CN105486554A - 一种蜱虫样品扫描电镜固定配方及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于寄生虫扫描电镜样品固定方法技术领域，涉及一种蜱虫样品扫描电镜固定配方及方法，该固定配方由PBS缓冲溶液、聚山梨酯及戊二醛制作成戊二醛固定液。方法包括步骤（一）观察蜱虫样品假头基内是否有残留的宿主组织，若有则去除；（二）清洗蜱虫样品体表；（三）用戊二醛固定液在室温下进行蜱虫样品固定；（四）固定后的蜱虫样品，进行乙醇的梯度脱水；（五）将蜱虫样品放入无水乙醇与丙酮的混合液中进行置换；最后放入丙酮进行置换；（六）将蜱虫样品放入真空冷冻干燥仪进行干燥，将获得的蜱虫样品进行喷金。扫描电镜观察时样品不会因电子束轰击后产生水蒸气遭遇高能电子流电离而放电，出现图像模糊、雾状，或者根本不能成像的现象。

Description

一种蜱虫样品扫描电镜固定配方及方法

技术领域

本发明属于寄生虫扫描电镜样品固定方法技术领域，特别是涉及一种蜱虫样品扫描电镜固定配方及方法。

背景技术

蜱也叫壁虱，具有较多地方性俗名，如草瘪子、狗豆子、草爬子、草蜱虫、隐翅虫等，是一类在哺乳动物、爬行类、鸟类和两栖类等脊椎动物体表依靠吸食其血液生存的节肢动物。对病原的传播及危害程度仅次于蚊类，同时也是动物和人类多种疾病的贮藏宿主和传播媒介。蜱在叮咬人、畜吸血时释放毒素，可导致瘫痪、刺激症、毒性反应及宿主的过敏反应。在我国蜱虫是多种病原的媒介蜱，可引起Q热、巴贝斯虫病、泰勒虫病、森林脑炎、新疆出血及莱姆病等，对我国畜牧业造成了巨大的威胁。通过对蜱虫的形态学鉴定，有助于从传播媒介对疾病进行防控，对我国蜱传疾病综合防控具有应用意义。蜱虫形态学鉴定主要通过体视显微镜和肉眼观察，我国境内蜱虫属与属之间很容易区分，但种与种之间由于在生活环境、宿主范围、季节消长规律和生活史等方面相似，在形态学上不易区分，同时，由于使用的主要仪器，体视显微镜观察范围有限，不能清晰观察到蜱虫更细微的特征结构，无助于形态学鉴定。因此，要获得更为详细的蜱虫结构的特征信息，需要借助扫描电子显微镜进行观察。

扫描电镜（SEM）是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观性貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应。其中，主要是样品的二次电子发射，可以观察到比0.2μm更小的精细结构。通过扫描电镜观察生物样品，可以有效的获得较光学显微镜观察结果更为细微的结构特征，是生物学研究的重要手段之一。而能否获得有效的、真实的、客观的、理想的样品表面的微小特征，样品的制备方法是决定性因素。在蜱虫寄生虫样品制备过程中，主要通过清洗、固定、脱水、真空干燥和喷金等环节。干燥是扫描电镜生物样品制备中的关键环节，如果处理不好，会直接影响到观察的清晰度与准确度，甚至直接导致试验失败。含水量高的样品在扫描电镜真空的镜筒中将造成诸多不良后果。样品受电子束轰击后蒸发的水蒸气遭遇高能电子流，产生电离而放电，引起束流大幅度波动，使图像模糊，出现雾状，或者根本不能成像。大多数样品在高真空中容易发生形态损伤，使研究特征皱缩、变形。蜱虫寄生虫体壁具有一定程度的骨化，水分主要分布在内脏器官，使用常规配方戊二醛固定液穿透能力很差，不能对其内部组织器官进行有效的固定。对其进行真空干燥时，随着水分的蒸发而引起蜱虫寄生虫样品体积变小、结构皱缩、表面干裂等，制备蜱虫寄生虫具有一定难度。

发明内容

本发明的目的：提供一种蜱虫样品扫描电镜配方及方法解决常规配方的固定液和方法穿透能力很差问题。

解决上述技术问题所采用的技术方案如下：一种蜱虫样品扫描电镜固定配方，该固定配方是由PBS缓冲溶液、聚山梨酯及戊二醛制作成戊二醛固定液。

所述的戊二醛固定液按体积百分比：聚山梨酯0.055-0.065%、规格为50%的戊二醛3-6%及余量的PBS缓冲溶液配比而成。最佳梯度配比1.5%戊二醛固定液100.06mL：由97mL的PBS缓冲溶液和60μL聚山梨酯和3mL50%戊二醛配制而成；或2.5%戊二醛固定液100.06mL：由95mL的PBS缓冲溶液和60μL聚山梨酯和5mL50%戊二醛配制而成；或3.5%%戊二醛固定液100.06mL：由94mL的PBS缓冲溶液和60μL聚山梨酯和6mL50%戊二醛配制而成。

