrizes homólogas descelularizadas com engenharia de tecidos como substitutas de tecidos, especialmente para aplicações cardiovasculares, em que o método sugerido supera as desvantagens da técnica anterior, na medida em que simplifica e reduz o processo de produção, possibilitando a disponibilidade de prateleira e reprodutibilidade e na medida em que minimiza o risco de infecção ou inflamação e reações imunológicas após OO implante. Produção da estrutura:

[0011] A invenção refere-se a um método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos (TEMD), compreendendo as seguintes etapas: - Primeiro, um substrato, preferencialmente uma malha compreendendo ácido poliglicólico (PGA), preferencialmente uma malha de PGA não tecida, é fornecida como material de partida para uma estrutura polimérica. Materiais alternativos são possíveis desde que ofereçam uma estrutura porosa comparável, necessária para o crescimento celular suficiente.

Possivelmente, uma malha de PGA compreendendo ainda ácido polilático (PLA) também pode atender a esses requisitos. - Em uma primeira etapa de revestimento, a malha, de preferência uma malha de PGA não tecida, é revestida com uma primeira solução de revestimento contendo poli-4- hidroxibutirato (P4HB), que é um tipo de poli- hidroxialcanoato (PHA). De preferência, a primeira solução de revestimento é uma solução de P4HB de baixa porcentagem em um solvente apolar, como tetra-hidrofurano (THF), em que o teor de P4HB é preferencialmente 0,5% -2%, mais preferencialmente cerca de 1%. Esta primeira etapa de revestimento é preferencialmente conduzida por revestimento por imersão da malha na primeira solução de revestimento, no entanto, outros métodos de revestimento, como o spray de revestimento, são possíveis.

O P4HB biodegradável transmite estabilidade mecânica ao produto final (além da matriz extracelular, veja abaixo), necessária para suportar a pressão sanguínea logo após o implante, enquanto o PGA é degradado em grande medida já durante a fase do biorreator, conforme descrito abaixo.

O PLA pode servir como um revestimento alternativo da malha de PGA. - Após a primeira etapa de revestimento, a malha revestida é de preferência seca ao ar por várias horas para que oO solvente evapore. - Caso o dispositivo médico de engenharia de tecidos a ser produzido seja um enxerto vascular (ou um enxerto vascular que compreenda ainda uma válvula cardíaca de engenharia de tecidos cultivada nele), a malha revestida, após a primeira etapa de revestimento, é então moldada em um tubo ou cilindro oco. Para isso, a malha é preferencialmente enrolada em torno de um formador, por exemplo, um cilindro metálico com as dimensões necessárias. Subsequentemente, as áreas das arestas são fixadas, de preferência sobrepondo as duas arestas e aquecendo as arestas sobrepostas a ao menos 60 graus Celsius, preferencialmente a cerca de 80 graus Celsius, utilizando-se um ferro de solda, por exemplo. Assim, o próprio P4HB é usado como elemento de fusão, uma vez que é um termoplástico com um ponto de fusão de 60 graus. Isto traz a vantagem de que a estrutura é um polímero tubular composto inteiramente de substâncias biodegradáveis. Métodos alternativos para fixar as bordas do tubo ou cilindro oco incluem colagem, agulhamento e tecelagem, bem como ligação polimérica intermolecular. O diâmetro do tubo é variável e, portanto, ajustável de acordo com o vaso-alvo no qual o TEVG será implantado (em termos do tipo de vaso e tamanho do paciente), escolhendo diferentes tamanhos de porção da malha como material de partida. O diâmetro radial desejado da estrutura de polímero tubular é de 1,0-2,5 cm, mais preferencialmente 1,2-1,8 cm, mais preferencialmente cerca de 1,6 cm, como no caso de um enxerto para uma conexão cavopulmonar pediátrica.

- No caso de uma estrutura polimérica tubular, realiza-se uma segunda etapa de revestimento: Nesta segunda etapa de revestimento, a estrutura polimérica tubular é revestida com uma solução preferencialmente de baixa porcentagem contendo P4HB, preferencialmente com um teor de 1-3%. mais preferencialmente cerca de 2% de P4HB. De preferência, a estrutura polimérica tubular é revestida apenas no seu lado externo, que fica ao longo da superfície externa (capa) da estrutura polimérica tubular. Para este fim, a estrutura polimérica tubular é de preferência montada em um dispositivo de retenção. Esta segunda etapa de revestimento é realizada, de preferência, por revestimento por pulverização, de preferência com um dispositivo de pulverização, como uma pistola de aerógrafo. Esta etapa pode ser repetida várias vezes, de acordo com a espessura desejada do revestimento. De preferência, na segunda etapa de revestimento, o revestimento por pulverização da superfície externa da estrutura polimérica tubular é realizado três vezes. De preferência, o teor final de P4HB na estrutura polimérica tubular é de 5% - 95% (p/p) (% em peso), mais preferencialmente 20-50%, ainda mais preferencialmente 22-45% e mais preferencialmente 24-32% (p/p) (porcentagem em peso). O teor é determinado de preferência pesando a estrutura antes da primeira etapa de revestimento e, se aplicável, após a segunda etapa de revestimento. - Posteriormente (tubular ou não), após o revestimento, a estrutura polimérica é esterilizada, preferencialmente por tratamento com óxido de etileno. Tratamentos com álcool e/ou radiação podem ser escolhidos como etapas de esterilização adicionais ou alternativas. - Após o revestimento e a esterilização, a estrutura polimérica é preferencialmente incubada em meio de cultura de células, de preferência por 12-72 horas para fins de equilíbrio antes da semeadura, para facilitar a subsequente ligação celular.

[0012] Uma estrutura polimérica com a estrutura porosa desejada e exibindo as propriedades desejadas (conforme citado mais abaixo para controle de qualidade) pode ser obtida usando o método de produção e revestimento acima mencionado. Além disso, técnicas alternativas como fabricação aditiva usando os referidos polímeros e métodos como FDM (modelagem de deposição fundida) ou Melt Electro Writing podem ser usados para gerar estruturas poliméricas nas referidas dimensões com as respectivas propriedades estruturais e topográficas.

[0013] Uma matriz inicial na forma de uma estrutura polimérica de uma malha de PGA revestida com P4HB, de preferência produzida e revestida de acordo com as etapas mencionadas acima, também pode ser facilmente obtida, isto é, comprada “pronta para usar” e usada como substrato para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos. Isolamento, expansão e semeadura celular:

[0014] Na produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos de acordo com a presente invenção, aplica-se uma suspensão de células contendo células humanas isoladas e expandidas, isto é, semeadas na estrutura polimérica. A produção dessa suspensão de células, compreendendo as células e uma solução transportadora de células, será descrita mais adiante.

[0015] As células utilizadas para semeadura na estrutura polimérica são preferencialmente células humanas, preferencialmente selecionadas de um grupo que consiste em fibroblastos, miofibroblastos, células-tronco mesenquimais células mononucleares e células progenitoras endoteliais. As células humanas são de preferência derivadas de uma fonte selecionada de um grupo que consiste em: medula Óssea, sangue, tecido adiposo, líquido amniótico, vilosidades coriônicas, matriz do cordão umbilical, sangue do cordão umbilical. Mais preferencialmente, as células humanas utilizadas para semeadura na estrutura polimérica são fibroblastos humanos, mais preferencialmente fibroblastos humanos derivados da veia do cordão umbilical humano (tecido da veia). Fontes alternativas de fibroblastos incluem, sem limitação, prepúcio, derme, veia aórtica/safena, artéria periférica etc. (tipos de células adequados, especialmente vantajosos para a engenharia de tecidos de válvulas cardíacas, são listados em ")). Células de uma linha celular estabelecida também podem ser usadas.

[0016] Como alternativa às células humanas, células animais podem ser utilizadas a partir de fontes equivalentes de tecido para a produção da suspensão celular.

[0017] Preferencialmente pelo menos 80 milhões de células, preferencialmente 1100-130 milhões de células, mais preferencialmente 115 milhões +/- 12 milhões de células são semeadas na estrutura polimérica dentro de uma solução transportadora de células. A densidade preferida de células na estrutura polimérica é de 0,5-5 milhões de células/cmº, mais preferencialmente 2-4 milhões de células/cm, mais preferencialmente entre 2,2-3,3 milhões de células/cmº.

[0018] Como mencionado, é possível que as células sejam compradas, isto é, obtidas em uma forma já isolada. Se não forem obtidas ou adquiridas de outra fonte, o fornecimento de células para a semeadura da estrutura polimérica de preferência também fará parte do método de produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos (TEMD) de acordo com um aspecto adicional da invenção. Caso as células primeiro tenham que ser isoladas com o objetivo de semear a estrutura, o método de produção de um TEMD de acordo com a presente invenção compreenderá adicionalmente o isolamento de células humanas, preferencialmente selecionadas de um grupo que consiste em fibroblastos, células-tronco mesenquimais células mononucleares e células progenitoras endoteliais, em que as células humanas são preferencialmente derivadas de uma fonte selecionada de um grupo que consiste em: medula óssea, sangue, tecido adiposo, líquido amniótico, vilosidades coriônicas, derme, matriz do cordão umbilical, sangue do cordão umbilical; As células humanas usadas para semear a estrutura polimérica são preferencialmente selecionadas a partir de um grupo que consiste em: - fibroblastos, de preferência derivados de uma das veias do cordão umbilical humano (tecido da parede do vaso), derme, prepúcio, veia aórtica, veia safena ou artéria periférica; mais preferencialmente derivado da veia do cordão umbilical humano; - células-tronco mesenquimais, preferencialmente derivadas da medula Óssea, tecido adiposo, líquido amniótico, vilosidades coriônicas, matriz do cordão umbilical ou sangue do cordão umbilical; - células mononucleares, de preferência derivadas da medula óssea; - células progenitoras endoteliais, de preferência derivadas de sangue, líquido amniótico ou sangue do cordão umbilical; - miofibroblastos, de preferência derivados da aorta, veia do cordão umbilical ou de outro tecido do cordão umbilical (por exemplo, geleia de Wharton).

