JP5226378B2 - 透過型電子顕微鏡、及び試料観察方法 - Google Patents

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Description

本発明は透過型電子顕微鏡、及び試料観察方法に関する。
透過型電子顕微鏡で試料を観察する場合、観察対象の試料は、コロジオン膜のようなプラスチック製の支持膜上に、水やアルコールのような分散媒を用いて、展開させて観察する。
従来、試料観察する場合の試料前処理や試料保持の方法として、例えば、特許文献１に示されるように、ウエットな環境中で、試料の走査電顕像を観察するため、試料が破裂しないように試料保持部に隔壁を設け、圧力を調整する方法がある。また、特許文献２に示されるように、粉末試料のＦＩＢ加工による薄膜化処理過程において、試料保持用の板状基板に凹部を設けて、試料を保持するための包埋剤の量を減らし、ＦＩＢ加工の時間を短縮する方法もある。さらに、特許文献３に示されるように、透過型電子顕微鏡で粉末試料を観察する場合、コロジオン膜に分散よく、試料が付着するように、粉末試料をバイブレータの振動を利用して振り掛けるようにする方法もある。
特表２００５−５２９３４０号公報 特開平１１−３０５７５号公報 特開昭４９−１０３５６５号公報
しかしながら、何れの特許文献による方法であっても、試料の変形を回避し、試料を移動させながら観察することはできない。
つまり、支持膜は電子線が通過できるような薄い有機高分子膜であるが、固体であるため、その上に載せた試料は、試料自身の重さや電子顕微鏡に挿入する前の乾燥作業の際などに変形を受けてしまい、正確な試料の形状を観察することはできない。
また、電子顕微鏡の鏡体内は真空状態であるため、対象試料は真空下で観察できるように乾燥しなければならない。そのため、生物試料のように水分を含む試料は、鏡体内に持ち込む前に、アルコールなどの有機溶剤を用いて脱水するが、その際、変質や変形が起こり、本来の生の状態に近い形で観察することは不可能である。
さらに、抽出したウイルスやタンパク粒子のように、微小な粒子状の試料については、瞬間的に凍結して非晶質の氷に埋め込んで観察することがあるが、試料は固体の氷の中に埋め込んでいるため、動きを観察することはできない。
試料の形状と試料の機能は密接に関係している。よって、試料の機能を解明するには、ありのままの形状を観察できるのが好ましい。従って、試料を変形させずに観察する方法が望まれている。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、試料を変形させずに試料そのものの形状を観察することのできる手段を提供するものである。
上記課題を解決するために、本発明は、開口部を有する試料保持部材（例えば、マイクログリッドやメッシュ等）にイオン液体を保持して、そこに試料を投入し、イオン液体中に試料を浮かして観察する。さらに、試料保持部材の近傍に、イオン液体を注入する機構（イオン液体導入機構）及び／又は電極を設けている。電極に電圧を印加すると、試料がイオン液体中で移動・変形でき、移動したり変形したりする様子を観察することができるようになる。また、試料保持部材の近傍に、蒸着装置を設けて蒸着しながらイオン液体内に試料を投入できるようにする。さらに、試料保持部材の近傍に、マイクロキャピラリーを設け、液体状の試料をイオン液体内に投入できるようにする。また、試料保持部材は回転できるようになっている。
即ち、本発明による透過型電子顕微鏡は、試料室に設置された試料に対して電子線を照射し、前記試料を透過した電子線から試料像を生成するものであって、試料ホルダーと、試料を透過した電子線に基づいて試料像を生成する画像生成部と、を備えている。ここで、試料ホルダーは、試料を試料室に導入するための試料ホルダーであって、その先端部である試料保持部材が電子線を透過させるための開口部を有し、試料が投入されたイオン液体を前記開口部で保持するものである。試料の導入に関しては、試料保持部材の開口部に、イオン液体を導入する液体導入機構によって行う。なお、イオン液体の導入量は液体導入量制御部によって制御される。
