JP2000069953A - 特定物質の細胞導入装置及びこれを用いた観察装置 - Google Patents
特定物質の細胞導入装置及びこれを用いた観察装置Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】特定物質を含むベシクル、特に１０μｍよりも
小さいベシクルをも、細胞試料の所望位置に押し付け導
入し得る特定物質の細胞導入装置を提供する。 【解決手段】ベース２に立てられた支柱４にはＺステー
ジ２０を介してアーム２２が固定されている。アーム２
２は一般にチューブスキャナーと呼ばれる円筒型圧電ア
クチュエーター２４の上端部を支持し、その下端にはヘ
ッド３０が固定されている。ヘッド３０の下側にはカン
チレバーチップ４０が取り付けられる。カンチレバーチ
ップ４０は、支持部４２から延びたレバー部４４を有
し、その先端は、表面処理が施されている。ヘッド３０
は、カンチレバーチップ４０のレバー部４４の変位を検
出する変位検出系を内部に備えている。支柱４に支持さ
れた試料台５２は好適には水平方向に移動可能であり、
レバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料との間の
位置合わせに利用される。
小さいベシクルをも、細胞試料の所望位置に押し付け導
入し得る特定物質の細胞導入装置を提供する。 【解決手段】ベース２に立てられた支柱４にはＺステー
ジ２０を介してアーム２２が固定されている。アーム２
２は一般にチューブスキャナーと呼ばれる円筒型圧電ア
クチュエーター２４の上端部を支持し、その下端にはヘ
ッド３０が固定されている。ヘッド３０の下側にはカン
チレバーチップ４０が取り付けられる。カンチレバーチ
ップ４０は、支持部４２から延びたレバー部４４を有
し、その先端は、表面処理が施されている。ヘッド３０
は、カンチレバーチップ４０のレバー部４４の変位を検
出する変位検出系を内部に備えている。支柱４に支持さ
れた試料台５２は好適には水平方向に移動可能であり、
レバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料との間の
位置合わせに利用される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ベシクルを細胞試
料の特定位置に近づけて、ベシクルに内包される特定物
質を細胞に導入するための細胞導入装置に関し、さらに
は、この細胞導入装置を備えた観察装置に関する。
料の特定位置に近づけて、ベシクルに内包される特定物
質を細胞に導入するための細胞導入装置に関し、さらに
は、この細胞導入装置を備えた観察装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡや膜タンパクや細胞質、細胞間の
情報伝達物質等の特定物質を細胞試料に導入する代表的
な手法には、以下に述べる三つがある。第一の手法は、
最初に特定物質が細胞試料と同じ構造の膜で囲まれたベ
シクルと呼ばれる物質を用意し、これを細胞試料の培養
液中に特定濃度で共存させ、細胞試料とベシクルとが接
触した後に、ベシクルが細胞試料に取り込まれるのを待
つことで、ベシクルに内包された特定物質を細胞試料に
導入させる方法である。
情報伝達物質等の特定物質を細胞試料に導入する代表的
な手法には、以下に述べる三つがある。第一の手法は、
最初に特定物質が細胞試料と同じ構造の膜で囲まれたベ
シクルと呼ばれる物質を用意し、これを細胞試料の培養
液中に特定濃度で共存させ、細胞試料とベシクルとが接
触した後に、ベシクルが細胞試料に取り込まれるのを待
つことで、ベシクルに内包された特定物質を細胞試料に
導入させる方法である。
【０００３】ここで、ベシクルについて説明する。ベシ
クルは、脂質膜の内側もしくは脂質膜上に、細胞試料を
導入させたい特定物質を取り込んだものを指し、例え
ば、特開平６−２９８６３８号公報に記載された「リポ
ソーム」はその一つである。
クルは、脂質膜の内側もしくは脂質膜上に、細胞試料を
導入させたい特定物質を取り込んだものを指し、例え
ば、特開平６−２９８６３８号公報に記載された「リポ
ソーム」はその一つである。
【０００４】この特開平６−２９８６３８号公報には、
「リポソーム」が内部に水相を含むリン脂質二重層の微
小ベシクルであると記載されている。また、ベシクルに
取り込まれた特定物質については、水溶性薬物（特定物
質）はその内水相へ、油溶性のものは二重膜部分へ取り
込むことができると記載がある。これは脂質膜の内側も
しくは脂質膜上に、特定物質が取り込まれた状態を示し
ている。また、特定物質がベシクルに取り込まれた状態
を内包と呼んでいる。
「リポソーム」が内部に水相を含むリン脂質二重層の微
小ベシクルであると記載されている。また、ベシクルに
取り込まれた特定物質については、水溶性薬物（特定物
質）はその内水相へ、油溶性のものは二重膜部分へ取り
込むことができると記載がある。これは脂質膜の内側も
しくは脂質膜上に、特定物質が取り込まれた状態を示し
ている。また、特定物質がベシクルに取り込まれた状態
を内包と呼んでいる。
【０００５】第二の手法は、同じく最初にベシクルを用
意し、ガラスチューブの先端にベシクルを吸着し、これ
を細胞試料に押し付けて融合させるやり方である。第三
の手法は、先端が尖ったガラスチューブ内に特定物質を
含ませ、ガラスチューブの先端を細胞試料に突き刺し、
中に含んでいる特定物質を細胞試料に注入するやり方で
ある。
意し、ガラスチューブの先端にベシクルを吸着し、これ
を細胞試料に押し付けて融合させるやり方である。第三
の手法は、先端が尖ったガラスチューブ内に特定物質を
含ませ、ガラスチューブの先端を細胞試料に突き刺し、
中に含んでいる特定物質を細胞試料に注入するやり方で
ある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】第一の手法では、特定
物質が細胞試料のどこに導入されたかが分からないた