[0019] As células são selecionadas por meio seletivo e aderem a uma placa de cultura de tecidos. As células são identificadas por citometria de fluxo com marcadores adequados da superfície celular. As células são então deixadas a proliferar, em que um tempo de duplicação inferior a 100 horas serve como critério de controle de qualidade preferido, além da exigência de estarem livres de patógenos. De preferência, são utilizadas células homólogas. Diferentemente da abordagem autóloga, o processo de engenharia de tecidos é independente do paciente, e assim os bancos de células podem ser estabelecidos e as fontes celulares ideais são selecionadas.

[0020] Opcionalmente, um banco de células principal (MCB) pode ser formado expandindo células isoladas e criopreservando-as em alíquotas múltiplas e idênticas. No caso de isolamento de fibroblastos da veia do cordão umbilical, com uma biópsia do cordão umbilical, pode-se estabelecer um MCB que seja suficiente para produzir aproximadamente 700 TEMD disponíveis no mercado. No caso de um MCB, um banco de células de trabalho (WCB) pode ser derivado do MCB descongelando uma alíquota de células desejadas do MCB e cultivando e subsequentemente criopreservando as células em alíquotas múltiplas e idênticas para estabelecer um banco de células de trabalho.

[0021] Quer compradas, retiradas de uma linha celular consolidada ou isoladas no decurso da produção do TEMD de acordo com a presente invenção, as células isoladas são utilizadas para a produção de uma suspensão celular.

[0022] Em todo caso, as células humanas isoladas devem ser expandidas, preferencialmente em vasos de cultura, de preferência por 5-8 dias.

[0023] Preferencialmente, as células com um número de passagem baixo (preferencialmente antes de P5, mais preferencialmente antes de P3) são colhidas e usadas para semear na estrutura polimérica, a fim de minimizar o risco de perda do fenótipo diferenciado das células. Depois de atingir um número suficiente de células em cultura para semear 70-180 milhões de células, preferencialmente 100-130 milhões de células, mais preferencialmente cerca de 115 milhões de células por dispositivo médico (enxerto), as células humanas expandidas são colhidas. De preferência, entre 20x10º células/ml e 60x10º células/ml, mais preferencialmente entre 35x10º células/ml e 45x10º células/ml, e mais preferencialmente cerca de 41x10º células/ml são utilizadas para semear na estrutura polimérica.

[0024] As células cultivadas são usadas para formar uma suspensão celular adicionando uma solução transportadora celular, preferencialmente compreendendo um agente gelificante, às células humanas isoladas. A solução transportadora de células contém preferencialmente trombina purificada e fibrinogênio purificado. De preferência, a suspensão de células é formada pela primeira adição de fibrinogênio purificado às células humanas isoladas para formar uma primeira suspensão de células e, em uma segunda etapa, a adição de trombina purificada à primeira suspensão de células para formar uma segunda suspensão de células para semeadura na estrutura polimérica. Imediatamente após a adição de trombina, ocorre a coagulação, que resulta em uma ligação das células à estrutura polimérica. O tempo de coagulação preferido da suspensão de células após a adição da solução transportadora de células é de 5 a 8 minutos, o qual é preferencialmente controlado antes da semeadura da suspensão de células na estrutura polimérica.

[0025] No caso de uma estrutura polimérica tubular, como para a produção de um enxerto vascular modificado por tecido, de preferência, a suspensão celular, cuja produção é descrita abaixo, é aplicada/semeada apenas em uma superfície interna da estrutura polimérica tubular. Para este fim, as células são semeadas de maneira homogênea ao longo da superfície interna da estrutura polimérica tubular, que é formada como um cilindro oco, resultando em uma distribuição homóloga da suspensão de células no substrato. Uma semeadura homóloga das células também pode ser alcançada, na medida em que a estrutura polimérica tubular é temporariamente vedada nas extremidades abertas, preenchida com uma suspensão de células e subsequentemente rotacionada em um recipiente cilíndrico preenchido com meio de cultura de células.

[0026] Após a semeadura e antes da incubação no biorreator, a estrutura polimérica semeada é preferencialmente incubada em condições estáticas por 12-48 horas, mais preferencialmente por 16-24 horas, no mesmo meio de cultura de células que na fase de biorreator, como mencionado abaixo. Fase do biorreator:

[0027] Após semear a suspensão de células na estrutura polimérica, o método de produção de um TEMD de acordo com a presente invenção compreende as seguintes etapas: - A estrutura polimérica semeada é colocada em um biorreator e estimulada mecanicamente pela exposição a um fluxo pulsátil de intensidade incremental. De preferência, a estimulação mecânica durante esta “etapa de condicionamento” é realizada por 10 a 30 dias, preferencialmente por 15 a 25 dias, mais preferencialmente por 16 a 20 dias. Se a duração da permanência no biorreator for muito curta, será desenvolvido tecido insuficiente; se a duração da permanência for longa demais, o conduto começará a se contrair (controle visual). De preferência, o meio de cultura contém ácido ascórbico, ou seja, vitamina C, preferencialmente cerca de 0,0225% v/v (volume/volume), em que mais preferencialmente, o meio de cultura no biorreator é o mesmo meio de cultura usado durante a expansão celular, com a exceção de que o ácido ascórbico terá sido adicionado. De acordo com uma modalidade preferida do método da invenção, o meio de cultura dentro do biorreator é alterado em intervalos definidos, preferencialmente duas vezes por semana. O resultado dessa fase do biorreator, na qual a estrutura semeada é treinada ou condicionada para suportar condições fisiológicas, é o dispositivo médico inventado por engenharia de tecidos. Durante a presença do TEMD no biorreator, uma matriz extracelular (MEC) é formada. O desempenho celular e, portanto, a formação de ECM no TEMD são monitorados durante a fase do biorreator. Para isto, conforme listado abaixo, os valores de composição do meio e lactato são controlados.

- Subsequentemente, o TEMD é removido do biorreator.

- Após a remoção do TEMD do biorreator, o TEMD é montado em um estabilizador. No caso de um TEMD baseado em uma estrutura polimérica tubular, o estabilizador é um estabilizador de conduto que preferencialmente tem uma forma cilíndrica. Durante a fase do biorreator, o TEMD tem tendência a se contrair, provavelmente devido à formação de MEC. A montagem no estabilizador é, portanto, útil para restabelecer a forma original do TEMD após uma possível “contração” durante a fase de condicionamento no biorreator.

O TEMD é então incubado, preferencialmente enquanto no estabilizador, sob condições estáticas, preferencialmente por 12-36 horas, em meio de cultura de células, em que o meio de cultura de células tem preferencialmente a mesma composição que no biorreator. Descelularização, tratamento com nuclease e lavagem: - Após a remodelagem, o TEMD é descelularizado. Durante a descelularização, as células são lisadas e removidas usando uma solução de lavagem compreendendo um detergente, como por exemplo Triton-X. De preferência, a solução de lavagem contém solução salina tamponada com fosfato (PBS), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), Triton X-100 e desoxicolato de sódio. Mais preferencialmente, a solução de lavagem contém PBS, EDTA 0,68 mM, Triton X-100 a 0,25% (v/v) e desoxicolato de sódio a 0,25% (p/p). A estringência da solução de lavagem é escolhida de maneira que os componentes celulares solúveis e indesejados sejam removidos enquanto a matriz extracelular que foi gerada pelas células durante a fase do biorreator é preservada. - Posteriormente, o TEMD é submetido a um tratamento de nuclease. Essa digestão enzimática serve para remover o DNA do TEMD. Para este fim, uma endonuclease ou uma exonuclease pode ser usada. De preferência, a benzonase é usada para a digestão do DNA. Para garantir que apenas restos mínimos de DNA permaneçam, uma etapa de controle de qualidade para determinação do conteúdo residual de DNA é realizada no produto final, conforme descrito abaixo.

[0028] As etapas de descelularização e de tratamento com nuclease oferecem as vantagens de que, em primeiro lugar, a imunogenicidade é reduzida, pois células homólogas são usadas para a produção do TEMD. Em segundo lugar, como nenhuma célula viva permanece no TEMD final, o produto final pode ser esterilizado, o que é benéfico para o paciente, pois reduz o risco de infecção. Em terceiro lugar, o produto final pode ser liofilizado, embalado e armazenado e, portanto, fornecido de maneira “pronta para usar”. - Em uma etapa final de produção de um TEMD de acordo com a presente invenção, o TEMD é enxaguado em uma solução de enxágue, preferencialmente em PBS, e depois em água desionizada (ddH20), para remover sais. O TEMD é então preferencialmente transferido para um tubo com uma tampa de filtro para uso posterior. Liofilização, embalagem e esterilização:

[0029] Após a lavagem do TEMD, o método de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente pelo menos uma e mais preferencialmente todas as etapas a seguir: - Para remover a água do TEMD, isto é, para secar o TEMD, o TEMD é submetido a um tratamento de liofilização. Para este fimy o TEMD é preferencialmente liofilizado em um tubo fechado com uma tampa de filtro para reduzir o risco de contaminação. É necessário um programa de liofilização ideal para evitar danos ao material, por exemplo, devido à formação de cristais. A liofilização é preferencialmente realizada de acordo com um programa de acordo com a Figura 6. A liofilização permite o armazenamento do TEMD em um estado completamente seco, facilitando o manuseio e o transporte. - Além disso, o TEMD é embalado. De preferência, a fim de proteger suficientemente o TEMD de danos mecânicos, contaminação e líquidos ou umidade, o TEMD liofilizado é empacotado duas vezes, por exemplo, em um saco de esterilização, tubo, embalagem de blister etc. - Finalmente, o TEMD é submetido a uma etapa de esterilização, a qual é preferencialmente realizada por tratamento com óxido de etileno. Isso é mais fácil se o produto tiver sido liofilizado, pois o óxido de etileno pode reagir com a água. os tratamentos alternativos de esterilização incluem o tratamento com etanol. No entanto, é mais provável que esta forma de tratamento mais agressiva danifique o material. Controle de qualidade durante o processo:

[0030] Várias etapas de controle de qualidade são realizadas durante o processo de produção do TEMD. Portanto, de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, oO método para a produção de um TEMD compreende ainda pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, mais preferencialmente todos os seguintes passos durante o processo: - Medição de um teor de P4HB na estrutura polimérica: De preferência, o teor de P4HB na estrutura polimérica está na faixa de 20-50% (p/p), mais preferencialmente 22-45%, mais preferencialmente 24-32%. Para este propósito, a malha de PGA é pesada antes da primeira etapa de revestimento e depois da primeira ou após a segunda etapa de revestimento, se aplicável, e os dois valores de peso são comparados entre si. - Garantia de deposição homóloga de P4HB na malha durante a primeira etapa do revestimento e também durante a segunda etapa do revestimento (se aplicável): Isso é garantido pelo controle visual durante cada etapa do revestimento. - Exame de células humanas a serem semeadas no suporte de polímero, preferencialmente em termos de identidade e/ou proliferação e/ou viabilidade celular e/ou falta de patógenos: A identidade celular (fenotipagem) é preferencialmente verificada por citometria de fluxo, usando a análise FACS com vários marcadores de superfície celular.

