JP2002508516A - ミクロ構造キャリア上における細胞単体および再構成膜系のポジショニングおよび電気生理学的特性決定 - Google Patents
ミクロ構造キャリア上における細胞単体および再構成膜系のポジショニングおよび電気生理学的特性決定Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ミクロ構造キャリア上における細胞単体および再構成膜系のポジショニングおよび電気生理学的特性決定
【解決手段】 平面キャリア上での細胞および小胞ないし細胞膜の非常に容易なポジショニングを可能とする測定装置ならびにその種の膜のポジショニングと高い信号雑音比を不断に維持しつつ前記の膜の電気的特性決定とを行なうための高効率の方法が記述される。これによって、物質と脂質膜との相互作用ないし膜上または膜内に結合されている物質ないしそれらと関連した信号導入メカニズムに関する判定が可能である。
Description
【０００１】
本出願は１９９７年１２月１７日に出願されたスイス国出願第２９０３／９７
号の優先権を請求する。
号の優先権を請求する。
【０００２】
本発明は細胞および小胞ないし脂質膜に関する測定装置ならびに膜の検査を可
能とする前記対象のポジショニング法、特に、チャネル形成蛋白質と、チャネル
形成蛋白質を介しまたはチャネル形成蛋白質と結合したレセプターとをチャネル
形成蛋白質の電気的特性の測定を通じて検査するための電気生理学的方法に関す
る。本発明に基づく測定方法は、特に、古典的なパッチクランプ技法の感度と選
択性とを有すると同時にミクロ構造キャリアに生体細胞または小胞をポジショニ
ングするための同じく本発明に基づく方法によってパッチ膜のより容易な作製な
らびに高い信号雑音比を可能とする（マルチアレイ）パッチクランプ法に関する
。さらに本発明はポジショニングならびに電気生理学的測定のいずれにも適した
測定装置に関する。
能とする前記対象のポジショニング法、特に、チャネル形成蛋白質と、チャネル
形成蛋白質を介しまたはチャネル形成蛋白質と結合したレセプターとをチャネル
形成蛋白質の電気的特性の測定を通じて検査するための電気生理学的方法に関す
る。本発明に基づく測定方法は、特に、古典的なパッチクランプ技法の感度と選
択性とを有すると同時にミクロ構造キャリアに生体細胞または小胞をポジショニ
ングするための同じく本発明に基づく方法によってパッチ膜のより容易な作製な
らびに高い信号雑音比を可能とする（マルチアレイ）パッチクランプ法に関する
。さらに本発明はポジショニングならびに電気生理学的測定のいずれにも適した
測定装置に関する。
【０００３】
多くの生物学的に重要なシグナル導入プロセスたとえば神経伝達は細胞膜上ま
たは細胞膜内で生ずる。それゆえ、膜蛋白質一般および神経性レセプターの生物
学的機能が特に薬理作用を有する作用物質によって影響されるということは驚く
べきことではない（J.-P. Changeux(1993), “Chemical signalling in the bra
in”、Sci. Ａm. Nov. p.30以下; A. G. Gilman(1995), Angew. Chem. Int. Ed.
Engl., 34:1406-1428; M.Rodbell(1995), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:142
0-1428）。
たは細胞膜内で生ずる。それゆえ、膜蛋白質一般および神経性レセプターの生物
学的機能が特に薬理作用を有する作用物質によって影響されるということは驚く
べきことではない（J.-P. Changeux(1993), “Chemical signalling in the bra
in”、Sci. Ａm. Nov. p.30以下; A. G. Gilman(1995), Angew. Chem. Int. Ed.
Engl., 34:1406-1428; M.Rodbell(1995), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:142
0-1428）。
【０００４】 レセプターに関する分子レベルの相互作用に関する機能知見ならびに作用物質
スクリーニングに際するそうしたレセプターの使用は現代の医薬品開発において
中心的な役割を果たしている。作用物質に関する既知の標的レセプター（ターゲ
ットレセプターとも称される）の数の増大および組み合わせの化学からする潜在
的作用物質の数の急速な増大と共に、大量の単位時間処理量で多数の各種物質の
分析を可能とする高感度のスクリーニング法（“high through-put screening”
＝ＨＴＳ）に対する需要が増大している。
スクリーニングに際するそうしたレセプターの使用は現代の医薬品開発において
中心的な役割を果たしている。作用物質に関する既知の標的レセプター（ターゲ
ットレセプターとも称される）の数の増大および組み合わせの化学からする潜在
的作用物質の数の急速な増大と共に、大量の単位時間処理量で多数の各種物質の
分析を可能とする高感度のスクリーニング法（“high through-put screening”
＝ＨＴＳ）に対する需要が増大している。
【０００５】 現在、薬理学的作用物質スクリーニングに際してはなお相対的に伝統的な方途
が採用されており、時間のかかるリガンド結合テストとレセプター機能テストと
が別々に実施されている（J. Hodgson (1992) Bio/Technology 9:973）。他方、
膜蛋白質、たとえばＧ蛋白質と結合したレセプターおよびチャネル形成レセプタ
ーは能動作用物質にとっての最重要な標的蛋白質に数え入れられる（J. Knowles
(1997) “Medicine for the new millennium hunting down deseases” Odysse
y Vol.3(1)）。この点で、古典的なパッチクランプ法は依然として機能的なレセ
プターテスト法として使用される。この電気生理学的方法の長所は、当該チャネ
ル形成蛋白質またはチャネル形成蛋白質と結合したレセプターの機能を、該チャ
ネル形成蛋白質の電気的特性の測定を介して直接知ることができる点にある。こ
の方法は非常に特異的且つ極めて敏感であり、基本的に個々のレセプター分子の
チャネル活動度を測定することができる。この場合、典型的には１〜０，１μｍ
の開口直径を有したガラス毛細管が１個の生体細胞の表面に密着させられる。こ
の毛細管によって覆われる膜面は「パッチ」と称される。ガラス毛細管電極と細
胞膜表面との接触が電気的に十分にシールされていれば、一方はガラス毛細管内
に置かれ、他方は膜対向環境内に置かれたマイクロ電極を利用して当該膜パッチ
を通るイオン流を電気的に測定することができる（O. P. Hamill, A. Martyら(1
981)。“Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recor
ding from cells and cell-free membrane patches.” Pflugers Arch 391(2):8
5-100）。
が採用されており、時間のかかるリガンド結合テストとレセプター機能テストと
が別々に実施されている（J. Hodgson (1992) Bio/Technology 9:973）。他方、
膜蛋白質、たとえばＧ蛋白質と結合したレセプターおよびチャネル形成レセプタ
ーは能動作用物質にとっての最重要な標的蛋白質に数え入れられる（J. Knowles
(1997) “Medicine for the new millennium hunting down deseases” Odysse
y Vol.3(1)）。この点で、古典的なパッチクランプ法は依然として機能的なレセ
プターテスト法として使用される。この電気生理学的方法の長所は、当該チャネ
ル形成蛋白質またはチャネル形成蛋白質と結合したレセプターの機能を、該チャ
ネル形成蛋白質の電気的特性の測定を介して直接知ることができる点にある。こ
の方法は非常に特異的且つ極めて敏感であり、基本的に個々のレセプター分子の
チャネル活動度を測定することができる。この場合、典型的には１〜０，１μｍ
の開口直径を有したガラス毛細管が１個の生体細胞の表面に密着させられる。こ
の毛細管によって覆われる膜面は「パッチ」と称される。ガラス毛細管電極と細
胞膜表面との接触が電気的に十分にシールされていれば、一方はガラス毛細管内
に置かれ、他方は膜対向環境内に置かれたマイクロ電極を利用して当該膜パッチ
を通るイオン流を電気的に測定することができる（O. P. Hamill, A. Martyら(1
981)。“Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recor
ding from cells and cell-free membrane patches.” Pflugers Arch 391(2):8
5-100）。
【０００６】 ただし、作用物質のスクリーニングと関連して、伝統的なパッチクランプ技法
は決定的な短所も有している。パッチクランプ測定はきわめて時間がかかると共
に、この分野での長い経験を有した特別に訓練された要員を要し、しかもそれは
実際にはＨＴＳに使用することができない。
は決定的な短所も有している。パッチクランプ測定はきわめて時間がかかると共
に、この分野での長い経験を有した特別に訓練された要員を要し、しかもそれは
実際にはＨＴＳに使用することができない。
【０００７】 そこで本発明の目的は、古典的なパッチクランプ技法の感度と選択性とを備え
つつ、同時に、生体細胞または小胞ないし当該脂質膜を自動ポジショニングする
ための本発明に基づく方法と測定装置の固有な表面性状とによって古典的なパッ
チクランプ技法の短所を取除いた特に（マルチアレイ）パッチクランプ法向けの
、取扱いが容易でスピーディーな検査を可能とする測定法／ポジショニング法を
提供することであった。本発明はさらに本発明に基づく方法の実施に特に適した
フラットなポジショニング装置／測定装置に関する。
つつ、同時に、生体細胞または小胞ないし当該脂質膜を自動ポジショニングする
ための本発明に基づく方法と測定装置の固有な表面性状とによって古典的なパッ
チクランプ技法の短所を取除いた特に（マルチアレイ）パッチクランプ法向けの
、取扱いが容易でスピーディーな検査を可能とする測定法／ポジショニング法を
提供することであった。本発明はさらに本発明に基づく方法の実施に特に適した
