DE112013000467T5

DE112013000467T5 - Verfahren zum Betrachten und Vorbehandeln von Proben

Info

Publication number: DE112013000467T5
Application number: DE201311000467
Authority: DE
Inventors: c/o Hitachi High-Technologies Shiono Masamichi; c/o Hitachi High-Technologies Co Nishimura Masako; c/o Hitachi High-Technologies Corp Konomi Mami
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2014-09-18
Anticipated expiration: 2033-02-21
Also published as: JP5792886B2; US20140370540A1; US9086343B2; DE112013000467B4; CN104094096B; JPWO2013133012A1; WO2013133012A1; CN104094096A

Abstract

Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Elastizität der Exoskelette und Gelenke von Wasserorganismen, die in eine Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung eingetaucht sind, und ihre ursprüngliche Form dadurch erhalten bleiben, daß der Unterschied im osmotischen Druck zwischen der Innenseite und der Außenseite der Wasserorganismen verringert wird und eine Dehydration der biologischen Proben vermieden wird. Zuerst wird der Wasserorganismus in eine niedrig konzentrierte ionische Flüssigkeit gegeben und dann die Konzentration der ionischen Flüssigkeit kontinuierlich angehoben, wodurch das Wasser im Wasserorganismus in seiner ursprünglichen Form durch eine hoch konzentrierte ionische Flüssigkeit ersetzt wird. Der allmähliche Anstieg in der Temperatur der ionischen Flüssigkeit durch natürliches Trocknen verringert den osmotischen Druckunterschied zwischen der Innenseite und der Außenseite des Wasserorganismus, und die Konzentration der ionischen Flüssigkeit im Inneren des Wasserorganismus steigt an.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betrachten von Zielobjekten, nachdem Wasser, das darin enthalten war, durch eine wässrige Lösung ersetzt wurde, die eine ionische Flüssigkeit enthält, unter einer Ladungsteilchenvorrichtung wie einem Rasterelektronenmikroskop und ein Verfahren zum Vorbehandeln der Zielobjekte mittels einer Sonde, die an der Ladungsteilchenvorrichtung angebracht ist.
Stand der Technik
Zu Studien an im Wasser lebenden Mikroorganismen wie kleinen Krustentierchen, etwa an Ruderfußkrebsen (Copepod), Cycrops, Daphnia, Gammarus, Euphasiid, Mysidopsis Bahia, Cumacea und Triopsidae spp; an großen Krustentiere wie Nauplius, Cypris, Zoea und Mince-Larven; an Zooplankton wie Rädertierchen und Amöben und an Phytoplankton wie Cyanophyceae, Chlorophyta und Symboidinium sp. sind morphologische Untersuchungen unter einem Mikroskop unentbehrlich. Um die Larven von kleinen und großen Krustentieren taxonomisch beurteilen zu können, sind morphologische Untersuchungen an den kleinen Beinchen, die Anhängsel genannt werden, sehr wichtig. Für eine genaue Untersuchung der Anhängsel von Krustentierchen, die auf komplizierte Weise verwirrt sind, müssen die Anhängsel bei einer Anatomie voneinander getrennt werden. Herkömmlich werden die Anhängsel von Krustentierchen für die Anatomie unter einem Lichtmikroskop voneinander getrennt. Die Steuerung von anatomischen Vorrichtungen ist jedoch unter einem Lichtmikroskop sehr schwierig und erfordert viel Erfahrung in der Anatomie.
Elektronenmikroskope mit ihrer großen Schärfentiefe sind für die Betrachtung der festen Formen von lebenden Organismen und mit ihren Sonden zum Handhaben der Proben in der Probenkammer des Mikroskops gut geeignet. Wenn jedoch im Wasser lebende Mikroorganismen aus dem Wasser genommen und der Atmosphäre ausgesetzt werden, trocknen sie aus und schrumpfen dabei so stark, daß ihre ursprüngliche Form verlorengeht. Besonders die Larven von kleinen Krustentierchen und großen Krustentieren verformen sich beim Trocknen und Schrumpfen sehr stark, auch wenn sie mit einem Fixiermittel wie Ethanol, Glutaraldehyd oder Formalin fixiert werden. Zur Betrachtung eines im Wasser lebenden Organismus unter einem Elektronenmikroskop muß dieser aus dem Wasser oder einem Einschlußmedium genommen und in ein Vakuum gebracht werden; aus diesem Grund ist es schwierig, die Proben ohne Vorbehandlung unter einem Elektronenmikroskop zu betrachten.
Zur Lösung dieses Problems wurden Verfahren zum Vorbehandeln von Proben für Elektronenmikroskope entwickelt. Ein typisches Beispiel dafür ist ein Verfahren, bei dem das Zerbrechen der Morphologie von weichem biologischen Gewebe durch die Verwendung eines Grobvakuum-Kryotisches für Elektronenmikroskope verhindert wird, wobei die Temperatur der Proben auf dem Kryotisch im Grobvakuum (1,3 bis 270 Pa) im Bereich von einigen zehn Grad unter Null bis Raumtemperatur gehalten werden kann. Zum Beispiel ist in der Nicht-Patent-Druckschrift 1 beschrieben, daß an Iponomea nil leaf primordium eine Kryoelektronenmikroskopie möglich war.
Andererseits wurden zum Betrachten und Kontrollieren von kleinen Proben in einer Flüssigkeit unter einem Elektronenmikroskop Verfahren entwickelt, bei denen eine ionische Flüssigkeit verwendet wird. In der Patent-Druckschrift 1 ist beschrieben, daß dabei die Eigenschaft einer ionischen Flüssigkeit ausgenutzt wird, auch im Vakuum nicht zu verdampfen, um biologische Proben in ihren ursprünglichen Formen unter dem Elektronenmikroskop zu betrachten. Insbesondere ist ein Verfahren beschrieben, bei dem Wasser enthaltende Proben in die ionische Flüssigkeit getaucht werden und dann das Wasser im Vakuum entfernt wird, so daß die ionische Flüssigkeit, die mit einem Lösungsmittel wie Alkohol verdünnt wurde, die Proben bedeckt. Das Lösungsmittel wird dann im Vakuum entfernt.
Seit dieser Erfindung ist die Entwicklung von Verfahren zum Betrachten von biologischen Proben unter Verwendung von ionischen Flüssigkeiten weiter fortgeschritten. In der Nicht-Patent-Druckschrift 2 zum Beispiel wird berichtet, daß, wenn eine ionische Flüssigkeit auf die Kolonien von auf einem Agar-Medium kultivierten, mit Osmiumsäure dampffixierten, säureechten Bakterien getropft wird, Abbildungen erhalten werden, die die ursprünglichen Strukturen der Kolonien von säureechten Bakterien wiederzugeben scheinen.
Die Patent-Druckschrift 2 beschreibt, daß bestimmte ionische Flüssigkeiten die Durchlässigkeit von biologischen Proben im Vergleich mit anderen ionischen Flüssigkeiten erhöhen. In den Ausführungsformen sind Beobachtungsbeispiele an den Stengeln von Undaria pinnatifida und Spinacia oleracea, Baumwollgewebe, Haar, Mäuseknochen, Erythrozyten und Streptococcus mutans angegeben. Darüberhinaus wird ein Verfahren zum Imprägnieren, Aufbringen und Aufsprühen eines Fluidmediums, das durch Lösen einer ionischen Flüssigkeit in einem polaren Lösungsmittel wie Wasser erhalten wird, auf die Proben beschrieben.