本発明による透過型電子顕微鏡は、さらに、試料保持部材の開口部に保持されたイオン液体内の試料に電圧を印加する電圧印加手段を備える。また、試料を加熱して蒸着させてイオン液体に投入する試料蒸着手段を備えるようにしても良い。
液体導入手段に関しては、試料保持部材の開口部に、液体状の試料、粉末試料が溶け込んだ溶液、及び溶液状の試薬試料の何れか１つと、イオン液体を独立して導入する構成にしても良い。
上述の透過型電子顕微鏡においては、試料保持部材を回転させながら試料を観察する構成にしても良い。
本発明による試料観察方法は、試料室に設置された試料に対して電子線を照射し、試料を透過した電子線から生成された試料像を観察する試料観察方法であって、試料を試料室に導入するための試料ホルダーの先端部である試料保持部材に、試料が分散されたイオン液体を導入する工程と、イオン液体に電子線を照射する工程と、試料を透過した電子線に基づいて生成された試料像を観察する工程と、を備えている。
イオン液体を導入する工程では、試料ホルダーが試料室にセットされた後、液体導入機構を用いて試料保持部材の開口部にイオン液体を導入する。この際、液体導入量制御部によって、イオン液体の導入量を制御するようにしても良い。
上記試料観察方法は、さらに、試料保持部材の開口部に保持されたイオン液体内の試料に電圧を印加する工程を備える。
なお、イオン液体を導入する工程では、イオン液体を試料保持部材に導入し、次いで、試料を加熱して蒸着させてイオン液体に投入するようにしても良い。
また、イオン液体を導入する工程では、試料ホルダーが試料室にセットされた後、液体導入機構を用いて、試料保持部材の開口部に、液体状の試料、粉末試料が溶け込んだ溶液、及び溶液状の試薬試料の何れか１つと、イオン液体とを独立して導入するようにしても良い。
また、電子線を照射する工程では、試料保持部材駆動機構を用いて、試料保持部材を回転させながら、電子線を試料に照射するようにしても良い。
さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
本発明によれば、試料を変形させずに試料そのものの形状を観察することができるようになる。なお、電圧を印加して敢えて試料を移動させた状態や変形させた状態を観察することもできる。
本発明は、試料保持部材に試料が投入されたイオン液体を保持させ、試料を液体中に浮かせた状態で観察できるようにした透過型電子顕微鏡、及びそれを用いて試料を観察する試料観察方法に関するものである。
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の各実施形態で用いられる試料保持部材（複数の開口を有するマイクログリッド）の構成を示す図である。図１ではマイクログリッドが示されているが、メッシュ等の複数の開口を有する部材でも良い。つまり、試料が投入されたイオン液体を試料保持部材に滴下したときに、液体の表面張力によって、開口部分に液体が保持されるような試料保持部材であれば良い。
図１ａは、試料室に挿入する試料を保持すると共に、電子線が通過するための開口を持つ試料保持部材で、マイクログリッドの模式図である。コロジオン膜のような有機高分子でできた薄い膜に多数の開口が設けられている。図１ｂは、イオン液体をマイクログリッドに分散する状態を示す模式図で、マイクログリッドの開口にイオン液体が分散されている状態を示している。さらに、図１ｃは、実際に、マイクログリッドにイオン液体を分散し、透過型電子顕微鏡で観察した透過電子像を指名している。ここでは、イオン液体が保持されたマイクログリッドの開口とそうでない開口が観察されている。なお、本発明で用いるイオン液体は、 例えば、1-Butyl-3-methylimidazolium Tetrafluoroborate（1-ブチル-3-メチルイミダゾリウム・テトラフルオロボレート）である。