め、のちの観察の際に不便がある。第二の手法では、ガ
ラスチューブで吸着できるベシクルの大きさは精々１０
μｍであり、これよりも小さいベシクルを導入すること
ができない。
物質が細胞試料のどこに導入されたかが分からないた
め、のちの観察の際に不便がある。第二の手法では、ガ
ラスチューブで吸着できるベシクルの大きさは精々１０
μｍであり、これよりも小さいベシクルを導入すること
ができない。
【０００７】第三の手法では、細胞試料の細胞膜に穴を
開けるため、細胞が破壊されるおそれがある。また、ガ
ラスチューブの先端は非常に細いことが要求されるが、
その加工にも限界がある。
開けるため、細胞が破壊されるおそれがある。また、ガ
ラスチューブの先端は非常に細いことが要求されるが、
その加工にも限界がある。
【０００８】本発明の目的は、ベシクルを、特に１０μ
ｍよりも小さいベシクルであっても、細胞試料の所望位
置に選択的に接触配置でき、これにより所望位置に特定
物質を導入できる特定物質の細胞導入装置を提供するこ
とである。本発明の目的は、また、細胞試料へのベシク
ルの導入の際に働く相互作用をも解析可能な観察装置を
提供することである。
ｍよりも小さいベシクルであっても、細胞試料の所望位
置に選択的に接触配置でき、これにより所望位置に特定
物質を導入できる特定物質の細胞導入装置を提供するこ
とである。本発明の目的は、また、細胞試料へのベシク
ルの導入の際に働く相互作用をも解析可能な観察装置を
提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ベシクルを細
胞に近づけ接触させることで特定物質を細胞内に導入す
るための装置であり、先端部にベシクルを保持可能で、
弾性変形し得るレバー部を持つカンチレバーチップと、
ベシクルの入った容器を載置するステージと、カンチレ
バーチップとステージの間に相対的な上下方向の移動を
与える上下移動機構と、カンチレバーチップとステージ
の間に相対的な水平方向の移動を与える水平移動機構と
を有している。
胞に近づけ接触させることで特定物質を細胞内に導入す
るための装置であり、先端部にベシクルを保持可能で、
弾性変形し得るレバー部を持つカンチレバーチップと、
ベシクルの入った容器を載置するステージと、カンチレ
バーチップとステージの間に相対的な上下方向の移動を
与える上下移動機構と、カンチレバーチップとステージ
の間に相対的な水平方向の移動を与える水平移動機構と
を有している。
【００１０】同装置は、好ましくは、カンチレバーチッ
プのレバー部の弾性変形量を検出し、これに基づいてレ
バー部が受けている力を特定する変位センサーを更に有
している。
プのレバー部の弾性変形量を検出し、これに基づいてレ
バー部が受けている力を特定する変位センサーを更に有
している。
【００１１】また、本発明は、特定物質の細胞への導入
および導入前後の細胞を観察するための装置であり、上
述した特定物質の細胞導入装置に加えて、細胞およびベ
シクルを光学的に観察するための光学系とを有してい
る。
および導入前後の細胞を観察するための装置であり、上
述した特定物質の細胞導入装置に加えて、細胞およびベ
シクルを光学的に観察するための光学系とを有してい
る。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態について説明する。細胞導入装置を備えた
観察装置の全体構成を図１に概略的に示す。本実施形態
の観察装置は細胞導入装置と倒立型光学顕微鏡とを含ん
でおり、以下では、先ず細胞導入装置について述べ、続
いて倒立型光学顕微鏡について述べることにする。
の実施の形態について説明する。細胞導入装置を備えた
観察装置の全体構成を図１に概略的に示す。本実施形態
の観察装置は細胞導入装置と倒立型光学顕微鏡とを含ん
でおり、以下では、先ず細胞導入装置について述べ、続
いて倒立型光学顕微鏡について述べることにする。
【００１３】［細胞導入装置］図１に示されるように、
ベース２に立てられた支柱４にはＺステージ２０が設け
られている。Ｚステージ２０は、支柱４に固定された固
定部２０ａと、固定部２０ａに対して移動可能に支持さ
れた移動部２０ｂとを有しており、移動部２０ｂに固定
されたアーム２２には、一般にチューブスキャナーと呼
ばれる円筒型圧電アクチュエーター２４の上端部が固定
されている。円筒型圧電アクチュエーター２４の下端に
はヘッド３０が固定されている。円筒型圧電アクチュエ
ーター２４は、その自由端が三次元的に変位し得、従っ
てヘッド３０を三次元的に移動し得る。
ベース２に立てられた支柱４にはＺステージ２０が設け
られている。Ｚステージ２０は、支柱４に固定された固
定部２０ａと、固定部２０ａに対して移動可能に支持さ
れた移動部２０ｂとを有しており、移動部２０ｂに固定
されたアーム２２には、一般にチューブスキャナーと呼
ばれる円筒型圧電アクチュエーター２４の上端部が固定
されている。円筒型圧電アクチュエーター２４の下端に
はヘッド３０が固定されている。円筒型圧電アクチュエ
ーター２４は、その自由端が三次元的に変位し得、従っ
てヘッド３０を三次元的に移動し得る。
【００１４】ヘッド３０の下側にはカンチレバーチップ
４０が取り付けられる。カンチレバーチップ４０は、支
持部４２から延びたレバー部４４を有し、その先端は、
分子間力により液中に存在するベシクルを良好に吸着し
得るように表面処理されている。この表面処理は、ベシ
クルの膜の状態に合わせて、例えば、親水化処理、疎水
化処理が施される。また、ベシクルの膜に官能基や蛋白
質分子が導入される場合を考慮し、レバー部４４の先端
部に官能基や蛋白質分子を導入する処理が施される。更
に、ベシクルの膜が電荷を有している場合を考慮し、レ
バー部４４を導電化する処理が施される。なお、導電化
処理については、レバー部４４の表面を処理するのでは
なく、レバー部４４の材料として導電材料を用いてもよ
い。
４０が取り付けられる。カンチレバーチップ４０は、支