Os critérios de aceitação incluem, entre outros, um teor de pelo menos 80% de células CD90 positivas e CD26 positivas e 5% ou menos de células CD90 positivas e CD3l positivas.

Como alternativa à análise FACS, a micromatriz pode ser usado. - Viabilidade e proliferação: Isso é verificado medindo o tempo de duplicação.

De preferência, o tempo de duplicação é inferior a 100 horas.

O número de passagem máximo preferido de células usadas para semear a estrutura polimérica é P3. - Além disso, as células devem ser verificadas como estando livres de patógenos (abaixo do limite de detecção (LOD)). - Controle do tempo de coagulação durante a preparação da suspensão celular: Isto é preferencialmente conduzido controlando a quantidade do agente gelificante.

Ao usar uma combinação de trombina e fibrinogênio, é preferida uma proporção de 1:1 (unidade: mg). O critério de aceitação para o tempo de coagulação é preferencialmente de 5 a 8 minutos; - Controle do número de células humanas semeadas na estrutura polimérica: O número preferido de células semeadas deve situar-se entre 2-4 milhões de células por em, de preferência entre 2,3-3,3 milhões de células por cmº da superfície da estrutura polimérica. - Controle da aplicação homogênea das células humanas na estrutura polimérica: isso é realizado por controle visual. - Controle da composição do meio durante a fase do biorreator (veja abaixo): o teor de vitamina Cc preferencialmente é de 0,0225% (v/v) no meio.

A composição preferida do meio no biorreator é a seguinte: 500 ml de A- DMEM (meio Eagle modificado da Advanced-Dulbecco), 50 ml de soro fetal bovino (FBS) (resultando em 9% (v/v)), 5 ml de Glutamax (200 mM) (resultando em 1,8 mM), 0,5 ml de gentamicina (10 mg/ml) (resultando em 0,009 mg/ml), 0,63 ml de vitamina C (20%) (resultando em 0,225% (v/v)). - Controle do desempenho celular durante a fase do biorreator: O lactato é usado como marcador preferido para o desempenho celular durante a fase do biorreator. Para esse fim, o valor de lactato é controlado a cada troca de meio. Os valores de lactato devem ser de pelo menos 1,5 mmol/l na primeira troca do meio, de pelo menos 2,5 mmol/l na segunda troca do meio, de pelo menos 3,0 mmol/l1 na terceira troca do meio, de pelo menos 3,5 mmol/l na quarta e quinta troca do meio. - Controle da formação de ECM durante a fase de biorreator: A formação de ECM durante a fase de biorreator pode ser verificada, por exemplo, por espectrometria de massa (MassSpec). O Propeptídeo C-Terminal Humano do Procolágeno Tipo I é separado durante a produção de ECM e é liberado no meio pelas células. Portanto, este propeptídeo pode ser detectado no meio durante a fase do biorreator e pode ser usado como um marcador adequado para a formação de MEC. A verificação da formação de ECM é realizada após a incubação do TEMD no estabilizador em um estado liofilizado e seco. Controle de qualidade pós-produção do TEMD:

[0031] Além disso, de preferência o TEMD acabado, isto é, o produto final, é submetido a um controle de qualidade compreendendo pelo menos um, preferencialmente mais de um, mais preferencialmente todos os passos a seguir:

- Verificação da esterilidade: A implantação do TEMD no paciente pretendido deve ser realizada em condições estéreis. A esterilidade das amostras de TEMD de um lote específico verifica se a esterilização durante o processo de produção é confiável e reproduzível.

- Medição do conteúdo de endotoxina: o critério de aceitação para a quantidade de endotoxina é <0,29 UE/ml, o que corresponde a <0,29 UE/Patch (“VE” = unidades de endotoxina, “Patch” = punção para biópsia com um diâmetro de 8 mm e uma área de 0,5 em). Endotoxinas são componentes estáveis ao calor da membrana celular externa de bactérias. A presença de endotoxinas no produto final seria uma indicação de contaminação bacteriana no processo e colocaria em risco a saúde dos pacientes em ensaios clínicos. O teste é determinado para verificar a ausência de qualquer resíduo bacteriano no produto final.

- Medição do conteúdo de micoplasma: Micoplasma são bactérias muito pequenas que podem aparecer como contaminantes em culturas de células. Como o micoplasma não é detectável por microscopia óptica e, em alguns casos, é resistente a antibióticos comuns, ele geralmente permanece sem ser detectado e influencia ou prejudica o crescimento da respectiva cultura de células. Uma contaminação por micoplasma da cultura de células humanas usada para a semeadura do TEMD também pode levar à contaminação do produto final. Para verificar se o processo de produção é confiável e reprodutivelmente livre de qualquer contaminação (abaixo do limite de detecção), as amostras de condutos são testadas por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) quanto à presença de micoplasma. O LOD do qPCR é descrito em Ph.

Eur. 2.6.7 como 1000 GC de concentração de DNA de micoplasma por enxerto vascular. - Medição do conteúdo residual de DNA: o DNA restante no TEMD pode ser um perigo para a saúde ou até risco de vida para o destinatário pretendido.

O conteúdo de DNA nas amostras de condutos de diferentes lotes é determinado pelo qPCR, a fim de verificar se a remoção do DNA é realizada de maneira confiável e reproduzível.

Portanto, um critério de aceitação preferido para um conteúdo residual de DNA é inferior a 50 ng de dsDNA por mg de peso seco. - Medição do teor de água residual: Para evitar a degradação hidrolítica e, portanto, prolongar a vida útil do produto final, o TEMD é liofilizado após a etapa de descelularização.

A determinação do teor de água nas amostras TEMD de diferentes lotes é realizada para verificar se a liofilização no processo de produção é confiável e reproduzível.

De preferência, o teor de água residual é inferior a 5%. - Medição do teor de polímero: A análise de polímero permite determinar se o conteúdo, razão e/ou o tamanho da molécula (comprimento da cadeia) dos polímeros são constantes em vários lotes de TEMD produzidos pelo método de acordo com a presente invenção.

De preferência, o TEMD descelularizado acabado tem um teor de 20-75% (p/p) de P4HB, mais preferencialmente 30-60% (p/p) de P4HB, mais preferencialmente 40-50% de P4HB e, de preferência, 0-30 % de PGA, mais preferencialmente 10-20% de PGA, mais preferencialmente 15-18% de PGA. - Medição do teor de hidroxiprolina: O colágeno é um componente estrutural importante no tecido da MEC do TEMD final de acordo com a presente invenção. Ao contrário de outras proteínas, o colágeno contém o aminoácido hidroxiprolina (HYP). O teor de colágeno pode, portanto, ser medido através da quantificação do conteúdo de HYP em TEMD de vários lotes. Isso deve garantir uma produção confiável e reproduzível de ECM durante o processo de produção em vários lotes. Um critério de aceitação preferido para o teor de hidroxiprolina é de mais do que 5 pg/mg.

- Medição do conteúdo de proteínas por várias proteínas marcadoras de ECM, em que, de preferência, é determinado o conteúdo das seguintes proteínas: fibronectina, cadeia de colágeno alfa-2 (I), cadeia de colágeno alfa-2 (VI). Além disso, é determinado, de preferência, o teor de proteínas de vários marcadores de descelularização, de preferência da seguinte forma: superóxido dismutase; Proteína ribossômica ácida 60S P2; integrina alfa 5. O produto final TEMD compreende uma distribuição característica de proteínas. As proteínas desejadas e/ou indesejadas são quantificadas por análise por espectrometria de massa (LC-MS/MS) dos peptídeos e pelo uso de peptídeos de referência específicos. A detecção das proteínas desejadas, isto é, marcadores ECM, é representativa através da determinação dos fragmentos peptídicos de três proteínas altamente abundantes: fibronectina, cadeia de colágeno alfa-2 (I) e cadeia de colágeno alfa-2 (VI). Por meio dessa medição, verifica-se que o conteúdo dessas proteínas estruturais da ECM é constante e reproduzível em vários lotes de TEMD. O critério de aceitação para o conteúdo das referidas proteínas de ECM é: um teor de fibronectina de pelo menos 100 fmol/ug e/ou um teor da cadeia de colágeno alfa-2 (I) de pelo menos 200 fmol/ug e/ou um teor da cadeia de colágeno alfa-2 (VI) de pelo menos 5 fmol/ug.

[0032] O conteúdo de proteínas indesejadas, isto é marcadores de descelularização, é determinado em que as seguintes proteínas não ECM representativas e/ou seus fragmentos peptídicos são quantificadas: superóxido dismutase, proteína ribossômica ácida 60S P2, Integrina alfa-

5. Por meio dessa medição, na qual o conteúdo dessas proteínas deve estar abaixo de um valor limite específico, é possível verificar se a descelularização foi bem-sucedida. Isso permite verificar uma descelularização constante e reproduzível. O critério de aceitação para o conteúdo das referidas proteínas marcadoras de descelularização é: um teor de superóxido dismutase inferior a 3 fmol/ng, preferencialmente inferior a 2 fmol/ug, e/ou um teor de proteína ribossômica ácida 60S P2 inferior a 3 fmol/ug, de preferência inferior a 2 fmol/pg, e/ou um teor de integrina alfa-5 inferior a 3 fmol/ug, preferencialmente inferior a 2 fmol/vpg.

[0033] Para as etapas de controle de qualidade acima mencionadas, as amostras são analisadas em uma forma seca após liofilização.

