JP7005528B2 - 消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞/前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせ、初期化方法および適用 - Google Patents
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Description
材料および方法
列挙される材料および下記方法は、原実験記録由来のものである。本発明の実際的な適用において、これは、列挙される実験により限定されることなく、産業的適用に適切な市販の材料および方法を使用して実行され得る。
(1)実験組織
外科手術または生検からの胃および十二指腸組織は、Department of general surgery of the General Hospital of the Chinese People’s Liberation Armyおよび307 Hospital of the Chinese People’s Liberation Armyにより提供された。中絶胎児組織はGeneral Hospital of the People’s Liberation Armyにより提供された。組織を提供した全患者に情報を与え、インフォームドコンセントに署名させた。組織検体の使用は、General Hospital of the People’s Liberation Armyおよび307 Hospitalの倫理委員会により承認された。
レーザー共焦点顕微鏡(Zeiss)、サーモスタット水浴(長風)、冷却遠心機(Eppendorf)、倒立位相差顕微鏡(Leica)、手術用器具(手術用シャンク、ブレード、眼科用ストレート鉗子、湾曲鉗子、ハサミ)およびレーザーフォーカス用小皿(NEST)。
1.Kubota培地(KM)培地の調製:1袋のRPMI 1640(Gibco)粉末を1Lの脱イオン水中で溶解させ、1xペニシリン-ストレプトマイシン、10-9M硫酸亜鉛七水和物(Sigma)、0.54gニコチンアミド(Sigma)、5mgインスリン(Sigma)、10-6Mヒドロコルチゾン(Sigma)、2gのNaHCO3(Sigma)、5x10-5M β-メルカプトエタノール(Sigma)、30nMセレン(Sigma))、遊離脂肪酸(Sigma)、10μg/mL高密度リポタンパク質(Sigma)、1gウシ血清アルブミン(Gibcoより購入)、5mgトランスフェリン(Sigma)、2mM Glutamax(Gibcoより購入)を添加した。
(1)胃上皮細胞の取得
胃上皮細胞は直接購入し得;胃前庭部、幽門または十二指腸粘膜上皮細胞は、以下のように単離および培養することによっても得られ得る:
筋線維芽細胞は直接購入し得;胃腸上皮下筋線維芽細胞は、以下の付着方法によって単離および培養することもできる:
以下の操作を含む、ヒト胃上皮細胞(hGEC)のチャリクティゼーション(charictization)の免疫蛍光同定を行った(一次抗体および二次抗体をそれぞれ表1および2で示した):
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞
ヒト胃上皮細胞(hGEC)および成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞(aGSEMF)を調製し、工程Iで保存した。
倒立位相差顕微鏡(Leica)、顕微鏡グリッド、冷却遠心機(Eppendorf)、12ウェルプレート。
1.基本試薬
Advanced DMEM/F-12培地、Advanced RPMI 1640培地、NEAA(非必須アミノ酸)、TrypLE消化酵素、グルタミン(Glutamax)、ディスパーゼは全てGibco社より購入、ペニシリン-ストレプトマイシンおよびマイトマイシン-C(Sigma)。
処方:Advanced DMEM/F12+2mMグルタミン(Glutamax)+ペニシリン-ストレプトマイシン(100U/mLペニシリン+0.1mg/mLストレプトマイシン)+SB43154(2μM)+VPA(0.5mM)+PD0325901(0.5μM))+RG108(0.04μM)+Bix01294(0.5μM)+Bay K 8644(2μM)+PS48(5μM)+FBP(3.5mM)。
(1)低分子化合物が介在するヒト胃上皮細胞(hGEC)または十二指腸上皮細胞(hDEC)から誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)への変換
