JP4601000B2 - 特定物質観察装置及び特定物質観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、微小な粒状の特定物質（細胞、プリンタのトナー粒子等）の表面状態を観察する特定物質観察装置及び特定物質観察方法に関するものである。特に、生細胞を観察する場合に好適に使用されるものである。

微小な粒状の特定物質を観察する際に、従来から様々な方法が用いられている。例えば、物質を原子分解能レベルで観察することができる走査型プローブ顕微鏡等を用いて、観察を行っている。ところが、観察対象物が動きの自由度が高い粒状の特定物質であるので、観察を開始する前に予め基板等に何らかの方法を用いて固定する必要がある。固定しない場合には、観察対象物が吸着水や静電気の影響を受けて、走査型プローブ顕微鏡のカンチレバーに付着してしまい、観察を行えない恐れがあるためである。従って、事前の固定が必須の作業であった。

特に、観察対象物が生細胞である場合には、細胞自身が動いてしまうので細胞構造を固定して動きを止めない限り詳細な観察を行えない。そのため、生細胞を一旦、専用の溶液（例えば、リン酸緩衝ホルマリン溶液等、グルタルアルデビド等）に入れて細胞構造を固定させ、その後、基板上に固定する方法を選択せざるを得なかった。

また、表面形状の観察とは別に、細胞の表面電位や表面の細胞膜に流れる電流等を測定して、電気的な解析を行いたい場合には、導電性を有する基板に細胞を固定させ、走査型プローブ顕微鏡のカンチレバーと基板との間の電位差や電流等の測定を行っていた。これにより、特定物質の電気的な解析を行うことも可能である。
特開平５−１９１１号公報

しかしながら、上記従来の方法では、以下の課題がまだ残されていた。
即ち、観察を行うにあたって、大気中や溶液中に存在する各種の特定物質を、その都度状況に応じて基板等に固定する必要があるので、ノウハウを必要とする準備作業が要求されていた。この固定作業には、経験が必要な上、時間と手間がかかるものであった。

特に、生細胞に関しては、従来から固定せずに生きたままの状態で観察を行い、リアルな応答を検出したいという要求がある。ところが、高分解能観察のスループットに対して生細胞の動きが早いため、上述したように細胞構造を固定するしかなく、このような要求には応えることが困難であった。そのため、生細胞の詳細な観察データを入手することが難しかった。
また、細胞構造を固定するので、時間の経過と共に刻々と変化する細胞に関しては、経時的な状態観察を行うことができず、連続的な解析をすることができなかった。

また、電気的な解析を行う場合には、導電性の基板を介して測定対象物である細胞等に電流を流すため、所望する測定箇所と基板との間に少なからずとも電気的な抵抗が存在してしまう。この電気抵抗は、無視できるものではないので、ｎＡ〜ｐＡの微小電流を計測することができなかった。そのため、高精度な解析を行うことが難しかった。
更に、生細胞は、上述したように細胞構造が固定されているので、生きたままの状態での電気的な解析を行うことができない。よって、電気的な反応をリアルに観察することができなかった。

この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、粒状の特定物質を一時的に固定した状態で簡便に観察を行うことができると共に、これら固定と観察とを何度でも容易に繰り返して連続的な観察を行うこと、更には、複数の特定物質の中から任意に１つだけ選択して一時的に固定し、速やかな観察を行うことができる特定物質観察装置及び特定物質観察方法を提供することである。
また、別の目的としては、僅かな電流や電圧であっても測定でき、特定物質の電気的な解析を高精度に行うことができる特定物質観察装置を提供することである。

上記の目的を達成するために、この発明は以下の手段を提供している。
本発明に係る特定物質観察装置は、粒状の特定物質を基板上で観察する特定物質観察装置であって、前記基板に対して面が対向するように配置され、基端側から先端側に向けて一方向に延びた平板状のレバー部と、該レバー部の先端に形成された開口部と、該レバー部を片持ち状態に支持するホルダ部と、前記レバー部の撓みを測定する撓み測定手段とを有するプローブと、先端に探針を有するカンチレバーと、前記カンチレバーと前記プローブとを、前記基板表面に平行なＸＹ方向と基板表面に垂直なＺ方向とに向けて、それぞれ移動させる移動手段と、前記開口部内に前記特定物質を嵌め込んだ状態で、該特定物質を前記基板に押し付けて一時的に固定させると共に、一時的に固定された特定物質の表面上を前記探針で走査するように、前記移動手段を制御する制御手段とを備えていることを特徴とするものである。

また、本発明の特定物質観察方法は、基板に対して面が対向するように配置され、基端側がホルダ部に片持ち状態に支持されたレバー部と、該レバー部の先端に形成された開口部とを有するプローブと、先端に探針を有するカンチレバーとを利用して、粒状の特定物質を基板上で観察する特定物質観察方法であって、前記プローブを、基板表面に平行なＸＹ方向及び基板表面に垂直なＺ方向に移動させ、前記開口部内に前記特定物質を嵌め込んだ状態で、該特定物質を前記基板に押し付けて一時的に固定する固定工程と、該固定工程後、一時的に固定された前記特定物質の表面上を前記探針で走査させ、特定物質の表面形状を観察する観察工程と、該観察工程後、前記プローブを前記ＸＹ方向及び前記Ｚ方向に移動させて、前記特定物質の固定を解く固定解除工程とを備え、前記固定工程を行う際に、前記レバー部の撓み具合から前記押し付け力を所定の値以下となるように調整していることを特徴とするものである。