フラットなポジショニング装置／測定装置に関する。
【０００８】 ［発明の詳細な説明］ 本発明に基づく方法は電気的にシールされたパッチ膜の作製ならびにそれに続
く測定にあたっての極度の容易性を特徴としている；この新しい技術は最新のマ
イクロテクノロジー法とのコンビネーションによって“high through-put scree
ning”（ＨＴＳ）へのあらゆる使用可能性を供する。さらに本発明に基づくポジ
ショニング・測定装置ならびに本発明に基づく方法は電気的測定と光学的測定と
のコンビネーションに適しており、該コンビネーションによって本発明に基づく
ポジショニング法で得られたフラットな膜で検査対象レセプターに関する新しい
重要な情報を得ることができる。
く測定にあたっての極度の容易性を特徴としている；この新しい技術は最新のマ
イクロテクノロジー法とのコンビネーションによって“high through-put scree
ning”（ＨＴＳ）へのあらゆる使用可能性を供する。さらに本発明に基づくポジ
ショニング・測定装置ならびに本発明に基づく方法は電気的測定と光学的測定と
のコンビネーションに適しており、該コンビネーションによって本発明に基づく
ポジショニング法で得られたフラットな膜で検査対象レセプターに関する新しい
重要な情報を得ることができる。
【０００９】 本発明に基づく、細胞および小胞ないし当該脂質膜のポジショニング法は２つ
の電極の間に電気絶縁材料製の隔壁―以下ではキャリアと称される―が配置され
ていることを特徴としている。該キャリアは開口ならびに、膜が固定される面を
有している。このキャリアは一体から成る必要はなく、たとえば、膜結合と膜ポ
ジショニングとに本来関係した材料がその上に固定されているか、または該材料
がその中に嵌め込まれているホルダから構成することが可能であり、この場合、
該材料は膜の結合ないしポジショニング用に少なくとも１個の開口を有している
。膜の固定は、たとえば負に帯電した膜表面と正に帯電したキャリア表面との間
の静電相互作用に基づかせることができる。キャリア表面がそうしたものとして
所望の電荷を有していない場合には、それを適切に修飾することが可能である。
細胞および小胞は、それらが懸濁液として一方の電極の通例直径０，２〜２ｍｍ
、好ましくは０，５〜１ｍｍの添加穴を介して、または開口近傍に設けられたチ
ューブを介して、またはピペットによって装置に与えられ、その際、それぞれキ
ャリアの上側と下側とに配置された２つの電極が電気泳動によって細胞または小
胞を開口に向かって移動させるだけの電位差を有している場合に、非常に良好に
ポジショニングされ得ることが明らかとなった。添加穴は任意の形状であってよ
いが、それは通例楕円形、特に円形であることから、開口上にたとえば同心的に
配置することができる。
の電極の間に電気絶縁材料製の隔壁―以下ではキャリアと称される―が配置され
ていることを特徴としている。該キャリアは開口ならびに、膜が固定される面を
有している。このキャリアは一体から成る必要はなく、たとえば、膜結合と膜ポ
ジショニングとに本来関係した材料がその上に固定されているか、または該材料
がその中に嵌め込まれているホルダから構成することが可能であり、この場合、
該材料は膜の結合ないしポジショニング用に少なくとも１個の開口を有している
。膜の固定は、たとえば負に帯電した膜表面と正に帯電したキャリア表面との間
の静電相互作用に基づかせることができる。キャリア表面がそうしたものとして
所望の電荷を有していない場合には、それを適切に修飾することが可能である。
細胞および小胞は、それらが懸濁液として一方の電極の通例直径０，２〜２ｍｍ
、好ましくは０，５〜１ｍｍの添加穴を介して、または開口近傍に設けられたチ
ューブを介して、またはピペットによって装置に与えられ、その際、それぞれキ
ャリアの上側と下側とに配置された２つの電極が電気泳動によって細胞または小
胞を開口に向かって移動させるだけの電位差を有している場合に、非常に良好に
ポジショニングされ得ることが明らかとなった。添加穴は任意の形状であってよ
いが、それは通例楕円形、特に円形であることから、開口上にたとえば同心的に
配置することができる。
【００１０】 電極間へのキャリアの固定は、それぞれの電極とキャリアとの間にそれぞれ１
個のスペーサを設けることによって行なうことができ、該スペーサはキャリア自
体と同様に電気絶縁材料から成ると共に、開口と電極との間に配置されてこれら
と接触している通路を有している。これらの通路は導電性液で満たされて基準チ
ャンバまたは試料チャンバとして利用することができる。この場合、基準チャン
バはその中に含まれている基準緩衝液が毛管力によってその中に固定されるよう
なわずかなサイズを有しているのが好適である旨が判明した。極端な場合には、
基準液を物理的境界なしにもっぱら毛管力のみでチップ表面と電極との間に保持
することが可能である。試料区画（試料チャンバ）はチップ表面と添加電極との
間に形成される。これは側方境界を持たず、毛管力によって保持される。ただし
、この方法を統合する意図で、試料チャンバに側方境界を設けることも可能であ
る。本発明の測定装置は物理的側方境界のない試料チャンバならびに物理的側方
境界のある試料チャンバのいずれも備えた実施形態を包括している。
個のスペーサを設けることによって行なうことができ、該スペーサはキャリア自
体と同様に電気絶縁材料から成ると共に、開口と電極との間に配置されてこれら
と接触している通路を有している。これらの通路は導電性液で満たされて基準チ
ャンバまたは試料チャンバとして利用することができる。この場合、基準チャン
バはその中に含まれている基準緩衝液が毛管力によってその中に固定されるよう
なわずかなサイズを有しているのが好適である旨が判明した。極端な場合には、
基準液を物理的境界なしにもっぱら毛管力のみでチップ表面と電極との間に保持
することが可能である。試料区画（試料チャンバ）はチップ表面と添加電極との
間に形成される。これは側方境界を持たず、毛管力によって保持される。ただし
、この方法を統合する意図で、試料チャンバに側方境界を設けることも可能であ
る。本発明の測定装置は物理的側方境界のない試料チャンバならびに物理的側方
境界のある試料チャンバのいずれも備えた実施形態を包括している。
【００１１】 分析目的に応じ膜の両側を測定液と接触させることが有意的であることから、
検査される物質の添加は通例基準側として利用される側から行なうことができる
ことは言うまでもない。また、たとえば基準緩衝剤を泥膏様のゲルと成し、ゲル
内に貯蔵されている基準緩衝剤の組成を変化させることなくゲルの外部にある液
体を交換することも可能である。こうしたゲルとして適しているのはたとえばア
ガロースおよびポリアクリルアミドである。
検査される物質の添加は通例基準側として利用される側から行なうことができる
ことは言うまでもない。また、たとえば基準緩衝剤を泥膏様のゲルと成し、ゲル
内に貯蔵されている基準緩衝剤の組成を変化させることなくゲルの外部にある液
体を交換することも可能である。こうしたゲルとして適しているのはたとえばア
ガロースおよびポリアクリルアミドである。
【００１２】 本発明に基づく測定方法は特にイオンチャネル電流の測定を信頼度の高い、再
現性ある方法で且つ高い信号雑音比を以って可能とする。これを実現するための
基礎は、正確なポジショニングとそれに続く、直径ｄＭ＜１５μｍ、好ましくは
＜１０μｍ、特に０，３〜７μｍ、特に好ましくは０，３〜５μｍ、特に極めて
好ましくは１〜５μｍのミクロ構造穴（以下では開口とも称する）への小胞、細
胞またはその他の生体オルガネラないし同様な起源の膜の電気的に密な結合であ
る。小胞または細胞ないしそれらの膜の電気的に密な結合はキャリア表面と膜表
面との間の強い静電引力によって実現される。
現性ある方法で且つ高い信号雑音比を以って可能とする。これを実現するための
基礎は、正確なポジショニングとそれに続く、直径ｄＭ＜１５μｍ、好ましくは
＜１０μｍ、特に０，３〜７μｍ、特に好ましくは０，３〜５μｍ、特に極めて
好ましくは１〜５μｍのミクロ構造穴（以下では開口とも称する）への小胞、細
胞またはその他の生体オルガネラないし同様な起源の膜の電気的に密な結合であ
る。小胞または細胞ないしそれらの膜の電気的に密な結合はキャリア表面と膜表
面との間の強い静電引力によって実現される。
【００１３】 本発明に基づく方法にとって、膜をできるかぎりフラットなキャリアに載置す
るのが好適である旨判明した。当該キャリアは多様な材料から構成することが可
能である；ただし適切な材料として好ましいのは、それが微視的にフラットであ
るのみならず、分子レベルでも相対的に平らであることである。適切な材料は、
さらに、システム中で不活性で導電性を持たず且つ好ましくは化学的に修飾可能
でなければならない。
るのが好適である旨判明した。当該キャリアは多様な材料から構成することが可
能である；ただし適切な材料として好ましいのは、それが微視的にフラットであ
るのみならず、分子レベルでも相対的に平らであることである。適切な材料は、
さらに、システム中で不活性で導電性を持たず且つ好ましくは化学的に修飾可能
でなければならない。
【００１４】 特に好適であると判明したのは、ミクロ構造化されたケイ素／酸化ケイ素・キ
ャリアまたはケイ素／オキシ窒化ケイ素・キャリアであって、すぐれた静電引力
を供するために所望の表面電荷を付与する物質でコーティングされたキャリアで
あった。これに適しているのは、たとえば、Mazia,Schattenらが記述しているよ
うなポリカチオンである（以下参照：D. Mazia, G. Schatten et al., (1975),
“Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine”, J. Cell. biol.
66:198-200）。こうしたポリカチオンとは、たとえばポリ−Ｌ−リシンおよび ポリエチレンイミンである。
ャリアまたはケイ素／オキシ窒化ケイ素・キャリアであって、すぐれた静電引力
を供するために所望の表面電荷を付与する物質でコーティングされたキャリアで
あった。これに適しているのは、たとえば、Mazia,Schattenらが記述しているよ
うなポリカチオンである（以下参照：D. Mazia, G. Schatten et al., (1975),
“Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine”, J. Cell. biol.