1.創始細胞の増殖:初代単離ヒト胃上皮細胞(hGEC)または十二指腸上皮細胞(hDEC)を創始細胞として使用し、Kubta培地(文献に従って調製、文献出典:Kubota,H.およびReid,L.M.(2000).Clonogenic hepatoblasts,common precursors for hepatocytic and biliary lineages,are lacking classical major histocompatibility complex class I antigen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,12132-12137)中で37℃にて5%CO2インキュベーター中で4~5日間培養し、創始細胞を増殖させた。
(1.1)ヒト胃上皮細胞(hGEC)から誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)への変換
ヒト胃上皮細胞(hGEC)の形態は、8個の低分子化合物(表3で示すとおりの8M)を用いた栄養膜細胞として8M初期化培地および単離培養胃腸上皮下筋線維芽細胞(GSEMF)の条件下で、絶えず明らかな変化が起こった。より大きな形態を持つダンス様(dance-like)または多数の角がある上皮の始まりから、より明確な境界を持つ小細胞クローンが第7日に出現し始めた。第15日に、図5で示されるように、ヒト胃上皮細胞(hGEC)は、境界が明確で、小さくて締まった細胞があり、比較的均一な形態であり、大きな核細胞質を有する典型的な内胚葉幹細胞/前駆細胞様クローン(G-hiEndoPC)に初期化されていた(図5の下の写真は上の写真のボックスの拡大部分であった)。
同様に、ヒト十二指腸上皮細胞(hDEC)から開始して、8M初期化培地および栄養膜細胞としての単離培養胃腸上皮下筋線維芽細胞(GSEMF)の作用下で、典型的な内胚葉幹細胞/前駆細胞クローン(D-hiEndoPC)も15日間にわたる誘導後に形成された(図6で示されるように、十二指腸上皮細胞(hDEC)の左の写真、および十二指腸上皮細胞の初期化によって生じた内胚葉幹細胞/前駆細胞(D-hiEndoPC)の右の写真は、G-hiEndoPCと同様の形態を有する(図5))。十二指腸組織の供給源が限られているため、通常、ヒト胃上皮細胞(hGEC)を初期化のための創始細胞として使用した。
内胚葉幹細胞/前駆細胞様クローンは、低分子化合物を使用せずに形成し得なかった。しかし、ヒト胃上皮細胞(hGEC)または胃腸上皮下筋線維芽細胞(GSEMF)のみをそれぞれ創始細胞として使用し、それらは8M初期化培地中で15日間培養した後に内胚葉幹細胞/前駆細胞様クローンを形成させ得ず(図7で示されるとおり)、このことから、低分子化合物(8M)、ヒト胃上皮細胞(hGEC)および胃腸上皮下筋線維芽細胞(GSEMF)の組み合わせが内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)の形成において不可欠な因子であったことが示された。
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
1.クローン総数の計算
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞
工程Iで、ヒト胃上皮細胞(hGEC)、胎児胃上皮下筋線維芽細胞(fGSEMF)、成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞(aGSEMF)、胎児腸上皮下筋線維芽細胞(fISEMF)、胎児横隔膜間質細胞(fDC)を調製し;間葉系幹細胞(MSC)、マウス胚性線維芽細胞(MEF)および成体ヒト皮膚線維芽細胞(HFF)は包皮組織に由来し、発明者らの研究室で単離および培養した。
倒立位相差顕微鏡(Leica)、顕微鏡グリッド、12ウェルプレート。
1.基本試薬:Advanced DMEM/F-12培地、Advanced RPMI 1640培地、NEAA(非必須アミノ酸)、グルタミン(Glutamax)はギブコより購入し;ペニシリン-ストレプトマイシン、マイトマイシン-CはSigmaより購入し;TrypLE、ディスパーゼ消化酵素はInvitrogenより購入し;マトリゲルゲルはBDより購入し;ゼラチンはSigmaより購入した。
(1)胎児腸上皮下筋線維芽細胞(fISEMF)または成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞(aGSEMF)のための馴化培地の調製:fISEMF細胞またはaGSEMF細胞を10μg/mLの濃度のマイトマイシンCで2~3時間処理し、PBSで3~4回洗浄し、次いでAdvanced DMEM/F-12培地を添加して培養し、培地を毎日回収し、0.22μMフィルターに通してろ過し、-80℃で保存した。
1)創始細胞(hGEC)としてのヒト胃上皮細胞の処理は工程IIと同じであった。
1)第2部でスクリーニングした栄養膜細胞を支持細胞として使用し、上記の8個の低分子化合物(8M)に対する培養条件に基づいて低分子を1個ずつ除去し、不可欠な低分子を最初にスクリーニングした。