[0034] Para os seguintes testes biomecânicos, as amostras são reidratadas. A espessura do material é medida em um estado liofilizado e após a reidratação:

[0035] A espessura da parede do TEMD é preferencialmente medida por análise microscópica. O critério de aceitação preferido para a espessura da parede é 0,1-20 mm, preferencialmente 0,1-0,6 mm na forma seca e/ou 0,15-25 mm, preferencialmente 0,15-0,7 mm na forma reidratada, respectivamente, e mais preferencialmente 0,3-0,4 mm na a forma seca e/ou 0,35-0,5 mm na forma reidratada, respectivamente. A espessura da parede é fundamental para a estabilidade mecânica do TEMD, especialmente quando o TEMD é um enxerto vascular. A espessura das amostras de TEMD de vários lotes foi determinada para verificar se os produtos finais tinham uma espessura de parede mínima exigida constante e reproduzível. A espessura da parede do TEMD de acordo com a presente invenção foi medida no estado seco e também no estado reidratado. A análise microscópica da espessura foi realizada em amostras de TEMD que foram subsequentemente submetidas a um teste de retenção de sutura ou resistência à tração (veja abaixo).

[0036] Para testar a capacidade de carga mecânica do TEMD, é preferencialmente realizado um teste de retenção de sutura. O teste de retenção da sutura, no qual se testa a força necessária para arrancar um fio de uma costura no TEMD, serve para analisar a tensão mecânica à qual o TEMD é submetido quando implantado em um paciente. Verifica-se assim que um TEMD produzido de acordo com o método inventivo é capaz de resistir à tensão mínima requerida de uma maneira reproduzível. O critério de aceitação preferido para a retenção da sutura é de pelo menos 0,5 N.

[0037] Um outro teste mecânico de deformação usado no TEMD é o teste de resistência à tração. Nele, uma amostra TEMD é montada em uma ferramenta de tração e esticada até o material rasgar e, portanto, a tensão de tração máxima pode ser determinada. O teste de resistência à tração em amostras TEMD de vários lotes verifica se o método de produção produz produtos finais que suportam de forma reprodutível a tensão de tração mínima exigida. O critério de aceitação preferido para a resistência à tração de um TEMD de acordo com a presente invenção é de 0,5 MPa.

[0038] Ao executar as etapas de controle de qualidade mencionadas, a produção pode ser controlada em várias etapas ao longo do processo (em processo e pós-produção). Isso permite que o processo seja conduzido de forma reproduzível e confiável. Portanto, para controle de qualidade, é possível realizar testes aleatórios de amostras representativas do mesmo lote.

[0039] Com o método descrito acima, produz-se um dispositivo médico de engenharia de tecidos superior, que compreende uma estrutura híbrida de um polímero biodegradável sintético e material biológico. A implantação de um dispositivo médico resultante da engenharia de tecidos permite remodelação/repovoamento adaptativo baseado em células no corpo do receptor para obter uma estrutura de tecido semelhante a um tecido nativo funcional/fisiológico. O que é surpreendente é que o TEMD de acordo com a presente invenção fornece um estado intermediário otimizado de maturação tecidual manipulada, em comparação com andaimes de polímero sintético, por um lado, e estruturas nativas maduras e descelularizadas, por outro. Essa “imaturidade controlada” resulta em uma composição/proporção específica de componentes sintéticos, “novo tecido” biológico e arquitetura 3D (ou seja, porosidade, camadas) e possui efeitos vantajosos, incluindo um aumento do grau de crescimento das células no corpo do receptor, assim proporcionando um grande trunfo sobre enxertos produzidos de acordo com métodos da técnica anterior.

[0040] A presente invenção refere-se ainda a um TEMD produzido de acordo com o método descrito acima. De preferência, o dispositivo médico de engenharia de tecido é selecionado do grupo que compreende: um enxerto vascular, uma substituição valvular (como uma válvula cardíaca de três folhas, isto é, uma válvula sinusal) ou um adesivo de tecido. O adesivo de tecido é preferencialmente um adesivo de aumento, um adesivo de parede septal ou um adesivo de parede pulmonar/aórtica. No entanto, são possíveis usos alternativos, como a substituição de um adesivo ou revestimento de tecido em vários órgãos do corpo humano ou animal. Por exemplo, um adesivo também pode servir como enxerto de pele.

[0041] Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de um TEMD de acordo com a descrição acima para o tratamento de uma doença em um paciente humano ou animal, preferencialmente um paciente pediátrico humano. A doença a ser tratada pode ser um defeito congênito cardiovascular ou um defeito na válvula cardíaca. No caso de um defeito na válvula cardíaca, o TEMD de acordo com a invenção pode ser concebido como um substituto para uma válvula tricúspide, uma válvula aórtica, uma válvula mitral ou uma válvula pulmonar. No caso de defeitos cardiovasculares congênitos, o TEMD pode ser usado para cirurgia reconstrutiva, como uma conexão cavopulmonar em um procedimento de Fontan ou correção de outros defeitos estruturais (ou seja, defeitos septais ou ventriculares, reconstrução dos grandes vasos, etc.).

[0042] Outro objeto da invenção é um método para o tratamento de uma doença compreendendo um defeito no tecido como mencionado acima, compreendendo a implantação de um TEMD de acordo com a descrição acima como um enxerto de substituição. O TEMD de acordo com a presente invenção pode ser utilizado no tratamento de uma doença cardiovascular em um paciente humano ou animal, compreendendo a implantação de um dispositivo médico de engenharia de tecidos de acordo com uma das modalidades descritas acima em um corpo humano ou animal. De preferência, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença compreendendo um defeito de uma conexão cavopulmonar em um paciente humano ou animal, o método compreendendo a implantação de um dispositivo médico de engenharia de tecidos de acordo com uma das modalidades descritas acima em um corpo humano ou animal, de preferência pediátrico.

[0043] Modalidades adicionais da invenção são descritas nas reivindicações dependentes. Breve descrição dos desenhos

[0044] As modalidades preferidas da invenção são descritas a seguir, fazendo referência aos desenhos, que têm o objetivo de ilustrar as presentes modalidades preferidas da invenção e sem a finalidade de limitá-las. Nos desenhos,

[0045] Fig. 1 mostra uma visão geral sistemática do processo do método de produção de acordo com a presente invenção, incluindo várias etapas de controle de qualidade;

[0046] Fig. 2 mostra imagens do processo de fabricação de uma estrutura polimérica tubular para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos de acordo com uma primeira modalidade preferida na forma de um enxerto vascular de engenharia de tecidos (TEVG), em que em A, a formação da malha em um tubo é mostrada; em B, é mostrada a fusão das arestas sobrepostas; em C, é mostrado o revestimento por pulverização da estrutura polimérica tubular; e em D, a estrutura polimérica tubular final em uma montagem antes da esterilização;

[0047] Fig. 3 mostra a semeadura das células humanas na superfície interna da estrutura polimérica tubular da Figura 257

[0048] Fig. 4 mostra especificações para um programa de fluxo de bombeamento para a fase do biorreator;

[0049] Fig. 5 mostra limiares da medição de lactato como marcadores de desempenho celular durante a fase do biorreator;

[0050] Fig. 6 mostra os detalhes do programa de liofilização preferencialmente usado;

[0051] Fig. 7 mostra os resultados de uma análise de espessura material de um TEVG;

[0052] Fig. 8 mostra, em A, uma configuração usada para o teste de retenção de sutura e, em B, a força de retenção de sutura medida para o TEVG final;

[0053] Fig. 9 mostra, em A, uma configuração usada para o teste de resistência à tração circunferencial, em B, gráficos brutos do teste de tração circunferencial e em C, a resistência à tração circunferencial do TEVG final indicada em MPa;

[0054] Fig. 10 mostra uma configuração experimental de um teste de pressão de ruptura hidráulica, em que em A é uma visão geral esquemática e B mostra a fixação do TEVG na configuração experimental;

[0055] Fig. 11 mostra os resultados do teste de pressão de ruptura (n=4) de acordo com a Figura 10;

[0056] Fig. 12 mostra o teor de hidroxiprolina e prolina medido em TEVGs de amostra (n=5);

[0057] Fig. 13 mostra os resultados da análise shotgun MS das amostras de TEVGs (n = 12), seguida pela anotação dos peptídeos detectados usando o termo 0031012 da ontologia gênica (OG) que permite atribuir os peptídeos à classe de proteínas da ECM, bem como à anotação de matrissoma. São mostradas intensidades de proteína (cps) de proteínas de ECM, bem como intensidades de proteína de matrissoma fundamental e proteínas associadas ao matrissoma;

[0058] Fig. 14 mostra os resultados da análise shotgun MS dos TEVGs de amostra, seguida de anotação usando as categorias de “Projeto Matrisome”, em que as intensidades de proteínas (cps) das proteínas que foram atribuídas às classes indicadas são mostradas;

[0059] Fig. 15 mostra os resultados de uma análise MS de marcadores ECM e marcadores de descelularização em TEVGs de amostra, em que A mostra uma quantificação absoluta dos marcadores indicados usando peptídeos de referência de concentração conhecida e B mostra uma quantificação relativa dos marcadores indicados;

[0060] Fig. 16 mostra, em A, uma cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) de uma amostra TEVG para determinar o conteúdo de PGA e P4HB e em B, o conteúdo de P4HB e PGA medido na amostra TEVG;

[0061] Fig. 17 mostra, em A, o raio do poro, em B, o volume do poro e em C, a área superficial específica medida nos TEVGs da amostra (n = 8);

[0062] Fig. 18 mostra coloração por hematoxilina/eosina (H&E) e azul Alcian de uma amostra de TEVG (n = 1);

[0063] Fig. 19 mostra uma análise microCT de uma amostra TEVG (n=1);

[0064] Fig. 20 mostra, de acordo com uma segunda modalidade exemplar da invenção, uma malha de PGA suturada em um stent sinusal de nitinol antes da semeadura e a válvula cardíaca de três folhas manipulada por tecido resultante após a descelularização;

[0065] Fig. 21 mostra, de acordo com uma terceira modalidade exemplar da invenção, uma malha de PGA suturada em um anel de aço inoxidável de metal antes da semeadura e o adesivo resultante da engenharia de tecidos após descelularização. Descrição das modalidades preferidas