この発明に係る特定物質観察装置及び特定物質観察方法においては、まず、基板上に存在する複数の、粒状の特定物質のうち、選択した１つの特定物質を一時的に固定する固定工程を行う。即ち、制御手段は、移動手段を制御してプローブをＸＹ方向及びＺ方向の３方向に適宜移動させる。そして、開口部内に粒状の特定物質が入り込むように、レバー部を特定物質の上方から被せ、そのまま基板上に押さえつける。これにより、特定物質は、開口部内に嵌め込まれた状態で、レバー部と基板との間で押さえつけられて一時的に固定された状態となる。

この際、レバー部は、特定物質を押さえ込むにつれて徐々に撓んで変形し始める。撓み測定手段は、このレバー部の撓み具合の測定を行っている。制御手段は、この測定手段の測定結果から押し付け力を判断し、プローブの押し付け動作を停止するように移動手段を制御する。これにより、観察対象物である特定物質を所定の大きさの力以下で押さえ付けることができ、必要以上の力で押さえて該特定物質に傷等を付けてしまうことを防止することができる。

この固定工程が終了した後、観察工程を行う。即ち、制御手段は、プローブを固定したまま移動手段を制御して、カンチレバーを３方向に適宜移動させ、開口部内に嵌め込まれた状態で一時的に固定されている特定物質上を探針で走査させる。この際、特定物質と探針との距離を、カンチレバーの撓みが一定となるように走査させる。この走査を行うことで、特定物質の表面形状を観察することができる。
次いで、観察工程が終了した後、固定解除工程を行う。即ち、レバー部を基板から離間するように、プローブを３方向に適宜移動させる。これにより、開口部内に嵌め込まれた状態で基板に押し付けられていた特定物質は、一時的な固定から開放される。

このように、予め基板に固定されていた特定物質を観察する従来の方法とは異なり、大気中や流体中に自然な状態で存在する特定物質を、観察の目的に応じたタイミングで、また、複数ある中から任意に１つだけ選択して速やかに観察を行えるので、観察の手間と時間とを軽減することができ、簡便である。

また、観察終了後も固定状態が続いていた従来のものとは異なり、観察中は特定物質を単に一時的に固定するだけであるので、観察終了後にこの固定状態を解いて元の状態に戻すことができる。よって、一定時間の経過後、再度同じ特定物質を一時的に固定して観察することも可能である。このように、特定物質の補足と、一時的な固定と、開放と連続的に行うことができ、時間の経過と共に刻々と変化する特定物質の状態を、連続的に観察することができる。なお、同じ特定物質を再度観察するだけでなく、異なる特定物質を次々と固定して、観察することもできる。

また、本発明に特定物質観察装置は、上記本発明の特定物質観察装置において、前記カンチレバーが、前記探針が前記開口部上に位置した状態で前記ホルダ部に基端側が支持されていることを特徴とするものである。

この発明に係る特定物質観察装置においては、カンチレバーの基端側がホルダ部に支持されて、カンチレバーとプローブとが一体的に構成されているので、コンパクトな構成にでき、小型化を図ることができる。また、探針が開口部上に配置されているので、開口部内に特定物質を嵌め込んだ状態で一時的に固定した後、速やかに探針による走査を開始することができる。よって、観察時間のさらなる短縮化を図ることができる。

また、本発明の特定物質観察装置は、上記本発明の特定物質観察装置において、溶液及び前記特定物質を貯留すると共に、少なくとも前記プローブ及び前記カンチレバーを溶液内に浸した状態で収納する容器を備えていることを特徴とするものである。

この発明に係る特定物質観察装置においては、プローブ及びカンチレバーが共に溶液中に浸された状態で、容器内に収納されている。これにより、容器内に含まれている特定物質を液中観察することができる。つまり、生細胞等の生きている特定物質を、観察することができる。
特に、上述したように、特定物質を一時的に固定した状態で観察を行うので、細胞構造が固定された状態の生細胞を観察するしかなかった従来の方法とは異なり、生きたままの状態で生細胞を観察することができる。従って、時間の経過と共に変化する生細胞のリアルな反応を観察することができ、高精度で連続的な解析を行えると共に、細胞のより詳細な観察を行える。このように液中観察を行えるので、生細胞等、観察できる特定物質の幅を広げることができ、機能性が向上する。

また、本発明の特定物質観察装置は、上記本発明の特定物質観察装置において、前記探針が、導電性の探針であり、前記開口部の内周面に形成された導電性膜と、該導電性膜に電気的に接続され、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して導電性膜を介して所定の電圧を印加する電圧印加手段と、前記特定物質を介して、前記導電性膜と前記探針との間に流れる電流を計測する電流計測手段とを備えていることを特徴とするものである。