66:198-200）。こうしたポリカチオンとは、たとえばポリ−Ｌ−リシンおよび ポリエチレンイミンである。
【００１５】 既述したように、適切なキャリアチップ材料自体の選択に際しては、小胞もし
くは生体細胞ないし当該膜または膜片と表面との静電結合、または場合によりフ
ァンデルワールス力結合または共有結合が可能となるように、表面の十分な修飾
可能性が顧慮されなければならない。また前記以外に一定の状況下では、疎水−
親水相互作用に基づく結合も可能である（Radler, J., H.Strey et al., (1995)
, “Phenomenology and Kinetics Of Lipid Bilayer Spreading On Hydrophilic
Surfaces”, Langmuir 11(11):4539-4548）。さらにキャリアチップ材料は加工
性を有し、すなわち所望のサイズの開口ないし窓を設けることが可能でなければ
ならず、また開口上への電界の集束を可能としなければならない。
くは生体細胞ないし当該膜または膜片と表面との静電結合、または場合によりフ
ァンデルワールス力結合または共有結合が可能となるように、表面の十分な修飾
可能性が顧慮されなければならない。また前記以外に一定の状況下では、疎水−
親水相互作用に基づく結合も可能である（Radler, J., H.Strey et al., (1995)
, “Phenomenology and Kinetics Of Lipid Bilayer Spreading On Hydrophilic
Surfaces”, Langmuir 11(11):4539-4548）。さらにキャリアチップ材料は加工
性を有し、すなわち所望のサイズの開口ないし窓を設けることが可能でなければ
ならず、また開口上への電界の集束を可能としなければならない。
【００１６】 特に好適なキャリアは、Ｓｉ／ＳｉＯ２・チップまたはケイ素／オキシ窒化ケ
イ素・チップであり、これは通例Ｄ＞２００ ｎｍの厚さの酸化物層を備えた取
引通例のＳｉウェーハから作製することができる。こうしたキャリアは容易にミ
クロ構造化することが可能であり、そうした構造はたとえばホトリソグラフィー
ないし、ｄ＜１，５μｍの開口の場合には、電子線照射リソグラフィーを行なっ
た後、ＫＯＨ含有溶媒中でのケイ素の異方性エッチングならびに石英層の反応性
イオンエッチングによって得ることができる。石英以外にガラス層、固体ポリマ
ーないしゲル状ポリマーなども適切な修飾可能表面を形成する。さらに、プラス
トマーおよびエラストマー（たとえばポリイミド、ポリメタクリル酸メチル、ポ
リカーボネート）、シリカゲル（たとえばシルガード）なども適当である。
イ素・チップであり、これは通例Ｄ＞２００ ｎｍの厚さの酸化物層を備えた取
引通例のＳｉウェーハから作製することができる。こうしたキャリアは容易にミ
クロ構造化することが可能であり、そうした構造はたとえばホトリソグラフィー
ないし、ｄ＜１，５μｍの開口の場合には、電子線照射リソグラフィーを行なっ
た後、ＫＯＨ含有溶媒中でのケイ素の異方性エッチングならびに石英層の反応性
イオンエッチングによって得ることができる。石英以外にガラス層、固体ポリマ
ーないしゲル状ポリマーなども適切な修飾可能表面を形成する。さらに、プラス
トマーおよびエラストマー（たとえばポリイミド、ポリメタクリル酸メチル、ポ
リカーボネート）、シリカゲル（たとえばシルガード）なども適当である。
【００１７】 こうした構造において重要なのは開口のサイズであり、これは＜１５μｍ、多
くの場合に＜１０μｍ、特に＜７μｍ、好ましくは＜５μｍであることが必要で
あり、また同じく重要なのは表面層たとえば石英層の窓のサイズであり、これは
好ましくは＜５０μｍである。ただし、理想的には、一定の状況下（緩衝剤導電
率が低い場合）において開口上への電界の高度な集束を補強すると共に、特に機
械的応力（破壊の危険）を低下させる開口サイズに減少されていることが必要で
あろう。Ｅ界の強度な不均質性（Ｅは開口への接近と共に増大する）に応じた強
度な電界集束はＦeletrisch〜Ｅ（Ｆ＝力のベクトル、Ｅ＝電界）によって開口 上への小胞の相応した正確な移動を可能にする。１つのキャリアが逐次または平
行して測定に利用される多数の開口を有することができるのは言うまでもない。
くの場合に＜１０μｍ、特に＜７μｍ、好ましくは＜５μｍであることが必要で
あり、また同じく重要なのは表面層たとえば石英層の窓のサイズであり、これは
好ましくは＜５０μｍである。ただし、理想的には、一定の状況下（緩衝剤導電
率が低い場合）において開口上への電界の高度な集束を補強すると共に、特に機
械的応力（破壊の危険）を低下させる開口サイズに減少されていることが必要で
あろう。Ｅ界の強度な不均質性（Ｅは開口への接近と共に増大する）に応じた強
度な電界集束はＦeletrisch〜Ｅ（Ｆ＝力のベクトル、Ｅ＝電界）によって開口 上への小胞の相応した正確な移動を可能にする。１つのキャリアが逐次または平
行して測定に利用される多数の開口を有することができるのは言うまでもない。
【００１８】 フラットな、少なくとも１個の開口を備えたキャリアチップは２つの電極の間
に配置される。適切な電極はたとえばＡｇ／ＡｇＣｌ、Ｐｔである；ただし製作
が容易であることからＡｇ／ＡｇＣｌ電極が好ましい。電極は電位固定（voltag
e clamp）の他に、特に小胞および細胞ないし当該膜のポジショニングにも利用 される。電極はキャリアから通例０，５〜３ｍｍ、多くの場合０，５〜１ｍｍの
間隔を置いて配置されるが、もっと引き離すことも可能である。シンメトリック
な配置を必要としないのが好ましい。
に配置される。適切な電極はたとえばＡｇ／ＡｇＣｌ、Ｐｔである；ただし製作
が容易であることからＡｇ／ＡｇＣｌ電極が好ましい。電極は電位固定（voltag
e clamp）の他に、特に小胞および細胞ないし当該膜のポジショニングにも利用 される。電極はキャリアから通例０，５〜３ｍｍ、多くの場合０，５〜１ｍｍの
間隔を置いて配置されるが、もっと引き離すことも可能である。シンメトリック
な配置を必要としないのが好ましい。
【００１９】 たとえばフラットな点化された電極、ないし開口を通る垂線の外側に配置され
た点電極を使用する際の、フラットな構成および垂線方向において容易に実現さ
れる光学的に明晰な構成により、前記システムは同時的な電気的・光学的（蛍光
）測定に適している。新しい蛍光技法たとえば蛍光相関分光法ならびに共焦点Ｃ
ＣＤ観察により個々のレセプターへのリガンド結合を光学的に検知することが可
能になった。こうした光学的技法と此処に紹介した方法とのコンビネーションに
よって初めてリガンド結合事象とチャネル活動度との区別ないし分解が可能であ
る。これによりたとえばリガンド結合によるレセプターのコンフォメーション変
化の安定化に関する重要な情報ならびにレセプターのリガンド結合部位の機能的
相違に関する重要な情報を得ることができる。（J. Edelstein, O. Schaad, J.-
P. Changeux(1997), “Single Binding versus Single Channel Recordings:A n
ew Approach to Study Ionotropic Receptors”, Biochemistry 36:13755-13760
）。これらの結果はアゴニストおよびアンタゴニストの作用態様の理解と共に新
薬の開発にとっても重要である。
た点電極を使用する際の、フラットな構成および垂線方向において容易に実現さ
れる光学的に明晰な構成により、前記システムは同時的な電気的・光学的（蛍光
）測定に適している。新しい蛍光技法たとえば蛍光相関分光法ならびに共焦点Ｃ
ＣＤ観察により個々のレセプターへのリガンド結合を光学的に検知することが可
能になった。こうした光学的技法と此処に紹介した方法とのコンビネーションに
よって初めてリガンド結合事象とチャネル活動度との区別ないし分解が可能であ
る。これによりたとえばリガンド結合によるレセプターのコンフォメーション変
化の安定化に関する重要な情報ならびにレセプターのリガンド結合部位の機能的
相違に関する重要な情報を得ることができる。（J. Edelstein, O. Schaad, J.-
P. Changeux(1997), “Single Binding versus Single Channel Recordings:A n
ew Approach to Study Ionotropic Receptors”, Biochemistry 36:13755-13760
）。これらの結果はアゴニストおよびアンタゴニストの作用態様の理解と共に新
薬の開発にとっても重要である。
【００２０】 本発明に基づく測定装置の多様な適用可能性はマルチアレイ設計によってさら
に向上させることができる。ミクロ構造化によってきわめて小さなスペースに、
同一の電極に連結されているかまたは、たとえばＡｇ／ＡｇＣｌ電極も同じく容
易にミクロ構造化し得ることから、別個の測定区画を表わすかする多様な開口を
設けることが可能である。
に向上させることができる。ミクロ構造化によってきわめて小さなスペースに、
同一の電極に連結されているかまたは、たとえばＡｇ／ＡｇＣｌ電極も同じく容
易にミクロ構造化し得ることから、別個の測定区画を表わすかする多様な開口を
設けることが可能である。
【００２１】 さらに、区画をチューブを介してポンプシステムと結び付けるかあるいは静水
圧差またはピエゾドロップ方式ないしインクジェット方式またはコンタクトトラ
ンスファー方式または電気浸透方式または温度制御方式または毛管電気泳動（Ｃ
Ｅ）またはＨＰＬＣ（High Pressure Liquid Chromatography）によって作動す る装置と結びつけることにより、本発明に基づく測定装置を試料添加・交換装置
、試料分離装置および測定調整装置と連結することができる。
圧差またはピエゾドロップ方式ないしインクジェット方式またはコンタクトトラ
ンスファー方式または電気浸透方式または温度制御方式または毛管電気泳動（Ｃ
Ｅ）またはＨＰＬＣ（High Pressure Liquid Chromatography）によって作動す る装置と結びつけることにより、本発明に基づく測定装置を試料添加・交換装置
、試料分離装置および測定調整装置と連結することができる。
【００２２】 膜活性物質の添加たとえば孔形成剤、プロテオリポソームおよび膜蛋白質の添
加によって測定に影響をおよぼすことができる。
加によって測定に影響をおよぼすことができる。
【００２３】 以下図面に基づいて本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明の方法ないし装置（測定装置）は従来のパッチクランプ技法に代わるも
のとして作用物質スクリーニングに際する使用に特に適しており且つたとえば環
境分析用のポータブル・バイオセンサとして特に好適である。以下に測定装置の
例ならびに該装置の適用領域を若干詳しく説明する。
のとして作用物質スクリーニングに際する使用に特に適しており且つたとえば環
境分析用のポータブル・バイオセンサとして特に好適である。以下に測定装置の
例ならびに該装置の適用領域を若干詳しく説明する。