持部４２から延びたレバー部４４を有し、その先端は、
分子間力により液中に存在するベシクルを良好に吸着し
得るように表面処理されている。この表面処理は、ベシ
クルの膜の状態に合わせて、例えば、親水化処理、疎水
化処理が施される。また、ベシクルの膜に官能基や蛋白
質分子が導入される場合を考慮し、レバー部４４の先端
部に官能基や蛋白質分子を導入する処理が施される。更
に、ベシクルの膜が電荷を有している場合を考慮し、レ
バー部４４を導電化する処理が施される。なお、導電化
処理については、レバー部４４の表面を処理するのでは
なく、レバー部４４の材料として導電材料を用いてもよ
い。
【００１５】ヘッド３０は、取り付けられたカンチレバ
ーチップ４０のレバー部４４の変位を検出する変位検出
系を内部に備えている。この変位検出系は、レーザーダ
イオード３２、フォーカスレンズ３４、全反射ミラー
（もしくはダイクロイックミラー）３６、複数の受光領
域を持つフォトダイオード３８とで構成されている。カ
ンチレバーチップ４０のレバー部４４の変位は、フォト
ダイオード３８に入射するレバー部４４からの反射光ビ
ームの位置に基づいて求められる。
ーチップ４０のレバー部４４の変位を検出する変位検出
系を内部に備えている。この変位検出系は、レーザーダ
イオード３２、フォーカスレンズ３４、全反射ミラー
（もしくはダイクロイックミラー）３６、複数の受光領
域を持つフォトダイオード３８とで構成されている。カ
ンチレバーチップ４０のレバー部４４の変位は、フォト
ダイオード３８に入射するレバー部４４からの反射光ビ
ームの位置に基づいて求められる。
【００１６】試料台５２は支柱４に支持されており、こ
の上には、ＤＮＡ等の物質を含んだベシクルを入れたシ
ャーレ等の透明な容器や細胞試料を入れたシャーレ等の
透明な容器が例えば代わる代わる置かれる。あるいは、
一つの透明な容器の内部を区切り、ベシクルと細胞試料
を異なる部分に別々に入れることが可能な容器を置いて
もよい。さらには、ベシクルと細胞試料を異なる箇所に
載せたスライドガラスが置かれてもよい。本明細書では
透明な容器に代表的にシャーレを想定して説明する。
の上には、ＤＮＡ等の物質を含んだベシクルを入れたシ
ャーレ等の透明な容器や細胞試料を入れたシャーレ等の
透明な容器が例えば代わる代わる置かれる。あるいは、
一つの透明な容器の内部を区切り、ベシクルと細胞試料
を異なる部分に別々に入れることが可能な容器を置いて
もよい。さらには、ベシクルと細胞試料を異なる箇所に
載せたスライドガラスが置かれてもよい。本明細書では
透明な容器に代表的にシャーレを想定して説明する。
【００１７】試料台５２は好適には水平方向に移動可能
に支持されており、そこに載せられるシャーレとカンチ
レバーチップとの間に水平方向の相対的な移動を与え、
レバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料との間の
位置合わせに利用される。
に支持されており、そこに載せられるシャーレとカンチ
レバーチップとの間に水平方向の相対的な移動を与え、
レバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料との間の
位置合わせに利用される。
【００１８】なお、レバー部の先端部とベシクルあるい
は細胞試料との間の位置合わせは、試料台５２を水平方
向に移動するだけでなく、円筒型圧電アクチュエータ４
２を用いてもよい。このようにレバー部の先端部とベシ
クルあるいは細胞試料との間に相対的な水平方向の移動
を与える機構を総称して水平移動機構とする。
は細胞試料との間の位置合わせは、試料台５２を水平方
向に移動するだけでなく、円筒型圧電アクチュエータ４
２を用いてもよい。このようにレバー部の先端部とベシ
クルあるいは細胞試料との間に相対的な水平方向の移動
を与える機構を総称して水平移動機構とする。
【００１９】さらに、試料台５２が垂直方向に移動可能
に支持され、円筒型圧電アクチュエータ４２と共に上下
方向移動機構を構成し、シャーレとカンチレバーチップ
との間に垂直方向の相対的な移動を与えることも可能で
ある。この構成は、水平移動機構により位置合わせの終
了したレバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料と
の距離制御に利用される。
に支持され、円筒型圧電アクチュエータ４２と共に上下
方向移動機構を構成し、シャーレとカンチレバーチップ
との間に垂直方向の相対的な移動を与えることも可能で
ある。この構成は、水平移動機構により位置合わせの終
了したレバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料と
の距離制御に利用される。
【００２０】［倒立型光学顕微鏡］続いて、倒立型光学
顕微鏡を構成する要素について述べる。透過照明のため
の照明系１０は、位相差観察法による観察を可能にする
ものであり、ベース２に立てられた支柱４の上端に設け
られたアーム６に支持されている。照明系１０は、光源
１２、コレクタレンズ１４、スライダ１６、コンデンサ
レンズ１８を有している。スライダ１６は、位相差観察
用のリング開口１６ａと光を透過する透光部１６ｂを持
ち、光路を横切って移動可能であり、必要に応じてリン
グ開口１６ａを光路中に配置することができる。
顕微鏡を構成する要素について述べる。透過照明のため
の照明系１０は、位相差観察法による観察を可能にする
ものであり、ベース２に立てられた支柱４の上端に設け
られたアーム６に支持されている。照明系１０は、光源
１２、コレクタレンズ１４、スライダ１６、コンデンサ
レンズ１８を有している。スライダ１６は、位相差観察
用のリング開口１６ａと光を透過する透光部１６ｂを持
ち、光路を横切って移動可能であり、必要に応じてリン
グ開口１６ａを光路中に配置することができる。
【００２１】試料台５２の下には、複数の対物レンズが
取り付け可能で、そのうちの一つを選択的に試料の下方