また、本発明の特定物質観察方法は、上記本発明の特定物質観察方法において、前記開口部の内周面には導電性膜が形成されていると共に、前記探針が導電性の探針であり、前記観察工程を行う際に、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して、前記導電性膜を介して所定の電圧を印加すると共に、特定物質を介して導電性膜と探針との間に流れる電流を計測する電流計測工程を同時に行うことを特徴とするものである。

この発明に係る特定物質観察装置及び特定物質観察方法においては、観察工程を行う際に、特定物質、例えば、生細胞の表面形状観察に加え、電流計測工程を行うことで電気的な解析を合わせて行うことができる。
即ち、開口部内に嵌め込まれて一時的に固定された特定物質は、開口部の内周面に形成された導電性膜に接触している状態となっている。よって、電圧印加手段により導電性膜を介して、生細胞に対して直接電圧を印加して電流を流すことができる。そして、電流計測手段が、生細胞を介して導電性膜と探針との間に流れた電流の計測を行う。

特に、導電性膜から生細胞に対して、観察を行っている探針の近傍に局所的に電流を流すので、従来測定が困難であった、ｎＡ〜ｐＡ程度の微小電流を計測することが可能である。よって、電気的解析をより高精度に行うことができる。
また、生きている状態の生細胞に対して電流を流すことができるので、例えば、細胞膜表面にあるチャネルの動きを調べることができる。特に、この電流測定と形状観察とを同時に行えるので、従来知られているパッチクランプ方式等では不可能であったチャネルの形状とチャネルの動きとを相関付けて観察することができる。これにより、チャネルの動きを詳細に解明することも可能である。このように、特定物質の電気的な解析を同時に行うことで、特定物質をより多角的に観察することができ、より詳細な解明を行うことができる。

また、本発明の特定物質観察装置は、上記本発明の特定物質観察装置において、前記探針が、導電性の探針であり、前記開口部の内周面に形成された導電性膜と、該導電性膜に電気的に接続され、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して導電性膜を介して所定の電圧を印加する電圧印加手段と、前記開口部の近傍に配された参照電極と、該参照電極の電位を基準として、前記特定物質と前記導電性膜との電位差を計測する電位計測手段とを備えていることを特徴とするものである。

また、本発明の特定物質観察方法は、上記本発明の特定物質観察方法において、前記開口部の内周面には導電性膜が形成されていると共に、前記探針が導電性の探針であり、前記観察工程を行う際に、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して、前記導電性膜を介して所定の電圧を印加すると共に、開口部の近傍に配された参照電極の電位を基準として、特定物質と導電性膜との電位差を計測する電位計測工程を同時に行うことを特徴とするものである。

この発明に係る特定物質観察装置及び特定物質観察方法においては、観察工程を行う際に、特定物質、例えば、生細胞の表面形状観察に加え、電位計測工程を行うことで電気的な解析を合わせて行うことができる。
即ち、開口部内に嵌め込まれて一時的に固定された特定物質は、開口部の内周面に形成された導電性膜に接触している状態となっている。これにより、電圧印加手段により導電性膜を介して生細胞に対して直接電圧を印加して、電流を流すことができる。そして、電位計測手段が、参照電極の電位を基準として、生細胞の表面電位と導電性膜との電位差を計測する。
特に、導電性膜から生細胞に対して直接且つ局所的に電流を流すので、生細胞の局所的な表面電位を計測することができるので、生細胞の電気的な解析を高精度に行うことができる。

本発明に係る特定物質観察装置及び特定物質観察方法によれば、粒状の特定物質を一時的に固定した状態で簡便に観察を行うことができると共に、これら固定と観察とを何度でも容易に繰り返して連続的な観察を行うことができる。よって、観察にかかる手間と時間を軽減することができる。

以下、本発明に係る特定物質観察装置及び特定物質観察方法の一実施形態について、図１から図４を参照して説明する。
本実施形態の特定物質観察装置１は、粒状の特定物質である生細胞Ｓを、基板２上で観察する装置であって、図１に示すように、プローブ３と、先端に探針４を有するカンチレバー５と、該カンチレバー５とプローブ３とを、基板表面２ａに平行なＸＹ方向と基板表面２ａに垂直なＺ方向に向けてそれぞれ移動させる移動手段６と、該移動手段６を制御する制御手段７と、溶液Ｗ及び複数の生細胞Ｓを貯留すると共に、少なくともプローブ３及びカンチレバー５を溶液Ｗ内に浸した状態で収納する容器８とを備えている。
即ち、本実施形態では、溶液Ｗ内に存在する生細胞Ｓを液中観察する場合を例にして説明する。