【００２５】 本発明に基づく測定装置は少なくとも２つの電極６、９と、液体の収容に適し
た分離した区画とを有し、それぞれ少なくとも１つの区画内に達するかまたは１
つの区画に接するかする任意の形状の対向した２つのレドックス電極６、９の間
に１つのキャリア１が存在し、該キャリアは少なくとも１個の開口３を有し且つ
それぞれ少なくとも２つの区画を互いに切離していることを特徴としている。
た分離した区画とを有し、それぞれ少なくとも１つの区画内に達するかまたは１
つの区画に接するかする任意の形状の対向した２つのレドックス電極６、９の間
に１つのキャリア１が存在し、該キャリアは少なくとも１個の開口３を有し且つ
それぞれ少なくとも２つの区画を互いに切離していることを特徴としている。
【００２６】 前記装置はキャリア１の片側または両側に、液体添加、液体貯蔵および場合に
より液体交換を可能にすると共にキャリアと電極との間に細胞、小胞、その他の
生体オルガネラまたはそれらの一部を添加することを可能とする手段を有してい
るのが好ましい。開口３はチップ上に電位差が存在する場合に電極６、９を介し
、開口に接近するにしたがって徐々に強くなり、開口近傍において小胞、細胞、
細胞片または生体オルガネラを電気泳動によって開口に向かって移動させること
のできる不均質な電界が開口の周囲に形成されるような直径を有しているのが好
ましい。さらにその他に、キャリア１は生体膜を引き付ける帯電した表面５を有
するかまたは表面と細胞、小胞、膜片または生体オルガネラとの分子固有の結合
もしくは多価イオンを介した結合を可能にする表面５を有しているのが好ましい
。こうしたキャリアはたとえば酸化層またはオキシ窒化層でコーティングされた
シリコンキャリアチップである。帯電した表面５は修飾、特にポリカチオンおよ
び／またはシランたとえばアミノシランによる修飾によってもつくりだすことが
可能であり、あるいはキャリアを帯電した表面５でコーティング２することも可
能である。キャリア１はさらにその表面の修飾前にまたはその直接の利用前に酸
素プラズマ中で浄化され、部分的または全面的に親水化することができる。
より液体交換を可能にすると共にキャリアと電極との間に細胞、小胞、その他の
生体オルガネラまたはそれらの一部を添加することを可能とする手段を有してい
るのが好ましい。開口３はチップ上に電位差が存在する場合に電極６、９を介し
、開口に接近するにしたがって徐々に強くなり、開口近傍において小胞、細胞、
細胞片または生体オルガネラを電気泳動によって開口に向かって移動させること
のできる不均質な電界が開口の周囲に形成されるような直径を有しているのが好
ましい。さらにその他に、キャリア１は生体膜を引き付ける帯電した表面５を有
するかまたは表面と細胞、小胞、膜片または生体オルガネラとの分子固有の結合
もしくは多価イオンを介した結合を可能にする表面５を有しているのが好ましい
。こうしたキャリアはたとえば酸化層またはオキシ窒化層でコーティングされた
シリコンキャリアチップである。帯電した表面５は修飾、特にポリカチオンおよ
び／またはシランたとえばアミノシランによる修飾によってもつくりだすことが
可能であり、あるいはキャリアを帯電した表面５でコーティング２することも可
能である。キャリア１はさらにその表面の修飾前にまたはその直接の利用前に酸
素プラズマ中で浄化され、部分的または全面的に親水化することができる。
【００２７】 特別な配置に基づき本発明に基づく測定装置は物理的境界を備えた区画を有す
る必要がない。
る必要がない。
【００２８】 好ましい実施形態の測定装置においてそれぞれ１つの電極とキャリア１の少な
くとも１個の開口３とはスペーサ７，１０に設けられた通路またはチャンバ８を
経て、開いたもしくは閉じた区画を形成しつつ互いに連結されている。
くとも１個の開口３とはスペーサ７，１０に設けられた通路またはチャンバ８を
経て、開いたもしくは閉じた区画を形成しつつ互いに連結されている。
【００２９】 また３つ以上の電極６、９と２個以上の開口３とを設け、少なくとも１つの電
極たとえば１つの基準電極が２個以上の開口３を介した測定に利用されるかまた
は測定装置が２個以上の開口３と開口３の倍の数の電極６、９とを有し、それぞ
れ２つの電極６、９の間に１個の開口３が配置されるようにすることもできる。
極たとえば１つの基準電極が２個以上の開口３を介した測定に利用されるかまた
は測定装置が２個以上の開口３と開口３の倍の数の電極６、９とを有し、それぞ
れ２つの電極６、９の間に１個の開口３が配置されるようにすることもできる。
【００３０】 さらに区画をチューブを経てポンプシステムまたは、静水圧ベースまたはピエ
ゾドロップ方式ないしインキジェット方式またはコンタクトトランスファー方式
または電気浸透方式または温度制御方式で作動する器具と連結し、液体ないし試
料を任意の区画に添加しもしくは交換し得るようにすることができる。
ゾドロップ方式ないしインキジェット方式またはコンタクトトランスファー方式
または電気浸透方式または温度制御方式で作動する器具と連結し、液体ないし試
料を任意の区画に添加しもしくは交換し得るようにすることができる。
【００３１】 また本発明に基づく測定装置を試料の分離、特に毛管電気泳動（ＣＥ）および
ＨＰＬＣを行なう装置と連結して、分離された物質の分析に利用し、または該測
定装置に区画内液位を連続的もしくは定期的にチェックするための手段ならびに
前以って適宜調整された注入パラメータを再調整するための手段を装備すること
も可能である。
ＨＰＬＣを行なう装置と連結して、分離された物質の分析に利用し、または該測
定装置に区画内液位を連続的もしくは定期的にチェックするための手段ならびに
前以って適宜調整された注入パラメータを再調整するための手段を装備すること
も可能である。
【００３２】 さらに別途の実施形態においてキャリア１の表面５を親水性領域と疎水性領域
とが生ずるように構造化し且つ親水性領域が好ましくは開口周囲に位置するよう
にすることが可能である。
とが生ずるように構造化し且つ親水性領域が好ましくは開口周囲に位置するよう
にすることが可能である。
【００３３】 前記測定装置はたとえば以下に詳細に述べる測定に使用することができる： 作用物質スクリーニング： 本発明は組合わせの化学によってそれぞれ少量で作製可能な多数の潜在的リガ
ンドのプロービングに特に適している。他方、多くのレセプター蛋白質、特にリ
ガンド制御レセプターおよびＧ蛋白質結合レセプターも非常に限定された量であ
れ入手可能である。本発明に基づく方法ないし本発明に基づく測定レイアウト／
測定装置によって、直接にかまたは小胞ないし脂質膜のレセプター蛋白質を前以
って単離／再構成した後に非常にわずかな細胞で作業を行なうことが可能である
。アレイ中のセンサエレメントの配列が複雑でないことから種々の物質またはレ
セプターを時間的に同時にセレクトすることが可能である。またその他に、脂質
小胞のレセプター純化および再構成を本発明に基づく装置にオプショナルに組入
れることのできるオンチップ・コンテナ中でマイクロクロマトグラフィーによっ
て行なうことが可能である。
ンドのプロービングに特に適している。他方、多くのレセプター蛋白質、特にリ
ガンド制御レセプターおよびＧ蛋白質結合レセプターも非常に限定された量であ
れ入手可能である。本発明に基づく方法ないし本発明に基づく測定レイアウト／
測定装置によって、直接にかまたは小胞ないし脂質膜のレセプター蛋白質を前以
って単離／再構成した後に非常にわずかな細胞で作業を行なうことが可能である
。アレイ中のセンサエレメントの配列が複雑でないことから種々の物質またはレ
セプターを時間的に同時にセレクトすることが可能である。またその他に、脂質
小胞のレセプター純化および再構成を本発明に基づく装置にオプショナルに組入
れることのできるオンチップ・コンテナ中でマイクロクロマトグラフィーによっ
て行なうことが可能である。
【００３４】 ＜従来のパッチクランプ技法の代替：＞ すでに冒頭で言及したように従来のパッチクランプ技法は膜レセプターの機能
性検査ならびに細胞内の信号プロセス／代謝プロセスに対する応答としての膜特
性変化の検査の基礎を形成している。たとえば形質転換細胞の場合がしばしばそ
うであるように、均質な細胞集団の単離された細胞が検査対象として利用される
場合には、本発明に基づく方法をパッククランプ技法と少なくとも同等な代替法
として使用することができる。この方法の検査対象として適しているのはたとえ
ば解離されたニューロン、培養された哺乳動物細胞系ならびに植物プロトプラス
トである。
性検査ならびに細胞内の信号プロセス／代謝プロセスに対する応答としての膜特
性変化の検査の基礎を形成している。たとえば形質転換細胞の場合がしばしばそ
うであるように、均質な細胞集団の単離された細胞が検査対象として利用される
場合には、本発明に基づく方法をパッククランプ技法と少なくとも同等な代替法
として使用することができる。この方法の検査対象として適しているのはたとえ
ば解離されたニューロン、培養された哺乳動物細胞系ならびに植物プロトプラス
トである。
【００３５】 ＜ポータブルバイオセンサ／環境分析：＞ 本発明に基づく測定システムの卓越した機構的安定性ないし実際に自動的な膜
構成によりバイオセンサでの該システムの使用が可能である。適切な形質転換細
胞または小胞中で再構成されたレセプターまたはチャネル形成蛋白質の使用によ
って、非常にさまざまな物質ないし代謝産物に対して敏感なセンサを構成するこ
とができる。この場合、本発明に基づく装置によって達成されるように、膜シー
ル（seal formation）が非常に良好であれば、感度は基本的にレセプターの結合
定数のみに依存し、たとえばＧ蛋白質結合レセプターの場合には１ナノモル以下
、イオノトロープレセプター（たとえば、５ ＨＴ３、ｎＡＣｈＲ、ＧＡＢＡＡ Ｒ、グリシンＲ、ＧｌｕＲ）の場合にはナノモル範囲内にあり得る（North, R.
A. (1994), Ligand-and voltage-gated ion channels, CRC Press; Peroutka, S
. J. (1991), Serotonin receptor subtypes―Basic and clinical aspects, Ne
w York, John Willey & Sons; Peroutka, S. J. (1994), G Protein coupled re
ceptors、CRC Press; Conley,E.C.(1996), The ion channel facts book, Academ
ic Press）。
構成によりバイオセンサでの該システムの使用が可能である。適切な形質転換細
胞または小胞中で再構成されたレセプターまたはチャネル形成蛋白質の使用によ
って、非常にさまざまな物質ないし代謝産物に対して敏感なセンサを構成するこ
とができる。この場合、本発明に基づく装置によって達成されるように、膜シー
ル（seal formation）が非常に良好であれば、感度は基本的にレセプターの結合
定数のみに依存し、たとえばＧ蛋白質結合レセプターの場合には１ナノモル以下
、イオノトロープレセプター（たとえば、５ ＨＴ３、ｎＡＣｈＲ、ＧＡＢＡＡ Ｒ、グリシンＲ、ＧｌｕＲ）の場合にはナノモル範囲内にあり得る（North, R.