Liste der zitierten Druckschriften
Patent-Druckschriften

Patent-Druckschrift 1: Internationale Veröffentlichung Nr. WO 2007/083756 ( US 2009/0173882 )
Patent-Druckschrift 2: Ungeprüfte japanische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 2011-137807

Nicht-Patent-Druckschriften

Nicht-Patent-Druckschrift 1: Kazuhiro UEDA, Mitsuhiko YAMADA, Machio GOTOH, Hisashi MATAUSHIMA, Kenzo KUBOKI, Attempt to Observe Samples at Low Temperatures under Low-Vacuum SEM, Proceedings of 49^th Academic Lectures, Japanese Society of Electron Microscope, P274, 1993
Nicht-Patent-Druckschrift 2: Mitsuru YOKOYAMA, Midori OGAWA, Takeshi ICHIHARA, Observation of Acid-Fast-Bacteria using Ionic Liquid unter SEM, Proceedings of 27^th Academic Lectures, Medical Biological Electronic Microscope Technology and General Assembly Program, P29, 2011

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Technisches Problem
In der Patent-Druckschrift 1 ist beschrieben, daß die Eigenschaft der ionischen Flüssigkeiten, im Vakuum nicht zu verdampfen, dazu verwendet wird, biologische Proben in ihren ursprünglichen Formen unter dem Elektronenmikroskop zu betrachten. Dabei tritt jedoch das Problem auf, daß der Wassergehalt von Wasserorganismen aufgrund der Unterschiede im osmotischen Druck beim direkten Aufbringen der ionischen Flüssigkeit auf die gegenüber Änderungen im osmotischen Druck empfindlichen Wasserorganismen oder beim direkten Einbringen in die ionische Flüssigkeit verlorengeht, wodurch die Wasserorganismen auch in der ionische Flüssigkeit austrocknen.
Das in der Patent-Druckschrift 1 beschriebene Verfahren kann darüberhinaus im Vakuum zu einem Sieden von Lösungsmittel führen, da die Probe mit einer ionischen Flüssigkeit beschichtet wird, die mit einem Lösungsmittel wie Alkohol verdünnt ist, das im Vakuum entfernt wird. Bei einem Sieden innerhalb der Schalen von Wasserorganismen (innerhalb des lebenden Organismus) steigt der Innendruck unter der Schale plötzlich an, wodurch die Schale in kleine Teile zerbrechen kann, die wegfliegen. Dadurch kann nicht nur die Probe zerstört werden, sondern es kann auch eine REM-Probenkammer kontaminiert werden.
In der Patent-Druckschrift 2 ist ein Verfahren zum Imprägnieren, Aufbringen und Aufsprühen eines Fluidmediums auf eine Probe beschrieben, das durch Lösen einer ionischen Flüssigkeit in einem polaren Lösungsmittel wie Wasser erhalten wird. Es ist nirgends angegeben, wie das Lösungsmittel wieder entfernt werden soll.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Betrachten von Proben mit einer Ladungsteilchenstrahl-Betrachtungsvorrichtung wie einem Elektronenmikroskop mit einem Unterdrücken einer Änderung in der Morphologie und einer Beschädigung von Wasserorganismen zu schaffen, die gegenüber einer Änderung im osmotischen Druck bei der Verwendung einer Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung empfindlich sind.
Lösung des Problems
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Betrachten von Proben ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: Eintauchen des Zielobjekts in eine Lösung, die eine ionische Flüssigkeit enthält; das Trocknen der Lösung, die die ionische Flüssigkeit enthält, mit einem Ausgleich des osmotischen Drucks zwischen der Lösung mit der ionischen Flüssigkeit und dem Inneren des Zielobjekts, um die Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der Lösung zu erhöhen; und Einstrahlen eines Ladungsteilchenstrahls auf das Zielobjekt, das mit der ionischen Flüssigkeit getränkt ist, um Abbildungen des Zielobjekts aufzunehmen.
Vorteilhafte Auswirkungen der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung kann ein Wasserorganismus mit einer Ladungsteilchenstrahl-Betrachtungsvorrichtung wie einem Elektronenmikroskop ohne eine Änderung in der Morphologie oder eine Beschädigung des Wasserorganismus betrachtet werden, der gegenüber einer Änderung im osmotischen Druck bei der Verwendung einer Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung empfindlich ist.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Seitenansicht einer Probenkammer eines Elektronenmikroskops bei einer ersten Ausführungsform.
2 ist eine Darstellung zur Erläuterung des Ablaufs des Verfahrens zum Betrachten von Proben bei der ersten Ausführungsform.
3 ist eine Ansicht zur Erläuterung des Zustands, wenn bei der ersten Ausführungsform eine Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung auf einen Gammarus getropft wird, wobei Ethanol durch Wasser ersetzt ist.
4 ist eine Ansicht zur Erläuterung des Zustands, wenn bei der ersten Ausführungsform der Gammarus mit der ionischen Flüssigkeit getränkt ist.
5 ist eine Ansicht zur Erläuterung des Verfahrens bei der Entfernung der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung von sehr kleinen Stellen wie dem Rand der Beine durch eine Berührung des Gammarus mit kegelförmigem Papier.
6 ist eine Ansicht des Gammarus in einer elektronenmikroskopischen Abbildung bei der ersten Ausführungsform.
7 ist eine elektronenmikroskopische Abbildung der Rückseite des Gammarus bei der ersten Ausführungsform.
8 ist eine elektronische Abbildung des Gammarus mit einem um 45 Grad geneigten Tisch des Elektronenmikroskops bei der ersten Ausführungsform.
9 ist eine elektronenmikroskopische Abbildung bei einem Betrachtungsbeispiel des Gammarus ohne das Verfahren der ersten Ausführungsform.
10 ist eine elektronenmikroskopische Abbildung eines Ruderfußkrebses bei einer zweiten Ausführungsform.
11 ist elektronenmikroskopische Abbildung bei einem Betrachtungsbeispiel des Ruderfußkrebses ohne das Verfahren der zweiten Ausführungsform.
12 ist eine Ansicht zur Erläuterung des Vorgangs bei der Anatomie eines Wasserorganismus, der mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkt ist, in einem Elektronenmikroskop unter Verwendung einer Sonde, die an der Probenkammer angebracht ist.
Beschreibung von Ausführungsformen
Zuerst werden die Probleme bei den herkömmlichen Verfahren genauer erläutert.
Bei dem in der Patent-Druckschrift 1 beschriebenen herkömmlichen Verfahren wird nach einem Gefrierschritt ein Vakuum-Lufttrocknungsschritt angewendet. Das Problem dabei ist, daß dabei die Elastizität von Gelenken und dergleichen verlorengeht, so daß es schwer ist, Beine und andere bewegliche Teile des Körpers auch zu bewegen. Wenn der Wasserorganismus mit Hilfe einer Sonde usw. in der Probenkammer des Elektronenmikroskops zergliedert wird, besteht daher die Gefahr, daß der getrocknete Wasserorganismus Schaden erleidet.
In der Patent-Druckschrift 1 ist beschrieben, daß die Eigenschaft einer ionischen Flüssigkeit, im Vakuum nicht zu verdampfen, dazu ausgenutzt wird, biologische Proben in ihrer ursprünglichen Form unter dem Elektronenmikroskop zu betrachten. Das Problem dabei ist jedoch, daß aufgrund der Unterschiede im osmotischen Druck beim direkten Aufbringen auf den Wasserorganismus, der auf eine Änderung im osmotischen Druck empfindlich ist, oder beim direkten Eintauchen in die ionische Flüssigkeit der Wassergehalt des Wasserorganismus verlorengeht, so daß der Wasserorganismus auch in der ionischen Flüssigkeit austrocknet. Wenn wie beschrieben die ionische Flüssigkeit mit einem Lösungsmittel wie Alkohol verdünnt ist, kann das Lösungsmittel im Vakuum sieden, wenn es im Vakuum entfernt wird.