一种利用权利要求1所述的固定配方固定蜱类样品的方法，包括步骤（一）观察蜱虫样品假头基内是否有残留的宿主组织，若有则去除；该方法还包括下述步骤：

（二）用PBS缓冲液清洗蜱虫样品体表，并用超声波进行清洗；

（三）将蜱虫样品浸于PBS缓冲液，用戊二醛固定液在室温下进行蜱虫样品固定；

（四）固定后的蜱虫样品，用PBS缓冲液清洗，放入通风橱自然干燥后，依次进行乙醇的梯度脱水；

（五）将蜱虫样品放入无水乙醇与丙酮的混合液中进行置换；最后放入丙酮进行置换；

（六）将蜱虫样品放入真空冷冻干燥仪进行干燥，将获得的蜱虫样品进行喷金，即可完成蜱虫样品的固定制作。

所述步骤（二）中PBS缓冲液的pH值为7.2；超声波清洗时间为60min。步骤（三）具体是指：将蜱虫样品浸于PBS缓冲液，在解剖镜下将蜱虫第1~3基节下方轻刺3个小孔，在室温下，将处理好的蜱虫样品1.5%戊二醛固定液固定3h，后再用2.5%戊二醛固定液固定4h，最后再用3%戊二醛固定液固定5h。步骤（四）中依次进行乙醇的梯度脱水是指依次进行规格为30%的乙醇，50%的乙醇，70%的乙醇，80%的乙醇，90%的乙醇，100%的乙醇和100%的乙醇梯度脱水，每次脱水10min。步骤（五）首先将蜱虫样品放入无水乙醇与丙酮体积比为1∶1的混合液中进行8min的置换；再放入无水乙醇与丙酮体积比为1∶4的混合液中进行10min的置换；最后放入100%丙酮进行30min置换。步骤（六）中真空冷冻干燥仪的真空度为0.1mbar，温度-42℃。步骤（六）中蜱虫样品进行喷金的方法为：第一次对蜱虫样品进行背面喷金，进行扫描电镜观察；然后将蜱虫样品取下，进行第二次腹面喷金即可，喷金后样品再次进行扫描电镜观察。上述中PBS缓冲液的pH值都为7.2。

本发明的有益效果：按照本发明的配方及方法固定的蜱虫样品，蜱虫体表表面干燥完整，并与内容物密切结合，紧密而坚实。在镀金过程中，用时更少且镀膜均匀。扫描电镜观察时样品不会因电子束轰击后产生水蒸气遭遇高能电子流电离而放电，出现图像模糊、雾状，或者根本不能成像的现象。

下面结合附图对本发明作进一步的说明，附图1为不同梯度戊二醛+不同梯度下乙醇脱水+真空冷冻干燥法处理；附图2为不同梯度下戊二醛浓度+不同梯度下乙醇脱水处理；附图3为常规配方戊二醛浓度+真空冷冻干燥仪处理；附图4为常规配方戊二醛浓度+不同梯度下乙醇脱水处理。

具体实施方式

实施例1、12只雄性成虫蜱虫检查其假头基内是否有残留的宿主组织，若有用精细的手术钳去除。用PBS缓冲液（pH=7.2）仔细清洗蜱虫体表，再用超声波清洗60min。将清洗后的蜱虫分成四组，每组三只，将第一、二组蜱虫浸于PBS缓冲液，在解剖镜下将蜱虫第1-3基节下方轻刺3个小孔，在室温下，将处理好的蜱虫样品1.5%戊二醛固定液固定3h，2.5%戊二醛固定液固定4h，3%戊二醛固定液固定5h。将第三、四组蜱虫浸于蒸馏水中，在解剖镜下将蜱虫第1-3基节下方轻刺3个小孔，放入2.5%戊二醛固定液（未使用新配方的固定液）中，在室温下分别进行12h的固定样品，如下

第一组：不同梯度下戊二醛浓度+不同梯度下乙醇脱水+真空冷冻干燥仪

第二组：不同梯度下戊二醛浓度+不同梯度下乙醇脱水

第三组：常规配方戊二醛浓度+真空冷冻干燥仪

第四组：常规配方戊二醛浓度+不同梯度下乙醇脱水

将第一组、第二组和第四组依次进行30%，50%，70%，80%，90%，100%和100%乙醇梯度脱水，每次10min。之后，放入无水乙醇与丙酮混合液中（体积比1∶1）进行8min的置换，再放入无水乙醇与丙酮混合液中（体积比1∶4）进行10min的置换，最后放入100%丙酮进行30min置换，将第一组和第三组放入真空冷冻干燥仪（真空度0.1mbar，温度-42℃）进行干燥。将四组获得的蜱虫样品，用导电胶带粘附与样品台上，进行喷金。喷金后的蜱虫样品，进行扫描电镜观察，结果如附图1-4所示。