A. (1994), Ligand-and voltage-gated ion channels, CRC Press; Peroutka, S
. J. (1991), Serotonin receptor subtypes―Basic and clinical aspects, Ne
w York, John Willey & Sons; Peroutka, S. J. (1994), G Protein coupled re
ceptors、CRC Press; Conley,E.C.(1996), The ion channel facts book, Academ
ic Press）。
【００３６】 本発明に基づく測定方法は以下の周知の測定原理を基礎としている： 膜透過イオンチャネルまたはイオノトロープレセプターの電気的特性は一般に
いわゆる電位固定技法（たとえば、古典的な電位固定、パッチクランプおよび卵
母細胞電位固定）で特徴づけられる（以下参照、Hamill, Marty et al., 1981 a
.a.o; J. G. Nicholls, A. R. Martin et al. (1992), From neuron to brain:a
cellular and molecular approach to the function of the nervous system、S
underland, Ma., Sinauer Associates, Inc.）。このため当該イオンチャネルを
含む膜に電位差が印加され、同時に、この電位差を保持するために必要な電流が
分析される。この分析は、Ｖ＝Ｉ×ＲないしＩ＝Ｖ／Ｒで表わされるオームの法
則にしたがい、導電率に関するデータおよび、それと―ただし一義的ではないが
―結びついて、チャネル形成蛋白質のコンフォメーション状態に関するデータを
もたらす。これからリガンド結合結果、電圧依存性などを求めることができる。
いわゆる電位固定技法（たとえば、古典的な電位固定、パッチクランプおよび卵
母細胞電位固定）で特徴づけられる（以下参照、Hamill, Marty et al., 1981 a
.a.o; J. G. Nicholls, A. R. Martin et al. (1992), From neuron to brain:a
cellular and molecular approach to the function of the nervous system、S
underland, Ma., Sinauer Associates, Inc.）。このため当該イオンチャネルを
含む膜に電位差が印加され、同時に、この電位差を保持するために必要な電流が
分析される。この分析は、Ｖ＝Ｉ×ＲないしＩ＝Ｖ／Ｒで表わされるオームの法
則にしたがい、導電率に関するデータおよび、それと―ただし一義的ではないが
―結びついて、チャネル形成蛋白質のコンフォメーション状態に関するデータを
もたらす。これからリガンド結合結果、電圧依存性などを求めることができる。
【００３７】 イオノトロープ膜蛋白質を通過するイオン流は膜電圧ＶＭ＝−６０ｍＶにて０
．１〜５０ｐＡと一般に非常にわずかであることから、信号雑音比が許容可能で
あるためには発生する漏れ電流の分散は測定される信号を５〜１０倍下回ってい
なければならない。この漏れ電流は基本的に膜とその固定物との間に発生し、あ
らゆる電位固定技法における根本的な重要問題を表わしている。
．１〜５０ｐＡと一般に非常にわずかであることから、信号雑音比が許容可能で
あるためには発生する漏れ電流の分散は測定される信号を５〜１０倍下回ってい
なければならない。この漏れ電流は基本的に膜とその固定物との間に発生し、あ
らゆる電位固定技法における根本的な重要問題を表わしている。
【００３８】 この問題はさまざまな方法で解決することが可能であり、たとえば測定される
膜領域の拡大およびそれと共に合算によるイオン電流の増加によって解決するこ
とが可能である。但しその際には、まさに生体システムにおいて、特異性が失わ
れることとなる。したがって一般に、たとえばリガンド添加に際し、一義的な判
定データまたはまったく人為の加わらない判定データを得ることはもはや不可能
であろう。
膜領域の拡大およびそれと共に合算によるイオン電流の増加によって解決するこ
とが可能である。但しその際には、まさに生体システムにおいて、特異性が失わ
れることとなる。したがって一般に、たとえばリガンド添加に際し、一義的な判
定データまたはまったく人為の加わらない判定データを得ることはもはや不可能
であろう。
【００３９】 だが十分な信号雑音差の問題は膜と電極との間に非常に高いシール抵抗（ｓｅ
ａｌ）が形成されることによっても解決することが可能である。この方式は本発
明に採用されている。このため細胞と小胞に対して非常に付着力のある表面を有
したフラットなキャリアチップが使用される。このチップは測定に際して異なっ
た電位に固定される２つの区画を分離しており、その中央には（半）マイクロメ
ーター大の穴が配置されている。この穴もしくは孔（開口）は基準緩衝液で満た
されており、測定のあいだ表面への細胞ないし小胞の強固な結合によって電気的
に密にシールされる。この非常に密な結合によって非常にわずかな（０．１ｐＡ
）イオン電流の測定も可能となる。
ａｌ）が形成されることによっても解決することが可能である。この方式は本発
明に採用されている。このため細胞と小胞に対して非常に付着力のある表面を有
したフラットなキャリアチップが使用される。このチップは測定に際して異なっ
た電位に固定される２つの区画を分離しており、その中央には（半）マイクロメ
ーター大の穴が配置されている。この穴もしくは孔（開口）は基準緩衝液で満た
されており、測定のあいだ表面への細胞ないし小胞の強固な結合によって電気的
に密にシールされる。この非常に密な結合によって非常にわずかな（０．１ｐＡ
）イオン電流の測定も可能となる。
【００４０】 脂質膜を用いた類似の手法―ただしこれは本発明に基づく表面要件ないし本発
明に基づく表面修飾を備えたキャリアなしで行われた―は膜のシール抵抗が小さ
すぎて高感度測定に使用することはできなかった。ＬＢトランスファーもこれに
属している（R. Coronado and R. Latorre (1983), "Phospholipid bilayers ma
de from monolayers on patch-clamp pipettes", Biophy. J. 43(2):231-6; D.
P. Nikolelis and C. G. Siontorou(1995), "Bilayer lipid membranes for flo
w injection monitoring of acetylcholine, urea, and penicillin "Anal. Che
m. 67(5):936-44; T. D. Osborn and P. Yager(1995), "Formation of planar s
olvent-free phospholipid bilayers by lnagmuir-blodgett transfer of monol
ayers to micromachined apertures in silicon", Langmuir 11(1):8-12; T. D.
Osborn and P. Yager (1995), "Modeling success and failure of Langmuir-B
lodgett transfer of phospholipid bilayers to silicon dioxide”, Biophys.
J. 68(4):1364-73および小胞展開(P. Nollert, H. Kiefer et al., (1995), “
Lipid vesicle adsorption versus formation of planar bilayers on solid su
rfaces”, Biophys. J. 69(4):1447-55; J. Radler, H. Strey et al., (1995), “Phenomenology and Kinetics Of Lipid Bilayers Spreading On Hydrophilic
Surfaces”, Langmuir 11(11):4539-4548)。ミニチュア化された黒膜（ＢＬＭ ）構成はEray, Dogan et al., 1995によって報告されている（以下参照、M. Era
y, N. S. Dogan et al., (1995), “A highly stable and selective biosensor
using modified nicotinic acetylcholine receptor(nAChR)”、Biosystems 35(
2-3):183-8）。
明に基づく表面修飾を備えたキャリアなしで行われた―は膜のシール抵抗が小さ
すぎて高感度測定に使用することはできなかった。ＬＢトランスファーもこれに
属している（R. Coronado and R. Latorre (1983), "Phospholipid bilayers ma
de from monolayers on patch-clamp pipettes", Biophy. J. 43(2):231-6; D.
P. Nikolelis and C. G. Siontorou(1995), "Bilayer lipid membranes for flo
w injection monitoring of acetylcholine, urea, and penicillin "Anal. Che
m. 67(5):936-44; T. D. Osborn and P. Yager(1995), "Formation of planar s
olvent-free phospholipid bilayers by lnagmuir-blodgett transfer of monol
ayers to micromachined apertures in silicon", Langmuir 11(1):8-12; T. D.
Osborn and P. Yager (1995), "Modeling success and failure of Langmuir-B
lodgett transfer of phospholipid bilayers to silicon dioxide”, Biophys.
J. 68(4):1364-73および小胞展開(P. Nollert, H. Kiefer et al., (1995), “
Lipid vesicle adsorption versus formation of planar bilayers on solid su
rfaces”, Biophys. J. 69(4):1447-55; J. Radler, H. Strey et al., (1995), “Phenomenology and Kinetics Of Lipid Bilayers Spreading On Hydrophilic
Surfaces”, Langmuir 11(11):4539-4548)。ミニチュア化された黒膜（ＢＬＭ ）構成はEray, Dogan et al., 1995によって報告されている（以下参照、M. Era
y, N. S. Dogan et al., (1995), “A highly stable and selective biosensor
using modified nicotinic acetylcholine receptor(nAChR)”、Biosystems 35(
2-3):183-8）。
【００４１】 本発明に基づく方法の重大な点は孔（開口）上への細胞と小胞との正確なポジ
ショニングである。このポジショニングは本発明に基づく電極配置と電界集束と
によって実現される。測定電極と基準電極との間の間隔は通例＜６ｍｍであるが
、これはもっと大きくてもよい。その際、測定電極と基準電極とはそれぞれ約０
，２〜３ｍｍ、好ましくは０，５〜２ｍｍ、特に０，５〜１ｍｍの間隔でキャリ
アチップの下側と上側に配置される。電気泳動による開口上への小胞ポジショニ
ングに効果的な電界をつくりだすクランプ電圧が使用される。この電圧は決定的
なものではないが、Ｖｃ＝−３０〜−３００ｍＶ、特に−６０〜−１００ｍＶ、
特に好ましくは−６０〜−８０ｍＶの範囲内にあるのが通例である。これに基づ
く電気泳動推進力により小胞および細胞は、電界にしたがって、正確にチップ穴
に向かって移動させられる。電界Ｅは非常に不均質で、開口に近づくにしたがっ
て非常に強くなることから、小胞は自動的に開口上に移動させられる。電気泳動
効果を有する電界の強さは特に開口近傍で効果的となることから（開口との距離
＜２００μｍ）、細胞／小胞はこの領域に運び込まれるかまたは対流によって同