Bei dem Verfahren nach der Nicht-Patent-Druckschrift 2 wird beim Auftropfen der ionischen Flüssigkeit auf die Kolonien eines säureechten Bakteriums, das in einem Agar-Medium kultiviert wurde, nach der Dampffixierung mit Osmiumsäure ein gutes Ergebnis erhalten. Das Problem dabei ist, daß Dehydrier/Brucheffekte aufgrund der Unterschiede im osmotischen Druck der ionischen Flüssigkeit und in biologischen Körpern bei Wasserorganismen wie kleinen Krustentieren beträchtlich sein kann, da die Wasserorganismen viel größer sind als Mikroorganismen wie säureechte Bakterien. Dazu kommt, daß der Dampf von Osmiumsäure stark giftig ist, so daß sich ein Sicherheitsproblem ergibt. Bei der Alternative zur Dampffixierung mit Osmiumsäure, einer chemischen Fixierung mit Glutaraldehyd, wird nicht so leicht eine mechanische Festigkeit erhalten, die ausreicht, der Bruchkraft durch den Unterschied im osmotischen Druck zu widerstehen.
Als Betrachtungsbeispiele sind in der Patent-Druckschrift 2 die Stengel von Undaria pinnatifida und Spinacia oleracea, Baumwollgewebe, Haar, Mäuseknochen, Erythrozyten und Streptococcus mutans angegeben. Die Betrachtungsbeispiele umfassen keine Wasserorganismen. Die biologischen Gewebe der Patent-Druckschrift 2 sind alle porös, so daß das Lösungsmittel sofort in das Innere der Probe vordringt. Um dagegen eine nicht zerstörende Betrachtung der Formen eines Wasserorganismus mit einer Schale (einem Exoskelett) wie bei kleinen Krustentieren durchzuführen, ist es erforderlich, die einzelnen Organismen durch das nicht zerstörte Exoskelett mit der ionischen Flüssigkeit zu tränken, so daß im Vergleich mit biologischen Geweben eine sehr lange Zeit für das Eintauchen und Trocknen benötigt wird. Da die Exoskelette von Wasserorganismen wasserabweisend sein können, müssen die Wasserorganismen, etwa kleine Krustentiere, in manchen Fällen zwangsweise in der ionischen Flüssigkeit untergetaucht werden. Die Vorgehensweise bei der Verwendung einer Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung bei der Betrachtung von Wasserorganismen ist daher eine vollständig andere als bei der Imprägnierung von zerteilten biologischen Geweben oder freien Zellen mit einer ionischen Flüssigkeit.
In der Patent-Druckschrift 2 ist ein Verfahren zum Imprägnieren, Aufbringen und Aufsprühen eines Fluidmediums, das durch Lösen einer ionischen Flüssigkeit in einem polaren Lösungsmittel wie Wasser erhalten wird, auf die Proben beschrieben, jedoch kein Verfahren zum Entfernen des Lösungsmittels angegeben.
Bei der vorliegenden Erfindung werden die Wasserorganismen zuerst in niedrig konzentrierte ionische Flüssigkeit (2 bis 10%) gegeben und dann wird die Konzentration der ionischen Flüssigkeit kontinuierlich erhöht, damit das Wasser in den Wasserorganismen durch hoch konzentrierte ionische Flüssigkeit ersetzt wird und dabei die ursprüngliche Form des lebenden Wasserorganismus erhalten bleibt. Dadurch wird der Unterschied im osmotischen Druck zwischen der Innenseite und der Außenseite des Wasserorganismus verringert, eine Dehydrierung der biologischen Probe verhindert und die Elastizität des Exoskeletts und der Gelenke des Wasserorganismus, der in die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung eingetaucht ist, bleibt erhalten, ohne daß die natürlichen Formen des Organismus zerstört werden. Die langsame Temperaturerhöhung der ionischen Flüssigkeit bei der natürlichen Trocknung verringert den osmotischen Druck zwischen der Innenseite und der Außenseite des Wasserorganismus, wodurch auch die Konzentration der ionischen Flüssigkeit im Wasserorganismus nur langsam ansteigt.
Im folgenden werden mit Bezug zu den beiliegenden Zeichnungen einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft anhand eines Rasterelektronenmikroskops (REM) beschrieben, ist aber nicht auf ein REM beschränkt. Die vorliegende Erfindung kann auch bei einer Probenbetrachtung durch eine Probenbetrachtungsvorrichtung mit einem Rastertransmissionselektronenmikroskop (RTEM), einem Ionenmikroskop und jeder andere Art von Ladungsteilchenstrahl verwendet werden.
Des weiteren wird vorliegende Erfindung anhand von Wasserorganismen als Beispiel für Proben oder Zielobjekte beschrieben, ist darauf aber nicht beschränkt. Die vorliegende Erfindung kann insbesondere bei der Betrachtung von Objekten verwendet werden, die gegen eine Änderung im osmotischen Druck oder dem Trocknen empfindlich sind. Die Betrachtungsobjekte können im Wasser lebende Mikroorganismen sein, zum Beispiel kleine Krustentiere wie Ruderfußkrebse, Cycrops, Daphnia, Gammarus, Euphasiid, Mysidopsis Bahia, Cumacea, Triopsidae spp.; große Krustentiere wie Nauplius, Cypris, Zoea, Mince-Larven und anderes; Zooplankton wie Rädertierchen und Amöben und Phytoplankton wie Cyanophyceae, Chlorophyta und Symboidinum sp.; Betrachtungsobjekte, die gegen Änderungen im osmotischen Druck empfindlich sind, etwa Wasser absorbierende Kunstharze, Agar, Gelatine und Amorphophallus konjac; Betrachtungsobjekte, die sich beim Trocknen schon unter gewöhnlichem Druck verformen, etwa Erdwärmer und Fadenwürmer; und Betrachtungsobjekte, die Trocknen unter gewöhnlichem Druck aushalten, sich jedoch im Vakuum verformen, etwa Insekten, Zecken und Spinnen.
Erste Ausführungsform
Die 1 zeigt eine Seitenansicht der Probenkammer eines Elektronenmikroskops bei einer ersten Ausführungsform. Das Elektronenmikroskop ist bei der ersten Ausführungsform ein Rasterelektronenmikroskop mit einem elektronenoptischen System mit einer Elektronenkanone zum Erzeugen eines Elektronenstrahls, einem Linsensystem zum Fokussieren des Elektronenstrahls und einem Deflektor zum Auslenken des Elektronenstrahls zum Abtasten einer Probe; mit einem Steuerabschnitt zum Steuern des elektronenoptischen Systems; mit einem Bilderzeugungsabschnitt zum Erzeugen der Abbildungen der Probe auf der Basis von Signalen von einem Detektor; mit einem Anzeigeabschnitt, etwa einer Anzeige, zum Anzeigen der aufgenommenen Abbildungen; mit einem Bedienabschnitt mit einer Maus und einer Konsole zum Bedienen der einzelnen Funktionen des Rasterelektronenmikroskops; und mit einer Vakuumpumpe zum Evakuieren der Säulen mit der Elektronenquelle und dem elektronenoptischen System (nicht dargestellt). Die Probenkammer kann auf ein Grobvakuum oder ein Hochvakuum abgepumpt werden, wobei zum Evakuieren der Probenkammer eine eigene Vakuumpumpe verwendet werden kann; in beiden Fällen werden die Proben in der Regel im Vakuumzustand betrachtet, da die Probenkammer des Elektronenmikroskops im Vakuumzustand gehalten wird. Der Steuerabschnitt und der Bilderzeugungsabschnitt können mit speziellen Leiterplatten als Hardware oder als Programm ausgeführt sein, das von einem Computer ausgeführt wird, der mit dem Elektronenmikroskop verbunden ist.