容器８は、上面が開口した断面コ形状に形成されており、内部に複数の生細胞Ｓ及び溶液Ｗ、例えば、培養液が貯留されている。また、基板２は、この容器８の底面に固定された状態で沈められている。また、本実施形態の容器８には、該容器８内に貯留された溶液Ｗを外部の排水タンク１０に排出する排水ポンプ１１と、該容器８内に貯液タンク１２から新たな溶液Ｗを注入する注入ポンプ１３とが接続されている。なお、注入ポンプ１３及び貯液タンク１２の数は、任意に設定して構わない。

上記プローブ３は、図２に示すように、基板２に対して面が対向するように配置され、基端側から先端側に向けて一方向に延びた平板状のレバー部２０と、該レバー部２０の先端に形成された開口部２１と、該レバー部２０を片持ち状態に支持するホルダ部２２と、レバー部２０の撓みを測定する撓み測定手段２３とを備えている。

このプローブ３は、例えば、シリコン支持層、酸化層及びシリコン活性層の３層を熱的に貼り合わせたＳＯＩ基板から形成されており、レバー部２０及びホルダ部２２が一体的に形成されている。
レバー部２０の先端部には、円形の上記開口部２１が形成されている。この開口部２１は、生細胞Ｓの最大直径よりも若干小さい大きさ（例えば、直径が数十μｍ〜１００μｍの範囲内）で形成されており、生細胞Ｓがレバー部２０の裏面側から表面側に通過しないようになっている。
なお、開口部２１の形状は、円形に限定されるものではなく、三角形状や四角形状でも良く、形状や大きさは観察対象物である特定物質に応じて、適宜変更すれば良い。

また、レバー部２０とホルダ部２２との接合部分であるレバー部２０の基端側には、開口２４が形成されており、レバー部２０が基端側で屈曲して撓み易くなっている。即ち、レバー部２０の基端側は、応力が集中する応力集中部として機能するようになっている。なお、この開口２４の数は、１つに限定されず、２つ以上形成しても構わないし、形成されていなくても構わない。
また、ホルダ部２２及びレバー部２０の基端側には、レバー部２０の撓み量に応じて抵抗値が変化するピエゾ抵抗素子２５が、開口２４の両側にレバー部２０の長手方向に沿って設けられている。なお、このピエゾ抵抗素子２５は、ＳＯＩ基板２にイオン注入法や拡散法等により不純物が注入されて形成されたものである。

また、このピエゾ抵抗素子２５には、アルミニウム等の金属配線２６が電気的に接続されており、金属配線２６を含む全体的な形状がＵ字状になるように形成されている。また、金属配線２６の端部は、２つの外部接続端子２７にそれぞれ電気的に接続されている。つまり、一方の外部接続端子２７から金属配線２６に流れた電流は、一方のピエゾ抵抗素子２５を通った後、開口２４を回り込んで他方のピエゾ抵抗素子２５に流れ、その後、他方の外部接続端子２７から外部に流れるようになっている。
なお、ピエゾ抵抗素子２５及び金属配線２６上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。

そして、外部接続端子２７を介して金属配線２６にバイアス電圧を印加することにより、レバー部２０の撓み、即ち、ピエゾ抵抗素子２５に生じる歪に応じてレベル変化する電気的信号を、出力信号として取り出すことができるようになっている。また、この出力信号は、図１に示す制御部３０に出力されるようになっている。
即ち、上述したピエゾ抵抗素子２５、金属配線２６及び外部接続端子２７は、上記撓み測定手段２３を構成している。

このように構成されたプローブ３は、図１に示すように、ホルダ部２２を介してＸＹＺステージ３１によって、ＸＹ方向及びＺ方向に移動するようになっている。これにより、プローブ３は、ＸＹ方向及びＺ方向の３方向に対して移動可能とされている。また、このＸＹＺステージ３１は、例えば、３方向に移動可能な圧電素子であり、駆動部３２から印加された電圧に応じて３方向に移動するようになっている。即ち、これらＸＹＺステージ３１及び駆動部３２は、上記移動手段６を構成している。

上記カンチレバー５は、プローブ３と同様に例えば、シリコン支持層、酸化層及びシリコン活性層の３層を熱的に貼り合わせたＳＯＩ基板から形成されており、図３に示すように、平板状のレバー部４０と、該レバー部４０の先端に形成された上記探針４と、レバー部４０の基端側を片持ち状に支持するホルダ部４１とを備えている。また、プローブ３と同様に、レバー部４０の基端側に開口４２が形成されていると共に、レバー部４０の撓み量に応じて抵抗値が変化するピエゾ抵抗素子４３が設けられている。また、このピエゾ抵抗素子４３にも同様に、金属配線４４及び２つの外部接続端子４５が電気的に接続されている。
なお、プローブ３と同様に、ピエゾ抵抗素子４３及び金属配線４４上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。

このように構成されたカンチレバー５は、図１に示すように、プローブ３と同様に、ホルダ部４１を介してＸＹＺステージ３５によって、ＸＹ方向及びＺ方向に移動するようになっている。また、このＸＹＺステージ３５も、例えば、３方向に移動可能な圧電素子であり、駆動部３６から印加された電圧に応じて３方向に移動するようになっている。即ち、これらＸＹＺステージ３５及び駆動部３６も、上記移動手段６を構成している一部である。