[0066] Na Figura 1, a visão geral sistemática do processo mostra as etapas do processo para produzir uma estrutura polimérica e isolar as células como processos preparatórios. Os produtos desses processos preparatórios, isto é, a estrutura polimérica e/ou as células isoladas, podem ser individualmente preparados como parte do método inventivo de produção do TEMD, conforme descrito abaixo, ou adquiridos separadamente para uso no método de produção do TEMD começando com o equilíbrio da estrutura polimérica e a expansão das células isoladas para preparar ambos para a etapa de semeadura celular. Exemplo 1: Produção de um enxerto vascular de engenharia de tecido Isolamento e expansão celular:

[0067] Os cordões umbilicais humanos (n = 3) foram coletados após o nascimento a termo, com consentimento informado, de acordo com o comitê de ética cantonal de Zurique, Suíça [KEK-ZH-2009-0095] e processados para isolamento de fibroblastos venosos, de acordo com os protocolos estabelecidos. A veia do cordão umbilical foi isolada cirurgicamente e pequenos pedaços de tecido foram cortados usando uma tesoura de dissecação. Os pedaços de tecido foram colocados em uma placa de Petri estéril e foram deixados para aderir ao fundo por 30 +/- 5 min. O meio de cultura foi adicionado suavemente e trocado a cada terceiro ou quarto dia. A composição do meio preferida utilizada para a primeira expansão das células isoladas é a seguinte: 500 ml de A-DMEM (meio de Eagle modificado da Advanced Dulbecco), 50 ml de Soro Fetal Bovino (FBS, Fetal Bovine Serum), 5 ml de Glutamax (200 mM), 1,25 ml de Gentamicina (10 mg/ml). Os pedaços de tecido foram removidos após o primeiro crescimento celular após aproximadamente 1-2 semanas de incubação em condições de incubadora umidificadas a 5% de CO, a 37ºC. Fabricação da estrutura:

[0068] A Figura 2, que se refere à produção de um enxerto vascular (ou um enxerto vascular compreendendo um enxerto valvular ligado a ele) de acordo com uma primeira modalidade exemplar da presente invenção, mostra a formação e solda de uma estrutura polimérica tubular após a primeira etapa de revestimento (não representada), bem como a segunda etapa de revestimento e a fixação da estrutura polimérica tubular em uma montagem. Os substratos da estrutura (adesivos de estrutura) foram fabricados a partir de malhas de ácido poliglicólico não tecido (PGA) (gravidade específica de 60-80 mg/cmº; Confluent Medical Technologies, Warkwick, EUA). Os emplastros da estrutura utilizados tinham uma forma retangular originalmente de 6 cm x 9 cm. Cada malha de PGA foi revestida em um procedimento definido em duas etapas. Primeiro, a malha de PGA foi imersa em uma solução de P4HB de baixa porcentagem (poli-4-hidroxibutirato a 1% (P4HB; TEPHA, Inc., EUA) em uma solução com o solvente apolar tetra- hidrofurano (Sigma-Aldrich, Suíça) e o solvente foi deixado evaporando por secagem ao ar durante várias horas. Em seguida, a malha de PGA foi moldada em um tubo envolvendo a malha em torno de um cilindro metálico com as dimensões necessárias, isto é, diâmetro radial de 1,6 cm. As partes/bordas sobrepostas da malha PGA revestida foram fundidas por aquecimento a 80 graus Celsius usando um ferro de solda. O tubo foi então montado em um dispositivo de retenção e revestido no exterior com uma solução de P4HB de baixa porcentagem (2% em tetra-hidrofurano) usando um dispositivo de pulverização (pistola de aerógrafo) em várias etapas. Após a segunda etapa de revestimento, a estrutura polimérica tubular foi reduzida para um comprimento de 8 cm (para adaptar o tamanho da estrutura polimérica tubular ao tamanho do dispositivo de retenção usado posteriormente para colocação no biorreator). A composição final da estrutura polimérica, isto é, a proporção de PGA para P4HB foi determinada pesando a estrutura polimérica antes e após o revestimento com P4HB.

[0069] As etapas de produção da estrutura são aplicáveis à produção de todos os tipos de TEMD; no entanto, a etapa de formação do tubo é realizada apenas no caso da produção de um enxerto vascular (ou de um enxerto valvular, se for para ser ligado a um enxerto vascular ou seu lúmen). A segunda etapa de revestimento é vantajosa para estruturas tubulares e opcional para estruturas não tubulares, como remendos planares ou enxertos compreendendo apenas a substituição da válvula sem qualquer porção semelhante a um vaso. Por conseguinte, o revestimento P4HB é geralmente mais fino em enxertos que foram revestidos apenas uma vez em vez de duas vezes.

[0070] A estrutura polimérica foi então empacotada e o óxido de etileno esterilizado em 6 + 1% de óxido de etileno e 94 + 1% de CO, por 180 min a 45 + 3 º C, > 40% rel. umidade e 2,6 + 0,1 bar para obter esterilidade. A esterilização foi seguida por uma fase apropriada de dessorção/ventilação para remover o óxido de etileno residual da estrutura.

[0071] Antes da semeadura, a estrutura foi equilibrada por pré-incubação por 12-72 horas em meio de cultura de células enriquecido com ácido ascórbico (vitamina C), com a seguinte composição: 500 ml de A-DMEM (meio de Eagle modificado da Advanced-Dulbecco), 50 ml de soro fetal bovino (FBS) (resultando em 59% (v/v)), 5 ml de glutamax (200 mM) (resultando em 1,8 mM), 0,5 ml de gentamicina (10 mg/ml) (resultando em 0,009 mg/ml), 0,63 ml de vitamina C (20%) (resultando em 0,225% (v /v)).

[0072] A porosidade de uma estrutura polimérica de amostra (DC16-90) foi analisada pela análise de adsorção de gás, ou seja, o método Brunauer - Emmett - Teller (BET), que se aplica a sistemas de adsorção multicamada: assim, um raio de poro médio (BET) de 50 Angstrôóôm foi medido, em uma área superficial específica de 12 mº/g, e um volume total de poros de 0,03 cmº/g. Semeadura celular:

[0073] Após pré-incubação/equilíbrio da estrutura polimérica, os fibroblastos humanos isolados foram semeados em estruturas utilizando uma densidade de 2,2-3,3 milhões de células/cmº.

[0074] Para isso, as células foram primeiro suspensas em fibrinogênio purificado (Sigma-Aldrich, Suíça) (10 mg/mL de proteína ativa), seguido pela adição de trombina purificada (Sigma-Aldrich, Suíça). Para cada estrutura, foram utilizados 1,2 mg de fibrinogênio e 1,2 U (unidades) de trombina (razão de 1:1), resultando em um tempo ideal de coagulação de aproximadamente 5-8 minutos. Imediatamente após a coagulação, a suspensão de células foi semeada nas estruturas estéreis de maneira homogênea.

[0075] Na Figura 3, é mostrado um padrão preferido de aplicação/semeadura da suspensão de células na superfície cilíndrica interna (lúmen) de uma estrutura polimérica tubular. Para este propósito, o suporte foi fixado manualmente com uma mão e a outra mão semeou homogeneamente a suspensão de células na superfície interna da malha. Outros padrões que atingem a distribuição homogênea desejada de células são possíveis. As etapas de semeadura são aplicáveis à produção de todos os tipos de TEMD.

[0076] Após a semeadura, a estrutura polimérica semeada foi incubada primeiro em condições estáticas por cerca de 16 horas no mesmo meio de cultura de células mencionado acima, também enriquecido pela adição de ácido ascórbico (vitamina C) da seguinte forma: 500 ml de A-DMEM (meio Eagle modificado da Advanced-Dulbecco), 50 ml de soro fetal bovino (FBS) (resultando em 9% (v/v)), 5 ml de Glutamax (200 mM) (resultando em 1,8 mM), 0,5 ml de gentamicina (10 mg/ml) (resultante em 0,009 mg/ml), 0,63 ml de vitamina C (20%) (resultando em 0,225% (v/v)). Acondicionamento no biorreator:

[0077] A estrutura polimérica semeada foi então colocada em um dispositivo de retenção em um biorreator e exposta a um fluxo pulsátil de intensidade incremental durante os próximos 21 +/- 4 dias no mesmo meio de cultura de células mencionado acima enriquecido pela adição de ácido ascórbico (vitamina C). O acondicionamento durante a fase do biorreator é aplicável à produção de todos os tipos de TEMD.

[0078] Na Figura 4, são apresentadas as especificações para um programa de fluxo de bomba preferido para um TEMD, especialmente para um TEVG, mostrando a geração de fluxo pulsátil por aumento incremental do volume bombeado durante a fase do biorreator.

[0079] A Figura 5 mostra uma tabela com limites mínimos de conteúdo de lactato em mmol/l a cada intervalo de troca médio. O lactato serve como um marcador para o desempenho celular durante a fase do biorreator. Durante a fase de biorreator, a formação de ECM foi verificada por espectrometria de massa, utilizando o Propeptídeo C-Terminal Humano Procolágeno Tipo I como marcador no meio de cultura de células.

[0080] Após a remoção do biorreator, o TEVG do Exemplo 1 foi colocado em um estabilizador de conduto e incubado sob condições estáticas por 12-36 horas no mesmo meio de cultura de células do biorreator. Esta etapa é aplicável também à produção de outros tipos de TEMD. Descelularização

[0081] Após a incubação, o TEVG do Exemplo 1 foi descelularizado. Durante a descelularização, as células foram lisadas e removidas usando uma solução de lavagem composta da seguinte maneira:

== =

[0082] Numa etapa adicional, o TEVG descelularizado do Exemplo 1 foi tratado com à nuclease benzonase para remover o DNA por digestão enzimática. Antes da liofilização, o TEVG descelularizado foi lavado em ddH20 para remover sais, cortado com 7 em de comprimento e subsequentemente transferido para um tubo de 50 ml com uma tampa de filtro e depois liofilizado. Esta etapa de descelularização é aplicável também à produção de outros tipos de TEMD. Liofilização:

[0083] Na Figura 6, é representado um programa preferido para liofilização. Este programa evita danos ao material, devido à formação de cristais, por exemplo. O produto final foi empacotado duas vezes em sacos de esterilização e esterilizado por tratamento com óxido de etileno junto a uma empresa externa (QMedics). Esta etapa de liofilização é aplicável também à produção de outros tipos de TEMD.