通过扫描电镜对不同处理方法的样品进行观察获得图像。电镜扫描结果显示蜱虫固定样品效果是第一组>第二组>第三组>第四组（图1-4）。其中经不同梯度下戊二醛浓度+真空冷冻干燥的仪第一组蜱虫在扫描电镜下，腹部饱满，上表面保持在同一水平面上，肛门无下陷或下陷不明显。未见沿生殖沟形成新的深沟，第四基节未发生倾斜。第二组中2号样品腹部下降并不明显，也相对完整的保持了蜱虫的原有形态。而第三组和第四组都发生不同程度的变形，腹部下降明显，沿生殖沟形成新的深沟，第四基节发生倾斜。这两组采用常规配方戊二醛浓度处理，因未加入乳化剂聚山梨酯，聚山梨酯能对组织内脂类进行微量溶解，能有效的促进戊二醛对蛋白质的固定，也未采用不同梯度戊二醛进行固定，戊二醛能使蛋白质变性起到固定效果，但高浓度戊二醛可使表面蛋白质变性形成一层保护膜，导致深层蛋白质无法被有效固定。因此，不同梯度戊二醛可增加其对样品的穿透力。通过上述试验最佳方案组为第一组。

Claims (10)

1.一种蜱虫样品扫描电镜固定配方，其特征在于，该固定配方是由PBS缓冲溶液、聚山梨酯及戊二醛制作成戊二醛固定液。

2.如权利要求1所述的固定配方，其特征在于，所述的戊二醛固定液按体积百分比：聚山梨酯0.055-0.065%、规格为50%的戊二醛3-6%及余量的PBS缓冲溶液配比而成。

3.如权利要求1或2所述的固定配方，其特征在于，最佳梯度配比1.5%戊二醛固定液100.06mL：由97mL的PBS缓冲溶液和60μL聚山梨酯和3mL50%戊二醛配制而成；或2.5%戊二醛固定液100.06mL：由95mL的PBS缓冲溶液和60μL聚山梨酯和5mL50%戊二醛配制而成；或3.5%%戊二醛固定液100.06mL：由94mL的PBS缓冲溶液和60μL聚山梨酯和6mL50%戊二醛配制而成。

4.一种利用权利要求1所述的固定配方固定蜱类样品的方法，包括步骤（一）观察蜱虫样品假头基内是否有残留的宿主组织，若有则去除；其特征在于，该方法还包括下述步骤：

（二）用PBS缓冲液清洗蜱虫样品体表，并用超声波进行清洗；

（三）将蜱虫样品浸于PBS缓冲液，用戊二醛固定液在室温下进行蜱虫样品固定；

（四）固定后的蜱虫样品，用PBS缓冲液清洗，放入通风橱自然干燥后，依次进行乙醇的梯度脱水；

（五）将蜱虫样品放入无水乙醇与丙酮的混合液中进行置换；最后放入丙酮进行置换；

（六）将蜱虫样品放入真空冷冻干燥仪进行干燥，将获得的蜱虫样品进行喷金，即可完成蜱虫样品的固定制作。

5.如权利要求4所述的固定方法，其特征在于，所述步骤（二）中PBS缓冲液的pH值为7.2；超声波清洗时间为60min。

6.如权利要求4所述的固定方法，其特征在于，步骤（三）具体是指：将蜱虫样品浸于PBS缓冲液，在解剖镜下将蜱虫第1~3基节下方轻刺3个小孔，在室温下，将处理好的蜱虫样品1.5%戊二醛固定液固定3h，后再用2.5%戊二醛固定液固定4h，最后再用3%戊二醛固定液固定5h。

7.如权利要求4所述的固定方法，其特征在于，步骤（四）中依次进行乙醇的梯度脱水是指依次进行规格为30%的乙醇，50%的乙醇，70%的乙醇，80%的乙醇，90%的乙醇，100%的乙醇和100%的乙醇梯度脱水，每次脱水10min。

8.如权利要求4所述的固定方法，其特征在于，步骤（五）首先将蜱虫样品放入无水乙醇与丙酮体积比为1∶1的混合液中进行8min的置换；再放入无水乙醇与丙酮体积比为1∶4的混合液中进行10min的置换；最后放入100%丙酮进行30min置换。

9.如权利要求4所述的固定方法，其特征在于，步骤（六）中真空冷冻干燥仪的真空度为0.1mbar，温度-42℃。

10.如权利要求4所述的固定方法，其特征在于，步骤（六）中蜱虫样品进行喷金的方法为：第一次对蜱虫样品进行背面喷金，进行扫描电镜观察；然后将蜱虫样品取下，进行第二次腹面喷金即可，喷金后样品再次进行扫描电镜观察。