また、カンチレバー５に設けられたピエゾ抵抗素子４３は、レバー部４０の撓みに応じてレベル変化する電気的信号を、出力信号としてＺ電圧フィードバック回路３７に出力するようになっている。このＺ電圧フィードバック回路３７は、送られてきた出力信号が常に一定となるように、駆動部３６をフィードバック制御する。これにより、生細胞Ｓ上の走査を行ったときに、探針４と生細胞Ｓとの距離を、カンチレバー５の撓みが一定となるように制御することができる。
また、このＺ電圧フィードバック回路３７には、上述した制御部３０が接続されており、該制御部３０がＺ電圧フィードバック回路３７により上下させる信号に基づいて、生細胞Ｓの表面形状観察を行うようになっている。

これらＺ電圧フィードバック回路３７及び制御部３０は、上記制御手段７を構成している。また、この制御手段７は、プローブ３が、開口部２１内に生細胞Ｓを嵌め込んだ状態で該生細胞Ｓを基板２に押し付けて一次的に固定するように移動手段６を制御すると共に、カンチレバー５が、一時的に固定された生細胞Ｓの表面上を探針４で走査するように移動手段６を制御するようになっている。
また、制御手段７は、プローブ３のピエゾ抵抗素子２５から送られてきた出力信号から、レバー部２０の撓み具合を算出している。つまり、生細胞Ｓの押し付け力の算出を行っている。そして、レバー部２０の撓み量が所定の値に達した時点で、押し付けを停止するように移動手段６の制御を行っている。これにより、必要以上の力で生細胞Ｓを押し付けてしまうことを防止できる。

次に、このように構成された特定物質観察装置１により、溶液Ｗ中に存在する複数の生細胞Ｓのうち、１つを選択して観察する特定物質観察方法について説明する。
本実施形態の生体物質観察方法は、プローブ３をＸＹ方向及びＺ方向に移動させ、開口部２１内に生細胞Ｓを嵌め込んだ状態で、該生細胞Ｓを基板２に押し付けて一時的に固定する固定工程と、該固定工程後、一時的に固定された生細胞Ｓの表面上を探針４で走査させ、生細胞Ｓの表面形状を観察する観察工程と、該観察工程後、プローブ３をＸＹ方向及びＺ方向に移動させて、生細胞Ｓの固定を解く固定解除工程とを備えている。
また、固定工程を行う際に、制御手段７は、ピエゾ抵抗素子２５から送られてきたレバー部２０の出力信号に基づいて、レバー部２０の押し付け力を所定の値以下となるように調整している。これら各工程について、以下に詳細に説明する。

まず、溶液Ｗ内にプローブ３及びカンチレバー５を位置させた状態で、注入ポンプ１３を作動させて貯液タンク１２から容器８内に生細胞Ｓを含む溶液Ｗを注入する。これにより、図１に示すように、プローブ３及びカンチレバー５の周囲に生細胞Ｓが存在した状態となる。また、この状態において、生細胞Ｓは、例えば、培養されている。
次いで、溶液Ｗ中に存在する複数の生細胞Ｓのうち、選択した１つの生細胞Ｓを一時的に固定する固定工程を行う。即ち、制御手段７は、駆動部３２からＸＹＺステージ３１に電圧を印加させて、プローブ３をＸＹ方向及びＺ方向に適宜移動させる。そして、開口部２１内に生細胞Ｓが入り込むように、レバー部２０を生細胞Ｓの上方から被せ、そのままの状態で基板２に押さえつけるよう制御する。これにより、生細胞Ｓは、図４に示すように、開口部２１内に嵌め込まれた状態で、レバー部２０と基板２との間で押さえ付けられて一時的に固定された状態となる。
なお、本実施形態では、レバー部２０の厚みの関係により、生細胞Ｓの上側が開口部２１から露出した状態となっている。

この際、レバー部２０は、生細胞Ｓを押さえ込むにつれて徐々に撓んで変形し始める。撓み測定手段２３は、このレバー部２０の撓み具合の測定を行っている。即ち、レバー部２０が撓んで変形すると、レバー部２０の基端側に設けられたピエゾ抵抗素子２５に撓みが生じ、該撓みに応じて抵抗値が変化する。そして、ピエゾ抵抗素子２５は、レバー部２０の撓みに応じた出力信号を制御部３０に出力する。制御部３０は、この送られてきた出力信号が所定の値に達した時点で、プローブ３の押し付け動作を停止するように、移動手段６を制御する。その結果、観察対象物である生細胞Ｓを所定の大きさの力で押さえ付けることができ、必要以上の力で押さえて該生細胞Ｓに傷等を付けてしまうことを防止することができる。

この固定が終了した後、観察工程を行う。即ち、制御手段７は、プローブ３を固定したまま、駆動部３６からＸＹＺステージ３５に電圧を印加するように移動手段６を制御する。そして、カンチレバー５をＸＹ方向及びＺ方向の３方向に適宜移動させ、図４に示すように、開口部２１内に嵌め込まれた状態で一時的に固定されている生細胞Ｓ上を探針４で走査させる。