全てのデータは3回以上の独立した実験から得ており、データは、別段の記述がない限り、平均±標準偏差として記載した。両側t検定のためのSPSSソフトウェアを使用して、2群のデータ間の統計学的解析を行った。2群間の差は、P<0.05で統計学的に有意とみなした。
SB431542(SB)が初期化系において初期化可能な低分子化合物の最少の組み合わせであることを確認した後、SB431542はTGF-βシグナル伝達経路の阻害剤であるので、発明者らはTGF-βシグナル伝達経路の別の阻害剤A83-01(A83)を用いることによりSBを置き換えることを試みて、低分子化合物の組み合わせの最適化実験を繰り返し、その結果から、A83(0.5μMの使用濃度)が単独または他の低分子と組み合わせる(BBRAと呼ぶ)かの何れかで初期化の同様の、またはより良好な効果を生じさせ得ることが示された。結果を図15Bで示し、BBRはそれぞれBix01294(B)、Bay K 8644(B)、RG108(R)の他の3つの低分子を表した。
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞、組織
ヒト胃上皮細胞(hGEC)、成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞(aGSEMF)、成体ヒト胃前庭部組織(General Hospital of the People’s Liberation Armyにより提供)。
フローサイトメトリー(BD)、レーザー共焦点顕微鏡(Zeiss)、倒立位相差顕微鏡(Leica)。
基本試薬:Advanced DMEM/F-12培地、NEAA(非必須アミノ酸)、グルタミン(Glutamax)はGibco社より購入し;ペニシリン-ストレプトマイシン、Accutase、マイトマイシン-CはSigma社より購入し;TrypLE消化酵素はInvitrogen社より購入した。
(1)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)-創始細胞の初期の位置
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
1)初期化は、男性由来の胃上皮細胞を女性由来の栄養膜細胞に、またはその逆で接種することにより行った。
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞
成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞(aGSEMF)、ヒト胃上皮細胞(hGEC)、誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)およびH9ヒト胚性幹細胞(ESC)は、Wicell社より購入した。
リアルタイム蛍光定量PCR装置(Bio-Rad)、通常のPCR装置(Eppendorf)、倒立位相差顕微鏡(Leica)、リアルタイム定量96ウェルプレートおよびブロッキング膜(Bio-Rad)、12ウェルプレート、レーザー共焦点蛍光顕微鏡(Zeiss)、細胞免疫コンフォーカス用の小皿(NEST)。
抗体は実施例1の第1部と同じであり、免疫組織化学キット(Vector Lab)、RAおよびLDN193189はSigma社より購入し;A83-01はStemgent社より購入し;b-FGF、Wnt3a、アクチビンA、FGF10は、R&D社より購入した。
(1)誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)における特徴的タンパク質の発現の分析
タンパク質免疫蛍光染色法は実施例1と同じであった。
初期化されたクローンのRNAを抽出し、逆転写し、リアルタイム蛍光定量的PCRを行い、具体的な方法は以下の工程を含んだ:
良好な増殖状態にあるヒト胚性幹細胞H9を、予めマトリゲルのゲルでコーティングしたウェルプレートに適切な密度で播種し、翌日、培地をDE誘導培地:Advanced RPMI 1640+1%(W/V)B27(無血清神経細胞添加物)+アクチビンA(100ng/mL)+CHIR99021(3μM、Stemgentより購入)に交換し、1日培養し、第2日および第3日に、培地をAdvanced RPMI 1640+1%B27+アクチビンA(100ng/mL)に交換した。
特有の型を有する内胚葉(figurate endoderm)(DE)への誘導後、培地をPGT誘導培地:Advanced RPMI 1640+2%(V/V)FBS+50ng/mLのFGF10(線維形成性増殖因子10)+シクロパミン(0.25μM)に交換し、3日内にPGTが得られた。
特有の型を有する内胚葉(figurate endoderm)(DE)への誘導後、培地をPFG誘導培地:Advanced RPMI 1640+RA(レチノイン酸、2μM)+LDN193189(0.25μM、Sigmaより購入)に交換し、PFGを3日内に得た。