に配置させるレボルバー５６が配置されている。レボル
バー５６には、位相差観察法による観察のための比較的
低倍率の対物レンズ５８と、蛍光観察のための高倍率高
ＮＡの対物レンズ６０が取り付けられている。
取り付け可能で、そのうちの一つを選択的に試料の下方
に配置させるレボルバー５６が配置されている。レボル
バー５６には、位相差観察法による観察のための比較的
低倍率の対物レンズ５８と、蛍光観察のための高倍率高
ＮＡの対物レンズ６０が取り付けられている。
【００２２】試料下に配置された対物レンズの下方に
は、ハーフミラー６２が配置されており、さらにその下
方に別のハーフミラー６４（あるいはダイクロイックミ
ラー）が配置されている。ハーフミラー６２は、蛍光用
光源７０からの光を対物レンズに向けて偏向するととも
に、対物レンズからの光を透過する。ハーフミラー６４
は、対物レンズからの光を部分的に顕微鏡像観察用のＣ
ＣＤカメラ６６へ向けて偏向するとともに、残りの光を
透過する。
は、ハーフミラー６２が配置されており、さらにその下
方に別のハーフミラー６４（あるいはダイクロイックミ
ラー）が配置されている。ハーフミラー６２は、蛍光用
光源７０からの光を対物レンズに向けて偏向するととも
に、対物レンズからの光を透過する。ハーフミラー６４
は、対物レンズからの光を部分的に顕微鏡像観察用のＣ
ＣＤカメラ６６へ向けて偏向するとともに、残りの光を
透過する。
【００２３】蛍光用励起光源７０は、光源７２、コレク
タレンズ７４、シャッター７６、コンデンサレンズ７８
を有している。ハーフミラー６４の下方には、蛍光を検
出するため、レンズ８６とフォトマルチプライヤー８８
が配置されている。蛍光観察の際には、励起光源７０と
ハーフミラー６２の間の光路上に励起光フィルター８２
が挿入されるとともに、ハーフミラー６２とハーフミラ
ー６４の間の光路上に吸収フィルター８４が挿入され
る。
タレンズ７４、シャッター７６、コンデンサレンズ７８
を有している。ハーフミラー６４の下方には、蛍光を検
出するため、レンズ８６とフォトマルチプライヤー８８
が配置されている。蛍光観察の際には、励起光源７０と
ハーフミラー６２の間の光路上に励起光フィルター８２
が挿入されるとともに、ハーフミラー６２とハーフミラ
ー６４の間の光路上に吸収フィルター８４が挿入され
る。
【００２４】［細胞試料へのベシクルに内包される特定
物質の導入］Ｚステージ２０を操作してヘッド３０を十
分に上げておき、ＤＮＡ等の特定物質を内包するベシク
ル１１２を含む溶液１１４を入れた透明な容器、例えば
シャーレ１１０を試料台５２の上に置く。Ｚステージ２
０を操作してヘッド３０を下げ、図２に示されるよう
に、カンチレバーチップ４０を溶液１１４中に沈め、レ
バー部４４の先端部が対物レンズ５８の焦点深度内に入
るまでシャーレ１１０の底に近づける。
物質の導入］Ｚステージ２０を操作してヘッド３０を十
分に上げておき、ＤＮＡ等の特定物質を内包するベシク
ル１１２を含む溶液１１４を入れた透明な容器、例えば
シャーレ１１０を試料台５２の上に置く。Ｚステージ２
０を操作してヘッド３０を下げ、図２に示されるよう
に、カンチレバーチップ４０を溶液１１４中に沈め、レ
バー部４４の先端部が対物レンズ５８の焦点深度内に入
るまでシャーレ１１０の底に近づける。
【００２５】透過位相差観察や微分干渉観察によりベシ
クル１１２を観察して、細胞試料に特定物質を導入する
のに適したベシクル１１２を選び、カンチレバーチップ
４０のレバー部４４の先端部を、選んだベシクル１１２
の上に合わせる。
クル１１２を観察して、細胞試料に特定物質を導入する
のに適したベシクル１１２を選び、カンチレバーチップ
４０のレバー部４４の先端部を、選んだベシクル１１２
の上に合わせる。
【００２６】このレバー部４４の先端部と選んだベシク
ル１１２との位置合わせは、水平方向移動機構を用いて
両者を相対的に移動して行なう。なお、この位置合わせ
は、試料台５２もしくは円筒型圧電アクチュエータ４２
の内の少なくとも一方を移動するだけでも可能である。
ル１１２との位置合わせは、水平方向移動機構を用いて
両者を相対的に移動して行なう。なお、この位置合わせ
は、試料台５２もしくは円筒型圧電アクチュエータ４２
の内の少なくとも一方を移動するだけでも可能である。
【００２７】圧電アクチュエーター２４を伸ばしてカン
チレバーチップ４０を下げ、レバー部４４の先端部分を
ベシクル１１２に押し付ける。前述したように、カンチ
レバーチップ４０のレバー部４４の先端部分はベシクル
を良好に吸着し得るように表面処理が施されているた
め、分子間力によりベシクル１１２を吸着する。吸着
後、Ｚステージ２０でヘッド３０を上昇させる。
チレバーチップ４０を下げ、レバー部４４の先端部分を
ベシクル１１２に押し付ける。前述したように、カンチ
レバーチップ４０のレバー部４４の先端部分はベシクル
を良好に吸着し得るように表面処理が施されているた
め、分子間力によりベシクル１１２を吸着する。吸着
後、Ｚステージ２０でヘッド３０を上昇させる。
【００２８】ベシクルの入ったシャーレ１１０を試料台
５２から取り除き、代わりに特定物質を導入したい細胞
試料１２２の溶液１２４の入ったシャーレ１２０を試料
台５２に置く。Ｚステージ２０を操作してヘッド３０を
下げ、図３に示されるように、カンチレバーチップ４０
を溶液１２４中に沈める。
５２から取り除き、代わりに特定物質を導入したい細胞
試料１２２の溶液１２４の入ったシャーレ１２０を試料
台５２に置く。Ｚステージ２０を操作してヘッド３０を
下げ、図３に示されるように、カンチレバーチップ４０
を溶液１２４中に沈める。
【００２９】透過位相差観察や微分干渉観察により、ベ
シクル１１２に内包された特定物質（以下、単に特定物
質と呼ぶ）を導入する細胞試料１２２を選び、カンチレ
バーチップ４０のレバー部４４の先端部分を、選んだ細
胞試料１２２の上に合わせる。
シクル１１２に内包された特定物質（以下、単に特定物