この際、カンチレバー５は、生細胞Ｓの表面形状に応じて上下に撓んで変形しようとするので、ピエゾ抵抗素子４３の抵抗値が変化する。そして、ピエゾ抵抗素子４３は、この撓みに応じた出力信号を、Ｚ電圧フィードバック回路３７に出力する。Ｚ電圧フィードバック回路３７は、送られてきた出力電圧が一定となるように、即ち、カンチレバー５の撓みが一定となるように、ＸＹＺステージ３５をＺ方向にフィードバック制御する。これにより、探針４と生細胞Ｓとの距離を、カンチレバー５の撓みが一定となるように制御した状態で走査することができる。また、制御部３０は、Ｚ電圧フィードバック回路３７により上下させる信号に基づいて、生細胞Ｓの表面形状の観察を行う。

次いで、観察工程が終了した後、固定解除工程を行う。即ち、レバー部２０を基板２から離間させるように、プローブ３を３方向に適宜移動させる。これにより、開口部２１内に嵌め込まれた状態で基板２に押し付けられていた生細胞Ｓは、固定から開放される。

上述したように、本実施形態の特定物質観察方法は、予め基板２に細胞構造が固定されていた生細胞Ｓを観察する従来の方法とは異なり、溶液Ｗ中に自然な状態で存在する生細胞Ｓを、観察の目的に応じたタイミングで、また、複数ある中から任意に１つだけ選択して速やかに観察を行えるので、観察の手間と時間とを軽減することができる。
また、観察終了後においても固定状態が続いていた従来の方法とは異なり、観察中は生細胞Ｓを一時的に固定するだけであるので、観察終了後にこの固定状態を解いて元の状態に戻すことができる。よって、一定時間の経過後、再度同じ生細胞Ｓを一時的に固定して観察することも可能である。

このように、生細胞Ｓの補足と、一時的な固定と、開放とを連続的に行うことができ、時間の経過と共に刻々と変化する生細胞Ｓの状態を連続的に観察することができる。なお、同じ生細胞Ｓを再度観察するだけでなく、異なる生細胞Ｓを次々と固定して観察することもできる。
特に、生細胞Ｓを一時的に固定した状態で観察を行い、その後開放することができるので、細胞構造を固定した状態で観察するしかなかった従来の方法とは異なり、生きたままの状態で生細胞Ｓを観察することができる。従って、生細胞Ｓのリアルな反応を観察することができ、より詳細な観察を行える。

また、本実施形態の特定物質観察装置１は、容器８を備えているので、生細胞Ｓ等の生きている特定物質であっても、そのままの状態で液中観察することができる。よって、観察できる特定物質の幅を広げることができ、機能性が向上する。

なお、上記実施形態において、プローブ３とカンチレバー５とを別々の構成としたが、図５に示すように、プローブ３とカンチレバー５とを一体的に構成しても構わない。即ち、探針４が開口部２１上に位置した状態で、カンチレバー５の基端側をプローブ３のホルダ部２２に支持させても構わない。こうすることで、コンパクトな構成にでき、小型化を図ることができる。また、探針４が開口部２１上に配置されているので、開口部２１内に生細胞Ｓを嵌め込んだ状態で一時的に固定した後、速やかに探針４による走査を開始することができる。よって、観察時間のさらなる短縮化を図ることができる。

次に、本発明に係る特定物質観察装置の第２実施形態を、図６を参照して説明する。なお、この第２実施形態においては、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第２実施形態と第１実施形態との異なる点は、第１実施形態では、単に生細胞Ｓの表面形状を観察するだけであったのに対し、第２実施形態の特定物質観察装置１は、生細胞Ｓの表面形状観察に加え、電気的な解析も行う点である。

即ち、本実施形態の特定物質観察装置５０は、図６に示すように、開口部２１の内周面に形成された導電性膜５１と、該導電性膜５１に図示しない配線を通じて電気的に接続され、開口部２１内に嵌め込まれた生細胞Ｓに対して導電性膜５１を介して所定の電圧を印加する電圧印加手段５２と、生細胞Ｓを介して導電性膜５１と探針４との間に流れる電流を計測する電流計測手段５３とを備えている。
また、本実施形態の特定物質観察装置５０は、探針４が導電性の探針となっており、図示しない配線を介して電流計測手段５３に電気的に接続されている。

このように構成された特定物質観察装置５０を用いた特定物質観察方法は、観察工程を行う際に、開口部２１内に嵌め込まれた生細胞Ｓに対して、導電性膜５１を介して所定の電圧を印加すると共に、生細胞Ｓを介して導電性膜５１と探針４との間に流れる電流を計測する電流計測工程を同時に行う。
即ち、図６に示すように、開口部２１内に嵌め込まれて一時的に固定された生細胞Ｓは、開口部２１の内周面に形成された導電性膜５１に接触している状態となっている。よって、電圧印加手段５２により導電性膜５１を介して、生細胞Ｓに対して直接電圧を印加して電流を流すことができる。そして、電流計測手段５３が生細胞Ｓを介して導電性膜５１と探針４との間に流れた電流の計測を行う。