所に達するかせざるを得ない。このため測定電極にはキャリアチップ穴（開口）
に向かい合った穴（たとえばｄ＜１ｍｍ）を設けることができる。
ショニングである。このポジショニングは本発明に基づく電極配置と電界集束と
によって実現される。測定電極と基準電極との間の間隔は通例＜６ｍｍであるが
、これはもっと大きくてもよい。その際、測定電極と基準電極とはそれぞれ約０
，２〜３ｍｍ、好ましくは０，５〜２ｍｍ、特に０，５〜１ｍｍの間隔でキャリ
アチップの下側と上側に配置される。電気泳動による開口上への小胞ポジショニ
ングに効果的な電界をつくりだすクランプ電圧が使用される。この電圧は決定的
なものではないが、Ｖｃ＝−３０〜−３００ｍＶ、特に−６０〜−１００ｍＶ、
特に好ましくは−６０〜−８０ｍＶの範囲内にあるのが通例である。これに基づ
く電気泳動推進力により小胞および細胞は、電界にしたがって、正確にチップ穴
に向かって移動させられる。電界Ｅは非常に不均質で、開口に近づくにしたがっ
て非常に強くなることから、小胞は自動的に開口上に移動させられる。電気泳動
効果を有する電界の強さは特に開口近傍で効果的となることから（開口との距離
＜２００μｍ）、細胞／小胞はこの領域に運び込まれるかまたは対流によって同
所に達するかせざるを得ない。このため測定電極にはキャリアチップ穴（開口）
に向かい合った穴（たとえばｄ＜１ｍｍ）を設けることができる。
【００４２】 あらゆる測定にとって、穴直径ないし開口直径が小胞または生体細胞の直径よ
りも遥かに小さい（ｄZelle，ｄVesikel≫ｄApertur）ことが重要である。した がってｄ＞２μｍの開口には直径ｄ＞２０μｍの小胞が使用されるのが好ましい
。
りも遥かに小さい（ｄZelle，ｄVesikel≫ｄApertur）ことが重要である。した がってｄ＞２μｍの開口には直径ｄ＞２０μｍの小胞が使用されるのが好ましい
。
【００４３】 固有の電気的特性は数学的に以下のように表わすことができる： 環状脂質膜の熱雑音はＲＭ−１／２に比例している（B. Sakmann and E. Nehe
r (1983), Single-channel recording, New York,London,Plenum Press.）：
r (1983), Single-channel recording, New York,London,Plenum Press.）：
【数１】
【００４４】 ＲＭ＝Ｒspec／（πｒＭ ２）であり、したがって以下の式が導かれる：
【数２】
【００４５】 前記式中でσは実効雑音電流、ｒは半径、ｆは周波数、ｋはボルツマン定数、
Ｒは抵抗、Ｔは温度を意味している。
Ｒは抵抗、Ｔは温度を意味している。
【００４６】 上記で述べたことから、測定目的に成功裏に使用し得る膜に関する結論として
、ｒＭ／（Ｒspec）1/2は非常に小さくなければならないことが判明する。これ の極小化は本発明により２つの方途、すなわち一方で膜半径ｒＭの極小化、また
は他方でさらに、使用される膜の電気的に密なシールによって行なうことができ
る。
、ｒＭ／（Ｒspec）1/2は非常に小さくなければならないことが判明する。これ の極小化は本発明により２つの方途、すなわち一方で膜半径ｒＭの極小化、また
は他方でさらに、使用される膜の電気的に密なシールによって行なうことができ
る。
【００４７】 膜の機構的安定性は膜の大きさに依存している。キャリア中の開口の大きさは
形成される膜の直径を制約する。開口および窓は同等な直径を有しているのが好
ましい。膜の偏向に必要とされる力はｒＭ−２に比例していることから、ｄAper tur ＜５μｍ、したがってｄＭ＜５μｍの構造にあっては、在来のＢＬＭシステ ムの場合のｄApertur＞１００μｍという典型的な穴径に比較して極度の膜安定 性向上が生ずることとなる。
形成される膜の直径を制約する。開口および窓は同等な直径を有しているのが好
ましい。膜の偏向に必要とされる力はｒＭ−２に比例していることから、ｄAper tur ＜５μｍ、したがってｄＭ＜５μｍの構造にあっては、在来のＢＬＭシステ ムの場合のｄApertur＞１００μｍという典型的な穴径に比較して極度の膜安定 性向上が生ずることとなる。
【００４８】 すでに先に論じたように、脂質膜用のキャリアは種々の材料から作製すること
が可能であるが、良好且つ正確な加工性からしてＳｉ／ＳｉＯ２およびケイ素／
オキシ窒化ケイ素・キャリアが好ましい。
が可能であるが、良好且つ正確な加工性からしてＳｉ／ＳｉＯ２およびケイ素／
オキシ窒化ケイ素・キャリアが好ましい。
【００４９】 脂質膜用キャリア（図１）として使用されるのが好ましいＳｉ／ＳｉＯ２チッ
プは通例＞２００ｎｍの厚さの酸化物層またはオキシ窒化物層２を有した取引通
例のシリコンウェーハ１から作製することができる。構造物はホトリソグラフィ
ーまたは、ｄ＜１，５μｍの開口３の場合には、電子線照射リソグラフィーを行
なった後、ＫＯＨ含有溶媒中でのシリコンの異方性エッチングならびに石英層の
反応性イオンエッチングによって得られる。図１は当該キャリアの見取り図を示
し、図２は開口を撮影した写真を示している。
プは通例＞２００ｎｍの厚さの酸化物層またはオキシ窒化物層２を有した取引通
例のシリコンウェーハ１から作製することができる。構造物はホトリソグラフィ
ーまたは、ｄ＜１，５μｍの開口３の場合には、電子線照射リソグラフィーを行
なった後、ＫＯＨ含有溶媒中でのシリコンの異方性エッチングならびに石英層の
反応性イオンエッチングによって得られる。図１は当該キャリアの見取り図を示
し、図２は開口を撮影した写真を示している。
【００５０】 この構造物について重要なのは開口の大きさであり、これは使用される小胞、
細胞ないしオルガネラよりも遥かに小さい必要があろう。開口サイズの減少は高
度なシールの形成にとって好適であるが、他方で開口周囲の電気的引力圏の縮小
を結果する。０．３〜７μｍの開口によって卓越した水準のシール可能性が得ら
れる。窓４（図１）のサイズは理想的な場合には開口３のサイズに減少させられ
ている。
細胞ないしオルガネラよりも遥かに小さい必要があろう。開口サイズの減少は高
度なシールの形成にとって好適であるが、他方で開口周囲の電気的引力圏の縮小
を結果する。０．３〜７μｍの開口によって卓越した水準のシール可能性が得ら
れる。窓４（図１）のサイズは理想的な場合には開口３のサイズに減少させられ
ている。
【００５１】 適切なキャリアチップ材料の選択にあたっては加工性以外にさらに表面の十分
な修飾可能性にも配慮し、表面への小胞または生体細胞の静電結合または所定の
共有結合を可能としなければならない。この点で、本来の表面修飾を行なう前に
キャリアチップを０２プラズマ中で何分間かにわたって処理するのが表面特性の
安定化に非常に寄与することが判明した。
な修飾可能性にも配慮し、表面への小胞または生体細胞の静電結合または所定の
共有結合を可能としなければならない。この点で、本来の表面修飾を行なう前に
キャリアチップを０２プラズマ中で何分間かにわたって処理するのが表面特性の
安定化に非常に寄与することが判明した。
【００５２】 小胞の強固な付着を保障するため、キャリアの表面は場合により定着剤たとえ
ばポリカチオンでコーティングされる（以下参照、Schatten et al., a. a. O.
1975）。物理吸着用にたとえばポリカチオンの水溶液、たとえば０．１％ポリ−
Ｌ−臭化リシン（σ）、ＭＷ １０００００を測定直前に２〜５分間にわたって
キャリアに与え、続いて測定緩衝液で洗い流すことができる。ペプチドポリカチ
オンの共有結合は石英表面のあらかじめ活性化されたヒジロキシル基を介し、た
とえばトシルクロリド（トリフェニルクロロメタン）によって行われるのが好ま
しい（M. L. Williamson, D. H. Atha et al., (1989), “Anti-T2 monoclonal
antibody immobilization on quartz fibers:stability and recognition of T2
mycotoxin”, Analytical Letters 22(4):803-816）。
ばポリカチオンでコーティングされる（以下参照、Schatten et al., a. a. O.
1975）。物理吸着用にたとえばポリカチオンの水溶液、たとえば０．１％ポリ−
Ｌ−臭化リシン（σ）、ＭＷ １０００００を測定直前に２〜５分間にわたって
キャリアに与え、続いて測定緩衝液で洗い流すことができる。ペプチドポリカチ
オンの共有結合は石英表面のあらかじめ活性化されたヒジロキシル基を介し、た
とえばトシルクロリド（トリフェニルクロロメタン）によって行われるのが好ま
しい（M. L. Williamson, D. H. Atha et al., (1989), “Anti-T2 monoclonal
antibody immobilization on quartz fibers:stability and recognition of T2
mycotoxin”, Analytical Letters 22(4):803-816）。
【００５３】 キャリア表面の修飾によって負の表面電荷による小胞の引き付けが実現される
が、これは膜とキャリア表面との間の電気的に非常に密なシールにとって完全に
十分なものである。
が、これは膜とキャリア表面との間の電気的に非常に密なシールにとって完全に
十分なものである。
【００５４】 小胞結合ないし細胞結合は分子固有の相互作用、たとえばビオチン−ストレプ
タビジンまたはヒスチジン−ＮＴＡ（ヒスチジン−ニトリロ三酢酸）によっても
実現することができる。
タビジンまたはヒスチジン−ＮＴＡ（ヒスチジン−ニトリロ三酢酸）によっても
実現することができる。
【００５５】 前記のポリカチオンの使用に代えて所望のｐＨ範囲のカチオン特性を有したそ
の他の化合物、たとえば４−アミノブチル−ジメチル−メトキシシランによって
表面を修飾することも可能である。
の他の化合物、たとえば４−アミノブチル−ジメチル−メトキシシランによって
表面を修飾することも可能である。
【００５６】 ＳｉＯ２表面と小胞との電気的に密な結合をつくりだすもう一つの可能性は測
定緩衝液にＣａ２＋イオンを添加することである。この場合、小胞が開口上に載
置された後、Ｃａ２＋濃度が＞２ｍＭに引き上げられる。図１１は膜の即時の電
気的シールを示している。
定緩衝液にＣａ２＋イオンを添加することである。この場合、小胞が開口上に載
置された後、Ｃａ２＋濃度が＞２ｍＭに引き上げられる。図１１は膜の即時の電
気的シールを示している。
【００５７】 電圧が僅かな場合（Ｖｃ＜２００ｍＶ、特に−２００〜２００ｍＶ）に小胞ま
たは細胞の電気泳動ポジショニング用の強い電界をつくりだすためには、電極間
の間隔を小さくした（Ｄ＜５ｍｍ）構成が好適であることが判明した。
たは細胞の電気泳動ポジショニング用の強い電界をつくりだすためには、電極間
の間隔を小さくした（Ｄ＜５ｍｍ）構成が好適であることが判明した。
【００５８】 電極は区画液中にまで達する球状もしくは任意の形状の空間域内で開口の周囲
に電界強度＞１００Ｖ／ｍが生ずるような間隔で互いに配置されるのが好適であ
り、区画ならびに開口もそのようにして緩衝剤ないし緩衝液で満たされるのが好
適である。
に電界強度＞１００Ｖ／ｍが生ずるような間隔で互いに配置されるのが好適であ
り、区画ならびに開口もそのようにして緩衝剤ないし緩衝液で満たされるのが好
適である。
【００５９】 以下に平面電極を備えた本発明に基づく測定システムの具体的な構成を述べる
こととする（図３）：電極６、たとえば寸法２０×２０×２ｍｍ３の銀板（たと
えば、純度＞９９．９８％Ａｇ、ただしこれ以下の純度も可能である）はセンサ
キャリアとして使用されると同時に基準電極としても使用される。この電極上に
、たとえば厚さ０．５〜２ｍｍのシリコンゴムガスケット（Sylgard 184, Dow C
orning, USA）のスペーサ７を介して正しい間隔で平行に本来の膜キャリアチッ プ１がポジショニングされる。このスペーサは幅約１ｍｍ、長さ＜６ｍｍの通路
（ないしチャンバ）８―これはたとえば押し抜きによってつくることができる―
を有し、該通路は緩衝液で満たされて開口３ないし膜と基準電極６との間の接触
をつくりだす。基準電極たとえば好ましくはＡｇ／ＡｇＣｌ電極をつくりだすた
め、前記通路はたとえば１ＭのＨＣｌで満たされ、通路内に露出している銀が電
圧下たとえばＶ＝０．８Ｖにて９０秒にわたって塩素化される。キャリアチップ
１はその下側を緩衝液で濡らした後、基準緩衝液で満たされた通路８上に載置さ
れる。
こととする（図３）：電極６、たとえば寸法２０×２０×２ｍｍ３の銀板（たと
えば、純度＞９９．９８％Ａｇ、ただしこれ以下の純度も可能である）はセンサ
キャリアとして使用されると同時に基準電極としても使用される。この電極上に
、たとえば厚さ０．５〜２ｍｍのシリコンゴムガスケット（Sylgard 184, Dow C
