ES2943332T3 - Producto sanitario de ingeniería tisular - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo médico de ingeniería tisular, así como a un método para la producción de dicho dispositivo médico, que comprende los siguientes pasos: proporcionar un armazón polimérico que comprende una malla que comprende ácido poliglicólico y un recubrimiento que comprende poli-4-hidroxibutirato; aplicación de una suspensión celular que contiene preferiblemente células humanas al andamio polimérico; colocación del armazón de polímero sembrado en un biorreactor y estimulación mecánica mediante exposición a un flujo pulsátil de intensidad incremental, formando así una matriz extracelular; montaje del injerto en un estabilizador de conductos e incubación en medio de cultivo celular; descelularización del injerto en una solución de lavado; tratamiento con nucleasas del injerto; y enjuague del injerto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Producto sanitario de ingeniería tisular

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular para su uso en aplicaciones terapéuticas, tales como intervenciones de sustitución de tejidos, especialmente para su uso en aplicaciones cardiovasculares. El producto sanitario comprende una estructura híbrida de un armazón sintético biodegradable y una matriz extracelular de ingeniería tisular cultivada a partir de células humanas o animales.

Estado de la técnica

Las construcciones de ingeniería tisular son útiles como prótesis en la reparación o sustitución de tejidos dañados o incluso órganos. En cirugía cardiovascular existe una gran necesidad de injertos, parches y válvulas para sustituir tejidos defectuosos debido a trastornos congénitos o, por ejemplo, calcificación y degeneración. Los materiales usados actualmente para la reparación de tejidos blandos son injertos sintéticos no degradables o tejidos fijados de origen alo-/xenogénico y, por lo tanto, inherentemente asociados con la degeneración disfuncional progresiva, riesgo de transmisión de enfermedades y falta de capacidad regenerativa. Estos inconvenientes limitan su uso más amplio en poblaciones de pacientes más jóvenes o requieren varias reoperaciones. Las construcciones de polímero sintético no degradable conllevan el riesgo de infección, calcificación o inflamación después de la implantación. Los polímeros sintéticos degradables han encontrado un amplio uso como armazones de cultivo tisular, sin embargo, fragmentos de polímeros degradables pueden causar reacciones inflamatorias. Como alternativa, los armazones de geles o mallas de colágeno no humano (por ejemplo, bovino o de rata) muestran una resistencia a la tracción limitada y conllevan el riesgo de contaminación o reacciones inmunógenas después del implante en un paciente humano.

Las matrices de armazón biodegradables se usan para formar la base de cualquier enfoque de ingeniería tisular in vitro actuando como una matriz temporal para la proliferación celular y la deposición de matriz extracelular hasta que el armazón sea reemplazado por neo-tejido. Mientras se desarrolla el sustituto vivo de ingeniería, el armazón biocompatible debe degradarse idealmente sin dejar restos en el cuerpo. El PGA se usa más comúnmente porque se degrada en un punto temporal predecible y en componentes (generalmente) biocompatibles. Aparte, la alta porosidad de las mallas de PGA permite una buena difusión, neovascularización e infiltración celular 2 Desafortunadamente, las mallas de PGA se biodegradan rápidamente en unas pocas semanas y, por lo tanto, no pueden resistir las fuerzas mecánicas ejercidas sobre los materiales y guiar la forma de la construcción de bioingeniería durante períodos de cultivo más prolongados 23. Como resultado, los polímeros híbridos se han diseñado para combinar la memoria de forma y la estabilidad mecánica de los polímeros de degradación lenta con las propiedades de degradación rápida de polímeros, tales como PGA 4. Por ejemplo, se han explorado combinaciones de PGA con polímeros tales como (poli-4-hidroxibutirato) P4HB, PLA o PGA [5,6]. A diferencia del PGA, que se sintetiza químicamente, el P4HB es producido de forma natural por microorganismos, lo que le hace más difícil de sintetizar 7 Después de la implantación en el cuerpo, el P4HB se degrada principalmente por hidrólisis a granel produciendo 4HB, un componente normal del cuerpo de los mamíferos 8 En 1998, Shinoka et al. notificaron la implantación quirúrgica de injertos vasculares de ingeniería tisular en corderos, en la que se construyeron armazones a partir de células autólogas sembradas en injertos de PGA 9

Para la ingeniería tanto de válvulas cardíacas como de tejidos vasculares, el uso de mallas de PGA recubiertas con P4HB, es decir, la combinación de la característica termoplástica de P4HB y la alta porosidad de las mallas de PGA, ha sido investigado intensamente con resultados prometedores in vitro y en estudios preclínicos 10-12, 12a.

En 2006, Hoerstrup et al. proporcionó la primera evidencia de arterias pulmonares funcionales, vivas, diseñadas a partir de células vasculares sembradas en armazones de PGA/P4HB en un modelo de crecimiento en cordero 5

Si bien los intentos preliminares con injertos alogénicos y xenogénicos descelularizados solo han mostrado una repoblación limitada de células hospedadoras en ensayos preclínicos y clínicos, el concepto de válvulas cardíacas de ingeniería tisular, vivas y autólogas con capacidad de autorreparación y remodelación se han propuesto como una alternativa prometedora para superar dichas limitaciones.

Siguiendo el enfoque de ingeniería tisular in vitro, la fabricación exitosa de sustitutos cardiovasculares vivos autólogos similares a sus equivalentes nativas depende de tres elementos principales: 1) células autólogas que se asemejan a sus equivalentes nativas en fenotipo y funcionalidad, 2) una matriz soportada temporal biocompatible que promueve la resistencia del tejido hasta que la matriz extracelular producida por las células autólogas garantiza la funcionalidad por sí misma, y 3) condiciones de cultivo que permiten la formación y maduración del tejido mediante condiciones in vitro similares a un entorno fisiológico, es decir, estímulos bioquímicos (por ejemplo, factores de crecimiento) y físicos (por ejemplo, carga mecánica cíclica) adecuados que apoyan la formación de tejido in vitro e in situ. Sin embargo, este concepto de ingeniería de tejidos "clásico" que comprende procedimientos complejos de múltiples etapas, tales como la recolección de células, la expansión celular, la siembra en armazones, el cultivo en biorreactor in vitro y la coordinación de implantación con prioridad temporal de los delicados injertos autólogos de ingeniería vivos requiere grandes esfuerzos logísticos y financieros.

Además de algunos estudios piloto ocasionales basados en válvulas cardíacas descelularizadas 1415, hasta el momento no se ha notificado ninguna evidencia sistémica de que el concepto de ingeniería tisular de válvulas cardíacas se pueda aplicar en la rutina clínica.

El documento EP 1315796 divulga la producción de una arteria de ingeniería tisular a partir de células que se siembran y cultivan en armazones poliméricos degradables (véase también 16). Sin embargo, aquí se necesita una biopsia del receptor previsto del vaso autólogo.

Por lo tanto, es deseable proporcionar un método para producir una gran cantidad de productos sanitarios de ingeniería tisular disponibles listos para usar, especialmente injertos cardiovasculares, que no requieren ninguna biopsia humana o animal del receptor previsto como material de partida, pero se basan en una fuente de células animales o humanas homólogas segura, establecida, controlada y abundantemente disponible. Ventajosamente, el producto sanitario de ingeniería tisular previsto tendrá una vida útil prolongada y estará disponible en una gran variedad de tamaños y formas. El producto previsto será ventajosamente completamente biodegradable, permitirá una rápida repoblación por parte de las células del hospedador hacia un tejido similar al nativo, proporcionará capacidad regenerativa y de autorreparación y, lo que es más importante, será susceptible de crecimiento somático.

Objeto de la invención

La presente invención propone un enfoque innovador para producir matrices de ingeniería tisular homólogas descelularizadas como sustitutos de tejido, especialmente para aplicaciones cardiovasculares, en donde el método sugerido supera las desventajas de la técnica anterior ya que simplifica y acorta el proceso de producción al permitir la disponibilidad y reproducibilidad estándar y ya que minimiza el riesgo de infección o inflamación y reacciones inmunológicas después de la implantación.

Producción de armazones:

La invención se refiere a un método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular (TEMD), que comprende las siguientes etapas:

- En primer lugar, un sustrato, preferentemente una malla que comprende ácido poliglicólico (PGA), preferentemente una malla de PGA no tejida, se proporciona como material de partida para un armazón polimérico. Son posibles materiales alternativos siempre que ofrezcan una estructura porosa comparable que sea necesaria para un crecimiento celular hacia el interior suficiente. Posiblemente, una malla de PGA que comprende además ácido poliláctico (PLA) también puede cumplir estos requisitos.

- En una primera etapa de recubrimiento, la malla, que es, preferentemente, una malla PGA no tejida, se recubre con una primera solución de recubrimiento que contiene poli-4-hidroxibutirato (P4HB), que es un tipo de polihidroxialcanoato (PHA). Preferentemente, la primera solución de recubrimiento es una solución de bajo porcentaje de P4HB en un disolvente apolar, por ejemplo, tetrahidrofurano (THF), en donde el contenido de P4HB es preferentemente del 0,5 %-2 %, más preferentemente aproximadamente el 1 %. Esta primera etapa de recubrimiento se lleva a cabo, preferentemente, mediante recubrimiento por inmersión de la malla en la primera solución de recubrimiento, sin embargo, otros métodos de recubrimiento, tales como, por ejemplo, recubrimiento por pulverización, son posibles. El P4HB biodegradable transmite estabilidad mecánica en el producto final (además de la matriz extracelular, véase más adelante), que es necesaria para soportar la presión arterial justo después de la implantación, mientras que el PGA se degrada en gran medida ya durante la fase de biorreactor, como se describe más adelante.

El PLA puede servir como recubrimiento alternativo de la malla de PGA.

- Después de la primera etapa de recubrimiento, la malla recubierta se seca preferentemente al aire durante varias horas para que se evapore el disolvente.

- En caso de que el producto sanitario de ingeniería tisular que se vaya a producir sea un injerto vascular (o un injerto vascular que además comprenda una válvula cardíaca de ingeniería tisular que crezca sobre el mismo), la malla recubierta, después de la primera etapa de recubrimiento, se conforma a continuación en un tubo o cilindro hueco. Para este fin, la malla se envuelve preferentemente alrededor de un dador de forma, por ejemplo, un cilindro metálico con las dimensiones requeridas. Posteriormente, las áreas de borde se fijan, preferentemente superponiendo los dos bordes y calentando los bordes superpuestos a al menos 60 grados centígrados, preferentemente a aproximadamente 80 grados centígrados, por ejemplo, usando un soldador.