質と呼ぶ）を導入する細胞試料１２２を選び、カンチレ
バーチップ４０のレバー部４４の先端部分を、選んだ細
胞試料１２２の上に合わせる。
【００３０】このレバー部４４の先端部と選んだ細胞試
料１１２との位置合わせは、水平方向移動機構を用いて
両者を相対的に移動して行なう。なお、この位置合わせ
は、試料台５２もしくは円筒型圧電アクチュエータ４２
の内の少なくとも一方を移動するだけでも可能である。
料１１２との位置合わせは、水平方向移動機構を用いて
両者を相対的に移動して行なう。なお、この位置合わせ
は、試料台５２もしくは円筒型圧電アクチュエータ４２
の内の少なくとも一方を移動するだけでも可能である。
【００３１】圧電アクチュエーター２４を伸ばしてカン
チレバーチップ４０を下げ、レバー部４４の先端部分に
付着しているベシクル１１２を細胞試料１２２に押し付
ける。細胞試料１２２に押し付けられたベシクル１１２
は、やがて細胞試料１２２に取り込まれ、特定物質が細
胞試料１２２に導入される。
チレバーチップ４０を下げ、レバー部４４の先端部分に
付着しているベシクル１１２を細胞試料１２２に押し付
ける。細胞試料１２２に押し付けられたベシクル１１２
は、やがて細胞試料１２２に取り込まれ、特定物質が細
胞試料１２２に導入される。
【００３２】この時、対向電極等の共存により、細胞膜
内外を脱分極状態とすることができる。また、ベシクル
中の溶媒にＣａ2+を含ませるなどの操作を行なうことも
可能である。このような構成を取ることにより、擬似的
に神経細胞の情報伝達状態等を作り出せるので、細胞試
料に様々な状態を誘起させる特定物質の導入が可能とな
る。
内外を脱分極状態とすることができる。また、ベシクル
中の溶媒にＣａ2+を含ませるなどの操作を行なうことも
可能である。このような構成を取ることにより、擬似的
に神経細胞の情報伝達状態等を作り出せるので、細胞試
料に様々な状態を誘起させる特定物質の導入が可能とな
る。
【００３３】本装置では、倒立型光学顕微鏡を利用し
て、レバー部４４と細胞試料１２２の位置合わせを行な
うため、細胞試料１２２の所望の位置に高い位置精度を
もって特定物質を導入できる。
て、レバー部４４と細胞試料１２２の位置合わせを行な
うため、細胞試料１２２の所望の位置に高い位置精度を
もって特定物質を導入できる。
【００３４】ベシクル１１２を吸着する際および特定物
質を細胞試料１２２に導入する際、好ましくは、ヘッド
３０内の変位検出系はレバー部４４の先端部の変位を検
出し、検出される変位情報に基づいてレバー部４４に働
いている力を求める。これにより、ベシクル１１２を吸
着する際にレバー部４４がベシクル１１２を押す力が分
かり、また特定物質を細胞試料１２２に導入する際にベ
シクル１１２が細胞試料１２２を押す力が分かる。
質を細胞試料１２２に導入する際、好ましくは、ヘッド
３０内の変位検出系はレバー部４４の先端部の変位を検
出し、検出される変位情報に基づいてレバー部４４に働
いている力を求める。これにより、ベシクル１１２を吸
着する際にレバー部４４がベシクル１１２を押す力が分
かり、また特定物質を細胞試料１２２に導入する際にベ
シクル１１２が細胞試料１２２を押す力が分かる。
【００３５】特定物質を細胞試料１２２に導入する際の
アプローチは、好ましくは、自動近接プログラムによっ
て行なわれ、任意の力でベシクル１１２を細胞試料１２
２に押し付けることができる。例えば、ベシクル１１２
を細胞試料１２２に押し付ける力は、０．１ｎＮ程度に
設定することが可能であり、設定値に達した時点で両者
の接近は停止する。この時、レバー部４４は押し付ける
力を受けて変位した状態で停止する。そのままレバー部
４４の変位を監視し続けることによって、特定物質が細
胞試料１２２に導入されたかどうかが判定できる。
アプローチは、好ましくは、自動近接プログラムによっ
て行なわれ、任意の力でベシクル１１２を細胞試料１２
２に押し付けることができる。例えば、ベシクル１１２
を細胞試料１２２に押し付ける力は、０．１ｎＮ程度に
設定することが可能であり、設定値に達した時点で両者
の接近は停止する。この時、レバー部４４は押し付ける
力を受けて変位した状態で停止する。そのままレバー部
４４の変位を監視し続けることによって、特定物質が細
胞試料１２２に導入されたかどうかが判定できる。
【００３６】このように、本装置では、カンチレバーチ
ップ４０のレバー部４４に働く力が分かるので、過剰な
力により、ベシクル１１２や細胞試料１２２を破壊した
り傷付けたりすることを未然に防ぐことができる。
ップ４０のレバー部４４に働く力が分かるので、過剰な
力により、ベシクル１１２や細胞試料１２２を破壊した
り傷付けたりすることを未然に防ぐことができる。
【００３７】また、これまでの装置ではベシクルを細胞
試料に押し付ける力を知る術が無かったが、本装置は導
入時にベシクルが細胞試料を押す力を知ることができ、
導入時にベシクルと細胞試料に働く力の情報は、ベシク
ル１１２が細胞試料１２２に取り込まれる反応の解明に
とって大いに役立つであろう。
試料に押し付ける力を知る術が無かったが、本装置は導
入時にベシクルが細胞試料を押す力を知ることができ、
導入時にベシクルと細胞試料に働く力の情報は、ベシク
ル１１２が細胞試料１２２に取り込まれる反応の解明に
とって大いに役立つであろう。
【００３８】［浮遊する細胞試料への特定物質の導入］
上では図３に関連付けてシャーレの底に固定した細胞試
料に対する特定物質の導入について述べた。シャーレ内
の溶液中を浮遊する細胞試料に対する特定物質の導入で
は、図４に示されるように、マニピュレータに支持され
た三次元的に位置決め可能なキャピラリ１３０を用いて
細胞試料１２２を保持し、キャピラリ１３０に保持され
た細胞試料１２２に対して、カンチレバーチップ４０の
レバー部４４に吸着されたベシクル１１２を押し付け
る。この一連の動作は、細胞試料１２２の位置決めが三
次元マニピュレータによって行なわれる点の他は、全く