図２は、本発明の第１の実施形態による透過型電子顕微鏡であって、イオン液体注入機構を備えた透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。図２に示されるように、電子顕微鏡鏡本体の電子銃１より放出された電子線２は、照射レンズ３ａおよび３ｂにより、試料ホルダー５に保持されている試料Ｓに照射されるようになっている。４ａおよび４ｂは、試料ホルダー５の試料ステージ駆動機構で、Ｘ方向およびＹ方向の試料ホルダー５の駆動を制御する。試料ホルダー５に保持された試料９を透過した電子線３は、拡大レンズ系により拡大されて、ＣＣＤカメラなどの撮像装置８に投影される。拡大レンズ系は、対物レンズ６ａ、中間レンズ６ｂ、投射レンズ６ｃで構成される。試料ホルダー５は、モータ電源１５を介して、試料回転用モータ１６により回転できるようになっている。
本実施形態では、試料保持部材（試料ホルダー５の先端部分）１７は、試料ステージの駆動機構により回転できる構成されている。よって、試料を電子線の光軸に対して回転して、試料を多角的に観察することができるようになっている。また、連続的な回転像を取得して、再構成し、電子線トモグラフィーにより、試料の三次元的な構造を観察することもできる。
また、本実施形態では、試料ホルダー５に連結したイオン液体注入機構により、試料保持部材１７にイオン液体を注入する。液槽１０に保持されたイオン液体は、送液ポンプ１１により、毛細管１２を介して、試料ホルダー５に注入される。毛細管１２には弁１３が設けられている。弁１３は、試料ホルダー５へのイオン液体の注入を制御するように作用する。送液ポンプ１１と弁１３は、イオン液体の液量制御部１４により、駆動が制御される。
図３は、試料ホルダー５に設けられたイオン液体注入（導入）機構の構成を示す図である。図３aはイオン液体注入機構を有する試料ホルダー５の外観を示している。試料９は先端部の開口部に設置される。また、図３ｂは、試料ホルダー５の先端部の拡大図である。試料保持部材１７には試料回転用モータ１６が連結されており、それによって試料保持部材１７は回転できるようになっている。さらに、図３ｃに図示するように、イオン液体は、試料保持部材１７に毛細管１２により注入される。ここで、試料保持部材１７は、金属細線をループ状に加工したものを用い、カートリッジ式で着脱できるようにしてもよい。
なお、本実施形態では、イオン液体の試料保持部材への分散状態を直接、透過型電子顕微鏡で観察して、電子線が通過するのに最適なイオン液体の液量をコントロールする。
以上のように、本実施形態では、試料保持部材１７が試料ステージの駆動機構により回転できるようになっているので、試料を電子線の光軸に対して回転して、試料を多角的に観察することができる。また、連続的な回転像を取得して、再構成し、電子線トモグラフィーにより、試料の三次元的な構造を観察することもできる。
＜第２の実施形態＞
図４は、本発明の第２の実施形態による透過型電子顕微鏡であって、電極付き試料ホルダーを備えた透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。第１の実施形態と異なり、本実施形態では、試料ホルダー５に連結した電圧印加用電源２０を動作して、イオン液体に電圧が印加されて、試料９に電界が作用するようになっている。また、図４には、第１の実施形態のイオン液体導入機構は示されていないが、これを設けても良いことは勿論である。
図５は、第２の実施形態による電極付き試料ホルダー５の構成を示す図である。図５aは、電極付き試料ホルダー５の外観を示している。試料９は当該試料ホルダー５の先端部の開口部に設置される。図５ｂは、試料ホルダー５の先端部の拡大図である。そして、試料ホルダー５の先端部分である試料保持部材１７は、それに連結された試料回転用モータ１６によって回転できるようになっている。また、図５ｃに図示するように、イオン液体を保持した試料保持部材１７に、電極１８が設置されている。
以上のような構成により、本実施形態では、試料保持部材に分散したイオン液体中に投入された試料が、電圧印加によって移動したり形状を変化させたりする様子を直接、透過型電子顕微鏡で観察することができる。これにより、例えば半導体製造プロセスにおける試料の変化の状態を把握することができる。また、本実施形態では、試料保持部材は試料ステージの駆動機構により回転できるので、試料を電子線の光軸に対して回転して、試料を多角的に観察する。連続的な回転像を取得して、再構成し、電子線トモグラフィーにより、試料の三次元的な構造を観察することもできる。