Im Inneren der Probenkammer befinden sich die Objektivlinse 1 des Elektronenmikroskops; der Elektronenstrahl 3, der von der Objektivlinse 1 des Elektronenmikroskops auf die Probe 2 eingestrahlt wird, die mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkt ist; ein Detektor 5 für reflektierte Elektronen, der ein Signal 4 für die von der mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkten Probe 2 reflektierten Elektronen erfaßt; und ein Sekundärelektronendetektor 7, der ein Sekundärelektronensignal 6 von der mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkten Probe 2 erfaßt. Die beim Einstrahlen des Elektronenstrahls auf die Probe erhaltenen Sekundärelektronen, reflektierten Elektronen und so weiter werden manchmal zusammen als Sekundärteilchen bezeichnet. Die mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkte Probe 2 befindet sich auf einem Probentisch 8 für das Elektronenmikroskop. Das Material für den Probentisch ist im allgemeinen Aluminium, der Probentisch kann jedoch auch aus einem Wasser absorbierenden Material bestehen, zum Beispiel Kohlenstoff, damit überschüssige ionische Flüssigkeit vom Probentisch abgeführt wird.
Bei der ersten Ausführungsform dient Gammarus, einer der wichtigsten marinen Wasserorganismen, als Zielobjekt bei der Beschreibung des Verfahrens zum Betrachten eines mit einer Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkten Wasserorganismus. Die erste Ausführungsform ist nicht auf den Gammarus beschränkt, sie kann bei der Betrachtung von Wasserorganismen wie Arthropoden, Plankton und kultivierten Zellen und bei der Betrachtung von anderen Proben verwendet werden, die gegen eine Änderung im osmotischen Druck empfindlich sind. Der bei der ersten Ausführungsform verwendete Gammarus hat eine Körperlänge von 3 mm oder weniger und befand sich für ein bis vier Monate in einer Ethanollösung mit einer Konzentration von 90% oder mehr; alternativ können auch Proben unmittelbar nach dem Einfangen verwendet werden.
Die 2 ist eine Ansicht zur Erläuterung des Vorgangs bei der Aufnahme der elektronenmikroskopischen Abbildung des Gammarus bei der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Zuerst wird der in Ethanol aufbewahrte Gammarus in Wasser gelegt, um das Ethanol im Gammarus durch Wasser zu ersetzen. Nach der Substitution durch Wasser hat sich die Farbe des Gammarus, der in der Ethanollösung durchscheinend ist, in undurchsichtig oder weiß geändert. Bei der ersten Ausführungsform liegt der Gammarus für 80 Minuten im Wasser. Die Zeit kann auch kürzer sein, wenn sich die Änderung in der Körperfarbe bereits früher abzeichnet. Der Gammarus wird dann aus dem Wasser genommen und auf den Probentisch des Elektronenmikroskops gelegt, wobei überschüssiges Wasser mit Filterpapier usw. aufgesaugt wird. Diese Schritte können entfallen, wenn das Probeninnere bereits Wasser enthält, etwa bei der Verwendung von Gammarus unmittelbar nach dem Einfangen.
Nach dem Aufsaugen von überschüssigem Wasser wird sofort eine kleine Menge an ionischer Flüssigkeit mit einer Pipette oder dergleichen auf die Probe getropft, bevor die Probe zu trocknen beginnt. Die 3 zeigt diesen Zustand. In der 3 befindet sich der Gammarus 10, dessen Inneres Wasser enthält, auf dem Probentisch 8. Mit einer Pipette 11 wird eine Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung 9 auf den Gammarus getropft. Da das Innere des Gammarus 10 unmittelbar nach dem Auftropfen mit Wasser getränkt ist, bleibt die Körperfarbe des Gammarus undurchsichtig oder weiß.
Für einen Gammarus ist die optimale Konzentration der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung 2% bis 5%, diese Konzentration hängt jedoch von der Art des Organismus oder dem Material, der Zusammensetzung oder dem osmotischen Druck ab. Unter dem Gesichtspunkt des Verhinderns eines Bruchs oder eines Schrumpfens der Probe durch eine Änderung im osmotischen Druck ist die Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der wässrigen Lösung vorzugsweise gleich oder kleiner als 10%. Bei der ersten Ausführungsform werden 20 ml der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung mit höherer oder niedrigerer Konzentration verwendet, es kann aber auch mehr oder weniger Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung verwendet werden, vorausgesetzt der Wasserorganismus ist in die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung eingetaucht. Die ionische Flüssigkeit hat vorzugsweise hydrophile Eigenschaften, bei der ersten Ausführungsform wird eine ionische Flüssigkeit mit der chemischen Formel C₈H₁₅N₂BF₄ verwendet. Beispielhaft wird Wasser als Lösungsmittel für die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung verwendet, es kann jedoch auch jedes andere Lösungsmittel verwendet werden. Mögliche Lösungsmittel sind außer Wasser zum Beispiel Ethanol, Methanol, Aceton, Hexan, Ether und Formalin einschließlich Formaldehyd.
Nach dem Auftropfen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung wird der Gammarus für mehr als zwei Stunden an Luft getrocknet. Trocknen an Luft heißt, daß die Probe so wie sie ist für eine gegebene Zeitspanne unter Atmosphärendruck bleibt, damit das Lösungsmittel auf natürliche Weise verdampft (natürliches Trocknen). Zum Erhöhen der Trocknungsgeschwindigkeit kann etwas Luft gegen die Probe geblasen werden, oder die Probe wird wie sie ist in einen Trockner mit einer bestimmten Temperatur gelegt oder aufgeheizt. Die Bezeichnungen Trocknen an Luft und natürliches Trocknen in den folgen Abschnitten umfassen daher auch einen Zustand, bei dem die Temperatur oder die Feuchtigkeit kontrolliert wird. Das Steuern der Temperatur oder der Feuchtigkeit ermöglicht eine Steuerung der Trocknungsgeschwindigkeit des Lösungsmittels.
Das heißt, daß ein Verfahren verwendet wird, bei dem das Lösungsmittel entfernt und die Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der wässrigen Lösung durch Trocknen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung erhöht wird, wobei der osmotische Druck zwischen der wässrigen Lösung und dem Inneren des Zielobjekts im Gleichgewicht ist. Bei dem Trocknungsverfahren der ersten Ausführungsform nimmt die Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der wässrigen Lösung kontinuierlich und allmählich zu. Bei dem in der ersten Ausführungsform beschriebenen Verfahren verdampft das Lösungsmittel, während sich die Probe in der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung befindet, so daß zwischen dem osmotischen Druck der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung und dem osmotischen Druck im Inneren des Zielobjekts ein ausgeglichener Zustand erhalten wird.
Ein allmählicher Anstieg in der Temperatur von der Temperatur der Anfangslösung der ionischen Flüssigkeit mit niedriger Konzentration (etwa 2 bis 10%) beim natürlichen Trocknen kann die Konzentration so erhöhen, daß die Probe davor bewahrt wird, aufgrund der Unterschiede im osmotischen Druck zu zerbrechen, so daß auch im Vakuum durch das Trocknen kein Bruch entsteht.
Alternativ ist es auch möglich, mehrere ionische Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Konzentrationen vorzubereiten und aufeinanderfolgend die Konzentration der Lösung zu erhöhen, in der sich die Probe befindet; das natürliche Trocknen ist jedoch weit einfacher und praktischer.