De este modo, el propio P4HB se usa como elemento de fusión, ya que es termoplástico con un punto de fusión de 60 grados. Esto tiene la ventaja de que el armazón polimérico tubular está compuesto completamente por sustancias biodegradables. Los métodos alternativos para fijar los bordes del tubo o cilindro hueco incluyen encolado, uso de agujas y tejido, así como enlaces poliméricos intermoleculares. El diámetro del tubo es variable y, por lo tanto, ajustable de acuerdo con el vaso objetivo en el que se vaya a implantar el TEVG (en términos de tipo de vaso y tamaño del paciente) eligiendo diferentes tamaños de parche de la malla como material de partida. El diámetro radial deseado del armazón polimérico tubular es de 1,0-2,5 cm, más preferentemente 1,2-1,8 cm, lo más preferentemente aproximadamente 1,6 cm, como en el caso de un injerto para una conexión cavopulmonar pediátrica.

- En el caso de un armazón polimérico tubular, se lleva a cabo una segunda etapa de recubrimiento: En esta segunda etapa de recubrimiento, el armazón polimérico tubular se recubre con una solución preferentemente de bajo porcentaje que contiene P4HB, preferentemente con un contenido del 1-3 %. más preferentemente aproximadamente el 2 % de P4HB. Preferentemente, el armazón polimérico tubular está recubierto solamente en su lado exterior, que está a lo largo de la superficie (camisa) exterior del armazón polimérico tubular. Para este fin, el armazón polimérico tubular está, preferentemente, montado en un dispositivo de sujeción. Esta segunda etapa de recubrimiento se lleva a cabo, preferentemente, mediante recubrimiento por pulverización, preferentemente con un dispositivo de pulverización tal como, por ejemplo, una pistola de aerógrafo. Esta etapa se puede repetir varias veces, de acuerdo con el espesor deseado del recubrimiento. Preferentemente, en la segunda etapa de recubrimiento, el recubrimiento por pulverización de la superficie exterior del armazón polimérico tubular se lleva a cabo tres veces. Preferentemente, el contenido final de P4HB en el armazón polimérico tubular es del 5 % -95 % (p/p) (porcentaje en peso), más preferentemente el 20-50 %, incluso más preferentemente el 22-45 %, y lo más preferentemente el 24-32 % (p/p) (porcentaje en peso). El contenido se determina preferentemente pesando el armazón antes de la primera etapa de recubrimiento y, si es aplicable, después de la segunda etapa de recubrimiento.

- Posteriormente (ya sea tubular o no), después del recubrimiento, el armazón polimérico se esteriliza, preferentemente mediante tratamiento con óxido de etileno. El tratamiento con alcohol y/o radiación se puede elegir como etapas de esterilización adicionales o alternativas.

- Después del recubrimiento y la esterilización, el armazón polimérico se incuba preferentemente en medio de cultivo celular, preferentemente durante 12-72 horas con fines de equilibrado antes de la siembra, para facilitar la unión celular posterior.

Se puede obtener un armazón polimérico con la estructura porosa deseada y que presente las propiedades deseadas (como se enumeran más adelante para el control de calidad) usando el método de producción y recubrimiento mencionado anteriormente. Más aún, se pueden usar técnicas alternativas tales como la fabricación aditiva usando dichos polímeros y métodos tales como FDM (modelado por deposición fundida) o Electroescritura por fusión para generar armazones poliméricos en dichas dimensiones con las respectivas propiedades estructurales y topográficas.

Una matriz inicial en forma de armazón polimérico de una malla de PGA recubierta con P4HB, preferentemente producida y recubierta de acuerdo con las etapas mencionados anteriormente, también se puede obtener fácilmente, es decir, comprarse "lista para usar" y usarse como sustrato para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular.

Aislamiento, expansión y siembra de células:

En la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con la presente invención, una suspensión celular que contiene células humanas aisladas y expandidas se aplica a, es decir, se siembra en el armazón polimérico. La producción de dicha suspensión celular, que comprende las células y una solución portadora de células, se describe adicionalmente más adelante.

Las células usadas para la siembra en el armazón polimérico son, preferentemente, células humanas, preferentemente seleccionado de un grupo que consiste en fibroblastos, miofibroblastos, células madre mesenquimatosas, células mononucleares y células progenitoras endoteliales. Las células humanas se derivan preferentemente de una fuente seleccionada de un grupo que consiste en: médula ósea, sangre, tejido adiposo, líquido amniótico, vellosidades coriónicas, matriz de cordón umbilical, sangre de cordón umbilical. Más preferentemente, las células humanas usadas para la siembra en el armazón polimérico son fibroblastos humanos, más preferentemente fibroblastos humanos derivados de vena de cordón umbilical humano (tejido de la vena). Las fuentes alternativas de fibroblastos incluyen, pero sin limitación, prepucio, dermis, vena aórtica/safena, arteria periférica, etc. (los tipos de células adecuados especialmente ventajosos para la ingeniería tisular de válvulas cardíacas se enumeran en 17). También se pueden usar células de una línea celular establecida.

Como alternativa a las células humanas, se pueden usar células animales de fuentes de tejido equivalentes para la producción de la suspensión celular.

Preferentemente al menos 80 millones de células, preferentemente 100-130 millones de células, más preferentemente, 115 millones /- 12 millones de células se siembran en el armazón polimérico dentro de una solución portadora de células. La densidad preferida de células en el armazón polimérico es de 0,5-5 millones de células/cm2, más preferentemente 2-4 millones de células/cm2, lo más preferentemente entre 2,2-3,3 millones de células/cm2.

Como se ha mencionado, es posible que las celdas se compren, es decir, se obtengan en una forma ya aislada. Si no se obtiene o compra de otra fuente, la provisión de células para sembrar el armazón polimérico es preferentemente también una parte del método de producción de un producto sanitario de ingeniería tisular (TEMD) de acuerdo con otro aspecto de la invención. En caso de que las células primero tengan que ser aisladas con el fin de sembrar el armazón, el método para producir un TEMD de acuerdo con la presente invención comprende además el aislamiento de células humanas, preferentemente seleccionado de un grupo que consiste en fibroblastos, células madre mesenquimatosas, células mononucleares y células progenitoras endoteliales, en donde las células humanas se derivan preferentemente de una fuente seleccionada de un grupo que consiste en: médula ósea, sangre, tejido adiposo, líquido amniótico, vellosidades coriónicas, dermis, matriz de cordón umbilical, sangre de cordón umbilical; Las células humanas usadas para sembrar el armazón polimérico se seleccionan preferentemente de un grupo que consiste en:

- fibroblastos, preferentemente derivados de uno de vena del cordón umbilical humano (tejido de la pared del vaso), dermis, prepucio, vena aórtica, vena safena o arteria periférica; más preferentemente derivados de vena del cordón umbilical humano;

- células madre mesenquimatosas, preferentemente derivadas de médula ósea, tejido adiposo, líquido amniótico, vellosidades coriónicas, matriz de cordón umbilical o sangre de cordón umbilical;

- células mononucleares, preferentemente derivadas de médula ósea;

- células progenitoras endoteliales, preferentemente derivadas de sangre, líquido amniótico o sangre de cordón umbilical;

- miofibroblastos, preferentemente derivados de la aorta, la vena del cordón umbilical, o de otro tejido del cordón umbilical (por ejemplo, gelatina de Wharton).

Las células se seleccionan mediante un medio selectivo y se adhieren a una placa de cultivo tisular. Las células se identifican mediante citometría de flujo con marcadores de superficie celular adecuados. A continuación, se deja que las células proliferen, en donde un tiempo de duplicación de menos de 100 horas sirve como criterio de control de calidad preferido, además del requisito de estar libres de patógenos. Preferentemente, se usan células homólogas. A diferencia del enfoque autólogo, el proceso de ingeniería tisular es independiente del paciente, por lo tanto, se pueden establecer bancos de células y seleccionar fuentes de células óptimas. Opcionalmente, se puede formar un banco de células maestras (MCB) expandiendo células aisladas y crioconservándolas en alícuotas múltiples e idénticas. En el caso de aislamiento de fibroblastos de la vena del cordón umbilical, con una biopsia de cordón umbilical, se puede establecer un MCB que sea suficiente para producir aproximadamente 700 TEMD que están disponibles listos para usar. En el caso de un MCB, se puede derivar un banco de células de trabajo (WCB) del MCB descongelando una alícuota de las células deseadas del MCB y cultivando adicionalmente y posteriormente crioconservando las células en alícuotas múltiples e idénticas para establecer un banco de células de trabajo.

Ya sean compradas, tomadas de una línea celular establecida, o aisladas en el curso de la producción del TEMD de acuerdo con la presente invención, las células aisladas se usan para la producción de una suspensión celular.

En cualquier caso, las células humanas aisladas deben expandirse, preferentemente en recipientes de cultivo durante preferentemente 5-8 días.

Preferentemente células de un número de pases bajo (preferentemente antes de P5, más preferentemente antes de P3) se recolectan y se usan para sembrar sobre el armazón polimérico, para minimizar el riesgo de pérdida del fenotipo diferenciado de las células. Después de alcanzar un número suficiente de células en cultivo para sembrar 70-180 millones de células, preferentemente 100-130 millones de células, lo más preferentemente aproximadamente 115 millones de células por producto sanitario (injerto), las células humanas expandidas se recolectan. Preferentemente, entre 20x106 células/ml y 60x106 células/ml, más preferentemente entre 35x106 células/ml y 45x 106 células/ml, y lo más preferentemente aproximadamente 41 x 106 células/ml se usan para sembrar en el armazón polimérico.

Las células recolectadas se usan para formar una suspensión celular añadiendo una solución portadora de células, preferentemente que comprende un agente gelificante, a las células humanas aisladas. La solución portadora de células contiene preferentemente trombina purificada y fibrinógeno purificado. Preferentemente, la suspensión celular se forma añadiendo primero fibrinógeno purificado a las células humanas aisladas para formar una primera suspensión celular y, en una segunda etapa, añadiendo trombina purificada a la primera suspensión celular para formar una segunda suspensión celular para siembra en el armazón polimérico. Inmediatamente después de la adición de trombina, se produce la coagulación, lo que da como resultado una unión de las células al armazón polimérico. El tiempo de coagulación preferido de la suspensión celular después de la adición de la solución portadora de células es de 5-8 minutos, que se controla preferentemente antes de sembrar la suspensión celular en el armazón polimérico.