＜第３の実施形態＞
図６は、本発明の第３の実施形態による透過型電子顕微鏡であって、蒸着による試料投入機構を備えた透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。
第１の実施形態とは異なり、本実施形態では、蒸着用電源２１が試料ホルダー５に連結されており、イオン液体中に蒸着により試料が投入されるような構成となっている。本実施形態でも、第１の実施形態のイオン液体導入機構を設けてもよい。
図７は、第３の実施形態の蒸着による試料投入機構を有する試料ホルダー５の構成を示している。図７ａは、蒸着による試料投入機構を有する試料ホルダー５の外観を示している。試料９は先端部の開口部に設置される。図７ｂは、試料ホルダー５の先端部の拡大図である。試料ホルダー５の先端部分である試料保持部材１７は、それに連結された試料回転用モータ１６によって回転できるようになっている。また、図７ｃに図示するように、イオン液体を保持した試料保持部材１７の近傍には、蒸着用ヒータ１９が設置される。蒸着用ヒータ１９上に保持した蒸着試料、たとえば、パラジウムや白金などの金属Ｍは、蒸着用電源２１により、通電加熱された蒸着用ヒータ１９上で、溶融し、その微粒子が、イオン液体中に投入されるように作用する。
本実施形態では、イオン液体に蒸着された金属微粒子の形状や、金属微粒子が蒸発してイオン液体に突入する微粒子の状態の様子を、直接透過型電子顕微鏡で観察することができる。これにより、微小領域における試料をなす材料の強度や材料同士（イオン）の相性を解析することができるようになる。
また、本実施形態では、試料保持部材は試料ステージの駆動機構により回転できるので、試料を電子線の光軸に対して回転して、試料を多角的に観察することができる。そして、連続的な回転像を取得して、再構成し、電子線トモグラフィーにより、試料の三次元的な構造を観察することができる。
＜第４の実施形態＞
図８は、本発明の第４の実施形態による透過型電子顕微鏡であって、イオン液体および反応液導入（注入）機構を備えた透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。
本実施形態では、試料ホルダー５に連結したイオン液体および反応液導入機構により、イオン液体および反応液をそれぞれ独立した注入機構によって注入しており、それぞれの注入量を独立して制御できるようになっている。つまり、液槽１０aおよび１０ｂに保持されたイオン液体および反応液は、それぞれの送液ポンプ１１aおよび１１ｂにより、それぞれの毛細管（マイクロキャピラリー）１２aおよび１２ｂを介して、試料ホルダー５に注入される。イオン液体および反応液のそれぞれの送液用毛細管１２aおよび１２ｂには、それぞれ、弁１３aおよび１３ｂが設けられている。弁１３aおよび１３ｂは、試料ホルダー５へのイオン液体および反応液の注入を制御するように作用する。送液ポンプ１１aおよび１１ｂと弁１３ａおよび１３ｂは、イオン液体および反応液の液量制御部１４ａおよび１４ｂにより、駆動が制御される。
図９は、第３の実施形態によるイオン液体および反応液注入機構を有する試料ホルダー５の構成を示している。図９ａはイオン液体および反応液注入機構を有する試料ホルダー５の外観を示している。試料９は先端部の開口部に設置される。図９ｂは、試料ホルダー５の先端部の拡大図である。試料保持部材１７は、それに連結された試料回転用モータ１６によって回転できるようになっている。また、図９ｃに図示されるように、イオン液体および反応液は、それぞれの送液用毛細管１２ａおよび１２ｂによって試料保持部材１７に注入される。ここで、試料保持部材１７は、金属細線をループ状に加工したものを用い、カートリッジ式で着脱可能な構成としても良い。