特に、導電性膜５１から生細胞Ｓに対して、観察を行っている探針４の近傍に局所的に電流を流すことができるので、従来測定が困難であった、ｎＡ〜ｐＡ程度の微小電流を計測することが可能である。よって、電気的解析をより高精度に行うことができる。
また、生きている状態の生細胞Ｓに対して電流を流すことができるので、細胞膜表面にあるチャネルの動きを調べることができる。特に、電流測定と形状観察とを同時に行えるので、従来知られているパッチクランプ方式等では不可能であったチャネルの形状とチャネルの動きとを相関付けて観察することができる。これにより、チャネルの動きを詳細に解明することも可能である。
このように、生細胞Ｓの電気的な解析を同時に行うことで、生細胞Ｓをより多角的に観察することができ、より詳細な解明を行うことができる。

なお、上記第２実施形態では、電流計測を行ったが、例えば、図７に示すように、溶液Ｗ中の探針４の近傍に参照電極６１を配置し、電流計測手段５３に変わって、参照電極６１の電位を基準として生細胞Ｓと導電性膜５１との電位差を計測する電位計測手段６２を設けて、特定物質観察装置６０を構成しても構わない。
この場合の特定物質観察装置６０を用いた特定物質観察方法は、観察工程を行う際に、開口部２１内に嵌め込まれた生細胞Ｓに対して、導電性膜５１を介して所定の電圧を印加すると共に、参照電極６１の電位を基準として、生細胞Ｓと導電性膜５１との電位差を計測する電位計測工程を行う。この場合においても、観察を行っている探針４の近傍において、生細胞Ｓの局所的な表面電位を計測することができるので、同様に生細胞Ｓの電気的な解析を高精度に行うことができる。

なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。

例えば、上記各実施形態では、特定物質として生細胞を例にして説明したが、生細胞に限られるものではない。例えば、表面が修飾された高分子のビーズやプリンタ等に使用されるトナー粒子等でも構わない。また、生細胞を液中観察するため、溶液を用いて液中観察する例を説明したが、上述したビーズやトナー粒子を観察する場合には、液中観察ではなく大気中で観察を行っても構わない。

また、上記実施形態では、ピエゾ抵抗素子を利用した自己検知方式によりカンチレバーの撓みを測定したが、自己検知方式に限られず、光を利用した光テコ方式により、カンチレバーの撓みを測定するように構成しても構わない。

また、上記各実施形態では、カンチレバーを振動させず静的な状態で走査を行ったが、この場合に限られず、例えば、圧電素子等の加振手段をホルダ部に設けて、カンチレバーをＺ方向に向けて所定の周波数で走査させても構わない。また、この場合には、カンチレバーの振動状態が一定となるように、特定物質と探針との距離を制御すればよい。このように、動的な方法で走査を行って観察することで、静的な方法に比べて測定結果の精度をより向上することができる。

また、上記各実施形態において、プローブをＸＹ方向及びＺ方向の３方向に適宜移動させて、生細胞を開口部内に入るように補足する際に、レーザ光を利用した光ピンセット技術を利用して生細胞の補足を補助しても構わない。
即ち、図８に示すように、例えば、基板２の下側から、任意に選択した生細胞Ｓに向けてレーザ光Ｌを照射する。この際、生細胞Ｓ内で集光するように図示しないレンズ等を利用してレーザ光Ｌを照射する。なお、この場合においては、光学的に透明な基板２を用いる。ここで、光り、即ち、粒子である光子は、運動量を持っているので、屈折や反射によって物体に力が及ぼされる。つまり、生細胞Ｓで反射又は通り抜けた光子は、屈折することで運動量として変換される。この際、一部の運動量が生細胞Ｓに分配され、これが生細胞Ｓを動かす力となる。

上述したように、レーザ光Ｌを照射することで生細胞Ｓを補足することができると共に、レーザ光Ｌを移動させることで生細胞Ｓを追従させて所定の方向に誘導することができる。また、この生細胞Ｓの誘導に合わせてプローブ３を動かすことで、より容易且つ確実に開口部２１内に生細胞Ｓを入れることができる。
上述したように、光りピンセット技術を利用することで、より短時間に生細胞Ｓの固定を行うことができ、さらに効率の良い観察を行うことができる。

本発明の第１実施形態に係る特定物質観察装置の構成図である。 図１に示す特定物質観察装置を構成するプローブの斜視図である。 図１に示す特定物質観察装置を構成するカンチレバーの斜視図である。 図１に示す特定物質観察装置により生細胞を観察する際の一工程図であり、プローブで生細胞を一時的に固定した後、生細胞の表面上を探針で走査している状態を示す図である。 図１に示す特定物質観察装置の変形例を示す図であり、プローブとカンチレバーとが一体的に構成されている状態を示す図である。 本発明の第２実施形態に係る特定物質観察装置を説明する図であって、開口部の内周面に形成された導電性膜を利用して、生細胞の電流測定を行っている状態を示す図である。 開口部の内周面に形成された導電性膜を利用して、生細胞の表面電位測定を行っている状態を示す図である。 図１に示す特定物質観察装置により観察を行う際に、光りピンセット技術により生細胞を補足すると共にプローブに向けて誘導している状態を示す図である。