全てのデータは3回以上の独立した実験から得ており、データは、別段の記述がない限り、平均±標準偏差として記載した。両側t検定のためのSPSSソフトウェアを使用して、2群のデータ間の統計学的解析を行った。2群間の差は、P<0.05で統計学的に有意とみなした。
(1)誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)における特徴的タンパク質の発現の分析
フローサイトメトリーによる初期化されたクローンにおける内胚葉特異的タンパク質の分析によって、図21で示されるように、hiEndoPCが相同的に高度にFOXA2(フォークヘッドコーディングボックスタンパク質A2)、SOX9(性決定領域Y遺伝子9)、SOX17(性決定領域Y遺伝子17)、LGR5(反復ロイシンリッチGタンパク質共役型受容体5)、EPCAM(上皮細胞接着分子)を発現することが明らかになった(アイソタイプはアイソタイプである)。hiEndoPCの免疫蛍光染色から、図22で示されるように、hiEndoPCがもはや胃特異的マーカーであるMUC6(粘膜タンパク質-6)およびGAST(ガストリン)を発現せず、胃の特性を喪失し、内胚葉幹細胞/前駆細胞特異的な転写因子FOXA2(赤色蛍光、96±2.6%の発現レベル)、SOX9(赤色蛍光、97±1.18%の発現レベル)および他の内胚葉幹細胞/前駆細胞関連マーカー、例えばCXCR4(緑色蛍光、98±0.56%の発現レベル)、EPCAM(赤色蛍光、97±2.7%の発現レベル)、LGR5(緑色蛍光、92±4.3%の発現レベル)、CK19(緑色蛍光、91±4.2%の発現レベルで)を発現し始めることが明らかになった。フローレベルでの検出は、免疫タンパク質染色と一致し、内胚葉前駆細胞としてのhiEndoPCの特徴がさらに確認された。
転写レベルでの結果からまた、ヒト胃上皮細胞(hGEC)と比較して、FOXA2(フォークヘッドコーディングボックスタンパク質A2)、SOX9(性決定領域Y遺伝子9)、GATA4(GATA結合タンパク質4)、HNF1B(肝細胞核因子ホメオボックスタンパク質B)、PDX1(膵臓十二指腸ホメオボックス遺伝子1)、ONECUT2(1つの切除ドメインタンパク質ファミリー2(one excised domain protein family 2))、HOXA3(ホメオボックスタンパク質A3)などの内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)における内胚葉初期発生関連遺伝子の発現が顕著に上方制御され、胚性幹細胞(ESC)に特有の型を有する内胚葉(figurate endoderm)(DE)、原腸(PGT)および前腸後部(PFG)由来の内胚葉の初期発生段階における初期内胚葉遺伝子の発現とさえも同等であり、特にPFGの発現パターンに最も類似していたことも示された(図23A、図23Aの列群は左から右に連続して、hEC、DE、PGT、PFG、hiEndoPC、P1、hiEndoPC、P4およびhGECであった)。さらに、hiEndoPCは、MUC6、PGC、GIFおよびGASTなどの胃特異的マーカーをもはや発現しなかった(図23B、図23Bの縦列群は、左から右に連続して、hGEC、hiEndoPCおよびヒト胃組織であった)。
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞
成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞(aGSEMF)、ヒト胃上皮細胞(hGEC)、十二指腸上皮細胞(hDEC)、誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)、特有の型を有する内胚葉(figurate endoderm)(DE)、原腸(PGT)、前腸後部(PFG)。
通常のPCR装置(Eppendorf)。
Illumina TotalPrepキット(Ambion)、Sentrix Chip Array(ヒトHT-12)、QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen)、EZ DNA Methylation-Goldキット(Zymo Research)。
(1)hGEC、hiEndoPC、PGTおよびPFGに対するRNA抽出および逆転写の方法は本実施例の工程Iと同じであった。
抽出したhGEC、hiEndoPC、PGTおよびPFG RNAを最初に増幅し、Illumina TotalPrepキットによって提供される手順に従って全RNAからバイオアシル化(bioacylated)cRNAを作製し、次いで、Sentrix Chip Arrayを使用してcRNAをハイブリダイゼーションさせ、イルミナ社により提供される方法に従ってハイブリダイゼーション後の処理を行った。Illumina BeadStudioソフトウェアを用いてデータを処理し、生データをGene Expression Omnibusデータベースにアップロードした(受入番号GSE69706)。