En el caso de un armazón polimérico tubular, tal como para la producción de un injerto vascular de ingeniería tisular, preferentemente, la suspensión celular, cuya producción se describe más adelante, se aplica/siembra solamente sobre una superficie interior del armazón polimérico tubular. Para este fin, las células se siembran de manera homogénea a lo largo de la superficie interior del armazón polimérico tubular, que está formado como un cilindro hueco, dando como resultado una distribución homóloga de la suspensión celular sobre el sustrato. También se puede lograr una siembra homóloga de las células ya que el armazón polimérico tubular se sella temporalmente en los extremos abiertos, se llena con una suspensión celular y posteriormente se hace girar en un recipiente cilíndrico lleno de medio de cultivo celular.

Después de la siembra y antes de la incubación en el biorreactor, el armazón polimérico sembrado se incuba preferentemente en condiciones estáticas durante 12-48 horas, más preferentemente durante 16-24 horas, en el mismo medio de cultivo celular que en la fase de biorreactor como se menciona más adelante.

Fase de biorreactor:

Después de sembrar la suspensión celular en el armazón polimérico, el método para producir un TEMD de acuerdo con la presente invención comprende las siguientes etapas:

- El armazón polimérico sembrado se coloca en un biorreactor y se estimula mecánicamente mediante la exposición a un flujo pulsátil de intensidad incremental. Preferentemente, la estimulación mecánica durante esta "etapa de acondicionamiento" se lleva a cabo durante 10-30 días, preferentemente durante 15-25 días, lo más preferentemente durante 16-20 días. Si la duración de la estancia en el biorreactor es demasiado corta, se desarrolla tejido insuficiente, si la duración de la estancia es demasiado larga, el conducto comienza a contraerse (control visual). Preferentemente, el medio de cultivo contiene ácido ascórbico, es decir,

Vitamina C, preferentemente aproximadamente el 0,0225 % v/v (volumen/volumen), en donde más preferentemente, el medio de cultivo en el biorreactor es el mismo que el medio de cultivo usado durante la expansión celular, con la excepción de que se añade ácido ascórbico. De acuerdo con una realización preferida del método inventivo, el medio de cultivo dentro del biorreactor se cambia en intervalos definidos, preferentemente dos veces por semana. El resultado de esta fase de biorreactor, en la que el armazón sembrado se entrena o acondiciona para soportar condiciones fisiológicas, es el producto sanitario de ingeniería tisular inventivo. Durante la presencia del TEMD en el biorreactor, se forma una matriz extracelular (ECM). El rendimiento de células y, por lo tanto, la formación de ECM en el TEMD se monitoriza durante la fase de biorreactor. Para este fin, como se enumera más adelante, se controlan la composición del medio y los valores de lactato.

- Posteriormente, el TEMD se retira del biorreactor.

- Después de la retirada del TEMD del biorreactor, el TEMD se monta sobre un estabilizador. En el caso de un TEMD basado en un armazón polimérico tubular, el estabilizador es un estabilizador de conducto que preferentemente tiene una forma cilíndrica. Durante la fase de biorreactor, el TEMD tiene tendencia a contraerse, muy probablemente debido a la formación de ECM. Por lo tanto, el montaje sobre el estabilizador es útil para restablecer la forma original del TEMD después de una posible "contracción" durante la fase de acondicionamiento en el biorreactor. A continuación, se incuba el TEMD, preferentemente mientras está sobre el estabilizador, en condiciones estáticas, preferentemente durante 12-36 horas, en medio de cultivo celular, en donde el medio de cultivo celular tiene preferentemente la misma composición que en el biorreactor.

Descelularización, tratamiento con nucleasa y enjuague:

- Después de la reconformación, el TEMD se descelulariza. Durante la descelularización, las células se lisan y se eliminan usando una solución de lavado que comprende un detergente, tal como, por ejemplo, Tritón-X. Preferentemente, la solución de lavado contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), Triton X-100 y desoxicolato de sodio. Más preferentemente, la solución de lavado contiene PBS, EDTA 0,68 mM, Triton X-100 al 0,25 % (v/v) y desoxicolato de sodio al 0,25 % (p/p). La rigurosidad de la solución de lavado se elige de forma que se eliminen los componentes celulares solubles e indeseados mientras se conserva la matriz extracelular que habían generado las células durante la fase del biorreactor.

- Posteriormente, el TEMD se somete a un tratamiento con nucleasa. Esta digestión enzimática sirve para eliminar el ADN del TEMD. Para este fin, se puede usar una endonucleasa o una exonucleasa. Preferentemente, se usa benzonasa para la digestión del ADN. Para garantizar que solo queden restos mínimos de ADN, se realiza una etapa de control de calidad de determinación del contenido de ADN residual en el producto terminado como se describe más adelante.

Las etapas de descelularización y tratamiento con nucleasa ofrecen las ventajas de que, en primer lugar, se reduce la inmunogenicidad, dado que se usan células homólogas para la producción del TEMD. En segundo lugar, dado que no quedan células vivas en el TEMD final, el producto final se puede esterilizar, lo que es beneficioso para el paciente, ya que reduce el riesgo de infección. En tercer lugar, el producto final se puede liofilizar, envasar y almacenar y, por lo tanto, proporcionar de una manera "lista para usar".

- En una etapa final de producir un TEMD de acuerdo con la presente invención, el TEMD se enjuaga en una solución de enjuague, preferentemente en PBS, y a continuación en agua desionizada (ddH²O), para eliminar las sales. A continuación, el TEMD se transfiere preferentemente a un tubo con una tapa de filtro para un uso pospuesto.

Liofilización, envasado y esterilización:

Después del enjuague del TEMD, el método de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente al menos una, y más preferentemente todas las etapas siguientes:

- Para eliminar el agua del TEMD, es decir, para secar el TEMD, el TEMD se somete a un tratamiento de MofiMzación, es decir, criodesecación. Para este fin, el TEMD se liofiliza preferentemente en un tubo cerrado con tapa de filtro para reducir el riesgo de contaminación. Es necesario un programa de liofilización óptimo para evitar daños en el material, por ejemplo, debidos a la formación de cristales. La liofilización se lleva a cabo, preferentemente, de acuerdo con un programa de acuerdo con la figura 6. La liofilización permite el almacenamiento del TEMD en un estado completamente seco, facilitando el amontonamiento y el transporte.

- Más aún, el TEMD es envasado. Preferentemente, para proteger suficientemente el TEMD de daños mecánicos, contaminación y líquido o humedad, el TEMD liofilizado es envasado doblemente, por ejemplo, en una bolsa de esterilización, tubo, envase blíster, etc.

- Finalmente, el TEMD se somete a una etapa de esterilización, que se realiza preferentemente mediante tratamiento con óxido de etileno. Esto es más fácil si el producto ha sido liofilizado, ya que el óxido de etileno podría reaccionar con el agua. Los tratamientos de esterilización alternativos incluyen el tratamiento con etanol.

Sin embargo, esta forma de tratamiento más agresiva es más probable que dañe el material.

Control de calidad durante el proceso:

Se llevan a cabo varias etapas de control de calidad durante el proceso de producción del TEMD. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, el método para la producción de un TEMD comprende además al menos una, preferentemente al menos dos, más preferentemente todas las siguientes etapas durante el proceso:

- Medición de un contenido de P4HB en el armazón polimérico: Preferentemente, el contenido de P4HB en el armazón polimérico está en el intervalo del 20-50 % (p/p), más preferentemente el 22-45 %, lo más preferentemente el 24-32 %. Para este fin, la malla de PGA se pesa antes de la primera etapa de recubrimiento y, a continuación, después de la primera o después de la segunda etapa de recubrimiento, si corresponde, y los dos valores de peso se comparan entre sí.

- Asegurar la deposición homóloga de P4HB en la malla durante la primera etapa de recubrimiento, y a continuación también durante la segunda etapa de recubrimiento (si corresponde): Esto se asegura mediante el control visual durante cada etapa de recubrimiento.

- Examen de células humanas que se sembrarán en el armazón polimérico, preferentemente en términos de identidad y/o proliferación y/o viabilidad celular, y/o ausencia de patógenos: La identidad celular (fenotipado) se verifica preferentemente mediante citometría de flujo, usando análisis FACS con diversos marcadores de superficie celular. Los criterios de aceptación incluyen, pero sin limitación, un contenido de al menos el 80 % de células positivas para CD90 y positivas para CD26, y el 5 % o menos de células negativas para CD90 y positivas para CD31. Como alternativa al análisis FACS, se puede utilizar micromatriz.

- Viabilidad y proliferación: Esto se verifica midiendo el tiempo de duplicación.

Preferentemente, el tiempo de duplicación es inferior a 100 horas. El número de pase máximo preferido de células usadas para sembrar en el armazón polimérico es P3.

- Más aún, se debe verificar que las células estén libres de patógenos (por debajo del límite de detección (LOD)). - Control del tiempo de coagulación durante la preparación de la suspensión celular: Esto se lleva a cabo preferentemente controlando la cantidad del agente gelificante. Cuando se usa una combinación de trombina y fibrinógeno, se prefiere una relación de 1:1 (unidad: mg). El criterio de aceptación para el tiempo de coagulación es, preferentemente, de 5 a 8 minutos;

- Control del número de células humanas sembradas en el armazón polimérico: El número preferido de células sembradas estará entre 2-4 millones de células por cm2, preferentemente entre 2,3-3,3 millones de células por cm2 del área superficial del armazón polimérico.

- Control de aplicación homogénea de las células humanas al armazón polimérico: esto se lleva a cabo mediante control visual.

- Control de la composición del medio durante la fase de biorreactor (véase más adelante): El contenido de vitamina C preferentemente es del 0,0225 % (v/v) en el medio. La composición preferida del medio en el biorreactor es la siguiente: 500 ml de A-DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco avanzado), 50 ml de suero fetal bovino (FBS) (dando como resultado un 9 % (v/v)), 5 ml de Glutamax (200 mM) (dando como resultado 1,8 mM), 0,5 ml de gentamicina (10 mg/ml) (dando como resultado 0,009 mg/ml), 0,63 ml de vitamina C (20 %) (dando como resultado un 0,225 % (v/v)).