符号の説明

Ｓ 生細胞（特定物質）
Ｗ 溶液
１、５０、６０ 特定物質観察装置
２ 基板２
２ａ 基板表面
３ プローブ
４ 探針
５ カンチレバー
６ 移動手段
７ 制御手段
８ 容器
２０ レバー部
２１ 開口部
２２ ホルダ部
２３ 撓み測定手段
５１ 導電性膜
５２ 電圧印加手段
５３ 電流計測手段
６１ 参照電極
６２ 電位計測手段

Claims (8)

1. 粒状の特定物質を基板上で観察する特定物質観察装置であって、
   前記基板に対して面が対向するように配置され、基端側から先端側に向けて一方向に延びた平板状のレバー部と、該レバー部の先端に形成された開口部と、該レバー部を片持ち状態に支持するホルダ部と、前記レバー部の撓みを測定する撓み測定手段とを有するプローブと、
   先端に探針を有するカンチレバーと、
   前記カンチレバーと前記プローブとを、前記基板表面に平行なＸＹ方向と基板表面に垂直なＺ方向とに向けて、それぞれ移動させる移動手段と、
   前記開口部内に前記特定物質を嵌め込んだ状態で、該特定物質を前記基板に押し付けて一時的に固定させると共に、一時的に固定された特定物質の表面上を前記探針で走査するように、前記移動手段を制御する制御手段とを備えていることを特徴とする特定物質観察装置。
2. 請求項１に記載の特定物質観察装置において、
   前記カンチレバーは、前記探針が前記開口部上に位置した状態で前記ホルダ部に基端側が支持されていることを特徴とする特定物質観察装置。
3. 請求項１又は２に記載の特定物質観察装置において、
   溶液及び前記特定物質を貯留すると共に、少なくとも前記プローブ及び前記カンチレバーを溶液内に浸した状態で収納する容器を備えていることを特徴とする特定物質観察装置。
4. 請求項３に記載の特定物質観察装置において、
   前記探針が、導電性の探針であり、
   前記開口部の内周面に形成された導電性膜と、
   該導電性膜に電気的に接続され、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して導電性膜を介して所定の電圧を印加する電圧印加手段と、
   前記特定物質を介して、前記導電性膜と前記探針との間に流れる電流を計測する電流計測手段とを備えていることを特徴とする特定物質観察装置。
5. 請求項３に記載の特定物質観察装置において、
   前記探針が、導電性の探針であり、
   前記開口部の内周面に形成された導電性膜と、
   該導電性膜に電気的に接続され、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して導電性膜を介して所定の電圧を印加する電圧印加手段と、
   前記開口部の近傍に配された参照電極と、
   該参照電極の電位を基準として、前記特定物質と前記導電性膜との電位差を計測する電位計測手段とを備えていることを特徴とする特定物質観察装置。
6. 基板に対して面が対向するように配置され、基端側がホルダ部に片持ち状態に支持されたレバー部と、該レバー部の先端に形成された開口部とを有するプローブと、先端に探針を有するカンチレバーとを利用して、粒状の特定物質を基板上で観察する特定物質観察方法であって、
   前記プローブを、基板表面に平行なＸＹ方向及び基板表面に垂直なＺ方向に移動させ、前記開口部内に前記特定物質を嵌め込んだ状態で、該特定物質を前記基板に押し付けて一時的に固定する固定工程と、
   該固定工程後、一時的に固定された前記特定物質の表面上を前記探針で走査させ、特定物質の表面形状を観察する観察工程と、
   該観察工程後、前記プローブを前記ＸＹ方向及び前記Ｚ方向に移動させて、前記特定物質の固定を解く固定解除工程とを備え、
   前記固定工程を行う際に、前記レバー部の撓み具合から前記押し付け力を所定の値以下となるように調整していることを特徴とする特定物質観察方法。
7. 請求項６に記載の特定物質観察方法において、
   前記開口部の内周面には導電性膜が形成されていると共に、前記探針が導電性の探針であり、
   前記観察工程を行う際に、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して、前記導電性膜を介して所定の電圧を印加すると共に、特定物質を介して導電性膜と探針との間に流れる電流を計測する電流計測工程を同時に行うことを特徴とする特定物質観察方法。
8. 請求項６に記載の特定物質観察方法において、
   前記開口部の内周面には導電性膜が形成されていると共に、前記探針が導電性の探針であり、
   前記観察工程を行う際に、前記開口部内に嵌め込まれた前記特定物質に対して、前記導電性膜を介して所定の電圧を印加すると共に、開口部の近傍に配された参照電極の電位を基準として、特定物質と導電性膜との電位差を計測する電位計測工程を同時に行うことを特徴とする特定物質観察方法。
   
   
   

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