最初に、DNAライブラリ構築、シーケンシングおよびデータ分析を実施した。2つの異なる検体および2つの対応するhiEndoPCの単クローンからのhGECを回収し、ゲノムDNAをQIAamp DNA Micro Kitで抽出し、EZ DNA Methylation-Goldキット(Zymo Research、商品番号D5005)を用いて亜硫酸変換を行い、次いでハイスループットシーケンシングプラットフォームHiSeq 2500(Illumina)を用いてシーケンシングを実施した。生データをGene Expression Omnibusデータベースにアップロードした(受入番号GSE69706)。
(1)誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)における全ゲノムDNAのエピジェネティック解析
工程Iにおいて、hiEndoPCの同定は、内胚葉幹細胞/前駆細胞のある種の特徴的マーカーに限定された。hiEndoPCおよびhGECが実際に2つの異なるタイプの細胞であったことを確認するために、発明者らは、全ゲノムDNAメチル化チップ検出を使用することによって、エピジェネティック修飾の観点からhiEndoPCおよびhGECを分析した。クラスター分析の結果から、hiEndoPCおよびhGECが異なるエピジェネティックパターンを有することが示され(図24A)、これによって、細胞が初期化後に顕著に変化したことが明確に確認された。ジーンオントロジー(GO)分析から、低メチル化状態の遺伝子、すなわちhiEndoPCにおける活性状態の遺伝子の分類が、hGECと比較して、主に胚発生または幹細胞発生に関連していることが示された(図24B)。これは、hiEndoPCの初期内胚葉特性および幹細胞/前駆細胞特性と一致した。
メチル化分析から、hGECと比較して、hiEndoPCではプロモーター領域におけるメチル化の上方制御および下方制御のための519個および857個の遺伝子があり(図25A)、内胚葉特異的転写因子FOXA2(フォークヘッドコーディングボックスタンパク質A2)およびGATA4(GATA結合タンパク質4)におけるプロモーター領域でのメチル化レベルがhiEndoPCにおいて有意に減少している(図25B)ことが示され、このことから、FOXA2およびGATA4の遺伝子発現が転写的に活性化されたことが示唆されるが、これはhiEndoPCにおけるFOXA2およびGATA4遺伝子の高発現と一致した。
複数レベルから内胚葉幹細胞/前駆細胞としてのhiEndoPCの特徴を確認した後、さらにその特性を明確にするためにhiEndoPCの発生段階を位置づけることも必要であった。天然状態でのhiEndoPCの陽性対照は得ることができなかったので、胚性幹細胞(ESC)に由来し、発生過程に従って誘導された、よく認められている特有の型を有する内胚葉(figurate endoderm)(DE)、原腸(PGT)、前腸後部(PFG)およびこのような初期内胚葉段階を陽性対照として使用して、全ゲノム発現のプロファイルを初期化によって得られたhiEndoPCと比較した。RNAディープシーケンシングから、hiEndoPCがPGTとPFGとの間にあり、PFGにより近いことが明らかになった(図26)。さらに、PCA主成分分析から、胃上皮細胞由来のhiEndoPCおよび十二指腸上皮細胞由来のhiEndoPCが全遺伝子発現プロファイルにおいて非常に類似していることが示され(PCA主成分分析は、より少数の重要な可変要素を選択するための複数の可変要素の線形変換による多変量統計解析法を指す)、これは、それらの細胞形態が以前に見出されたものと最も類似していることと一致し、それらの創始細胞とは異なり、またESC由来の特有の型を有する内胚葉(DE)、栄養膜細胞(GSEMF)とも顕著に異なった(図27)。
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞
ヒト胃上皮細胞(hGEC)、誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)。
H7650透過型電子顕微鏡(HITACHI)、H7650電子顕微鏡、AMT XR16M CCDデジタルカメラ(デジタルカメラの電子カプラー、AMT)、AMTキャプチャエンジンソフトウェアバージョン600.259(キャプチャエンジニアリングソフトウェア(capture engineering software))、取り外し可能な96ウェルプレート(Corning)。
Polybed 812エポキシ樹脂は、Polysciences,Inc.,Warrington,PAより購入、レイノルドのクエン酸鉛(National Instrument Analysis and Testing Center,Academy of Military Medical Sciencesにより提供)、水性酢酸ウラニル(National Instrument Analysis and Testing Center,Academy of Military Medical Sciencesにより提供)。