同様である。
上では図３に関連付けてシャーレの底に固定した細胞試
料に対する特定物質の導入について述べた。シャーレ内
の溶液中を浮遊する細胞試料に対する特定物質の導入で
は、図４に示されるように、マニピュレータに支持され
た三次元的に位置決め可能なキャピラリ１３０を用いて
細胞試料１２２を保持し、キャピラリ１３０に保持され
た細胞試料１２２に対して、カンチレバーチップ４０の
レバー部４４に吸着されたベシクル１１２を押し付け
る。この一連の動作は、細胞試料１２２の位置決めが三
次元マニピュレータによって行なわれる点の他は、全く
同様である。
【００３９】［原子間力顕微鏡への拡張］カンチレバー
チップ４０は、レバー部４４の先端に探針部４６を備え
ていてもよい。探針部４６は、平坦部４６ｂから突出し
た先鋭な突起部４６ａを有しており、平坦部４６ｂを基
準にした突起部４６ａの高さは吸着するベシクル１１２
の直径よりも小さい。
チップ４０は、レバー部４４の先端に探針部４６を備え
ていてもよい。探針部４６は、平坦部４６ｂから突出し
た先鋭な突起部４６ａを有しており、平坦部４６ｂを基
準にした突起部４６ａの高さは吸着するベシクル１１２
の直径よりも小さい。
【００４０】ベシクル１１２は、突起部４６ａと平坦部
４６ｂの境部分に吸着される。突起部４６ａの高さは、
ベシクル１１２の直径よりも小さい寸法が選ばれている
ので、ベシクル１１２を細胞試料に近づける際に、ベシ
クル１１２が細胞試料に接触する前に、先鋭な突起部４
６ａが細胞試料に触れることがない。
４６ｂの境部分に吸着される。突起部４６ａの高さは、
ベシクル１１２の直径よりも小さい寸法が選ばれている
ので、ベシクル１１２を細胞試料に近づける際に、ベシ
クル１１２が細胞試料に接触する前に、先鋭な突起部４
６ａが細胞試料に触れることがない。
【００４１】先鋭な突起部４６ａは、特定物質が細胞試
料に導入される前後の観察に利用される。本装置は、原
子間力顕微鏡の構成に必要な要素、すなわち、円筒型圧
電アクチュエーター２４とカンチレバーチップ４０とそ
のレバー部の変位を検出する変位検出系を含んでいる。
従って、図５に示される探針部４６を備えたカンチレバ
ーチップ４０を用いることにより、突起部４６ａをプロ
ーブとする原子間力顕微鏡観察が行なえ、特定物質の導
入前後の細胞試料を高分解能で観察することができる。
料に導入される前後の観察に利用される。本装置は、原
子間力顕微鏡の構成に必要な要素、すなわち、円筒型圧
電アクチュエーター２４とカンチレバーチップ４０とそ
のレバー部の変位を検出する変位検出系を含んでいる。
従って、図５に示される探針部４６を備えたカンチレバ
ーチップ４０を用いることにより、突起部４６ａをプロ
ーブとする原子間力顕微鏡観察が行なえ、特定物質の導
入前後の細胞試料を高分解能で観察することができる。
【００４２】［照明系］本装置は、透過明視野照明、透
過位相差照明、微分干渉照明、落射蛍光照明等の特殊観
察法の利用が可能である。
過位相差照明、微分干渉照明、落射蛍光照明等の特殊観
察法の利用が可能である。
【００４３】［透過明視野照明］透過明視野照明は、カ
ンチレバーの位置を明瞭に示すので、主に、カンチレバ
ー裏面に照射されるレバー部４４の変位検出用のレーザ
ー光スポットのカンチレバー上における位置調整に用い
られる。
ンチレバーの位置を明瞭に示すので、主に、カンチレバ
ー裏面に照射されるレバー部４４の変位検出用のレーザ
ー光スポットのカンチレバー上における位置調整に用い
られる。
【００４４】［透過位相差照明］透過位相差照明は、試
料の屈折率の違いを元にコントラストを付ける観察法で
有り、この照明法は数μｍ以下の厚さの光学的に透明な
試料に対して有効である。また、培養細胞の周辺部分の
境界を見つけるなどの薄い試料（細胞）の形態を低分解
能で観察する方法として有効である。
料の屈折率の違いを元にコントラストを付ける観察法で
有り、この照明法は数μｍ以下の厚さの光学的に透明な
試料に対して有効である。また、培養細胞の周辺部分の
境界を見つけるなどの薄い試料（細胞）の形態を低分解
能で観察する方法として有効である。
【００４５】なお、透過位相差照明は、リング照明を用
いているため、照明のＮＡを対物レンズのＮＡに比べて
充分利用していないめ、高解像の観察に適した観察法で
はない。
いているため、照明のＮＡを対物レンズのＮＡに比べて
充分利用していないめ、高解像の観察に適した観察法で
はない。
【００４６】また、高解像の観察を行うのであれば、透
過微分干渉照明を用いた観察が適している。この照明は
屈折率分布の位置的な変化を元に光学的に透明な試料に
コントラストを付ける観察法である。透過微分干渉照明
の一例が、特開平９−１５５０４号に記載されている。
同文献に含まれる開示内容は、ここに引用することによ
り、すべて本明細書に組み込まれるものとする。
過微分干渉照明を用いた観察が適している。この照明は
屈折率分布の位置的な変化を元に光学的に透明な試料に
コントラストを付ける観察法である。透過微分干渉照明
の一例が、特開平９−１５５０４号に記載されている。
同文献に含まれる開示内容は、ここに引用することによ
り、すべて本明細書に組み込まれるものとする。
【００４７】この照明方法は、光源からの光を偏光子
（ポラライザー）で直線偏光にして第１のノマルスキー
プリズムに入射させ、ここで常光と異常光とに分離して
コンデンサーレンズを経て、試料を透過した常光及び異
常光を対物レンズを経て第２のノマルスキープリズムで
合波し、その合波した常光及び異常光を、検光子（アナ
ライザー）を経て干渉させて結像面に微分干渉像を形成
している。
（ポラライザー）で直線偏光にして第１のノマルスキー
プリズムに入射させ、ここで常光と異常光とに分離して
コンデンサーレンズを経て、試料を透過した常光及び異
常光を対物レンズを経て第２のノマルスキープリズムで
合波し、その合波した常光及び異常光を、検光子（アナ
ライザー）を経て干渉させて結像面に微分干渉像を形成