- Control del rendimiento de células durante la fase de biorreactor: Se usa lactato como marcador preferido para el rendimiento de células durante la fase de biorreactor. Para este fin, el valor de lactato se controla en cada cambio de medio. Los valores de lactato deben ser de al menos 1,5 mmol/l en el primer cambio de medio, al menos 2,5 mmol/l en el segundo cambio de medio, al menos 3,0 mmol/l en el tercer cambio de medio, al menos 3,5 mmol/l en el cuarto y quinto cambio de medio.

- Control de la formación de ECM durante la fase de biorreactor: La formación de ECM durante la fase de biorreactor se puede verificar, por ejemplo, mediante espectrometría de masas (MassSpec). El propéptido C-terminal de procolágeno de tipo I humano se separa durante la producción de ECM y es liberado en el medio por las células. Por lo tanto, este propéptido puede detectarse en el medio durante la fase de biorreactor y puede usarse como un marcador adecuado para la formación de ECM.

La verificación de la formación de ECM se lleva a cabo después de la incubación del TEMD en el estabilizador en un estado liofilizado, seco.

Control de calidad después de la producción del TEMD:

Más aún, preferentemente el TEMD terminado, es decir, el producto final, se somete a un control de calidad que comprende al menos una, preferentemente más de una, más preferentemente todas las siguientes etapas:

- Verificación de la esterilidad: La implantación del TEMD en el paciente receptor previsto debe llevarse a cabo en condiciones estériles. La esterilidad de las muestras de TEMD de un lote específico verifica que la esterilización durante el proceso de producción sea fiable y reproducible.

- Medición del contenido de endotoxinas: El criterio de aceptación para la cantidad de endotoxina es <0,29 UE/ml, que corresponde a <0,29 UE/parche ("UE" = unidades de endotoxina, "Parche" = punzón de biopsia con un diámetro de 8 mm y un área de 0,5 cm2). Las endotoxinas son componentes termoestables de la membrana celular externa de las bacterias. La presencia de endotoxinas en el producto final sería un indicio de contaminación bacteriana en el proceso y pondría en peligro la salud de los pacientes en los ensayos clínicos. La prueba se determina para verificar la ausencia de dichos restos bacterianos en el producto final.

- Medición del contenido de micoplasma: Los micoplasmas son bacterias muy pequeñas que pueden aparecer como contaminantes en cultivos celulares. Dado que los micoplasmas no son detectables por microscopía óptica y, en algunos casos, son resistentes a los antibióticos estándar, a menudo pasan desapercibidos e influyen en o alteran el crecimiento del cultivo celular respectivo. Una contaminación por micoplasma del cultivo de células humanas usado para la siembra del TEMD también podría conducir a una contaminación del producto final. Con el fin de verificar que el proceso de producción sea fiable y reproduciblemente libre de dicha contaminación (por debajo del límite de detección (LOD)), las muestras del conducto se analizan mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) para detectar la presencia de micoplasma. El LOD de qPCR se describe en Ph. Eur. 2.6.7 como concentración de ADN de micoplasma de 1000 GC por injerto vascular.

- Medición del contenido de ADN residual: El ADN restante en el TEMD podría ser un peligro para la salud o incluso poner en peligro la vida del receptor previsto. El contenido de ADN en las muestras de conducto de diferentes lotes se determina mediante qPCR para verificar que la eliminación de ADN se lleva a cabo de forma fiable y reproducible. Por lo tanto, un criterio de aceptación preferido para un contenido de ADN residual es inferior a 50 ng de ADNbc por mg de peso seco.

- Medición del contenido de agua residual: Para evitar la degradación hidrolítica y, por lo tanto, prolongar la vida útil del producto final, el TEMD se liofiliza (criodeseca) después de la etapa de descelularización. La determinación del contenido de agua en las muestras de TEMD de diferentes lotes se lleva a cabo para comprobar que la liofilización en el proceso de producción es fiable y reproducible. Preferentemente, el contenido de agua residual es inferior al 5 %.

- Medición del contenido de polímeros: El análisis de polímeros permite determinar si el contenido, la relación y/o el tamaño de la molécula (longitud de la cadena) de los polímeros son constantes a través de diversos lotes de TEMD producidos mediante el método de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, el TEMD descelularizado terminado tiene un contenido del 20-75 % (p/p) de P4HB, más preferentemente del 30-60 % (p/p) de P4HB, lo más preferentemente del 40-50 % de P4HB, y preferentemente del 0-30 % de PGA, más preferentemente el 10-20 % de PGA, lo más preferentemente el 15-18 % de PGA.

- Medición del contenido de hidroxiprolina: El colágeno es un componente estructural importante en el tejido de ECM del TEMD final de acuerdo con la presente invención. A diferencia de otras proteínas, el colágeno contiene el aminoácido hidroxiprolina (HYP). Por lo tanto, el contenido de colágeno puede medirse cuantificando el contenido de HYP en TEMD de diversos lotes. Esto debería garantizar una producción de ECM fiable y reproducible durante el proceso de producción entre diversos lotes. Un criterio de aceptación preferido para el contenido de hidroxiprolina es más de 5 pg/mg.

- Medición del contenido de proteínas mediante diversas proteínas marcadoras de la ECM, en donde preferentemente, se determina el contenido de las siguientes proteínas: fibronectina, cadena alfa-2(1) de colágeno, cadena alfa-2(VI) de colágeno. Más aún, preferentemente se determina el contenido de proteína de diversos marcadores de descelularización, preferentemente como sigue: superóxido dismutasa; proteína ribosómica ácida P2 de 60S; integrina alfa 5. El producto TEMD final comprende una distribución característica de proteínas. Las proteínas deseadas y/o no deseadas se cuantifican mediante análisis por espectrometría de masas (LC-MS/MS) de los péptidos y el uso de péptidos de referencia específicos. La detección de las proteínas deseadas, es decir, marcadores de la ECM, es representativa mediante la determinación de los fragmentos peptídicos de tres proteínas muy abundantes: fibronectina, cadena alfa-2(I) de colágeno, cadena alfa-2(VI) de colágeno. Por medio de esta medición, se verifica que el contenido de estas proteínas de la ECM estructurales es constante y reproducible entre diversos lotes de TEMD. El criterio de aceptación para el contenido de dichas proteínas de la ECM son: un contenido de fibronectina de al menos 100 fmol/pg, y/o un contenido de cadena alfa-2(I) de colágeno de al menos 200 fmol/pg, y/o un contenido de cadena alfa-2(VI) de colágeno de al menos 5 fmol/pg.

El contenido de proteínas no deseadas, es decir, marcadores de descelularización, se determina porque se cuantifican las siguientes proteínas no de la ECM representativas y/o sus fragmentos peptídicos: superóxido dismutasa, proteína ribosómica ácida P2 de 60S, integrina alfa-5. Por medio de esta medición, en la que el contenido de estas proteínas debe estar por debajo de un valor umbral específico, se muestra que la descelularización tuvo éxito. Esto permite verificar una descelularización constante y reproducible. Los criterios de aceptación para el contenido de dichas proteínas marcadoras de descelularización son: un contenido de superóxido dismutasa de menos de 3 fmol/pg, preferentemente de menos de 2 fmol/pg, y/o un contenido de proteína ribosómica ácida P2 de 60S de menos de 3 fmol/pg, preferentemente de menos de 2 fmol/pg, y/o un contenido de integrina alfa-5 de menos de 3 fmol/pg, preferentemente de menos de 2 fmol/pg.

Para las etapas de control de calidad mencionadas anteriormente, las muestras se analizan en forma seca después de la liofilización.

Para las siguientes pruebas biomecánicas, las muestras se rehidratan. El espesor del material se mide en estado liofilizado y después de la rehidratación:

El espesor de la pared del TEMD se mide preferentemente mediante análisis microscópico. El criterio de aceptación preferido para el espesor de la pared es de 0,1-20 mm, preferentemente 0,1-0,6 mm en forma seca y/o de 0,15-25 mm, preferentemente 0,15-0,7 mm en forma rehidratada, respectivamente, y más preferentemente 0,3-0,4 mm en forma seca y/o 0,35-0,5 mm en forma rehidratada, respectivamente. El espesor de la pared es crítico para la estabilidad mecánica del TEMD, especialmente cuando el TEMD es un injerto vascular. Se determinó el espesor de las muestras de TEMD de diversos lotes para verificar que los productos finales tuvieran un espesor de la pared mínimo requerido constante y reproducible. El espesor de la pared del TEMD de acuerdo con la presente invención se midió tanto en estado seco como rehidratado. El análisis microscópico del espesor se llevó a cabo en muestras de TEMD que posteriormente se sometieron a una prueba de retención de sutura o resistencia a la tracción (véase más adelante).

Para probar la capacidad de carga mecánica del TEMD, preferentemente se lleva a cabo una prueba de retención de sutura. La prueba de retención de sutura, en la que la fuerza necesaria para arrancar un hilo de una costura en el TEMD, sirve para analizar la deformación mecánica, a la que se somete el TEMD cuando se implanta en un paciente. De este modo se verifica que un TEMD producido de acuerdo con el método inventivo es capaz de resistir la deformación mínima requerida de manera reproducible. El criterio de aceptación preferido para la retención de sutura es al menos 0,5 N.

Otra prueba de deformación mecánica usada en el TEMD es la prueba de resistencia a la tracción. En ella, una muestra de TEMD se monta en un engranaje de tracción/herramienta de tracción y se estira hasta que el material se rasga y, por lo tanto, se puede determinar la deformación por tracción máxima. La prueba de resistencia a la tracción en muestras de TEMd de diversos lotes verifica que el método de producción produce productos finales que resisten de manera reproducible la deformación por tracción mínima requerida. El criterio de aceptación preferido para la resistencia a la tracción de un TEMD de acuerdo con la presente invención es 0,5 MPa.

Al llevar a cabo las etapas de control de calidad mencionadas, la producción se puede controlar en diversas etapas a lo largo del proceso (durante el proceso y después de la producción). Esto permite que el proceso se lleve a cabo de forma reproducible y fiable. Por lo tanto, para el control de calidad, es posible llevar a cabo pruebas aleatorias de muestras representativas del mismo lote.