orning, USA）のスペーサ７を介して正しい間隔で平行に本来の膜キャリアチッ プ１がポジショニングされる。このスペーサは幅約１ｍｍ、長さ＜６ｍｍの通路
（ないしチャンバ）８―これはたとえば押し抜きによってつくることができる―
を有し、該通路は緩衝液で満たされて開口３ないし膜と基準電極６との間の接触
をつくりだす。基準電極たとえば好ましくはＡｇ／ＡｇＣｌ電極をつくりだすた
め、前記通路はたとえば１ＭのＨＣｌで満たされ、通路内に露出している銀が電
圧下たとえばＶ＝０．８Ｖにて９０秒にわたって塩素化される。キャリアチップ
１はその下側を緩衝液で濡らした後、基準緩衝液で満たされた通路８上に載置さ
れる。
【００６０】 測定ないし膜作製にあたって測定液ないし小胞液は直接キャリアチップ１の上
側の開口３ないし窓４かまたは測定電極９の上側に、たとえば約５〜１０μｌの
体積Ｖにて与えられる。障害発生を極小化するため開口３の周辺域をたとえばｒ
＝１ｍｍの間隔でシリコンリング１０（Sylgaard）によって囲むことができる。
このリング１０はチップと測定電極との間に形成されるメニスカスと共に試料チ
ャンバ（試料区画）を形成する。たとえば厚さ０．８ｍｍの塩素化された正方形
銀板（たとえば４×４ｍｍ２）から成る測定電極９、特にリング状銀板（たとえ
ばｄ＝２ｍｍ）から成る測定電極９は好ましくは約１ｍｍまでの間隔を置いて特
にチップ表面と平行にポジショニングされるが、その際、細胞液添加ないし小胞
液添加および測定液添加のために該電極に設けられた好ましくは漏斗状の穴１１
（ｄｍｉｎ＝０．４−１ｍｍ）はキャリアチップ１のマイクロ開口３に対して正
確に同心的にポジショニングされるのが好適である。この測定電極にはその上側
と下側にそれぞれ、添加穴１１の形成に寄与するスペーサ１２を設けることがで
きる。
側の開口３ないし窓４かまたは測定電極９の上側に、たとえば約５〜１０μｌの
体積Ｖにて与えられる。障害発生を極小化するため開口３の周辺域をたとえばｒ
＝１ｍｍの間隔でシリコンリング１０（Sylgaard）によって囲むことができる。
このリング１０はチップと測定電極との間に形成されるメニスカスと共に試料チ
ャンバ（試料区画）を形成する。たとえば厚さ０．８ｍｍの塩素化された正方形
銀板（たとえば４×４ｍｍ２）から成る測定電極９、特にリング状銀板（たとえ
ばｄ＝２ｍｍ）から成る測定電極９は好ましくは約１ｍｍまでの間隔を置いて特
にチップ表面と平行にポジショニングされるが、その際、細胞液添加ないし小胞
液添加および測定液添加のために該電極に設けられた好ましくは漏斗状の穴１１
（ｄｍｉｎ＝０．４−１ｍｍ）はキャリアチップ１のマイクロ開口３に対して正
確に同心的にポジショニングされるのが好適である。この測定電極にはその上側
と下側にそれぞれ、添加穴１１の形成に寄与するスペーサ１２を設けることがで
きる。
【００６１】 基準緩衝剤／測定緩衝剤の充填時および貯蔵時の毛管力の利用により本システ
ムは液体貯蔵に関するその開放性にもかかわらず機構的に非常に安定である。閉
鎖システムの場合にたとえば温度差によって発生し得るような静水圧差による膜
の障害はこの開放性によって排除される。
ムは液体貯蔵に関するその開放性にもかかわらず機構的に非常に安定である。閉
鎖システムの場合にたとえば温度差によって発生し得るような静水圧差による膜
の障害はこの開放性によって排除される。
【００６２】 もう一つの実現形態は点状電極ないし線状電極を使用している（図４）：この
場合、表面修飾され、場合により特にフラットなホルダーたとえばガラスホルダ
ーまたはテフロンホルダー上に固定されたチップ１はチップ１の上側と下側とに
配置され、場合により外側に（端面を除いて）保護層１１特にテフロン層を備え
た、たとえば直径ｄ＝０．１〜２ｍｍ（保護層を除く）の２本の銀線ないし銀電
極６、９の塩素化された端面１０の間に配置される（電極６−電極９の間隔はた
とえば４ｍｍ）。ピペットまたはチップ近傍に取付けられたチューブまたは以下
に挙げる試料ハンドリングシステムのいずれかにより緩衝液がチップの両側に与
えられ、毛管力によってチップと電極との間に保持される。オフセットキャリブ
レーションと通例Ｖ＝−６０〜−１００ｍＶの適切な電圧を印加した後、小胞／
細胞がピペットまたはさらに別なチューブまたは以下に挙げる試料ハンドリング
システムのいずれかを用い、修飾されたチップ面に与えられる。電気パラメータ
の変化に基づいて小胞結合および膜形成が追跡される。
場合、表面修飾され、場合により特にフラットなホルダーたとえばガラスホルダ
ーまたはテフロンホルダー上に固定されたチップ１はチップ１の上側と下側とに
配置され、場合により外側に（端面を除いて）保護層１１特にテフロン層を備え
た、たとえば直径ｄ＝０．１〜２ｍｍ（保護層を除く）の２本の銀線ないし銀電
極６、９の塩素化された端面１０の間に配置される（電極６−電極９の間隔はた
とえば４ｍｍ）。ピペットまたはチップ近傍に取付けられたチューブまたは以下
に挙げる試料ハンドリングシステムのいずれかにより緩衝液がチップの両側に与
えられ、毛管力によってチップと電極との間に保持される。オフセットキャリブ
レーションと通例Ｖ＝−６０〜−１００ｍＶの適切な電圧を印加した後、小胞／
細胞がピペットまたはさらに別なチューブまたは以下に挙げる試料ハンドリング
システムのいずれかを用い、修飾されたチップ面に与えられる。電気パラメータ
の変化に基づいて小胞結合および膜形成が追跡される。
【００６３】 一般的に述べた測定装置ならびに詳しく述べた実現例は統合されて試料ハンド
リングシステムが増設されたシステムに基本的に適している。このハンドリング
システムに数え入れられるのは、たとえばポンプ、静水圧差、電気浸透効果、圧
電効果および温度効果または機械的変位をベースとして定まった液量を記述した
構成の液体区画内におよび／または同区画外に輸送することのできる液体輸送シ
ステムである。同時に、多重開口チップによるかまたは１個の開口を有した複数
のキャリアチップを用い、記述した構成を容易に並列することが可能である。
リングシステムが増設されたシステムに基本的に適している。このハンドリング
システムに数え入れられるのは、たとえばポンプ、静水圧差、電気浸透効果、圧
電効果および温度効果または機械的変位をベースとして定まった液量を記述した
構成の液体区画内におよび／または同区画外に輸送することのできる液体輸送シ
ステムである。同時に、多重開口チップによるかまたは１個の開口を有した複数
のキャリアチップを用い、記述した構成を容易に並列することが可能である。
【００６４】 膜として適した巨大一枚膜胞（Ｇｉａｎｔ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓ
ｉｃｌｅｓ，ＧＵＶ）は水和法によって作製することが可能である（H. H. Hub,
U. Zimmermann et al., (1982), “Preparation of large unilamellar vesicl
es”, FEBS Lett. 140(2):254-256; P. Mueller, T. F. Chien et al., (1983),
"Formation and properties of cell-size lipid bilayer vesicles", Biophys
. J. 44(3):375-81; K. Akashi, H. Miyata et al., (1996), "Preparation of
giant liposomes in physiological cnditions and their characterization un
der an optical microscope", Biophys. J. 71(6):3242-50）。修飾が適切であ ればこの方法によりプロテオリポソームを作製することも可能である（M. Criad
o and B. U. Keller (1987), “A membrane fusion strategy for single-chann
el recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette
electrodes”, FEBS Lett. 224(1):172-6; B. U. Keller, R.Hedrich et al.,
(1988), “Single channel recordings of reconstituted ion channel protein
s:an improved technique”, Pflugers Arch 411(1):94-100）。
ｉｃｌｅｓ，ＧＵＶ）は水和法によって作製することが可能である（H. H. Hub,
U. Zimmermann et al., (1982), “Preparation of large unilamellar vesicl
es”, FEBS Lett. 140(2):254-256; P. Mueller, T. F. Chien et al., (1983),
"Formation and properties of cell-size lipid bilayer vesicles", Biophys
. J. 44(3):375-81; K. Akashi, H. Miyata et al., (1996), "Preparation of
giant liposomes in physiological cnditions and their characterization un
der an optical microscope", Biophys. J. 71(6):3242-50）。修飾が適切であ ればこの方法によりプロテオリポソームを作製することも可能である（M. Criad
o and B. U. Keller (1987), “A membrane fusion strategy for single-chann
el recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette
electrodes”, FEBS Lett. 224(1):172-6; B. U. Keller, R.Hedrich et al.,
(1988), “Single channel recordings of reconstituted ion channel protein
s:an improved technique”, Pflugers Arch 411(1):94-100）。
【００６５】 チップに対する小胞の電気的に密な結合を保障するため、キャリア表面とは逆
の小胞表面の正味帯電が必要である。小胞表面は、膜に組み込まれた蛋白質の生
理学的状態をできるだけ保障するために、たとえばパルミトイルオレイルホスフ
ァチドイルグリセロール（ＰＯＰＧ）によって負に帯電させることができる。
の小胞表面の正味帯電が必要である。小胞表面は、膜に組み込まれた蛋白質の生
理学的状態をできるだけ保障するために、たとえばパルミトイルオレイルホスフ
ァチドイルグリセロール（ＰＯＰＧ）によって負に帯電させることができる。
【００６６】 ポジショニングの後、細胞ないし小胞は、それらが自発的に破裂しない場合に
は、たとえば低張溶媒たとえば純水での処理によって破壊することができる。
は、たとえば低張溶媒たとえば純水での処理によって破壊することができる。
【００６７】 本発明に基づくフラットタイプの測定装置はそれと結びついた短い拡散時間に
よって「多孔パッチ」技法の使用にも特に適している（R. Horn and A. Marty (
1988), “Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole
-cell recording method”, J. Gen. Physiol. 92(2):145-59; J. Rae, K. Coop
er et al., (1991), “Low access resistance perforated patch recordings u
sing amphotericin B.”, J. Neurosci. Methods. 37(1):15-26）。これらの技 法において、細胞内容（サイトゾル）への化学的結合は通例ガラスピペットに付
着している膜片に孔形成抗生物質を浸透させることによって達成される。この方
法のメリットは同時に電気的な利用を実現しつつ測定緩衝液でサイトゾルを洗い
流す必要がないということである。
よって「多孔パッチ」技法の使用にも特に適している（R. Horn and A. Marty (
1988), “Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole
-cell recording method”, J. Gen. Physiol. 92(2):145-59; J. Rae, K. Coop
er et al., (1991), “Low access resistance perforated patch recordings u