Die 4 zeigt den Zustand der Probe vier Stunden nach dem in der 3 gezeigten Zustand. Durch das Trocknen an der Luft nimmt die Menge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung allmählich ab, so daß schließlich der Gammarus teilweise freiliegt. Die Konzentration im Inneren des Gammarus 13 steigt dabei weiter an und steht weiter mit dem osmotischen Druck der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung 12 im Gleichgewicht, deren Konzentration durch das Trocknen an Luft ansteigt. Beim Eindringen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung tief in den Körper des Gammarus ändert sich die Körperfarbe des Gammarus von weiß nach durchscheinend. Dadurch kann festgestellt werden, wann der Körper des Gammarus mit der ionischen Flüssigkeit durchtränkt ist. Alternativ kann vorab mit dem erwähnten Verfahren unter Verwendung der Körperfarbe die Zeit gemessen werden, die ein Standard-Probenkörper für das Durchtränken mit der ionischen Flüssigkeit braucht, und dann auf der Basis der Eintauchzeit festgestellt werden, ob die tatsächliche Zielprobe mit der ionischen Flüssigkeit getränkt ist. Es gibt hinsichtlich dieser Verfahren jedoch keine Einschränkung für die Bestimmung, ob das Zielobjekt mit der ionischen Flüssigkeit getränkt ist, was zum Beispiel auch anhand des Gewichts des Zielobjekts festgestellt werden kann.
Während der ersten zwei bis drei Stunden des Trocknen an der Luft nach dem Auftropfen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung auf die Probe nimmt die Menge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ständig ab; danach wird in der Menge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung keine Änderung mehr beobachtet, wenn das Trocknen an der Luft beendet ist. Die Zeit für das Trocknen an der Luft hängt vom Wetter und der aufgetropften Menge an Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ab. Da der osmotischen Druck in der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung und im Inneren des Gammarus gleich ist, tritt kein Bruch auf, und die Form der Probe bleibt auch dann erhalten, wenn sie für einen ganzen Tag oder mehr so liegen bleibt wie sie ist.
Nach dem Trocknen an Luft wird überschüssige Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung mit einem Abtupfelement 14 aus Papier wie Filterpapier oder Gaze aufgesaugt. Wie in der 5 gezeigt, kann die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung dadurch von Stellen wie dem Rand der Beine entfernt werden, daß das konusförmige Abtupfelement 14 mit dem Gammarus in Kontakt gebracht wird. Dabei kann die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung dadurch von kleinen Stellen wie dem Raum zwischen den Beinen entfernt werden, daß das Papier, etwa ein Filterpapier oder ein Abfallpapier (Kimwipes (ein Warenzeichen) usw.) vorher mit Wasser oder einer hydrophilen Lösung getränkt wird. Der Grund dafür ist, daß die Viskosität der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung an der Probenoberfläche aufgrund des Trocknen zugenommen hat und von dem mit Wasser oder einer hydrophilen Lösung getränkten Papier beim Kontakt mit der Probenoberfläche leichter absorbiert wird. Wenn beim Entfernen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung Schwierigkeiten auftreten, kann die Probe auch mit einer Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung geringer Konzentration oder Wasser gewaschen werden. Auch eine Bewegung des Gammarus auf einem Probentisch aus einem Wasser absorbierenden Material wie Kohlenstoff erhöht die Wirksamkeit beim Entfernen von überschüssiger Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung.
Nach dem Entfernen von überschüssiger ionischer Flüssigkeit kann die Probe unter dem Elektronenmikroskop betrachtet werden. Vorzugsweise ist das für die Betrachtung verwendete Elektronenmikroskop ein Rasterelektronenmikroskop (REM). Die 6 zeigt eine Abbildung 15 des Gammarus, die mit dem Elektronenmikroskop und dem Verfahren der ersten Ausführungsform erhalten wird. Es ist zu sehen, daß der Gammarus mit dem Elektronenmikroskop aufgenommen werden kann, ohne daß sich die Form verändert oder beschädigt wird, die gegen eine Änderung im osmotischen Druck empfindlich ist.
Da die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung von der Oberfläche des Gammarus entfernt wurde, können in der 6 die feinen Strukturen, etwa die Tastfühler 16, betrachtet werden, ohne daß diese mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung bedeckt sind. Da der Gammarus, bei dem das Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde, auch im Vakuum seine Elastizität behält, kann nach der ersten Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop und dem Umdrehen des Gammarus dessen Rückseite betrachtet werden, und der Gammarus kann nach einer Bewegung der Gelenke und Beine nach der ersten Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop betrachtet werden. Die 7 zeigt eine Abbildung 17 der Rückseite des Gammarus, der nach der ersten Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop umgedreht und erneut betrachtet wurde. Die 7 zeigt das gleiche Exemplar wie die 6, wobei in der 7 die entgegengesetzte Seite wie in der 6 zu sehen ist. Das Bein 18 weist in der 7 eine andere Orientierung auf, da die Gelenke des Beins aus dem in der 6 gezeigten Zustand bewegt wurden.
Der in der 7 gezeigte Gammarus, dessen Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde, kann leicht vom Probentisch des Elektronenmikroskops abgenommen werden. Er kann jedoch auch dann stabil betrachtet werden, ohne daß er abrutscht, wenn der Probentisch des Elektronenmikroskops geneigt wird, da er durch eine geringe Menge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung am Probentisch klebt. Die 8 zeigt eine elektronenmikroskopische Abbildung 19 des Gammarus, bei dem das Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde und der bei einer Neigung des Probentisches von 45 Grad betrachtet wird.
Zum Vergleich zeigt die 9 ein Beispiel für die Betrachtung eines Gammarus ohne das bei der ersten Ausführungsform verwendete Verfahren. Das linke Bild zeigt eine Abbildung 20 des Gammarus, das ohne Verwendung der ionischen Flüssigkeit erhalten wurde, und das rechte Bild eine vergrößerte elektronenmikroskopische Abbildung 21 der Beine in dem Kästchen in der Mitte des linken Bildes. Das in der 9 gezeigte Beispiel wurde mit Ausnahme der Verwendung der ionischen Flüssigkeit unter den gleichen Bedingungen aufgenommen wie die Abbildungen der ersten Ausführungsform. Offensichtlich ging die Feuchtigkeit der Probe verloren, die schließlich ausgetrocknet war, als der Gammarus bei einer konstanten Temperatur ohne Verwendung des Verfahrens der ersten Ausführungsform betrachtet wurde. Wie aus der mit dem Bezugszeichen 21 versehenen Abbildung hervorgeht, sind insbesondere die Beine stark verformt und gebrochen.
Das beschriebene Probenbehandlungsverfahren kann von der Probenbehandlungsvorrichtung automatisch ausgeführt werden oder durch Befolgen der Gebrauchsanleitung. Eine solche Probenbehandlungsvorrichtung wird manchmal Vorbehandlungsvorrichtung genannt. Die Probenbehandlungsvorrichtung, die zum Ausführen des Verfahrens der ersten Ausführungsform verwendet wird, weist zumindest einen Eintauchabschnitt zum Eintauchen des Zielobjekts in die wässrige Lösung mit der ionischen Flüssigkeit und einen Trocknungsabschnitt zum Erhöhen der Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der wässrigen Lösung mit der ionischen Flüssigkeit durch Trocknen der wässrigen Lösung mit der ionischen Flüssigkeit bei einem ausgeglichenen osmotischen Druck zwischen der wässrigen Lösung mit der ionischen Flüssigkeit und der Innenseite des Zielobjekts auf. Der Eintauchabschnitt kann dabei zum Beispiel eine Vorrichtung zum Aufnehmen einer kleinen Menge der wässrigen Lösung mit der ionischen Flüssigkeit und zum Auftropfen auf das Zielobjekt sein, etwa eine Mikropipette. Der Trocknungsabschnitt kann eine Probenkammer sein, in der das Zielobjekt unter atmosphärischen Druck gesetzt wird, oder ein Trockner usw., bei dem die Temperatur und die Feuchtigkeit gesteuert werden können. Alternativ kann die Trocknungszeit durch einen Zeitgeber gesteuert werden, der an der Probenbehandlungsvorrichtung angebracht ist, wenn die zum Trocknen erforderliche Zeit vorab bestimmt wurde.