Con el método descrito anteriormente, se produce un producto sanitario de ingeniería tisular superior, que comprende una estructura híbrida de un armazón polimérico biodegradable sintético y material biológico. La implantación de un producto sanitario de ingeniería tisular resultante permite la remodelación/repoblación adaptativa basada en células en el cuerpo del receptor hacia una estructura de tejido funcional/fisiológica similar a la nativa. Lo sorprendente es que el TEMD de acuerdo con la presente invención proporciona un estado intermedio optimizado de maduración de tejido de ingeniería, en comparación con los armazones poliméricos sintéticos, por un lado, y estructuras nativas descelularizadas maduras, por el otro. Esta "inmadurez controlada" da como resultado una composición/relación específica de componentes sintéticos, "neo-tejido" biológico y arquitectura en 3D (es decir, porosidad, disposición en capas) y tiene efectos ventajosos, incluyendo un mayor grado de crecimiento interno de células en el cuerpo del receptor, proporcionando así una gran ventaja frente a los injertos producidos de acuerdo con métodos de la técnica anterior.

Preferentemente, el producto sanitario de ingeniería tisular producido de acuerdo con el método descrito anteriormente se selecciona del grupo que comprende: un injerto vascular, un sustituto valvular (tal como una válvula cardíaca de tres valvas, es decir, una válvula sinusal) o un parche de tejido. El parche de tejido preferentemente es un parche de aumento, un parche de pared septal o un parche de pared pulmonar/aórtica. Sin embargo, son posibles usos alternativos tales como para la sustitución de un parche o un revestimiento de un tejido en diversos órganos del cuerpo humano o animal. Por ejemplo, un parche también puede servir como injerto de piel.

Un TEMD producido de acuerdo con la descripción anterior, puede usarse para el tratamiento de una enfermedad en un paciente humano o animal, preferentemente un paciente pediátrico humano. El tratamiento de la enfermedad no forma parte de la invención. La enfermedad a tratar puede ser un defecto congénito cardiovascular o un defecto de válvula cardíaca. En caso de un defecto de válvula cardíaca, el TEMD producido de acuerdo con el proceso descrito puede diseñarse como un sustituto para una válvula tricúspide, una válvula aórtica, una válvula mitral o una válvula pulmonar.

En el contexto de defectos cardiovasculares congénitos, el TEMD se puede usar para cirugía reconstructiva, tal como una conexión cavopulmonar en un procedimiento de Fontan o la corrección de cualquier otro defecto estructural (es decir, defectos septales o ventriculares, reconstrucción de los grandes vasos, etc.).

Un método para tratar una enfermedad que comprende un defecto tisular como se mencionó anteriormente, comprende la implantación de un TEMD producido de acuerdo con la descripción anterior como un injerto de sustitución. El TEMD producido de acuerdo con el proceso de la presente invención puede usarse en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular en un paciente humano o animal, que comprende la implantación de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una de las realizaciones descritas anteriormente en un cuerpo humano o animal. Preferentemente, el TEMD producido de acuerdo con el proceso de la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad que comprende un defecto de una conexión cavopulmonar en un paciente humano o animal, comprendiendo el método la implantación de un producto sanitario de ingeniería tisular como se ha descrito anteriormente en un cuerpo humano o animal preferentemente pediátrico.

Las realizaciones adicionales de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.

Descripción de las figuras

Las realizaciones preferidas de la invención se describen en lo sucesivo con referencia a los dibujos, que tienen el fin de ilustrar las presentes realizaciones preferidas de la invención y no el fin de limitar las mismas. En los dibujos,

La figura 1 muestra una visión general de proceso sistemática del método de producción de acuerdo con la presente invención, incluyendo diversas etapas de control de calidad;

La figura 2 muestra imágenes del proceso de fabricación de un armazón polimérico tubular para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una primera realización preferida en forma de injerto vascular de ingeniería tisular (TEVG), en donde en A, se muestra la formación de la malla en un tubo; en B, se muestra la fusión de los bordes superpuestos; en C, se muestra el recubrimiento por pulverización del armazón polimérico tubular; y en D, el armazón polimérico tubular final sobre un soporte antes de la esterilización;

La figura 3 muestra la siembra de las células humanas en la superficie interior del armazón polimérico tubular de la figura 2;

La figura 4 muestra las especificaciones de un programa de flujo de bomba para la fase de biorreactor;

La figura 5 muestra umbrales de medición de lactato como marcador del rendimiento de células durante la fase de biorreactor;

La figura 6 muestra los detalles del programa de liofilización usado preferentemente;

La figura 7 muestra los resultados de un análisis de espesor de material de un TEVG;

La figura 8 muestra en A, una configuración usada para la prueba de retención de sutura, y en B, la resistencia de retención de la sutura medida para el TEVG final;

La figura 9 muestra en A, una configuración usada para la prueba de resistencia a la tracción circunferencial, en B, gráficos en bruto de la prueba de tracción circunferencial, y en C, la resistencia a la tracción circunferencial del TEVG final indicada en MPa;

La figura 10 muestra un entorno experimental de una prueba de presión de estallido hidráulica, en donde en A, se muestra una visión general esquemática, y en B, se muestra la fijación del TEVG en el entorno experimental;

La figura 11 muestra los resultados de la prueba de presión de estallido (n=4) de acuerdo con la figura 10;

La figura 12 muestra el contenido de hidroxiprolina y prolina medido en TEVG de muestra (n=5);

La figura 13 muestra los resultados del análisis por MS "shotgun" de TEVG de muestra (n=12), seguido de la anotación de los péptidos detectados usando el término de ontología génica (GO) 0031012 que permite asignar los péptidos a la clase de proteínas de la ECM, así como la anotación de matrisoma. Se muestran las intensidades de proteína (cps) de las proteínas de la ECM, así como las intensidades de proteína de las proteínas del matrisoma central y asociadas al matrisoma;

La figura 14 muestra los resultados del análisis por MS "shotgun" de TEVG de muestra seguido de la anotación usando categorías del "Matrisome Project", en donde se muestran las intensidades de proteína (cps) de las proteínas que se asignaron a las clases indicadas;

La figura 15 muestra los resultados de un análisis por MS de marcadores de la ECM y marcadores de descelularización en TEVG de muestra, en donde en A, se muestra una cuantificación absoluta de los marcadores indicados usando péptidos de referencia de concentración conocida, y en B, se muestra una cuantificación relativa de los marcadores indicados;

La figura 16 muestra, en A, una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de un TEVG de muestra para determinar el contenido de PGA y P4HB, y en B, el contenido de P4HB y PGA medido en el TEVG de muestra;

La figura 17 muestra, en A, el radio de poro, en B, el volumen de poro, y en C, el área superficial específica medida en TEVG de muestra (n=8);

La figura 18 muestra la tinción con hematoxilina/eosina (H&E) y la tinción con azul alcián de un TEVG de muestra (n=1);

La figura 19 muestra un análisis por microCT de un TEVG de muestra (n=1);

La figura 20 muestra, de acuerdo con un segundo ejemplo de realización de la invención, una malla de PGA suturada en un stent sinusal de nitinol antes de la siembra y la válvula cardíaca de tres valvas de ingeniería tisular resultante después de la descelularización;

La figura 21 muestra, de acuerdo con un tercer ejemplo de realización de la invención, una malla PGA suturada sobre un anillo metálico de acero inoxidable antes de la siembra y el parche de ingeniería tisular resultante después de la descelularización.

Descripción detallada de la invención

En la figura 1, la visión general de proceso sistemática muestra las etapas del proceso para producir un armazón polimérico y aislar las células como procesos preparatorios. Los productos de estos procesos preparatorios, es decir, el armazón polimérico y/o las células aisladas, pueden prepararse individualmente como parte del método inventivo de producción del TEMD, como se describe adicionalmente más adelante, o por separado, se pueden comprar u obtener de otro modo para su uso en el método de producción del TEMD comenzando con el equilibrado del armazón polimérico y la expansión de las células aisladas para preparar ambos para la etapa de siembra de células.

Ejemplo 1: Producción de un injerto vascular de ingeniería tisular

Aislamiento y expansión de células:

Se recogieron cordones umbilicales humanos (n=3) después de nacimientos a término con consentimiento informado de acuerdo con la comisión de ética cantonal de Zúrich, Suiza [KEK-ZH-2009-0095] y se procesaron para el aislamiento de fibroblastos venosos de acuerdo con protocolos establecidos¹³. La vena del cordón umbilical se aisló quirúrgicamente y se cortaron pequeños trozos de tejido con unas tijeras de disección. Los trozos de tejido se colocaron en una placa de Petri estéril y se dejaron adherir al fondo durante 30 /- 5 minutos. El medio de cultivo se añadió suavemente y se cambió cada tres o cuatro días. La composición del medio preferido usado para la primera expansión de las células aisladas es la siguiente: 500 ml de A-DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco avanzado), 50 ml de Suero Fetal Bovino (FBS), 5 ml de Glutamax (200 mM), 1,25 ml de gentamicina (10 mg/ml). Los trozos de tejido se retiraron después del primer crecimiento celular después de aproximadamente 1-2 semanas de incubación en condiciones de incubadora humidificada al 5 % de CO² a 37 °C.

Fabricación de armazones:

La figura 2, que se refiere a la producción de un injerto vascular (o un injerto vascular que comprende un injerto valvular unido al mismo/en su interior) de acuerdo con un primer ejemplo de realización de la presente invención, muestra la formación y soldadura de un armazón polimérico tubular después del primera etapa de recubrimiento (no representada), así como la segunda etapa de recubrimiento y la fijación del armazón polimérico tubular en un soporte. Los sustratos de armazón (parches de armazón) se fabricaron a partir de mallas de ácido poliglicólico (PGA) no tejidas (gravedad específica 60-80 mg/cm³ ; Confluent Medical Technologies, Warkwick, Estados Unidos). Los parches de armazón usados tenían una forma rectangular de originalmente 6 cm x 9 cm. Cada malla de PGA se recubrió en un procedimiento definido de dos etapas. En primer lugar, la malla de PGA se sumergió en una solución de bajo porcentaje de P4HB (poli-4-hidroxibutirato al 1 % (P4HB; TEPHA, Inc., Estados Unidos) en una solución con el disolvente apolar tetrahidrofurano (Sigma-Aldrich, Suiza)) y se dejó evaporar el disolvente mediante secado al aire durante varias horas. Acto seguido, la malla de PGA se moldeó en un tubo envolviendo la malla alrededor de un cilindro metálico con las dimensiones requeridas, es decir, diámetro radial de 1,6 cm. Las partes/bordes superpuestos de la malla de PGA recubierta se fusionaron calentándolos a 80 grados centígrados usando un soldador. A continuación, el tubo se montó en un dispositivo de sujeción y se recubrió por fuera con una solución de bajo porcentaje de P4HB (2 % en tetrahidrofurano) usando un dispositivo de pulverización (pistola de aerógrafo) en varias etapas. Después de la segunda etapa de recubrimiento, el armazón polimérico tubular se acortó a una longitud de 8 cm (para adaptar el tamaño del armazón polimérico tubular al tamaño del dispositivo de sujeción usado posteriormente para la colocación en el biorreactor). La composición final del armazón polimérico, es decir, la relación de PGA a P4HB se determinó pesando el armazón polimérico antes y después del recubrimiento con P4HB.