Controle de Qualidade de TEVG:

[0084] O produto final, isto é, o TEVG descelularizado, liofilizado e esterilizado, foi submetido a um controle de qualidade de acordo com as seguintes etapas: verificação da esterilidade; verificação do conteúdo de endotoxina; verificação do conteúdo de micoplasma; verificação de DNA residual; verificação do teor de água residual; verificação do teor de polímero; verificação do teor de hidroxiprolina; verificação do teor de proteínas: fibronectina, cadeia de colágeno alfa-2 (1), cadeia de colágeno alfa-2 (VI), marcadores de descelularização (superóxido dismutase,

proteína ribossômica ácida 60S P2, integrina alfa 5); medição da espessura por análise microscópica (seca/reidratada); teste de retenção de suturas; teste de resistência à tração. Essas etapas de controle de qualidade são aplicáveis também à produção de outros tipos de TEMDs.

[0085] Um lote de produção de TEVG consistia em 656 enxertos. Um deles foi separado para a produção de amostras representativas e as peças foram embaladas separadamente, liofilizadas e esterilizadas, paralelamente aos 5 enxertos restantes. As peças foram então utilizadas para as várias análises, incluindo esterilidade. Para fins de teste, a embalagem foi removida novamente. As amostras de TEVG foram analisadas em forma seca após liofilização. Para os testes biomecânicos, as amostras foram reidratadas.

[0086] A espessura da parede do TEVG foi determinada em estado liofilizado e após reidratação por um microscópio de medição (Vision Engineering, HAWK 15-3) de acordo com a I1SO7198: 2016 na Endolab Mechanical Engineering GmbH, Thansau/Rosenheim, Alemanha. A análise de sete TEVG revelou uma espessura média de 342 +/- 57 um, como mostrado na Figura

7. Após a reidratação por 20 minutos em NaCl a 0,9%, a espessura da parede aumentou em 16%, para 397 +/- 64 um. A medição da espessura da parede também é aplicável à produção de outros tipos de TEMDs.

[0087] Para avaliar outras propriedades mecânicas de um TEMD produzido de acordo com o método da presente invenção, a resistência à tração circunferencial do TEVG produzido de acordo com o Exemplo 1 foi avaliada usando uma máquina de teste de tração que atende aos requisitos da ISO 5081 (Equipamento usado: célula de carga, Instron, 2530-437;

Máquina de teste universal, Instron, 5944). Uma amostra do TEVG final foi cortada no sentido normal no eixo longo e o comprimento da amostra (L) foi medido. Para a análise biomecânica, a amostra foi reidratada por 20 min em solução de NaCl a 0,9%. A amostra de TEVG em sua forma tubular foi colocada em dois pinos arredondados (veja a Figura 9A). A amostra foi esticada a uma taxa uniforme de 100 mm/min até o ponto de ruptura ser atingido. A carga na ruptura foi determinada (Tmax) e a resistência à tração circunferencial determinada pela seguinte fórmula: Resistência à tração circunferencial = Tmax/2*L. As amostras tubulares de TEVG (n = 5 de 3 séries diferentes de produção) com um comprimento médio de 1,4 cm quebraram a uma carga média de 8,4 N, resultando em uma força circunferencial de 0,29 +/- 0,05 N/mm. Com base na espessura da parede das amostras, foi calculada uma resistência à tração circunferencial média de 0,87 +/- 0,21 MPa (ver Figura 9C).

[0088] A hemodinâmica pelo fluxo sanguíneo e pressão arterial induz forças biomecânicas nas paredes dos vasos. Para avaliar a resiliência mecânica do TEVG, foram realizados testes de ruptura para avaliar as condições sob as quais a ruptura do TEVG é induzida. Para este fim, um TEVG completo do Exemplo 1 foi reidratado por 20 min em solução de NaCl a 0,9%. Após a reidratação, o enxerto vascular foi aplicado na instalação de teste e exposto a pressões hidráulicas crescentes usando água destilada como elemento fluido. Durante o teste, o aumento da pressão foi registrado. A pressão foi aumentada até o TEVG romper (veja a Figura 10). Sob pressões hidráulicas crescentes, foi observada a formação de pequenos orifícios. Sob pressões hidráulicas de 264 + 52 mmHg, observou-se ruptura do TEVG (ver Figura 11).

[0089] Para determinar o teor de água residual no TEVG uma titulação de Karl Fischer de acordo com Ph. Eur. 2.5.12 é realizada. O teor de água residual em 7 TEVG derivado de 5 lotes de produção diferentes foi determinado em média a 4,1 +/- 0,5% (p/p) (não representado).

[0090] O teor de HYP em 5 TEVG (de três lotes de produção diferentes) foi analisado de acordo com Ph. Eur. 2.2.56 e foi em média 11,7 + 0,8 pga/mg (p/p; média +/- desvio padrão) (veja a Figura 12).

[0091] Para determinar a composição proteica do TEVG descelularizado, foi realizada análise por espectrometria de massa (MS). Para esse fim, as amostras de TEVG foram primeiro digeridas (protocolo na matriz: redução de proteínas, alquilação e digestão com tripsina) e posteriormente adquiridas no modo shotgun LC-MS/MS. Os dados de LC-MS/MS foram pesquisados usando um banco de dados humano UniProt, e as proteínas ECM foram anotadas com base no termo GO 0031012 e com as categorias funcionais de proteínas do “Projeto Matrissoma”, para caracterizar a composição do ECM presente no TEVG com mais detalhes (veja a Figura 13). O Projeto Matrissoma "permite a previsão do conjunto de matriz extracelular e proteínas associadas à ECM (http: //web.mit .edu/hyneslab/matrisome/). A anotação de proteínas baseada nas categorias “Projeto Matrissoma” se mostrou mais seletiva em comparação com o termo GO 0031012. A anotação “Projeto Matrissoma” também permite uma classificação de proteínas nas seguintes categorias: glicoproteínas ECM; colágenos; reguladores de ECM; proteínas relacionadas a ECM; proteoglicanos; fatores secretados (veja a Figura 14).

[0092] As etapas de avaliação de outras propriedades mecânicas descritas acima para o TEVG de acordo com o Exemplo 1 também são aplicáveis à produção de outros tipos de TEMDs.

[0093] Para quantificar marcadores para a matriz extracelular presente no TEVG de maneira absoluta, foram utilizados peptídeos de referência para três proteínas marcadoras da ECM (colágeno de cadeia alfa-2 (1); colágeno de cadeia alfa-2 (VI) e fibronectina). Além disso, para demonstrar que o processo de descelularização durante a produção do TEVG funcionou efetivamente, foram usados peptídeos de referência para três marcadores de descelularização (proteína ribossômica ácida P2 de 60S; integrina alfa-5 e superóxido dismutase [Mn] mitocondrial). A quantificação absoluta desses marcadores de ECM e de descelularização estão representados na figura 15. os marcadores adicionais de ECM e descelularização foram analisados, porém essa quantificação é apenas relativa, uma vez que nenhum peptídeo de referência foi aplicado para sua quantificação (consulte a Figura 15B). Marcadores de descelularização confirmaram que a etapa de descelularização realizada durante a produção do TEVG remove componentes celulares indesejados enquanto preserva o ECM.

[0094] O TEMD de acordo com a presente invenção é composto de proteínas humanas (principalmente proteínas ECM) e os polímeros “biodegradáveis poli-4-hidroxibutirato (P4HB) e ácido poliglicólico (PGA). A produção do TEMD da invenção começa com a produção de estruturas poliméricas (compostas por PGA e P4HB) que são subsequentemente semeadas com células. Com a semeadura de células na estrutura polimérica,

é iniciada a degradação dos polímeros por hidrólise, especialmente para a PGA de degradação rápida. Para monitorar o conteúdo dos polímeros no produto final TEMD, os polímeros do TEVG do Exemplo 1 foram extraídos do produto final usando um eluente e posteriormente analisados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) na empresa contratada PSS Polymer Services GmbH , Mainz, Alemanha. A cromatografia de exclusão por tamanho caracterizou a distribuição do peso molecular dos extratos e, ao calibrar com amostras puras dos materiais de partida do polímero (PGA, P4HB; veja a Figura 16 A) de concentração conhecida, o conteúdo de cada polímero foi avaliado de maneira semi-quantitativa. Utilizando esta abordagem, um conteúdo de P4HB de 40,7 + 4,6% (p/p) e um conteúdo de PGA de 17,1 + 4,1% (p/p) foram determinados nas amostras de TEVG testadas (n = 7 de cinco produções lotes média +/- desvio padrão) (veja a Figura 16B).

[0095] Na cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) de um enxerto vascular de amostra para determinar o conteúdo de PGA e P4HB de acordo com a Fig. 16A, o conteúdo de PGA e P4HB foi avaliado por cravação com soluções poliméricas puras (PGA ou P4HB, indicadas por setas) de concentrações conhecidas.

[0096] A análise de adsorção de gás é comumente usada para medições de área superficial e porosidade. Isso envolve a exposição de materiais sólidos a gases (geralmente é usado gás nitrogênio) em uma variedade de condições e a avaliação da absorção de peso ou do volume da amostra. A análise desses dados fornece informações sobre as características físicas do sólido, incluindo: porosidade, volume total de poros e tamanho dos poros. A porosidade do TEVG foi determinada pelo método de Barrett, Joyner e Halenda (BJH), que se aplica ao mesoporo e à pequena faixa de tamanhos de macroporos. Os resultados são mostrados na Figura 17.

[0097] Para analisar a composição estrutural do TEVG e visualizar componentes específicos, a análise histológica padrão foi realizada no Institut Mutualiste Montsouris (IMM), Paris, França. Uma coloração com hematoxilina/eosina (H&E) foi usada para visualizar a estrutura do tecido e para confirmar a ausência de núcleos/DNA e uma coloração com azul Alzuan foi usada para visualizar glicosaminoglicanos. Os glicosaminoglicanos são abundantes em ECM e, portanto, um marcador para ECM. As manchas representativas de H&E e azul Alcian do TEVG mostradas na Figura 18 confirmam a ausência de núcleos e a presença de ECM, respectivamente. Em ambas as manchas, a natureza porosa do TEVG é discernível. A parte externa do TEVG, que é composta principalmente de várias camadas de P4HB que são pulverizadas durante a produção da estrutura do polímero, são marcadas com a seta vermelha na Figura 18.