Da die Probenbehandlungsvorrichtung ein Lichtmikroskop umfaßt, mit dem das im Trocknungsabschnitt getrocknete Zielobjekt beobachtet werden kann, kann das Ausmaß der Verringerung der ionischen Flüssigkeit aufgrund des Trocknens geprüft und festgestellt werden, ob das Zielobjekt geschrumpft ist oder sich verformt hat. Wie oben erwähnt kann die Probenbehandlungsvorrichtung auch dazu verwendet werden, um auf der Basis einer Änderung in der Farbe des Zielobjekts festzustellen, ob das Zielobjekt mit der ionischen Flüssigkeit durchtränkt ist.
Bei der ersten Ausführungsform wird die wässrige Lösung mit der ionischen Flüssigkeit, die nach dem Trocknen noch übrigbleibt, mit dem Abtupfelement 14 aufgesaugt, zum Beispiel mit Papier, etwa Filterpapier, oder Gaze; es ist dabei möglich, eine solche Art von Abtupfelement an der Probenbehandlungsvorrichtung anzubringen, um die die ionische Flüssigkeit enthaltende wässrige Lösung, die nach dem Trocknen im Trocknungsabschnitt noch vorhanden ist, zu entfernen.
Durch Anbringen eines Abschnitts zum Erfassen des Trocknungsfortschritts der wässrigen Lösung mit der ionischen Flüssigkeit auf der Basis der Gewichtsänderung des Zielobjekts an der Probenbehandlungsvorrichtung kann auf einfache Weise festgestellt werden, wann das Zielobjekt mit der ionischen Flüssigkeit durchtränkt ist.
Zweite Ausführungsform
Anhand einer zweiten Ausführungsform werden im folgenden die Verfahren zum Betrachten eines mit einer Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkten Wasserorganismus, wobei ein Ruderfußkrebs (Cycrop) als Beispiel für den Wasserorganismus dient; und zum Herstellen von Objektgläsern für ein Lichtmikroskop unter Verwendung des mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkten Wasserorganismus beschrieben. Gleiche Teile wie bei der ersten Ausführungsform werden in den folgenden Abschnitten nicht noch einmal erläutert. Die bei der zweiten Ausführungsform verwendeten Ruderfußkrebse haben eine Körperlänge von 2 mm oder weniger und befanden sich für einen Monat in einer Ethanollösung mit einer Konzentration von 90% oder mehr, es können jedoch auch Proben unmittelbar nach dem Einfangen verwendet werden.
Zuerst wird der in der Ethanollösung aufbewahrte Ruderfußkrebs in Wasser gelegt, um das Ethanol durch Wasser zu ersetzen. Dabei ändert sich die Körperfarbe, die in der Ethanollösung durchscheinend ist, in undurchsichtig oder weiß, wenn das Ethanol durch Wasser ersetzt ist. Bei der zweiten Ausführungsform wird der Ruderfußkrebs für 80 Minuten in Wasser getaucht, die Zeit kann aber auch kürzer sein und anhand der Körperfarbe überprüft werden. Der Ruderfußkrebs wird dann aus dem Wasser genommen, auf den Probentisch eines Elektronenmikroskops gelegt und dabei überschüssiges Wasser mit Filterpapier etc. aufgesaugt. Diese Schritte können entfallen, wenn die Probe bereits Wasser enthält, zum Beispiel wenn ein Gammarus unmittelbar nach dem Einfangen verwendet wird.
Nach dem Aufsaugen von überschüssigem Wasser wird sofort mit dem in der 3 gezeigten Verfahren eine kleine Menge an ionischer Flüssigkeit mit einer Pipette oder dergleichen auf die Probe getropft, bevor die Probe zu trocknen beginnt. Für den Ruderfußkrebs ist die optimale Konzentration der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung 10%, die Konzentration hängt jedoch von der Art des Organismus oder dem Material, der Zusammensetzung und dem osmotischen Druck ab. Bei der zweiten Ausführungsform werden 20 ml der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung verwendet, es kann aber auch mehr oder weniger Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung verwendet werden, vorausgesetzt der Wasserorganismus ist in das Wasser eingetaucht. Die ionische Flüssigkeit hat vorzugsweise hydrophile Eigenschaften, bei der zweiten Ausführungsform wird eine ionische Flüssigkeit mit der chemischen Formel C₈H₁₅N₂BF₄ verwendet. Beispielhaft wird Wasser als Lösungsmittel für die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung verwendet, es kann jedoch auch jedes andere Lösungsmittel verwendet werden. Mögliche Lösungsmittel sind außer Wasser zum Beispiel Ethanol, Methanol, Aceton, Hexan, Ether und Formalin einschließlich Formaldehyd.
Nach dem Auftropfen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung auf den Ruderfußkrebs erfolgt für mehr als zwei Stunden ein Trocknen an Luft. Die Bezeichnung Trocknen an Luft hat hier die gleiche Bedeutung wie bei der ersten Ausführungsform; das heißt, daß die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung mit einem Ausgleich des osmotischen Drucks zwischen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung und dem Inneren des Zielobjekts getrocknet wird, was allgemein die Verfahren zum Entfernen von Lösungsmitteln unter kontinuierlichem Erhöhen der Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der wässrigen Lösung umfaßt. Durch das Trocknen an der Luft nimmt die Menge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung allmählich ab, so daß schließlich ein Teil des Ruderfußkrebses freiliegt. Beim Eindringen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung in den Körper des Ruderfußkrebses ändert sich die Körperfarbe des Ruderfußkrebses von weiß nach transparent. Auf der Basis dieser Änderung kann festgestellt werden, ob der Körper des Ruderfußkrebses mit der ionischen Flüssigkeit durchtränkt ist. Alternativ kann auch die Zeit, die für das Eindringen der ionischen Flüssigkeit in das Innere einer Standardprobe erforderlich ist, vorab bestimmt werden und dann auf der Basis der Eintauchzeit festgestellt werden, ob die Zielprobe mit der ionischen Flüssigkeit getränkt ist. Für zwei bis drei Stunden nimmt nach dem Beginn des Trocknen an Luft nach dem Auftropfen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung die Menge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung kontinuierlich ab, und schließlich wird keine Änderung in der Menge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung mehr festgestellt, womit das Trocknen an der Luft abgeschlossen ist. Die Zeit für das Trocknen an der Luft hängt vom Wetter und der Menge der aufgetropften Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ab. Da der osmotische Druck zwischen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung und dem Inneren des Ruderfußkrebses ausgeglichen ist, bricht die Probe nicht, und ihre Form bleibt auch dann erhalten, wenn sie für längere Zeit so liegen bleibt wie sie ist.
Nach dem Trocknen an Luft wird überschüssige Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung mit einem Abtupfelement aus Papier wie Filterpapier oder Gaze aufgesaugt. Das Verfahren zum Aufsaugen von überschüssiger Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ist das in der 5 gezeigte Verfahren. Dabei kann, wenn das Papier wie das Filterpapier oder Kimwipe oder die Gaze vorab mit Wasser oder einer hydrophilen Lösung getränkt wird, die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung von winzigen Stellen wie zum Beispiel dem Platz zwischen den Beinen entfernt werden. Der Grund dafür ist, daß die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung, deren Viskosität an der Probenoberfläche beim Trocknen zugenommen hat, von dem mit Wasser oder einer hydrophilen Lösung getränkten Papier beim Kontakt mit der Probenoberfläche leichter absorbiert wird. Wenn beim Entfernen der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung Schwierigkeiten auftreten, kann die Probe auch mit einer Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung geringer Konzentration oder Wasser abgewaschen werden. Auch eine Bewegung des Gammarus auf einem Probentisch aus einem Wasser absorbierenden Material wie Kohlenstoff erhöht die Wirksamkeit beim Entfernen von überschüssiger Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung.