本実施形態では、試料保持部材の近傍に、液体状の試料、あるいは粉末試料が溶け込んだ溶液、あるいは溶液状の試薬を導入する機構、たとえばマイクロキャピラリーを設けて、イオン液体内に液体試料を投入する。このとき、導入する試料が、酵素であれば酵素反応、あるいは、抗体であって抗原を含む試料を分散していた場合は抗原抗体反応など、試薬との反応の様子を直接電子顕微鏡で観察することができる。そして、本実施形態では、試料保持部材は試料ステージの駆動機構により回転できるので、試料を電子線の光軸に対して回転して試料を多角的に観察することもできる。また、連続的な回転像を取得して画像を再構成し、電子線トモグラフィーにより試料の三次元的な構造を観察することもできる。
＜まとめ＞
本発明の実施形態によれば、透過型電子顕微鏡において、イオン液体を分散媒として用いて、試料を浮かせた状態に保持し、試料を変形させることなく観察することができる。
また、試料保持部材の近傍に、イオン液体を注入する機構を設けることによって、イオン液体の注入量をコントロールし、さらに、イオン液体の注入量が最適であるか否かは、電子顕微鏡像を見ながら確認できるので、試料支持膜としての膜厚の制御を確実に行うことができる。
さらに、試料保持部材の近傍に、電極を設けているので、通電によって試料を移動させることができ、その現象を直接電子顕微鏡で観察することができる。
また、試料保持部材の近傍に、蒸着装置を設けているので、イオン液体内に金属微粒子を蒸着し、その微粒子の観察や蒸着の現象を直接、電子顕微鏡で観察できる。
試料保持部材の近傍に、液体状の試料、あるいは粉末試料が溶け込んだ溶液、あるいは溶液状の試薬を導入する機構、たとえばマイクロキャピラリーを設けているので、イオン液体内に液体試料を投入することができる。このとき、導入する試料が、酵素であれば、酵素反応、あるいは、抗体であれば、抗原を含む試料を分散していた場合は、抗原抗体反応など、試薬との反応の様子を直接、電子顕微鏡で観察することができる。
試料保持部材は、試料ステージの駆動機構により回転できるので、試料を電子線の光軸に対して回転することが可能となり、試料を多角的に観察することができる。また、連続的な回転像を取得して、再構成し、電子線トモグラフィーにより、試料の三次元的な構造を観察することができる。
本発明の各実施形態で用いる試料保持部材（マイクログリッド）の構造を示す図である。 本発明の第１の実施形態による透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。 第１の実施形態による、イオン液体導入機構付き試料ホルダーの構成を示す図である。 本発明の第２の実施形態による透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。 第２の実施形態による、電極付き試料ホルダーの構成を示す図である。 本発明の第３の実施形態による透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。 第３の実施形態の、蒸着による試料投入機構付き試料ホルダーの構成を示す図である。 本発明の第４の実施形態による透過型電子顕微鏡の概略構成を示す図である。 第４の実施形態による、イオン液体および反応液導入機構付き試料ホルダーの構成を示す図である。
符号の説明
１・・・電子銃、２・・・電子線、３ａ・・・照射レンズ（１）、３ｂ・・・照射レンズ（２）、４ａ・・・試料ステージ駆動機構（Ｘ方向）、４ｂ・・・試料ステージ駆動機構（Ｙ方向）、５・・・試料ホルダー、６ａ・・・対物レンズ、６ｂ・・・中間レンズ、７・・・蛍光板、８・・・ＣＣＤカメラなどの撮像装置、９・・・試料、１０・・・液槽、１０ａ・・・イオン液体用液槽、１０ｂ・・・反応液用液槽、１１・・・送液ポンプ、１１ａ・・・イオン液体送液ポンプ、１１ｂ・・・反応液送液ポンプ、１２・・・毛細管（マイクロキャピラリー）、１２ａ・・・イオン液体送液用毛細管（マイクロキャピラリー）、１２ｂ・・・反応液送液用毛細管（マイクロキャピラリー）、１３・・・弁、１３ａ・・・イオン液体用弁、１３ｂ・・・反応液用弁、１４・・・液量制御部、１４ａ・・・イオン液体の液量制御部、１４ｂ・・・反応液の液量制御部、１５・・・モータ電源、１６・・・試料回転用モータ、１７・・・試料保持部材、１８・・・電極、１８ａ・・・陽電極、１８ｂ・・・負電極、１９・・・蒸着用ヒータ、２０・・・電圧印加用電源、２１・・・蒸着用電源