[0098] Para analisar a espessura e a estrutura da parede do TEVG, foi realizada a microtomografia de raios-X (microCT) (veja a Figura 19). A microCT usa raios-x para criar seções transversais de um objeto físico que pode ser usado para recriar um modelo virtual (modelo 3D) sem destruir o objeto original. O prefixo micro-(p) é usado para indicar que os tamanhos de pixel das seções transversais estão na faixa de micrômetros.

[0099] As etapas de controle de qualidade descritas acima são aplicáveis à produção de outros tipos de TEMDs. Implantação do TEVG:

[00100] A implantação do TEVG do Exemplo 1 deve ser realizada por anastomose na VCI (veia cava inferior) e na artéria pulmonar por ligação de sutura. Para avaliar a estabilidade mecânica e, portanto, a segurança da sutura, foram realizados testes de retenção da sutura. Para isso, foi inserida uma sutura (fio de aço inoxidável com diâmetro de 0,14 mm, que corresponde à sutura prolene 5/0) a 2 mm do final de uma amostra de TEVG reidratada através de uma parede do dispositivo para formar uma meia alça (veja a Figura 8A). A sutura foi puxada a uma taxa de 100 mm/min e a força necessária para puxar a sutura através do dispositivo foi registrada (Equipamento utilizado: célula de carga, Instron, 2530-437; Máquina de teste universal, Instron, 5944). A força de retenção da sutura de 7 TEVG foi medida e, em média, uma força de 0,82 +/- 0,25 N (correspondente a 82 g) teve que ser aplicada para puxar a sutura através do dispositivo (consulte a Figura 8B). A avaliação da estabilidade mecânica mencionada acima também é aplicável à produção de outros tipos de TEMDs. Exemplo 2: Produção de uma válvula sinusal com engenharia de tecido

[00101] De acordo com uma segunda modalidade exemplar da presente invenção, uma estrutura de válvula cardíaca de três folhas foi feita a partir de uma malha de PGA não tecida e finalmente integrada a um stent sinusal de nitinol usando suturas contínuas (como mostrado na Figura 20). A estrutura de PGA foi revestida com P4HB a 1%, seca durante a noite e esterilizada com EtOH, Pen-Strep (Penicilina-Estreptomicina; 10'000 U/ml) e anfotericina. Finalmente, a estrutura PGA foi incubada durante a noite a 37ºC com um meio de crescimento otimizado compreendendo DMEM avançado suplementado com 1% de solução Pen-Strep, 1% de Glutamax, 10% de FBS e 10% de FBS e

130 mg de Vit. C (por 500 ml).

[00102] Depois disso, a válvula foi semeada com fibroblastos dérmicos humanos (1x106 células/cm?) usando fibrina como veículo celular. Após a semeadura, a estrutura foi colocada, de preferência em uma configuração fechada das folhas, em um sistema duplicador de pulso duplo por 4 semanas de cultura. Durante a cultura da válvula, foram utilizadas inserções para impor uma geometria fisiológica da válvula. Vit. C ou TGF-B foram utilizados como suplementos opcionais no meio para melhorar a produção de MEC. O processo de descelularização foi realizado como descrito no Exemplo 1.

[00103] A válvula sinusal, sendo projetada para a substituição de uma respectiva válvula sinusal na artéria pulmonar, serve como exemplo para a produção de enxertos de substituição da válvula cardíaca. Exemplo 3: Produção de um patch com engenharia de tecido

[00104] De acordo com uma segunda modalidade exemplar da presente invenção, uma estrutura de PGA foi cortada (circular ou em tira) e revestida com 1% de P4HB. Após a secagem durante a noite, o patch foi suturado em um anel metálico de aço inoxidável (como mostrado na Figura 21) e esterilizado com EtOH, Pen-Strep e anfotericina. Em seguida, o patch foi incubado durante a noite a 37ºC com um meio de crescimento otimizado compreendendo DMEM avançado suplementado com 1% de solução Pen-Strep, 1% de Glutamax, 10% de FBS e 10% de FBS e 130 mg de Vit. C (por 500 ml). Depois disso, os fibroblastos dérmicos humanos foram semeados no adesivo usando fibrina como veículo celular. Após a semeadura, o adesivo foi colocado em um pequeno frasco médio e cultivado por 4 semanas usando um agitador orbital para melhorar a distribuição do meio.

Também para a produção do adesivo, Vit.

C ou TGF-B foram utilizados como suplementos opcionais no meio para melhorar a produção de MEC.

O processo de descelularização foi realizado como descrito no Exemplo 1. Bibliografia 1 Langer, R. & Vacanti, J.

P.

Tissue Engineering.

Science 260, 920-926, doi:DOI 10.1126/science.8493529 (1993). 2 Asti, A. & Gioglio, L.

Natural and synthetic biodegradable polymers: different scaffolds for cell expansion and tissue formation.

Int J Artif Organs 37, 187- 205, doi:10.530/ijao.5000307 (2014). 3 Dunn, A.

S., Campbell, P.

G. & Marra, K.

G.

The influence of polymer blend composition on the degradation of polymer/hydroxyapatite biomaterials.

J Mater Sci Mater Med 12, 673-677 (2001). 4 Sugiura, T. et al.

Tropoelastin inhibits intimal hyperplasia of mouse bioresorbable arterial vascular grafts.

Acta Biomater 52, 74-80, doi:10.1016/j.actbio.2016.12.044 (2017). Mol, A. et al.

Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application.

Circulation 114, 1152-158, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.105.001123 (2006). 6 Weber, B. et al.

Injectable living marrow stromal cell- based autologous tissue engineered heart valves: first experiences with a one-step intervention in primates.

Eur Heart J 32, 2830-2840, doi:10.1093/eurheartj/ehr059 (2011). 7 Li, H., Du, R. & Chang, J.

Fabrication, characterization, and in vitro degradation of composite scaffolds based on PHBV and bioactive glass.

J Biomater Appl 20, 1137-155, doi:10.1177/0885328205049472 (2005).

8 Chen, G.

Q. & Wu, Q.

The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials.

Biomaterials 26, 6565-6578, doi:10.1016/j.biomaterials.2005.04.036 (2005). 9 Shinoka, T. et al.

Creation of viable pulmonary artery autografts through tissue engineering.

J Thorac Cardiov Sur 115, 536-545, doi:Doi 10.1016/S0022-5223(98)70315-0 (1998). Schmidt, D., Stock, U.

A. & Hoerstrup, S.

P.

Tissue engineering of heart valves using decellularized xenogeneic or polymeric starter matrices.

Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 362, 1505-1512, doi:10.1098/rstb.2007.2131 (2007). 11 Hoerstrup, S.

P. et al.

Functional living trileaflet heart valves grown in vitro.

Circulation 102, III44-49 (2000). 12 Weber, B. et al.

Off-the-shelf human decellularized tissue-engineered heart valves in a non-human primate model.

Biomaterials 34, 7269-7280, doi:10.1016/j.biomaterials.2013.04.059 (2013). 13 Hoerstrup, S.

P. et al.

Living, autologous pulmonary artery conduits tissue engineered from human umbilical cord cells.

Ann Thorac Surg 74, 46-52; discussion 52 (2002). 14 Hoerstrup, S.P. et al.

Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT in pediatric patients.

Eur.

J.

Cardiothorac.

Surg. 2003; 23:1002-6. Agrawal C.M. et al., Biodegradable polymeric scaffolds for musculoskeletal tissue engineering.

J.

Biomedic.

Mat.

Res. 2001; 55:141-50. 16 Niklason et al., Functional arteries grown in vitro, Science, 1999; 284: 489-93. 17 D.

Schmid, S.P.

Hoerstrup, “Tissue engineered heart valves based on human cells”, Swiss Med.

Wkly. 2005; 135: 618-623.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: A) prover uma estrutura polimérica, com a referida estrutura polimérica compreendendo um substrato compreendendo ácido poliglicólico e um revestimento compreendendo poli-4- hidroxibutirato; B) aplicar uma suspensão de células contendo células isoladas e expandidas à estrutura polimérica, produzindo assim uma estrutura polimérica semeada; Cc) colocar a estrutura polimérica semeada em um biorreator e estimulação mecânica por exposição a um fluxo pulsátil de intensidade incremental, formando assim um dispositivo médico de engenharia de tecidos compreendendo uma matriz extracelular; D) montar o dispositivo médico de engenharia de tecidos em um estabilizador de conduto e incubação sob condições estáticas em um meio de cultura de células; E) descelularizar o dispositivo médico de engenharia de tecidos em uma solução de lavagem compreendendo um detergente; F) tratar com nuclease do dispositivo médico de engenharia de tecidos; G) lavar do dispositivo médico de engenharia de tecidos.

2. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a etapa A) compreender as seguintes etapas: - prover uma malha compreendendo ácido poliglicólico como substrato para uma estrutura polimérica; sendo que uma primeira etapa de revestimento, revestimento da malha com uma solução contendo poli-4-hidroxibutirato, preferencialmente por revestimento por imersão; - esterilizar a estrutura polimérica, de preferência por tratamento com óxido de etileno; - incubar, de preferência, a estrutura polimérica, de preferência por 12-72h em meio de cultura celular.

3. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o dispositivo médico de engenharia de tecidos ser um enxerto vascular e que, após a primeira etapa de revestimento e antes da esterilização, o método compreende as seguintes etapas: - modelar a malha revestida em um tubo e, de preferência, fixar as bordas da malha, aquecendo-as de preferência a pelo menos 60 graus Celsius, preferencialmente a cerca de 80 graus Celsius, preferencialmente usando um ferro de solda, formando assim uma estrutura polimérica tubular; sendo que uma segunda etapa de revestimento, revestir a estrutura polimérica tubular, de preferência apenas no lado externo do tubo, com uma solução contendo poli-4- hidroxibutirato, preferencialmente por revestimento por pulverização.

4. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de na etapa B), as células contidas na suspensão de células serem células humanas selecionadas a partir de um grupo que consiste em fibroblastos, células-tronco mesenquimais, células mononucleares e células progenitoras endoteliais, em que as células são preferencialmente derivadas de uma fonte selecionada de um grupo que consiste em medula Óssea, sangue, tecido adiposo, líquido amniótico, vilosidades coriônicas, matriz do cordão umbilical e sangue do cordão umbilical, em que as células na suspensão celular são mais preferencialmente fibroblastos humanos, mais preferencialmente fibroblastos humanos derivados de uma veia do cordão umbilical humano.

5. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de na etapa B) a suspensão de células contendo células isoladas e expandidas ser aplicada apenas a uma superfície interna da estrutura de polímero tubular.

6. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de na etapa B) pelo menos 0,5-5 milhões de células/cm?, preferencialmente 2-4 milhões de células/cm, mais preferencialmente 2,2-3,3 milhões de células/cm? serem semeadas na estrutura polimérica.

7. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de a suspensão de células aplicada na etapa B) ser preparada por um método que compreende pelo menos um, preferencialmente mais que um, e mais preferencialmente todas as seguintes etapas: - isolar as células, preferencialmente células humanas selecionadas de um grupo que consiste em fibroblastos,

células-tronco mesenquimais, células mononucleares e células progenitoras endoteliais, em que as células são preferencialmente derivadas de uma fonte selecionada de um grupo que consiste em: medula óssea, sangue, adiposo tecido, fluido amniótico, vilosidades coriônicas, matriz do cordão umbilical, sangue do cordão umbilical, em que mais preferencialmente as células são fibroblastos humanos derivados de uma veia do cordão umbilical humano; - expandir as células isoladas, preferencialmente em pelo menos um vaso de cultura por 5-8 dias; - cultivar as células isoladas; - formar uma suspensão de células adicionando uma solução transportadora de células, preferencialmente compreendendo um agente gelificante, mais preferencialmente compreendendo fibrinogênio e trombina purificada, às células isoladas, em que a suspensão de células é preferencialmente formada adicionando primeiro fibrinogênio purificado às células isoladas para formar uma primeira suspensão celular e subsequentemente adicionando trombina purificada à primeira suspensão celular para formar uma segunda suspensão celular que então serve como suspensão celular para aplicação na estrutura do polímero na etapa B).

8. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de o método compreender ainda pelo menos uma das etapas a seguir após a etapa de enxágue do dispositivo médico de engenharia de tecidos, mais preferencialmente que uma das etapas a seguir e, mais preferencialmente, todas as etapas a seguir: - liofilizar o dispositivo médico de engenharia de tecidos; - embalar o dispositivo médico de engenharia de tecidos; - esterilizar o dispositivo médico de engenharia de tecidos, de preferência por tratamento com óxido de etileno.

9. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de o método compreender ainda uma ou mais, de preferência todas as seguintes etapas do controle de qualidade em processo: - determinar um conteúdo de P4HB na estrutura polimérica, em que o critério de aceitação para o conteúdo de P4HB na estrutura polimérica é que o conteúdo de P4HB na estrutura polimérica esteja na faixa de 5-95% p/p), preferencialmente de 20-50%, mais preferencialmente de 22-45%, mais preferencialmente de 24-32%; - garantir a deposição homóloga de P4HB na malha da estrutura polimérica; - examinar as células a serem semeadas na estrutura polimérica antes da semeadura em termos de identidade celular, proliferação, viabilidade e falta de patógenos; - controlar o tempo de coagulação da suspensão celular; - controlar o número de células semeadas na estrutura polimérica; - controlar a aplicação homogênea das células à estrutura polimérica; - controlar a composição do meio no biorreator; - controlar o valor do lactato a cada mudança do meio no biorreator; - controlar a formação da matriz extracelular no biorreactor, preferencialmente por espectrometria de massa,

preferencialmente utilizando propeptídeo humano do tipo C do procolágeno humano I como marcador adequado.

10. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de durante o controle de qualidade das células a serem semeadas na estrutura polimérica antes da semeadura, a identidade da célula ser determinada por citometria de fluxo e/ou em que a capacidade de proliferação é determinada medindo o tempo de duplicação, em que o critério de aceitação preferido para o tempo de duplicação é inferior a 100 horas.

11. Método para a produção de um dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de o método compreender ainda pelo menos uma etapa de controle de qualidade do dispositivo médico de engenharia de tecidos acabado, em que pelo menos uma, de preferência pelo menos duas, e mais preferencialmente todas as etapas a seguir do controle de qualidade são realizadas no dispositivo médico de engenharia de tecidos acabado: - verificar a esterilidade; - medir o teor de endotoxinas; - medir o teor de micoplasma; - medir o teor de DNA residual; - medir o teor de água residual; - medir o teor de polímeros; - medir o teor de hidroxiprolina; - medir o teor proteico, preferencialmente através da determinação de um teor proteico da matriz extracelular, mais preferencialmente de ao menos uma das seguintes proteínas selecionadas do grupo que consiste em: fibronectina, colágeno de cadeia alfa-2 (II), colágeno de cadeia alfa-2 (VI); e/ou determinando um conteúdo de proteínas marcadoras de descelularização, mais preferencialmente de ao menos uma das seguintes proteínas selecionadas do grupo que consiste em: superóxido dismutase, proteína ribossômica ácida 60S P2, integrina alfa 5; - medir a espessura, preferencialmente por análise óptica, preferencialmente por análise microscópica, preferencialmente na forma seca e/ou reidratada, em que um critério de aceitação para a espessura do dispositivo médico de engenharia de tecidos descelularizado é preferencialmente uma faixa de 0,1 a 20 mm em um forma seca, preferencialmente 0,1- 0,6 mm na forma seca e/ou 0,15-25 mm na forma reidratada, preferencialmente 0,15-0,7 mm na forma reidratada, mais preferencialmente uma faixa de 0,3-0,4 um na forma seca e/ou 0,35-0,5 mm na forma reidratada; - testar a retenção de suturas, em que preferencialmente um critério de aceitação é que o dispositivo médico manipulado por tecidos resista a mais de 0,5 N; - testar a resistência à tração, em que preferencialmente um critério de aceitação é que o dispositivo médico manipulado por tecidos resista a mais de 0,5 MPa; - testar a pressão de ruptura, em que preferencialmente um critério de aceitação é que o dispositivo médico manipulado por tecidos resista a uma pressão superior a 150 mmHg.

12. Dispositivo médico de engenharia de tecidos caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de l a

11.

13. Dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o dispositivo médico de engenharia de tecidos ser selecionado a partir do grupo que compreende um enxerto vascular, um enxerto valvular ou um patch de tecido.

14. Dispositivo médico de engenharia de tecidos, de preferência produzido por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de o dispositivo médico de engenharia de tecidos conter uma estrutura polimérica compreendendo uma malha de PGA que compreende um revestimento contendo P4HB e uma matriz extracelular desenvolvida na estrutura polimérica e em que o dispositivo médico de engenharia de tecidos compreende um ou mais, de preferência todos os seguintes recursos: - um teor de endotoxinas inferior a 0,29 UE/ml; - um teor de micoplasma abaixo do limite de detecção; - um teor residual de DNA inferior a 50 ng de dsDNA por mg de peso seco; - um teor de água residual inferior a 5%; - um teor de PGA de O a 30% e um teor de P4HB de 30 a 75% (P/P); - um teor de hidroxiprolina superior a 5 vpg/mg; - um teor de fibronectina de pelo menos 100 fmol/ug e/ou um teor de colágeno de cadeia alfa-2 (I) de pelo menos 200 fmol/ug e/ou um teor de colágeno de cadeia alfa-2 (VI) de pelo menos 5 fmol/ug; e/ou um teor de superóxido dismutase inferior a 3 fmol/ug e/ou um teor de proteína ribossômica ácida 60S P2 inferior a 3 fmol/ug e/ou um teor de integrina alfa-5 inferior a 3 fmol/ug - uma espessura de 0,15-700 um;

- uma retenção de sutura de pelo menos 0,5 N; - resistência à tração de pelo menos 0,5 MPa; - pressão de ruptura superior a 150 mmHg.

15. Uso do dispositivo médico de engenharia de tecidos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 12 a 14, caracterizado pelo fato de ser utilizado como um enxerto de substituição cardiovascular em pacientes humanos ou animais, de preferência como substituto de uma conexão cavopulmonar, preferencialmente em pacientes pediátricos humanos com síndrome hipoplásica do coração esquerdo,

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, do dispositivo médico da engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 14, caracterizado pelo fato de ser utilizado como uma válvula cardíaca ou como um adesivo em um paciente humano ou animal com um defeito do sistema cardiovascular, de preferência em um paciente pediátrico humano.

17. Dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 14, caracterizado pelo fato de ser utilizado no tratamento de uma doença cardiovascular de um corpo humano ou animal, de preferência de um paciente pediátrico humano.

18. Dispositivo médico de engenharia de tecidos, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser utilizado no tratamento de um defeito de uma conexão cavopulmonar em um paciente humano ou animal, preferencialmente no tratamento da síndrome do coração esquerdo hipoplásico em um paciente pediátrico humano.

Pr - De ( — Polímero ) ( Biópsia ) Ds / : " A / Viabilidade” S Ident... 7. de Duplic. Poput. 7 (FTIR) Isolamento celular / (Pb) Identid (FACS) 5 < Puçõza Espes- > Estabelecer o banco de Esterilidade Endotoxinas > 8 " > Porosido” / células principal/de trabalho — Micoplasma 2 a T. pallidum & - “ Status / õ “viral F E a Peso inn a 7 de PAHB > Fabricação da estrutura S 2 Inspeção visual > , polimérica ko) “+ Esterilidade Revestir tubo de PGA com o “Endotoxinas” PA4HB — — SR Expansão celular EK Equilíbrio da Lónt.celular. Expansão de fibroblastos p// S estrutura Viabilid. semeadura da estrutura o PDT polimérica vv emeadura de célutras. Semear estrutura polimérica s com células 2? Teste. > de qel — a o

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S É Descelularização < u — nspeção visuat+— > do conduto — É Ss Liofilização e — tnspeção << visual conduto — —— MicroCL— T o

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