Las etapas de producción de armazones son aplicables a la producción de todo tipo de TEMD, sin embargo, la etapa de formación del tubo se lleva a cabo únicamente en el caso de la producción de un injerto vascular (o de un injerto valvular si va a estar unido a o en la luz de un injerto vascular). La segunda etapa de recubrimiento es ventajosa para armazones tubulares y opcional para armazones no tubulares, tales como parches planos o injertos que comprenden solo el sustituto de la válvula sin ninguna porción similar a un vaso. Por consiguiente, el recubrimiento de P4HB es generalmente más delgado en los injertos que solo se recubrieron una vez en lugar de dos veces.

A continuación, el armazón polimérico se envasó y se esterilizó con óxido de etileno en 6±1 % de óxido de etileno y 94±1 % de CO² durante 180 minutos a 45±3 °C, > 40 % de humedad relativa y 2,6 ±0,1 bares para obtener esterilidad. La esterilización fue seguida por una fase apropiada de desorción/ventilación para eliminar el óxido de etileno residual del armazón.

Antes de la siembra, el armazón se equilibró mediante preincubación durante 12-72 horas en un medio de cultivo celular enriquecido con ácido ascórbico (vitamina C), que tenía la siguiente composición: 500 ml de A-DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco avanzado), 50 ml de suero fetal bovino (FBS) (dando como resultado un 9 % (v/v)), 5 ml de Glutamax (200 mM) (dando como resultado 1,8 mM), 0,5 ml de gentamicina (10 mg/ml) (dando como resultado 0,009 mg/ml), 0,63 ml de vitamina C (20 %) (dando como resultado un 0,225 % (v/v)).

La porosidad de un armazón polimérico de muestra (DC16-90) se analizó mediante análisis de adsorción de gas, es decir, el método Brunauer-Emmett-Teller (BET), que se aplica a los sistemas de adsorción multicapa: De este modo, se midió un radio de poro promedio (BET) de 50 Angstrom, en un área superficial específica de 12 m2/g, y un volumen de poro total de 0,03 cm3/g.

Siembra de células:

Después de la preincubación/equilibrado del armazón polimérico, los fibroblastos humanos aislados se sembraron sobre armazones usando una densidad de 2,2-3,3 millones de células/cm2

Para este fin, las células se suspendieron primero en fibrinógeno purificado (Sigma-Aldrich, Suiza) (10 mg/ml de proteína activa), seguido de la adición de trombina purificada (Sigma-Aldrich, Suiza). Por armazón, se usaron 1,2 mg de fibrinógeno y 1,2 U (unidades) de trombina (relación 1:1), dando como resultado un tiempo de coagulación óptimo de aproximadamente 5-8 minutos. Inmediatamente después de la coagulación, la suspensión celular se sembró sobre los armazones estériles de manera homogénea.

En la figura 3, se muestra un patrón preferido de aplicación/siembra de la suspensión celular en la superficie cilíndrica interna (luz) de un armazón polimérico tubular. Para este fin, el soporte se fijó manualmente con una mano y con la otra mano se sembró homogéneamente la suspensión celular en la superficie interior de la malla. Son posibles otros patrones que consiguen la deseada distribución homogénea de células. Las etapas de siembra son aplicables a la producción de todo tipo de TEMD.

Después de la siembra, el armazón polimérico sembrado se incubó primero en condiciones estáticas durante aproximadamente 16 horas en el mismo medio de cultivo celular mencionado anteriormente, también enriquecido por la adición de ácido ascórbico (vitamina C) de la siguiente manera: 500 ml de A-DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco avanzado), 50 ml de suero fetal bovino (FBS) (dando como resultado un 9 % (v/v)), 5 ml de Glutamax (200 mM) (dando como resultado 1,8 mM), 0,5 ml de gentamicina (10 mg/ml) (dando como resultado 0,009 mg/ml), 0,63 ml de vitamina C (20 %) (dando como resultado un 0,225 % (v/v)).

Acondicionamiento en biorreactor:

El armazón polimérico sembrado se colocó, a continuación, en un dispositivo de sujeción en un biorreactor y se expuso a un flujo pulsátil de intensidad incremental durante los siguientes 21+/-4 días en el mismo medio de cultivo celular mencionado anteriormente enriquecido mediante la adición de ácido ascórbico (vitamina C). El acondicionamiento durante la fase de biorreactor es aplicable a la producción de todo tipo de TEMD.

En la figura 4, se representan las especificaciones para un programa de flujo de bomba preferido para un TEMD, especialmente para un TEVG, mostrando la generación de flujo pulsátil por aumento incremental del volumen bombeado durante la fase de biorreactor.

La figura 5 muestra una tabla con los umbrales mínimos de contenido de lactato en mmol/l en cada intervalo de cambio de medio. El lactato sirve como marcador para el rendimiento de células durante la fase de biorreactor. Durante la fase de biorreactor, la formación de ECM se verificó por espectrometría de masas, usando Propéptido C-Terminal de Procolágeno de Tipo I Humano como marcador en el medio de cultivo celular.

Después de la retirada del biorreactor, el TEVG del ejemplo 1 se colocó en un estabilizador de conducto y se incubó en condiciones estáticas durante 12-36 horas en el mismo medio de cultivo celular que en el biorreactor. Esta etapa es aplicable también a la producción de otros tipos de TEMD.

Descelularización:

Después de la incubación, el TEVG del ejemplo 1 se descelularizó. Durante la descelularización, las células se lisaron y eliminaron usando una solución de lavado que se compone de la siguiente manera:

continuación

En una etapa adicional, el TEVG descelularizado del ejemplo 1 se trató con la nucleasa Benzonase para eliminar el ADN por digestión enzimática. Antes de la liofilización, el TEVG descelularizado se enjuagó en ddH²O para eliminar las sales, se cortó a una longitud de 7 cm, y posteriormente se transfirió a un tubo de 50 ml con tapa de filtro y, a continuación se liofilizó (criodesecó). Esta etapa de descelularización también es aplicable a la producción de otros tipos de TEMD.

Liofilización:

En la figura 6, se representa un programa preferido para la liofilización. Este programa evita daños al material, por ejemplo, debidos a la formación de cristales. El producto final se envasó doblemente en bolsas de esterilización y se esterilizó mediante tratamiento con óxido de etileno en una empresa externa (QMedics). Esta etapa de liofilización también es aplicable a la producción de otros tipos de TEMD.

Control de calidad de TEVG:

El producto final, es decir, el TEVG descelularizado, liofilizado y esterilizado, se sometió a un control de calidad de acuerdo con las siguientes etapas: verificación de esterilidad; verificación del contenido de endotoxinas; verificación del contenido de micoplasma; verificación de ADN residual; verificación del contenido de agua residual; verificación del contenido de polímeros; verificación del contenido de hidroxiprolina; verificación del contenido de proteínas: fibronectina, cadena alfa-2(I) de colágeno, cadena alfa-2(VI) de colágeno, marcadores de descelularización (superóxido dismutasa, proteína ribosómica ácida P2 de 60S, integrina alfa 5); medición del espesor por análisis microscópico (seco/rehidratado); prueba de retención de sutura; prueba de resistencia a la tracción. Estas etapas de control de calidad son aplicables también a la producción de otros tipos de TEMD.

Un lote de producción de TEVG consistía en 6 injertos. Uno de ellos se cortó para la producción de muestras representativas y los trozos se envasaron por separado, se liofilizaron y se esterilizaron, en paralelo a los 5 injertos restantes. Los trozos fueron se usaron, a continuación, para los diversos análisis, incluyendo la esterilidad. A los efectos de las pruebas, el envase se retiró de nuevo. Las muestras de TEVG se analizaron en forma seca después de la liofilización. Para las pruebas biomecánicas, las muestras se rehidrataron.

El espesor de la pared del TEVG se determinó en estado liofilizado y después de la rehidratación mediante un microscopio de medición (Vision Engineering, HAWK 15-3) de acuerdo con la norma ISO7198:2016 en Endolab Mechanical Engineering GmbH, Thansau/Rosenheim, Alemania. El análisis de siete TEVG reveló un espesor promedio de 342 /- 57 pm, como se muestra en la figura 7. Después de la rehidratación durante 20 minutos en NaCl al 0,9 %, el espesor de la pared aumentó en un 16 % a 397 /- 64 pm. La medición del espesor de la pared también es aplicable a la producción de otros tipos de TEMD.

Para evaluar otras propiedades mecánicas de un TEMD producido de acuerdo con el método de la presente invención, la resistencia a la tracción circunferencial del TEVG producido de acuerdo con el ejemplo 1 se evaluó usando una máquina de pruebas de tracción que cumplía con los requisitos de la norma ISO 5081 (Equipo usado: Célula de carga, Instron, 2530-437; Máquina de prueba universal, Instron, 5944). Se cortó una muestra del TEVG final normal al eje largo y se midió la longitud de la muestra (L). Para el análisis biomecánico, la muestra se rehidrató durante 20 minutos en una solución de NaCl al 0,9 %. La muestra de TEVG en su forma tubular se colocó en dos clavijas redondeadas (véase la figura 9A). La muestra se estiró a una velocidad uniforme de 100 mm/minuto hasta que se alcanzó el punto de rotura. Se determinó la carga de rotura (T^máx) y la Resistencia a la Tracción Circunferencial determinada por la siguiente fórmula: Resistencia a la tracción circunferencial = T^máx/2*L. Las muestras TEVG tubulares (n=5 de 3 ciclos de producción diferentes) con una longitud promedio de 1,4 cm se rompieron con una carga promedio de 8,4 N, dando como resultado una resistencia circunferencial de 0,29 /- 0,05 N/mm. Basándose en el espesor de la pared de las muestras, se calculó una resistencia a la tracción circunferencial media de 0,87 /- 0,21 MPa (véase la figura 9C).