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞
成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞(aGSEMF)、誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)。
倒立位相差顕微鏡(Leica)、MltraVIEW(Perspective,PerkinElmer)。
フィブロネクチン(FN)、Cell-TAKゲル(CT)はBDより購入し;無血清細胞凍結培地(Bio-Tool);A83-01(Stemgent);bFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子b)、Wnt3aは全てR&Dより購入し;マイトマイシン-C(Sigma);Advanced DMEM/F12、ディスパーゼはGibcoより購入した。
(1)hiEndoPCの継代
1.継代前の準備:マイトマイシン-Cで処理したaGSEMFを予めウェルプレートに適切な密度で播種したか、または約3時間前に、ウェルプレートにおいてフィブロネクチン(FN)、Cell-TAK(CT)ゲルでコーティングして室温で乾燥させた;
1.凍結:手作業で拾い上げたクローンを5mg/mLのディスパーゼ酵素により37℃で5分間消化し、小片にブローした(blown)。細胞を培地で2回洗浄し、次いで細胞を適量の無血清細胞凍結培地で再懸濁し、クライオチューブに入れ、直接-80℃で保存した。
(1)初期化中のhiEndoPCの増殖の特徴
内胚葉前駆細胞としてのhiEndoPCの分子的特徴を確認した後、増殖の特徴を分析した。初期化中のhiEndoPCの動態を慎重に観察し、3つの相に分けた:第0~7日のいくつかの密で鋭い縁は細胞クローンの段階的な出現の特徴であり(第I相);第7~10日にクローンについて増殖がより遅くなる過程があり(第II相)、クローンが小型から大型に成長し;第10~15日はクローンについて急速に増殖する段階であり(第III相)、多くの小型のクローンが急速に凝集してより大型のクローンになり、細胞の倍加時間はこの段階で36.1±4.7時間であった(図29参照)。
hiEndoPCは内胚葉前駆細胞であったので、継代増殖に対するある一定の可能性があることはやむを得なかった。発明者らは継代条件について繰り返しスクリーニングし、最終的に、Advanced DMEM/DF12+AWF(A83-01 0.5μM+Wnt3a 50ng/mL bFGF 10ng/mL)、すなわちFN+AWF(図30A)またはCT+AWF(図30B)と組み合わせて細胞外マトリクスとしてフィブロネクチン(FN)ゲルまたはBD Cell-TAK(CT)ゲルの条件下および栄養膜細胞不含の同様の条件下で継代した後、クローンがよく増殖し、元のクローンの状態で維持されたと判断した。幹細胞/前駆細胞クローンの元の形態は、Advanced DMEM/DF12+A(A83-01 0.5μM)と組み合わせた栄養膜細胞としてのaGSEMFの条件下、すなわち栄養膜細胞+Aで維持された(図30C)。hiEndoPCも凍結し得、クローンの元の形態は、クローンの蘇生後に栄養膜細胞+Aの条件下で維持し得た(図30D、解凍後の細胞、凍結後に蘇生)。
hiEndoPCは上記継代培養条件下で約4~6世代増殖させ得、細胞形態は継代中、基本的に変化しないままであった(図31、下段の写真は上段の写真のボックスの拡大部分であった)。4世代後、細胞増殖速度は遅くなり、第6世代の細胞数がピークに達し、このことから、その増殖能が限定的であったことが示される。初期化およびおよそ4~6回の増幅後、毎回利用可能なおよそ106個のヒト胃上皮細胞(hGEC)で開始して、およそ109個の幹細胞/前駆細胞(hiEndoPC)を得た(図32)。
材料および方法
(I)実験材料
(1)実験用細胞
ヒト胃上皮細胞(hGEC)、誘導性内胚葉前駆細胞(hiEndoPC)およびH9ヒト胚性幹細胞(ESC)は、Wicell社より購入した。
リアルタイム蛍光定量PCR装置(Bio-Rad)、通常のPCR装置(Eppendorf)、正立蛍光顕微鏡(Leica)、リアルタイム定量96ウェルプレートおよびブロッキング膜(Bio-Rad)、12ウェルプレート、レーザー共焦点蛍光顕微鏡(Zeiss)、倒立位相差顕微鏡(Leica)、細胞免疫コンフォーカス(cellular immunoconfocus)用の小皿(NEST)。
1.主な抗体
(1)免疫蛍光染色法は上記と同じであった。
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
プロトコールは、C-ペプチドELISAキットの要件に従って実施した。具体的な方法は以下の工程を含んだ:
具体的な方法は以下の工程を含んだ:
全てのデータは3回以上の独立した実験から得ており、データは、別段の記述がない限り、平均±標準偏差として記載した。両側t検定のためのSPSSソフトウェアを使用して、2群のデータ間の統計学的解析を行った。2群間の差は、P<0.05で統計学的に有意とみなした。
古典的膵臓分化誘導プロトコール[Pagliuca Felicia W,Millman Jeffrey R,Guertler M,Segel M,Van Dervort A,Ryu Jennifer Hら、Generation of Functional Human Pancreatic β Cells In Vitro.Cell.2014;159:428-39.Rezania A,Bruin JE,Arora P,Rubin A,Batushansky I,Asadi Aら、Reversal of diabetes with insuLin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.Nat Biotechnol.2014;32:1121-33]に従い、hiEndoPCを膵臓へと分化誘導した。誘導の2週間後、hiEndoPC由来膵臓細胞(hiEndoPC-Pans)は、インビボで膵島の三次元出芽形態を示した(図33A)。DTZ(ジチゾン)染色から、hiEndoPC-Panが赤色に見えたことが示され、このことから細胞の細胞質が膵島β細胞に特徴的な亜鉛イオンを含有していたことが示唆された(図33B)。hiEndoPC-Panの膵臓特異的タンパク質染色は、膵臓特異的転写因子PDX1およびNKX6.1、膵島α細胞マーカーGCG、膵島β細胞マーカーC-PEPおよびPRO-INSおよび膵島δ細胞マーカーSSTの顕著な発現を示した(図33Cおよび33D)。転写レベルの分析から、様々な膵臓の特徴的な遺伝子が誘導後に上方制御されることが明らかになったが(図33E)、これは免疫染色の結果と一致した。hiEndoPC-Panが膵島β細胞からインスリンを合成および放出する最も重要な能力を有するか否かを確認するために、様々な刺激条件下でhiEndoPC-PanのC-ペプチド放出能を調べた。高グルコースで刺激した場合、C-ペプチドの放出は低糖群と比較して顕著に増加した。他のインスリン分泌促進剤KCLおよびトルブタミドを使用した場合、Cペプチドの放出がまた顕著に増加した。さらに、刺激に対するhiEndoPC-Panのインスリン放出反応は、ESC由来の膵島細胞と同等であった(図33F)。hiEndoPC-Panの糖刺激反応性は、将来の糖尿病性高血糖症の処置にとって意義のある重要な臨床応用性があった。
古典的な腸細胞誘導プロトコール[Spence JR,Mayhew CN,Rankin SA,Kuar MF,Vallance JE,Tolle Kら、Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.Nature.2010;470:105-9.Watson CL,Mahe MM,Munera J,Howell JC,Sundaram N,Poling HMら、An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells.Nature Medicine.2014;20:1310-4]に従い、hiEndoPCの腸管への分化を検出した。誘導の2週間後、hiEndoPC由来腸オルガノイド(hiEndoPC-Int)は、インビトロで初代腸培養の形態学的特徴を呈することが分かった(図34A)。hiEndoPC-Intにおける腸特異的転写因子CDX2、小腸細胞マーカーVIL1、杯細胞マーカーMUC2、小腸内分泌細胞マーカーCHGAおよび小腸パネート細胞マーカーLYSOの発現は、誘導後に顕著に上方制御された(図34B)。さらに、タンパク質レベルで、腸の特徴的なマーカーであるVIL1、MUC2、CDX2、LGR5およびECADも顕著に発現され(図34C)、これによりhiEndoPC-Intが当初腸の特徴を有していたことが確認された。
古典的な肝臓誘導プロトコール[Gouon-Evans V,Boussemart L,Gadμe P,Nierhoff D,Koehler CI,Kubo Aら、BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.Nat Biotechnol.2006;24:1402-11]を使用して、hiEndoPCを肝細胞に分化するように誘導し、hiEndoPC由来の肝細胞(hiEndoPC-Hep)は、HNF4A、CEBPA、CEBPB、TF、AATGGT、G6PC、CYP1A1、CYP3A4、CYP3A7、MGT1A1、MGT1A3などを含む初代肝細胞の特徴を有する複数の機能的遺伝子を発現し始めることが分かった(図35A)。同時に、AFP(アルファ-フェトプロテイン)およびCK18(サイトケラチン18)の染色は、hiEndoPC-Hepにおいて陽性であり(図35B);フローレベルでのALB(アルブミン)陽性細胞の割合は90%以上と高く(図35C)、これにより、hiEndoPC-Hepが最初に肝細胞の特徴を保持していたことが示された。