Nach dem Entfernen von überschüssiger ionischer Flüssigkeit kann die Probe unter dem Elektronenmikroskop betrachtet werden. Vorzugsweise ist das für die Betrachtung verwendete Elektronenmikroskop ein Rasterelektronenmikroskop (REM). Der Grundaufbau des REM ist der gleiche wie bei der ersten Ausführungsform. Die 10 zeigt eine Abbildung 15 des Gammarus, die mit dem Elektronenmikroskop und dem Verfahren der zweiten Ausführungsform erhalten wird. Es ist zu sehen, daß der Gammarus mit dem Elektronenmikroskop aufgenommen werden kann, ohne daß sich die Form verändert oder beschädigt wird, die gegen eine Änderung im osmotischen Druck empfindlich ist. Die elektronenmikroskopische Abbildung 22 der 10 wurde mit einem um 45 Grad geneigten Probentisch erhalten. Es ist ersichtlich, daß die Probe in der geneigten Position betrachtet werden kann.
Zum Vergleich zeigt die 11 ein Beispiel für die Betrachtung eines Ruderfußkrebses ohne das bei der zweiten Ausführungsform verwendete Verfahren. Das in der 11 gezeigte Beispiel wurde mit Ausnahme der Verwendung der ionischen Flüssigkeit unter den gleichen Bedingungen aufgenommen wie die Abbildung der zweiten Ausführungsform. Wie die elektronenmikroskopische Abbildung 23 der 11 zeigt, ist der Ruderfußkrebs sehr empfindlich gegen Austrocknen und hat sich bei konstanter Temperatur und konstantem Druck stark verformt. Es ist unmöglich, einen bei konstanter Temperatur getrockneten Ruderfußkrebs ohne das Verfahren der zweiten Ausführungsform zu betrachten.
Im allgemeinen wird der Ruderfußkrebs unter einem Lichtmikroskop betrachtet. Bei dem Verfahren der zweiten Ausführungsform zum Behandeln der Zielproben ist es nicht erforderlich, die Probe mit einem Kleber wie Kohlenstoffband oder Kohlenstoffpaste am Probentisch zu befestigen, da die Probe durch eine kleine Restmenge der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung am Probentisch haftet. Der Wasserorganismus kann daher nach der Betrachtung und Anatomie einfach vom Probentisch des Elektronenmikroskops abgenommen werden und leicht als Probe für ein Lichtmikroskop zur Herstellung eines Objektglases mit Wasser oder einem anderen Einschlußmedium umgeben werden. Es ist möglich, den Ruderfußkrebs, in dem das Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde, nach der Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop in Wasser oder ein anderes Einschlußmedium wie Kanadabalsam einzuschließen.
Ein Ruderfußkrebs, der mit dem herkömmlichen Gefriertrocknungsverfahren behandelt wurde, weist Hohlräume auf, und es ist schwer, die Hohlräume mit Wasser oder Kanadabalsam zu füllen, woraus sich das Problem ergibt, daß Luftblasen entstehen. Bei dem Verfahren der zweiten Ausführungsform entstehen dagegen keine Hohlräume im Ruderfußkrebs, dessen Inneres mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung getränkt ist; entsprechend können Objektgläser für das Lichtmikroskop hergestellt werden, ohne daß zu befürchten ist, daß im Inneren des Wasserorganismus Luftblasen entstehen.
Das Verfahren der zweiten Ausführungsform kann mit der Probenbehandlungsvorrichtung der ersten Ausführungsform durchgeführt werden. Es kann dabei ein Abschnitt zum Herstellen von Proben für das Lichtmikroskop an der Probenbehandlungsvorrichtung angebracht werden, an dem ein Einschlußmedium auf das Zielobjekt getropft wird, um die Objektgläser für das Elektronenmikroskop herzustellen.
Dritte Ausführungsform
Bei der Taxonomie der Larven von kleinen und großen Krustentieren hat die morphologische Untersuchung der kleinen Beinchen eine große Bedeutung, die Anhängsel genannt werden. Zur genauen Untersuchung der Anhängsel von Krustentieren müssen die kompliziert verwickelten Anhängsel für eine Anatomie voneinander getrennt werden. Herkömmlich werden die Anhängsel von Krustentieren für die Anatomie unter einem Lichtmikroskop getrennt; unter dem Lichtmikroskop ist jedoch die Steuerung der anatomischen Vorrichtungen schwierig und erfordert viel Erfahrung in der Anatomie. Bei der vorliegenden Ausführungsform wird ein Verfahren zum Zergliedern von Krustentieren unter dem Elektronenmikroskop erläutert, mit dem dieses Problem gelöst wird. Die Beschreibung von gleichen Teilen wie bei der ersten Ausführungsform wird in den folgenden Abschnitten nicht wiederholt.
Die 12 zeigt eine Ansicht zur Erläuterung, wie Wasserorganismen, die durch das Imprägnieren mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung elastisch geworden sind, unter dem Elektronenmikroskop mit einer Sonde zerlegt werden, die in der Probenkammer des Elektronenmikroskops angeordnet ist. Der Wasserorganismen 24 der 12, der durch das Imprägnieren mit der Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung elastisch geworden ist, ist eine Probe, die wie bei der ersten oder zweiten Ausführungsform behandelt worden ist. Die im Inneren der Probenkammer des Elektronenmikroskops angeordnete Sonde 25 kann vorzugsweise bewegt werden, während die Probe unter dem Elektronenmikroskop betrachtet wird. Das Handhaben der Probe bei der Aufnahme einer Abbildung mittels des Elektronenstrahls ermöglicht die Aufnahme von Bewegungsbildern, in denen der Bewegungszustand der Probe visuell zu erkennen ist.
Wenn die Ausrichtung des Wasserorganismus 24 nicht für eine Anatomie geeignet ist, wird der Wasserorganismus 24 durch Wenden mit der Sonde 25 gedreht. Der Zustand des gedrehten Wasserorganismus entspricht dem in der 7 gezeigten Zustand. Aus der 12 ist ersichtlich, daß der Probentisch 8 des Elektronenmikroskops, falls erforderlich, geneigt werden kann.
Nach der Ausrichtung des Wasserorganismus 24 werden die Gelenke der Anhängsel mit der Sonde 25 bewegt oder die Anhängsel für die Anatomie getrennt. Dieser Vorgang wird erleichtert, wenn zwei oder mehr Sonden an der Probenkammer des Elektronenmikroskops angebracht sind. Entsprechend sind zwei oder mehr Sonden an der Probenkammer des Elektronenmikroskops angebracht. Die Beine 26 des mit der Sonde 25 zu zerlegenden Wasserorganismus werden unter Verwendung der Sonde 25 getrennt.
Das Verfahren der dritten Ausführungsform zur Betrachtung des Wasserorganismus, bei dem Wasser oder eine andere Lösung durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde, hat den Vorteil, daß die Gelenke auch in der Hochvakuumumgebung des Elektronenmikroskops nicht ihre Beweglichkeit verlieren, so daß sich bewegende Teile wie die Beine auch bewegt werden können. Das Verfahren hat den weiteren Vorteil, daß nach oder während der Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop der Wasserorganismus betrachtet werden kann, während die beweglichen Teile wie die Beine des Wasserorganismus mit der Sonde bewegt werden, die an der Probenkammer des Elektronenmikroskops angebracht ist. Dadurch kann der Wasserorganismus als Probe zerlegt werden.
Die abgetrennten Teile des Wasserorganismus, in dem das Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde, haben leitende Eigenschaften. Entsprechend ist es möglich, das Herumfliegen von abgebrochenen Teilen der Probe beim Aufladen und eine Kontamination der Probenkammer des Elektronenmikroskops durch die herumfliegenden Bruchstücke zu verhindern. Der Wasserorganismus, in dem das Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde, behält seine Elastizität, so daß es möglich ist, zum Beispiel die Anhängsel zu biegen, ohne daß die Probe beschädigt wird.