している。
【００４８】この構成を図１の装置に追加することによ
り透過微分干渉照明を実現できる。この微分干渉照明は
位相差照明と比べて、照明のＮＡに原理的には限定が無
いため、対物レンズのＮＡすべてを利用でき、高倍率の
観察が可能である。従って、試料の細かい構造まで形態
を確認したい場合に利用できる。
り透過微分干渉照明を実現できる。この微分干渉照明は
位相差照明と比べて、照明のＮＡに原理的には限定が無
いため、対物レンズのＮＡすべてを利用でき、高倍率の
観察が可能である。従って、試料の細かい構造まで形態
を確認したい場合に利用できる。
【００４９】上述した透過位相差照明及び透過微分干渉
照明を総称して透過コントラスト照明という。 ［落射蛍光照明］落射蛍光照明は、ベシクルの中に目的
物質が十分な量入っているかを確認するために用いられ
る。また、ベシクルを試料（細胞）に接触させた後の試
料の反応・状態変化を観察するのに適している。更に、
ベシクルと接触させたい試料の特定部位を蛍光染色し、
あるいは試料（細胞）のＤＮＡに例えばＧＦＰ（Green
Flourescent Protein ）を発現させるＤＮＡを導入し、
蛍光を発している部分あるいはＧＦＰを生成し蛍光を発
している細胞を特定するために利用できる。
照明を総称して透過コントラスト照明という。 ［落射蛍光照明］落射蛍光照明は、ベシクルの中に目的
物質が十分な量入っているかを確認するために用いられ
る。また、ベシクルを試料（細胞）に接触させた後の試
料の反応・状態変化を観察するのに適している。更に、
ベシクルと接触させたい試料の特定部位を蛍光染色し、
あるいは試料（細胞）のＤＮＡに例えばＧＦＰ（Green
Flourescent Protein ）を発現させるＤＮＡを導入し、
蛍光を発している部分あるいはＧＦＰを生成し蛍光を発
している細胞を特定するために利用できる。
【００５０】なお、蛍光顕微鏡としては図１に示した構
成以外に、走査型レーザー顕微鏡を用いてベシクルの観
察を行うことも有効である。また、透過位相差照明、透
過微分干渉照明、落射蛍光照明は、試料の観察だけでは
なく、ベシクルを探針先端に取り付けるための位置調整
及び探針先端にベシクルが取り付けられた状態での探針
と試料との位置調整に用いられる。
成以外に、走査型レーザー顕微鏡を用いてベシクルの観
察を行うことも有効である。また、透過位相差照明、透
過微分干渉照明、落射蛍光照明は、試料の観察だけでは
なく、ベシクルを探針先端に取り付けるための位置調整
及び探針先端にベシクルが取り付けられた状態での探針
と試料との位置調整に用いられる。
【００５１】上述した通り、蛍光照明は試料とベシクル
との反応・状態変化を観察測定するのに適しており、透
過コントラスト照明は試料の形態・構造を観察測定する
のに適している。従って、試料の形態とベシクルによる
試料の反応等を関連づけて測定したい場合には、蛍光照
明と透過コントラスト照明とを組み合わせた照明方法が
好ましい。本発明は、上述した実施の形態に限定される
ものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれる
すべての実施を含む。
との反応・状態変化を観察測定するのに適しており、透
過コントラスト照明は試料の形態・構造を観察測定する
のに適している。従って、試料の形態とベシクルによる
試料の反応等を関連づけて測定したい場合には、蛍光照
明と透過コントラスト照明とを組み合わせた照明方法が
好ましい。本発明は、上述した実施の形態に限定される
ものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれる
すべての実施を含む。
【００５２】
【発明の効果】本発明によれば、特定物質を含むベシク
ル、特に１０μｍよりも小さいベシクルをも、細胞試料
の所望位置に押し付け導入し得る特定物質の細胞導入装
置が提供される。
ル、特に１０μｍよりも小さいベシクルをも、細胞試料
の所望位置に押し付け導入し得る特定物質の細胞導入装
置が提供される。
【図１】本発明による細胞導入装置を備えた観察装置の
全体構成を概略的に示している。
全体構成を概略的に示している。
【図２】カンチレバーチップのレバー部にベシクルを吸
着する様子を示している。
着する様子を示している。
【図３】カンチレバーチップのレバー部に吸着されたベ
シクルを細胞試料に導入する様子を示している。
シクルを細胞試料に導入する様子を示している。
【図４】浮遊する細胞試料に対するベシクルの導入の様
子を示している。
子を示している。
【図５】原子間力顕微鏡への拡張を可能にするカンチレ
バーチップのレバー部の構造を示している。
バーチップのレバー部の構造を示している。
２０ Ｚステージ ２４ 圧電アクチュエーター ３０ ヘッド ４０ カンチレバーチップ ４２ 支持部 ４４ レバー部 ５２ 試料台
フロントページの続き Ｆターム(参考） 2F069 AA02 BB40 GG07 HH04 JJ06 JJ14 2H052 AA03 AA05 AA07 AA09 AB14 AB24 AC04 AC05 AC07 AC14 AC33 AC34 AD34 AF11 AF19 4B029 AA23 AA25 AA27 BB01 BB15 BB20 CC01 CC03
Claims (3)
- 【請求項１】 ベシクルを細胞に近づけ接触させること
で特定物質を細胞内に導入するための装置であり、 先端部にベシクルを保持可能で、弾性変形し得るレバー
部を持つカンチレバーチップと、 ベシクルの入った容器を載置するステージと、 カンチレバーチップとステージの間に相対的な上下方向
の移動を与える上下移動機構と、 カンチレバーチップとステージの間に相対的な水平方向
の移動を与える水平移動機構とを有している、特定物質
の細胞導入装置。 - 【請求項２】 カンチレバーチップのレバー部の弾性変
形量を検出し、これに基づいてレバー部が受けている力
を特定する変位センサーを更に有している、請求項１に