hiEndoPCの甲状腺への分化誘導後[Longmire TA,Ikonomou L,Hawkins F,ChristodouLou C,Cao Y,Jean JCら、Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.Cell Stem Cell.2012;10:398-411]、hiEndoPC由来甲状腺細胞(hiEndoPC-Thyroid)における甲状腺および肺により共有される特異的転写因子NKX2.1、甲状腺特異的転写因子Pax8、サイログロブリン(Tg)および甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)の発現レベルは誘導前と比較して非常に顕著に向上した(図36A)。hiEndoPC由来肺細胞(hiEndoPC-Lung)における、肺特異的転写因子NKX2.1、肺クララ細胞マーカーCC-10、I型肺胞細胞のマーカーとしてのアクアポリンAQP5およびII型肺胞細胞のマーカーとしての界面活性タンパク質SPA、SPBおよびSPCの発現が顕著に上方制御された(図36B)。
Claims (6)
- 消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞/前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせ物であって、前記低分子化合物が、TGF-βシグナル伝達経路、エピジェネティック修飾因子、Ca2+チャネル活性化因子および代謝調節因子からなる機能的な群から選択され;低分子化合物の組み合わせ物は、FBP、Bay K 8644(Bay)、Bix01294(Bix)、SB431542(SB)若しくはA83-01(A83)、VPA、RG108(RG)、PD0325901、およびPS48の全てを含む、8個の低分子化合物(8M);又は、BBRS組み合わせ物と呼ばれる、Bix01294(Bix)、Bay K 8644(Bay)、RG108(RG)およびSB431542(SB)を含有する、4個の低分子化合物(4M)、若しくはBBRA組み合わせ物と呼ばれる、Bix01294(Bix)、Bay K 8644(Bay)、RG108(RG)、および83-01(A83)を含有する、4個の低分子化合物(4M)である、低分子化合物の組み合わせ物。
- 8個の低分子化合物を含む前記組み合わせ物が、50:12500:12.5:1:12.5:50:125:87500のモル比のSB431542:VPA:PD0325901:RG108:Bix01294:Bay K 8644:PS48:FBPの組み合わせ物;または12.5:12500:12.5:1:12.5:50:125:87500のモル比のA83:VPA:PD0325901:RG108:Bix01294:Bay K 8644:PS48:FBPの組み合わせ物である、請求項1に記載の低分子化合物の組み合わせ物。
- 前記BBRS又はBBRA組み合わせ物中の各化合物が、1~10μMのSB431542、0.4~1μMのA83、0.01~1μMのRG108、0.1~2μMのBix01294、1~4μMのBay K 8644の濃度で使用される、請求項1に記載の低分子化合物の組み合わせ物。
- 前記BBRS組み合わせ物が、50:1:12.5:50のモル比のSB:RG:Bix:Bayの各化合物の組み合わせ物であり、前記BBRA組み合わせ物が、12.5:1:12.5:50のモル比のA83:RG:Bix:Bayの各化合物の組み合わせ物である、請求項1または3に記載の低分子化合物の組み合わせ物。
- 各化合物が、2μMのSB431542、0.5μMのA83、0.04MのRG108、0.5μMのBix01294および2μMのBay K 8644の濃度で使用される、請求項4に記載の低分子化合物の組み合わせ物。
- 消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞/前駆細胞に初期化するための初期化キットであって、請求項1~5の何れか1項に記載の低分子化合物の組み合わせ物および前記化合物の使用のための説明書を含み;各化合物が個別に包装されるか、または各化合物が、8M組み合わせ物もしくはBBRS組み合わせ物もしくはBBRA組み合わせ物で混合および包装され、使用される各化合物の濃度が前記説明書に記載される、初期化キットであって、フィーダー細胞およびフィーダー細胞の使用のための説明書をさらに含み、前記フィーダー細胞が、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞を包含する消化管由来間質細胞である、初期化キット。
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