Die zerlegte Probe kann so wie sie ist unter dem Elektronenmikroskop betrachtet werden, sie kann jedoch auch, falls erforderlich, anschließend mit einem anderen Analysegerät wie einem Lichtmikroskop untersucht werden. In diesem Fall werden nach dem Verfahren der zweiten Ausführungsform mit einem Einschlußmedium Objektgläser hergestellt. Wenn für die Betrachtung ein biologisches Mikroskop verwendet wird, können die oben erwähnten Schritte an den Objektgläsern für das Lichtmikroskop oder am Abdeckglas durchgeführt werden. Im allgemeinen ist Glas ein isolierendes Material, das sich auflädt; das Aufbringen einer dünnen Schicht aus einer ionischen Flüssigkeit auf die Glasoberfläche kann zu einer Leitfähigkeit beitragen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die beschriebenen Ausführungsformen beschränkt und kann verschiedene Abänderungen aufweisen. Die vorstehenden Ausführungsformen wurden für ein leichteres Verständnis der vorliegenden Erfindung angeführt und sind nicht immer auf ein Verfahren mit allen beschriebenen Schritten beschränkt. Teile des Verfahrens einer Ausführungsform können durch Teile des Verfahrens einer anderen Ausführungsform ersetzt werden, und Teile des Verfahrens einer Ausführungsform können zu dem Verfahren einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Teile der Verfahren der einzelnen Ausführungsformen können zu Verfahren anderer Ausführungsformen hinzugefügt, weggelassen oder ersetzt werden.
Bezugszeichenliste

1: Objektivlinse
2: Probe
3: Elektronenstrahl
4: Signal für die reflektierten Elektronen
5: Detektor für die reflektierten Elektronen
6: Sekundärelektronensignal
7: Sekundärelektronendetektor
8: Probentisch
9: Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung
10: Gammarus, bei dem Ethanol durch Wasser ersetzt ist
11: Pipette
12: Konzentrierte Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung
13: Gammarus
14: Abtupfelement
15: Elektronenmikroskopische Abbildung eines Gammarus, bei dem Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde.
16: Tastfühler des Gammarus
17: Elektronenmikroskopische Abbildung der Rückseite des Gammarus, der nach der ersten Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop umgedreht und erneut mit dem Elektronenmikroskop betrachtet wird.
18: Bein, dessen Gelenke nach der ersten Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop bewegt wurden.
19: Elektronenmikroskopische Abbildung des Gammarus, bei dem Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde, der mit einer Neigung des Probentisches des Elektronenmikroskops um 45 Grad betrachtet wird.
20: Elektronenmikroskopische Abbildung eines Gammarus ohne Verwendung der ionischen Flüssigkeit.
21: Vergrößerte elektronenmikroskopische Abbildung von Beinen des Gammarus, die sich beim Trocknen verformt haben.
22: Elektronenmikroskopische Abbildung eines Ruderfußkrebses, bei dem Wasser durch die Ionenflüssigkeits-Wasser-Lösung ersetzt wurde.
23: Elektronenmikroskopische Abbildung eines Ruderfußkrebses ohne Verwendung der ionischen Flüssigkeit.
24: Wasserorganismus
25: Sonde
26: Beine des Wasserorganismus.

Claims

Verfahren zum Betrachten von Proben unter Aufnehmen von Abbildungen eines Zielobjekts durch Erfassen eines Signals, das beim Einstrahlen eines Ladungsteilchenstrahls auf das Zielobjekt erhalten wird, mit den Schritten Eintauchen des Zielobjekts in eine wässrige Lösung, die eine ionische Flüssigkeit enthält; Trocknen zum Erhöhen der Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung durch Trocknen der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung mit einem Ausgleich des osmotischen Drucks zwischen der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung und dem Inneren des Zielobjekts; und Betrachten für die Aufnahme der Abbildung des Zielobjekts durch Einstrahlen des Ladungsteilchenstrahls auf das Zielobjekt, das mit der wässrigen Lösung getränkt ist, die die ionische Flüssigkeit enthält.
Verfahren zum Betrachten von Proben nach Anspruch 1 mit dem Schritt des Tränkens des Zielobjekts, wobei das Ende des Trocknungsschritts auf der Basis einer Änderung in der Farbe des Zielobjekts festgelegt wird.
Verfahren zum Betrachten von Proben nach Anspruch 1, wobei die ionische Flüssigkeit hydrophile Eigenschaften aufweist.
Verfahren zum Betrachten von Proben nach Anspruch 3 mit dem Schritt des Entfernens der wässrigen Lösung, die die ionische Flüssigkeit enthält, mit einem Element, das mit Wasser oder einer hydrophilen Lösung getränkt ist, nach dem Trocknungsschritt.
Verfahren zum Betrachten von Proben nach Anspruch 1, wobei die Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung, die beim Eintauchschritt verwendet wird, gleich oder kleiner als 10% ist.
Verfahren zum Betrachten von Proben nach Anspruch 1, mit den Schritten des Herstellens von Objektgläsern für ein Lichtmikroskop durch Einschließen des Zielobjekts, das mit der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung getränkt ist, mit einem Einschlußmedium und des Betrachtens der Objektgläser für ein Lichtmikroskop unter einem Lichtmikroskop.
Verfahren zum Betrachten von Proben nach Anspruch 1 mit dem Schritt des Aufteilens oder Zerlegens des Zielobjekts, das mit der wässrigen Lösung getränkt ist, die die ionische Flüssigkeit enthält, mit einer Sonde.
Verfahren zum Vorbehandeln von Proben, die mit einer Vorrichtung zum Aufnehmen von Abbildungen der Proben durch Erfassen eines Signals, das beim Einstrahlen eines Ladungsteilchenstrahls auf die Proben erhalten wird, betrachtet werden, mit den Schritten Eintauchen der Proben in eine wässrige Lösung, die eine ionische Flüssigkeit enthält; und Trocknen zum Erhöhen der Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung durch Trocknen der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung mit einem Ausgleich des osmotischen Drucks zwischen der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung und dem Inneren der Proben.
Probenbehandlungsvorrichtung zum Behandeln eines Zielobjekts in einem Zustand, der für die Betrachtung mit einer Probenbetrachtungsvorrichtung geeignet ist, die eine Abbildung des Zielobjekts durch Erfassen eines Signals aufnimmt, das beim Einstrahlen eines Ladungsteilchenstrahls auf das Zielobjekt erhalten wird, mit einem Eintauchabschnitt zum Eintauchen des Zielobjekts in eine wässrige Lösung, die eine ionische Flüssigkeit enthält; und mit einem Trocknungsabschnitt zum Erhöhen der Konzentration der ionischen Flüssigkeit in der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung durch Trocknen der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung mit einem Ausgleich des osmotischen Drucks zwischen der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung und dem Inneren des Zielobjekts.
Probenbehandlungsvorrichtung nach Anspruch 9 mit einem Lichtmikroskop zum Betrachten des Zielobjekts, das im Trocknungsschritt getrocknet wurde.
Probenbehandlungsvorrichtung nach Anspruch 9 mit einem Abschnitt zum Entfernen von der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung, die nach dem Trocknungsschritt im Trocknungsabschnitt verblieben ist.
Probenbehandlungsvorrichtung nach Anspruch 9 mit einem Abschnitt zum Erfassen des Fortschreitens des Trocknens der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung auf der Basis eine Änderung im Gewicht des Zielobjekts.
Probenbehandlungsvorrichtung nach Anspruch 9, wobei der Eintauchabschnitt eine Mikropipette zum Auftropfen der die ionische Flüssigkeit enthaltenden wässrigen Lösung auf das Zielobjekt ist.