記載の特定物質の細胞導入装置。 - 【請求項３】 特定物質の細胞への導入および導入前後
の細胞を観察するための装置であり、 請求項１に記載の特定物質の細胞導入装置と、 細胞およびベシクルを光学的に観察するための光学系と
を有している、細胞およびベシクルの観察装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24315898A JP3461448B2 (ja) | 1998-08-28 | 1998-08-28 | 特定物質の導入装置及びこれを用いた観察装置、及び、物質導入方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24315898A JP3461448B2 (ja) | 1998-08-28 | 1998-08-28 | 特定物質の導入装置及びこれを用いた観察装置、及び、物質導入方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000069953A true JP2000069953A (ja) | 2000-03-07 |
| JP3461448B2 JP3461448B2 (ja) | 2003-10-27 |
Family
ID=17099679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24315898A Expired - Fee Related JP3461448B2 (ja) | 1998-08-28 | 1998-08-28 | 特定物質の導入装置及びこれを用いた観察装置、及び、物質導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3461448B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004538443A (ja) * | 2000-08-15 | 2004-12-24 | バイオフォース ナノサイエンシズ インコーポレイテッド | ナノスケール分子配列装置 |
| JP2006349617A (ja) * | 2005-06-20 | 2006-12-28 | Sii Nanotechnology Inc | 光学顕微鏡を備えた走査型プローブ顕微鏡 |
| JP2007033117A (ja) * | 2005-07-25 | 2007-02-08 | Sii Nanotechnology Inc | 走査型プローブ顕微鏡 |
| JP2007205849A (ja) * | 2006-02-01 | 2007-08-16 | Seiko Instruments Inc | 多機能カンチレバー及び走査型プローブ顕微鏡並びに加工対象物の切削方法 |
| JP2008092824A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Seiko Instruments Inc | 細胞侵襲用プローブ及び該細胞侵襲用プローブを有する細胞侵襲装置、並びに、細部侵襲方法 |
| JP2009058231A (ja) * | 2007-08-29 | 2009-03-19 | Shimadzu Corp | 液中試料の分析方法 |
| JP2009139865A (ja) * | 2007-12-10 | 2009-06-25 | Olympus Corp | チップ駆動装置 |
-
1998
- 1998-08-28 JP JP24315898A patent/JP3461448B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004538443A (ja) * | 2000-08-15 | 2004-12-24 | バイオフォース ナノサイエンシズ インコーポレイテッド | ナノスケール分子配列装置 |
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| JP2007033117A (ja) * | 2005-07-25 | 2007-02-08 | Sii Nanotechnology Inc | 走査型プローブ顕微鏡 |
| JP4575250B2 (ja) * | 2005-07-25 | 2010-11-04 | エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社 | 走査型プローブ顕微鏡 |
| JP2007205849A (ja) * | 2006-02-01 | 2007-08-16 | Seiko Instruments Inc | 多機能カンチレバー及び走査型プローブ顕微鏡並びに加工対象物の切削方法 |
| JP4697708B2 (ja) * | 2006-02-01 | 2011-06-08 | セイコーインスツル株式会社 | 多機能カンチレバー及び走査型プローブ顕微鏡並びに加工対象物の切削方法 |
| JP2008092824A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Seiko Instruments Inc | 細胞侵襲用プローブ及び該細胞侵襲用プローブを有する細胞侵襲装置、並びに、細部侵襲方法 |
| JP2009058231A (ja) * | 2007-08-29 | 2009-03-19 | Shimadzu Corp | 液中試料の分析方法 |
| JP2009139865A (ja) * | 2007-12-10 | 2009-06-25 | Olympus Corp | チップ駆動装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3461448B2 (ja) | 2003-10-27 |
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