La hemodinámica por el flujo sanguíneo y la presión arterial inducen fuerzas biomecánicas en las paredes de los vasos. Para evaluar la elasticidad mecánica del TEVG, se han realizado pruebas de estallido para evaluar las condiciones en las cuales se induce la ruptura del TEVG. Para este fin, se rehidrató un TEVG completo del ejemplo 1 durante 20 minutos en una solución de NaCl al 0,9 %. Después de la rehidratación, el injerto vascular se aplicó a la configuración de prueba y se expuso a presiones hidráulicas crecientes usando agua destilada como elemento fluido. Durante la prueba se registró el aumento de presión. Se aumentó la presión hasta que se rompió el TEVG (véase la figura 10). A presiones hidráulicas crecientes, se observó la formación de pequeños orificios. A presiones hidráulicas de 264 ± 52 mmHg se observó la rotura del TEVG (véase la figura 11).

Para determinar el contenido de agua residual en el TEVG, se lleva a cabo una titulación de Karl Fischer de acuerdo con Ph. Eur. 2.5.12. El contenido de agua residual en 7 TEVG derivados de 5 lotes de producción diferentes se determinó en un promedio de 4,1 /- 0,5 % (p/p) (no representado).

El contenido de HYP en 5 TEVG (de tres lotes de producción diferentes) se analizó de acuerdo con Ph. Eur. 2.2.56. y fue en promedio 11,7 /- 0,8 pg/mg (p/p; promedio /desv. est.) (véase la figura 12).

Para determinar la composición proteica del TEVG descelularizado, se realizó análisis por espectrometría de masas (MS). Para este fin, las muestras TEVG se digirieron primero (protocolo en matriz: reducción de proteínas, alquilación y digestión con tripsina) y posteriormente se adquirieron en modo LC-MS/MS "shotgun". Los datos de LC-MS/MS se buscaron usando una base de datos humana UniProt, y las proteínas de la ECM se anotaron basándose en el término GO 0031012 y con las categorías de proteínas funcionales del "Matrisome Project", para caracterizar con más detalle la composición de la ECM presente en TEVG (véase la figura 13). El Matrisome Project permite la predicción del conjunto de proteínas de la matriz extracelular y asociadas a la ECM (http://web.mit.edu/hyneslab/matrisome/). La anotación de proteínas basada en las categorías del "Matrisome Project" resultó ser más selectiva en comparación con el término GO 0031012. La anotación "Matrisome Project" también permite una clasificación de proteínas en las siguientes categorías: glucoproteínas de la ECM; colágenos; reguladores de la ECM; proteínas afiliadas a la ECM; proteoglicanos; factores secretados (véase la figura 14).

Las etapas de evaluación de propiedades mecánicas adicionales descritas anteriormente para el TEVG de acuerdo con el ejemplo 1 también son aplicables a la producción de otros tipos de TEMD.

Para cuantificar marcadores de la matriz extracelular presentes en TEVG de forma absoluta, se usaron péptidos de referencia para tres proteínas marcadoras de la ECM (cadena alfa-2(I) de colágeno; cadena alfa-2(VI) de colágeno y fibronectina). Más aún, para demostrar que el proceso de descelularización durante la producción del TEVG funcionó de manera efectiva, se usaron péptidos de referencia para tres marcadores de descelularización (proteína ribosómica ácida P2 de 60S; integrina alfa-5 y superóxido dismutasa [Mn] mitocondrial)". La cuantificación absoluta de estos marcadores de descelularización y de la ECM se representa en la figura 15A. Se analizaron marcadores adicionales de la ECM y de descelularización, sin embargo esta cuantificación es solo relativa ya que no se aplicaron péptidos de referencia para su cuantificación (véase la figura 15B). En general, el análisis de estos marcadores de descelularización y de la ECM confirmó que la etapa de descelularización realizada durante la producción de TEVG elimina los componentes celulares no deseados mientras conserva la ECM.

El TEMD de acuerdo con la presente invención está compuesto por proteínas humanas (principalmente proteínas de la ECM) y los polímeros biodegradables poli-4-hidroxibutirato (P4HB) y ácido poliglicólico (p Ga ). La producción del TEMD inventivo comienza con la producción de armazones poliméricos (compuestos por PGA y P4HB) que posteriormente se siembran con células. Con la siembra de células en el armazón polimérico se inicia la degradación de los polímeros por hidrólisis, especialmente para el PGA de degradación rápida. Para monitorizar los contenidos de los polímeros en el producto TEMD final, los polímeros del TEVG del ejemplo 1 se extrajeron del producto final usando un eluyente y posteriormente se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en la empresa contratada PSS Polymer Services GmbH, Maguncia, Alemania. La cromatografía de exclusión por tamaño caracterizó la distribución de peso molecular de los extractos y calibrando con muestras puras de los materiales de partida poliméricos (PGA, P4HB; véase la figura 16 A) de concentración conocida, el contenido de cada polímero se evaluó de manera semicuantitativa. Usando este enfoque, se determinó un contenido de P4HB de 40,7 /- 4,6 % (p/p) y un contenido de PGA de 17,1 /- 4,1 % (p/p) en las muestras de TEVG analizadas (n=7 de cinco lotes de producción; promedio /- desv. est.) (véase la figura 16B).

En la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de una muestra de injerto vascular para determinar el contenido de PGA y P4HB de acuerdo con la figura 16A, el contenido de PGA y P4HB se evaluó añadiendo soluciones de polímero puro (PGA o P4HB, indicadas con flechas) de concentraciones conocidas.

El análisis de adsorción de gas se usa comúnmente para medir el área superficial y la porosidad. Esto implica exponer materiales sólidos a gases (generalmente se emplea gas nitrógeno) en una variedad de condiciones y evaluar la captación de peso o el volumen de la muestra. El análisis de estos datos proporciona información sobre las características físicas del sólido, que incluyen: porosidad, volumen total de poro y tamaño de poro. La porosidad del TEVG se determinó por el método de Barrett, Joyner y Halenda (BJH) que se aplica al intervalo de tamaño de mesoporo y macroporo pequeño. Los resultados se muestran en la figura 17.

Para analizar la composición estructural del TEVG y visualizar componentes particulares, el análisis histológico estándar se realizó en el Institut Mutualiste Montsouris (IMM), París, Francia. Se usó una tinción con hematoxilina/eosina (H&E) para visualizar la estructura del tejido y para confirmar la ausencia de núcleos/ADN y se usó una tinción con azul alcián para visualizar los glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos son abundantes en la ECM y, por lo tanto, son un marcador de la ECM. Las tinciones representativas con H&E y azul alcián del TEVG que se muestran en la figura 18 confirman la ausencia de núcleos y la presencia de la ECM, respectivamente. En ambas tinciones es discernible la naturaleza porosa del TEVG. El exterior del TEVG, que en particular se compone de varias capas de P4HB que se pulverizan durante la producción del armazón polimérico, está marcado con la flecha roja en la figura 18.

Para analizar el espesor de la pared y la estructura de TEVG, se realizó microtomografía de rayos X (microCT) (véase la figura 19). La microCT usa rayos X para crear secciones transversales de un objeto físico que se pueden usar para recrear un modelo virtual (modelo en 3^d ) sin destruir el objeto original. El prefijo micro-(p) se usa para indicar que los tamaños de píxel de las secciones transversales están en el intervalo de micrómetros.

Las etapas de control de calidad descritas anteriormente son aplicables a la producción de otros tipos de TEMD.

Implantación del TEVG (no forma parte de la invención):

La implantación del TEVG del ejemplo 1 se va a realizar mediante anastomosis a la IVC (vena cava inferior) y la arteria pulmonar mediante ligadura con sutura. Para evaluar la estabilidad mecánica y, por tanto la seguridad de la sutura, se han realizado pruebas de retención de sutura. Para este fin, una sutura (hilo de acero inoxidable con un diámetro de 0,14 mm, que corresponde a la sutura Prolene 5/0) se insertó a 2 mm del extremo de una muestra de TEVG rehidratada a través de una pared del producto sanitario para formar un medio bucle (véase la figura 8A). Se tiró de la sutura a una velocidad de 100 mm/minuto y se registró la fuerza requerida para hacer pasar la sutura a través del producto sanitario (Equipo usado: Célula de carga, Instron, 2530-437; Máquina de prueba universal, Instron, 5944). Se midió la resistencia de retención de la sutura de 7 TEVG y en promedio se tuvo que aplicar una fuerza de 0,82 /- 0,25 N (correspondiente a 82 g) para tirar de la sutura a través del producto sanitario (véase la figura 8B). La evaluación de la estabilidad mecánica mencionada anteriormente también es aplicable a la producción de otros tipos de TEMD.

Ejemplo 2: Producción de una válvula sinusal de ingeniería tisular

De acuerdo con un segundo ejemplo de realización de la presente invención, se fabricó un armazón de válvula cardíaca de tres valvas a partir de una malla de PGA no tejida y finalmente se integró en un stent sinusal de nitinol mediante el uso de suturas continuas (como se muestra en la figura 20). El armazón de PGA se recubrió con P4HB al 1 %, se secó durante la noche y se esterilizó con EtOH, Pen-Strep (penicilina-estreptomicina; 10.000 U/ml), y anfotericina. Por último, el armazón de PGA se incubó durante la noche a 37 °C con un medio de crecimiento optimizado que comprendía DMEM avanzado complementado con 1 % de solución Pen-Strep, 1 % de Glutamax, 10 % de FBS y 130 mg de vitamina C (por 500 ml).

Después, la válvula se sembró con fibroblastos dérmicos humanos (1x106 células/cm2) usando fibrina como portador de células. Después de la siembra, se colocó el armazón, preferentemente en una configuración cerrada de las valvas, en un sistema duplicador de doble pulso durante 4 semanas de cultivo. Durante el cultivo de la válvula, se utilizaron insertos para imponer una geometría de válvula fisiológica. Se usaron vitamina C o TGF-p como suplementos opcionales en el medio para mejorar la producción de la ECM. El proceso de descelularización se realizó como se describe para el ejemplo 1.

La válvula sinusal, que está diseñada para la sustitución de una válvula sinusal respectiva en la arteria pulmonar, sirve como ejemplo para la producción de injertos de sustitución de válvulas cardíacas.