Claims (14)

  1. 試料室に設置された試料に対して電子線を照射し、前記試料を透過した電子線から試料像を生成する透過型電子顕微鏡であって、
    前記試料を真空状態である前記試料室に導入するための試料ホルダーであって、その先端部である試料保持部材が前記電子線を透過させるための開口部を有し、前記試料が投入されたイオン液体を前記開口部で表面張力により保持する、試料ホルダーと、
    真空下で前記イオン液体に浮かんだ状態の前記試料を透過した電子線に基づいて試料像を生成する画像生成部と、
    を備えることを特徴とする透過型電子顕微鏡。
  2. さらに、前記試料保持部材の開口部に、前記イオン液体を導入する液体導入機構を備えることを特徴とする請求項１に記載の透過型電子顕微鏡。
  3. さらに、前記イオン液体の導入量を制御する液体導入量制御部を備えることを特徴とする請求項２に記載の透過型電子顕微鏡。
  4. さらに、前記試料保持部材の開口部に保持された前記イオン液体内の前記試料に電圧を印加する電圧印加手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の透過型電子顕微鏡。
  5. さらに、試料を加熱して蒸着させて前記イオン液体に投入する試料蒸着手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の透過型電子顕微鏡。
  6. さらに、前記試料保持部材の開口部に、液体状の試料、粉末試料が溶け込んだ溶液、及び溶液状の試薬試料の何れか１つと、前記イオン液体を独立して導入する液体導入機構を備えることを特徴とする請求項１に記載の透過型電子顕微鏡。
  7. さらに、前記試料保持部材を回転させるための試料保持部材駆動機構を備えることを特徴とする請求項１に記載の透過型電子顕微鏡。
  8. 試料室に設置された試料に対して電子線を照射し、前記試料を透過した電子線から生成された試料像を観察する試料観察方法であって、
    前記試料を真空状態である前記試料室に導入するための試料ホルダーの先端部である試料保持部材の開口部に、前記試料が分散されたイオン液体を導入する工程と、
    前記開口部に表面張力により保持されている前記イオン液体に電子線を照射する工程と、
    真空下で前記イオン液体に浮かんだ状態の前記試料を透過した電子線に基づいて生成された試料像を観察する工程と、
    を備えることを特徴とする試料観察方法。
  9. 前記イオン液体を導入する工程では、前記試料ホルダーが前記試料室にセットされた後、液体導入機構を用いて前記試料保持部材の開口部に前記イオン液体を導入することを特徴とする請求項８に記載の試料観察方法。
  10. 液体導入量制御部によって、前記イオン液体の導入量を制御することを特徴とする請求項９に記載の試料観察方法。
  11. さらに、前記試料保持部材の開口部に保持された前記イオン液体内の前記試料に電圧を印加する工程を備えることを特徴とする請求項８に記載の試料観察方法。
  12. 前記イオン液体を導入する工程では、前記イオン液体を前記試料保持部材に導入し、次いで、試料を加熱して蒸着させて前記イオン液体に投入することを特徴とする請求項８に記載の試料観察方法。
  13. 前記イオン液体を導入する工程では、前記試料ホルダーが前記試料室にセットされた後、液体導入機構を用いて、前記試料保持部材の開口部に、液体状の試料、粉末試料が溶け込んだ溶液、及び溶液状の試薬試料の何れか１つと、前記イオン液体とを独立して導入することを特徴とする請求項８に記載の試料観察方法。
  14. 前記電子線を照射する工程では、試料保持部材駆動機構を用いて、前記試料保持部材を回転させながら、前記電子線を前記試料に照射することを特徴とする請求項８に記載の試料観察方法。
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