Ejemplo 3: Producción de un parche de ingeniería tisular

De acuerdo con un segundo ejemplo de realización de la presente invención, se cortó un armazón de PGA (circular o en tiras) y se recubrió con P4HB al 1 %. Después del secado durante la noche, el parche se suturó sobre un anillo metálico de acero inoxidable (como se muestra en la figura 21) y se esterilizó con EtOH, Pen-Strep y anfotericina. Acto seguido, el parche se incubó durante la noche a 37 °C con un medio de crecimiento optimizado que comprendía DMEM avanzado complementado con 1 % de solución Pen-Strep, 1 % de Glutamax, 10 % de FBS y 130 mg de vitamina C (por 500 ml). Después, se sembraron fibroblastos dérmicos humanos sobre el parche usando fibrina como portador de células. Después de la siembra, el parche se colocó en un pequeño frasco con medio y se cultivó durante 4 semanas usando un agitador orbital para mejorar la distribución del medio. También para la producción del parche, se usaron vitamina C o TGF-p como suplementos opcionales en el medio para mejorar la producción de la ^e C^m . El proceso de descelularización se realizó como se describe para el ejemplo 1.

REFERENCIAS

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13 Hoerstrup, S. P. et al. Living, autologous pulmonary artery conduits tissue engineered from human umbilical cord cells. Ann Thorac Surg 74, 46-52; discusión 52 (2002).

14 Hoerstrup, S.P. et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT in pediatric patients. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2003; 23:1002-6.

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16 Niklason et al., Functional arteries grown in vitro, Science, 1999; 284: 489-93.

17 D. Schmid, S.P. Hoerstrup, "Tissue engineered heart valves based on human cells", Swiss Med. Wkly. 2005; 135: 618-623.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular, que comprende las siguientes etapas:

A. ) proporcionar un armazón polimérico, comprendiendo dicho armazón polimérico un sustrato que comprende ácido poliglicólico y un recubrimiento que comprende poli-4-hidroxibutirato;

B. ) aplicación de una suspensión celular que contiene células aisladas y expandidas al armazón polimérico, produciendo así un armazón polimérico sembrado;

C. ) colocación del armazón polimérico sembrado en un biorreactor y estimulación mecánica por exposición a un flujo pulsátil de intensidad incremental, formando así un producto sanitario de ingeniería tisular que comprende una matriz extracelular;

D. ) montaje del producto sanitario de ingeniería tisular sobre un estabilizador de conducto e incubación en condiciones estáticas en un medio de cultivo celular;

E. ) descelularización del producto sanitario de ingeniería tisular en una solución de lavado que comprende un detergente;

F. ) tratamiento con nucleasa del producto sanitario de ingeniería tisular;

G. ) enjuague del producto sanitario de ingeniería tisular.

2. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa A.) comprende las siguientes etapas:

- proporcionar una malla que comprende ácido poliglicólico como sustrato para un armazón polimérico;

- en una primera etapa de recubrimiento, recubrir la malla con una solución que contiene poli-4-hidroxibutirato, preferentemente mediante recubrimiento por inmersión;

- esterilizar el armazón polimérico, preferentemente mediante tratamiento con óxido de etileno;

- y preferentemente incubar el armazón polimérico, preferentemente durante 12-72 h en medio de cultivo celular.

3. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que el producto sanitario de ingeniería tisular es un injerto vascular, y que después de la primera etapa de recubrimiento y antes de la esterilización, el método comprende las siguientes etapas:

- conformar la malla recubierta en un tubo, y preferentemente fijar los bordes de la malla calentándolos preferentemente a al menos 60 grados centígrados, preferentemente a aproximadamente 80 grados centígrados, preferentemente usando un soldador, formando así un armazón polimérico tubular;

- en una segunda etapa de recubrimiento, recubrir el armazón polimérico tubular, preferentemente solo en un lado exterior del tubo, con una solución que contiene poli-4-hidroxibutirato, preferentemente mediante recubrimiento por pulverización.

4. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que en la etapa B), las células contenidas en la suspensión celular son células humanas seleccionadas de un grupo que consiste en fibroblastos, células madre mesenquimatosas, células mononucleares y células progenitoras endoteliales, en donde las células se derivan preferentemente de una fuente seleccionada de un grupo que consiste en médula ósea, sangre, tejido adiposo, líquido amniótico, vellosidades coriónicas, matriz de cordón umbilical y sangre de cordón umbilical, en donde las células en la suspensión celular más preferentemente son fibroblastos humanos, lo más preferentemente fibroblastos humanos derivados de una vena del cordón umbilical humano.

5. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que en la etapa B.), la suspensión celular que contiene células aisladas y expandidas se aplica solo a una superficie interior del armazón polimérico tubular.

6. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que en la etapa B.) al menos 0,5-5 millones de células/cm2, preferentemente 2-4 millones de células/cm2, más preferentemente 2,2-3,3 millones de células/cm2 se siembran en el armazón polimérico.

7. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la suspensión celular aplicada en la etapa B.) se prepara mediante un método que comprende al menos una, preferentemente más de una, y lo más preferentemente todas las siguientes etapas:

- aislamiento de las células, preferentemente células humanas seleccionadas de un grupo que consiste en fibroblastos, células madre mesenquimatosas, células mononucleares y células progenitoras endoteliales, en donde las células se derivan preferentemente de una fuente seleccionada de un grupo que consiste en médula ósea, sangre, tejido adiposo, líquido amniótico, vellosidades coriónicas, matriz de cordón umbilical, sangre de cordón umbilical, en donde lo más preferentemente las células son fibroblastos humanos derivados de una vena del cordón umbilical humano;

- expansión de las células aisladas, preferentemente en al menos un recipiente de cultivo durante 5-8 días; - recolección de las células aisladas;

- formar una suspensión celular añadiendo una solución portadora de células, preferentemente que comprende un agente gelificante, más preferentemente que comprende fibrinógeno y trombina purificada, a las células aisladas, en donde la suspensión celular se forma preferentemente añadiendo primero fibrinógeno purificado a las células aisladas para formar una primera suspensión celular y, posteriormente, añadiendo trombina purificada a la primera suspensión celular para formar una segunda suspensión celular que, a continuación, sirve como suspensión celular para la aplicación al armazón polimérico en la etapa B.).

8. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el método comprende además al menos una de las siguientes etapas después de la etapa de enjuague del producto sanitario de ingeniería tisular, más preferentemente más de una de las siguientes etapas, y más preferentemente todas las siguientes etapas:

- liofilización del producto sanitario de ingeniería tisular;

- envasado del producto sanitario de ingeniería tisular;

- esterilización del producto sanitario de ingeniería tisular, preferentemente mediante tratamiento con óxido de etileno.

9. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el método comprende además una o más, preferentemente todas las siguientes etapas de control de calidad durante el proceso:

- determinación de un contenido de P4HB en el armazón polimérico, en donde el criterio de aceptación para el contenido de P4HB en el armazón polimérico es que el contenido de P4HB en el armazón polimérico esté en el intervalo del 5-95 % p/p), preferentemente del 20-50 %, más preferentemente del 22-45 %, lo más preferentemente del 24-32 %;

- asegurar la deposición homóloga de P4HB sobre la malla del armazón polimérico;

- examen de las células que se van a sembrar en el armazón polimérico antes de la siembra en términos de identidad, proliferación, viabilidad celular y ausencia de patógenos;

- control del tiempo de coagulación de la suspensión celular;

- control del número de células sembradas en el armazón polimérico;

- control de la aplicación homogénea de las células al armazón polimérico;

- control de la composición del medio en el biorreactor;

- control del valor de lactato en cada cambio de medio en el biorreactor;

- control de la formación de matriz extracelular en el biorreactor, preferentemente mediante espectrometría de masas, preferentemente usando propéptido C-terminal de procolágeno de tipo I humano como marcador adecuado.

10. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con la reivindicación 9, en donde durante el control de calidad de las células que se van a sembrar en el armazón polimérico antes de la siembra, la identidad celular se determina mediante citometría de flujo, y/o en donde la capacidad de proliferación se determina midiendo el tiempo de duplicación, en donde el criterio de aceptación preferido para el tiempo de duplicación es inferior a 100 horas.

11. Método para la producción de un producto sanitario de ingeniería tisular de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el método comprende además al menos una etapa de control de calidad del producto sanitario de ingeniería tisular terminado, en donde al menos una, preferentemente al menos dos, más preferentemente, todas las siguientes etapas de control de calidad se realizan en el producto sanitario de ingeniería tisular terminado:

- verificación de la esterilidad;

- medición del contenido de endotoxinas;

- medición del contenido de micoplasma;

- medición del contenido de ADN residual;

- medición del contenido de agua residual;

- medición del contenido de polímeros;

- medición del contenido de hidroxiprolina;

- medición del contenido de proteínas, preferentemente determinando un contenido de proteínas de la matriz extracelular, más preferentemente de al menos una de las siguientes proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: fibronectina, cadena alfa-2(I) de colágeno, cadena alfa-2(VI) de colágeno; y/o determinando un contenido de proteínas marcadoras de descelularización, más preferentemente de al menos una de las siguientes proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: superóxido dismutasa, proteína ribosómica ácida P2 de 60S, integrina alfa 5;

- medición del espesor, preferentemente mediante análisis óptico, preferentemente mediante análisis microscópico, preferentemente en una forma seca y/o rehidratada, en donde un criterio de aceptación para el espesor del producto sanitario de ingeniería tisular descelularizado es preferentemente un intervalo de 0,1-20 mm en una forma seca, preferentemente de 0,1-0,6 mm en una forma seca y/o de 0,15-25 mm en una forma rehidratada, preferentemente de 0,15-0,7 mm en una forma rehidratada, más preferentemente un intervalo de 0,3­ 0,4 pm en una forma seca y/o 0,35-0,5 mm en una forma rehidratada;

- prueba de retención de sutura, en donde preferentemente un criterio de aceptación es que el producto sanitario de ingeniería tisular resista más de 0,5 N;

- prueba de resistencia a la tracción, en donde preferentemente un criterio de aceptación es que el producto sanitario de ingeniería tisular resista más de 0,5 MPa;

- prueba de presión de estallido, en donde preferentemente un criterio de aceptación es que el producto sanitario de ingeniería tisular resista una presión superior a 150 mmHg.