sing amphotericin B.”, J. Neurosci. Methods. 37(1):15-26）。これらの技 法において、細胞内容（サイトゾル）への化学的結合は通例ガラスピペットに付
着している膜片に孔形成抗生物質を浸透させることによって達成される。この方
法のメリットは同時に電気的な利用を実現しつつ測定緩衝液でサイトゾルを洗い
流す必要がないということである。
【００６８】 本発明に基づき、生体細胞または、特別な状況下にあっては小胞も（この場合
、その機構的安定性は十分に高度なものでなければならない）開口上側に結合さ
れた後、孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたはニスタチンを基準区画内に与
えることができる。この場合、開口を覆う膜パッチの穿孔速度は同等なパッチク
ランプ技法の場合よりも遥かに大である。
、その機構的安定性は十分に高度なものでなければならない）開口上側に結合さ
れた後、孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたはニスタチンを基準区画内に与
えることができる。この場合、開口を覆う膜パッチの穿孔速度は同等なパッチク
ランプ技法の場合よりも遥かに大である。
【００６９】 さらに膜パッチの破壊に際しても、ホールセル・パッチクランプ技法（ＷＣＲ
Ｔ）と同様に、基準緩衝液を介してより大量の蛋白質を細胞質内に容易に添加す
ることが可能である。その根拠は測定システムのフラットな構成であり、これが
ＷＣＲＴに比較してサイトゾルないし小胞内容中への大量のマクロ分子の遥かに
迅速な拡散を可能とする（Z. M. Pei, J.M.Ward et al., (1996), “A novel ch
loride channel in Vicia faba guard cell vacuoles activated by the serine
/threonine kinase,CDPK”, EMBO J. 15(23):6564-74）。
Ｔ）と同様に、基準緩衝液を介してより大量の蛋白質を細胞質内に容易に添加す
ることが可能である。その根拠は測定システムのフラットな構成であり、これが
ＷＣＲＴに比較してサイトゾルないし小胞内容中への大量のマクロ分子の遥かに
迅速な拡散を可能とする（Z. M. Pei, J.M.Ward et al., (1996), “A novel ch
loride channel in Vicia faba guard cell vacuoles activated by the serine
/threonine kinase,CDPK”, EMBO J. 15(23):6564-74）。
【００７０】 本発明に基づく測定装置ないし本発明に基づくポジショニング法は非常に広範
な適用可能性を有している。これらは、すでに先に論じた適用可能性以外に、小
胞ないし細胞の分離またはサイズ分析に、また、たとえば純光学的な検査または
顕微注射のための細胞のポジショニングにも使用することができる。本システム
により特にたとえばリガンド結合研究におけるイオノトロープ膜蛋白質の直接の
機能分析が可能である。本システムはそのシンプルな構成、結果の再現性ならび
に膜シールの機構的安定性と結びついて特にスクリーニング分野のバイオセンサ
にも適しており、この点でパッチクランプ技法に代わる省コスト・省時間的代替
法を表わしている。本システムの容易な並列可能性によって本システムは基本的
にＨＴＳにも適している。
な適用可能性を有している。これらは、すでに先に論じた適用可能性以外に、小
胞ないし細胞の分離またはサイズ分析に、また、たとえば純光学的な検査または
顕微注射のための細胞のポジショニングにも使用することができる。本システム
により特にたとえばリガンド結合研究におけるイオノトロープ膜蛋白質の直接の
機能分析が可能である。本システムはそのシンプルな構成、結果の再現性ならび
に膜シールの機構的安定性と結びついて特にスクリーニング分野のバイオセンサ
にも適しており、この点でパッチクランプ技法に代わる省コスト・省時間的代替
法を表わしている。本システムの容易な並列可能性によって本システムは基本的
にＨＴＳにも適している。
【００７１】 検査は細胞および小胞を使用して行なうことができるが、また細胞片、細胞オ
ルガネラおよび脂質膜を使用しても可能である。
ルガネラおよび脂質膜を使用しても可能である。
【００７２】 本方法により信号雑音差に優れた、膜抵抗の記録が可能である。
【００７３】 本発明に基づく方法において、測定液もしくは基準液または双方の液を別の液
と交換し、あるいは分析される物質を測定側および／または基準側の液に加える
ことが可能であり、たとえば孔形成剤を一方のまたは双方の区画に添加し、膜の
導電率ないし特定のイオンに対する膜の透過性を高め、あるいは任意のサイズの
プロテオリポソームを同様にして添加し、これを開口３を覆う膜と融合させ、こ
うしてその中に含まれている任意の膜蛋白質の電気的測定または光学的測定を可
能とすることができる。また開口（３）を覆う膜を構成した後に膜蛋白質をその
中に組み込むことも可能である。
と交換し、あるいは分析される物質を測定側および／または基準側の液に加える
ことが可能であり、たとえば孔形成剤を一方のまたは双方の区画に添加し、膜の
導電率ないし特定のイオンに対する膜の透過性を高め、あるいは任意のサイズの
プロテオリポソームを同様にして添加し、これを開口３を覆う膜と融合させ、こ
うしてその中に含まれている任意の膜蛋白質の電気的測定または光学的測定を可
能とすることができる。また開口（３）を覆う膜を構成した後に膜蛋白質をその
中に組み込むことも可能である。
【００７４】 本方法の実施は開口３を覆う膜を光学的、特に蛍光測定に利用し得るようにし
て膜の当該測定を実施するように構成された装置を用いて行なうことも可能であ
る。
て膜の当該測定を実施するように構成された装置を用いて行なうことも可能であ
る。
【００７５】 また、一つのキャリアに設けられた複数の開口３が使用され、測定が少なくと
も２個の開口３を介して逐次および／または平行して行なわれおよび／またはキ
ャリア１の一方の側のすべての電極または複数の電極が一つの共通の電位を有す
るかもしくはそれらを単一の電極にまとめるかすることも可能である。
も２個の開口３を介して逐次および／または平行して行なわれおよび／またはキ
ャリア１の一方の側のすべての電極または複数の電極が一つの共通の電位を有す
るかもしくはそれらを単一の電極にまとめるかすることも可能である。
【００７６】 以下に本方法をいくつかの例に基づいて詳しく説明することとする。ただしこ
れらの例は決して本発明の範囲を制限するものとして解されてはならない。
れらの例は決して本発明の範囲を制限するものとして解されてはならない。
【００７７】
＜小胞形成およびサイズ分離＞ １００μｌのアゾレクチン（Fluka）または卵レシチン（ＥＰＣ）、５０μｌ のパルミトイルオレイルホスファチドイルグリセロール（ＰＯＰＧ）、３μｌの
ジパルミトイルホスホチドイルエタノールアミン−ローダミン（DPPE-Rhodamin ）（Molecular Probes, USA）（すべてクロロホルム中に１０ｍｇ／ｍｌ、アバ ンチ極性脂質）と７０μｌのメタノールが回転気化器（Buchi Rotavapor R-114 ）中で４００ｍｍＨｇの低圧にて乾燥され、１０ｍｌの丸形フラスコ中で膜とさ
れた。続いて真空中にて１時間培養された後、１０ｍｌのＨ２Ｏまたは、＜１５
０ｍＭ ＫＣｌおよび／または＜６００ｍＭのスクロースまたは好ましくはソル
ビトールを含んだ１０ｍｌの緩衝液が加えられた。この過程で形成された小胞は
３７℃にて約１６ｈ後にほぼ透明なミストとして現われた。小胞は１ｍｌのピペ
ットで吸引され、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３、最終濃度０，２重量％）の（オ
プショナルな）添加後４℃にて爾後の使用まで貯蔵保管された。
ジパルミトイルホスホチドイルエタノールアミン−ローダミン（DPPE-Rhodamin ）（Molecular Probes, USA）（すべてクロロホルム中に１０ｍｇ／ｍｌ、アバ ンチ極性脂質）と７０μｌのメタノールが回転気化器（Buchi Rotavapor R-114 ）中で４００ｍｍＨｇの低圧にて乾燥され、１０ｍｌの丸形フラスコ中で膜とさ
れた。続いて真空中にて１時間培養された後、１０ｍｌのＨ２Ｏまたは、＜１５
０ｍＭ ＫＣｌおよび／または＜６００ｍＭのスクロースまたは好ましくはソル
ビトールを含んだ１０ｍｌの緩衝液が加えられた。この過程で形成された小胞は
３７℃にて約１６ｈ後にほぼ透明なミストとして現われた。小胞は１ｍｌのピペ
ットで吸引され、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３、最終濃度０，２重量％）の（オ
プショナルな）添加後４℃にて爾後の使用まで貯蔵保管された。
【００７８】 この方法に基づく脂質小胞の作製は大部分（＞９０％）が２５０μｍまでのサ
イズの一枚膜小胞を結果した（図５）。小胞の一部はさらにより小さな小胞を含
んでいたが、これらは膜形成に関係していなかった。表面を電気的に密にシール
する膜の構成に純化された小胞を使用するにはいっさいの小胞と１０μｍ以下で
あった脂質不純物との分離が必要であった。分離が不十分な場合には開口近傍に
おける小さな小胞の結合によって反発効果が生じ、これが大きな小胞（＞１０μ
ｍ）による電気的に密な開口シールを妨げた。小胞は孔径２０μｍのナイロンネ
ットによる＞２０ｈの透析によってサイズ分離された；必要な場合には、脂質組
成が適切であれば、温度を≦４℃、特に１℃に降下させることによって小胞膜の
流動性を低下させることができる。小胞膜の単層性は調整が適切であればアラメ
チシンの添加（これについては以下参照、R. B. Gennis (1989), “Biomembrane
s: molecular structcure and function”, New York, Berlin, Heidelberg, Sp
ringer Verlag）（図１２に図示）と共焦点顕微鏡分析によって補強することが できる（図６）。
イズの一枚膜小胞を結果した（図５）。小胞の一部はさらにより小さな小胞を含
んでいたが、これらは膜形成に関係していなかった。表面を電気的に密にシール
する膜の構成に純化された小胞を使用するにはいっさいの小胞と１０μｍ以下で
あった脂質不純物との分離が必要であった。分離が不十分な場合には開口近傍に
おける小さな小胞の結合によって反発効果が生じ、これが大きな小胞（＞１０μ
ｍ）による電気的に密な開口シールを妨げた。小胞は孔径２０μｍのナイロンネ
ットによる＞２０ｈの透析によってサイズ分離された；必要な場合には、脂質組
成が適切であれば、温度を≦４℃、特に１℃に降下させることによって小胞膜の
流動性を低下させることができる。小胞膜の単層性は調整が適切であればアラメ
チシンの添加（これについては以下参照、R. B. Gennis (1989), “Biomembrane
s: molecular structcure and function”, New York, Berlin, Heidelberg, Sp
ringer Verlag）（図１２に図示）と共焦点顕微鏡分析によって補強することが できる（図６）。
【００７９】 ＜小胞の電気泳動ポジショニング＞ 変法１： 各測定の前に電極間のオフセット電圧ＶOffsetが修正された。このため５μｌ
の緩衝液が直接開口上に与えられ、続いて測定電極がチップ表面に１ｍｍまで接
近させられた。チップ表面と電極との間に液体メニスカスが形成された後、オフ
セット電圧とシステム容量が補償された。
の緩衝液が直接開口上に与えられ、続いて測定電極がチップ表面に１ｍｍまで接
近させられた。チップ表面と電極との間に液体メニスカスが形成された後、オフ
セット電圧とシステム容量が補償された。
【００８０】 続いて小胞を含有した分散液１０μｌが測定電極の上側に与えられ、小胞は測
定電極に設けられた円形穴を通って沈降した。前記測定電極穴を通って移動した
小胞は印加された電極電圧ＶＭ＝−５０〜−８０ｍＶに対応する電界の影響下で
直接開口上に加速移動させられた。この場合、達成された集束は無修飾の表面の
開口を通る小胞通過数で測定して窓サイズに依存していた（窓と称されるのはエ
ッチングによって露出したＳｉＯ２層部分のことである）（図２）。小さなＳｉ
Ｏ２窓（＜４５×４５μｍ２）が存在する場合には小胞流量は著しく増加してい
た。
定電極に設けられた円形穴を通って沈降した。前記測定電極穴を通って移動した
小胞は印加された電極電圧ＶＭ＝−５０〜−８０ｍＶに対応する電界の影響下で
直接開口上に加速移動させられた。この場合、達成された集束は無修飾の表面の
開口を通る小胞通過数で測定して窓サイズに依存していた（窓と称されるのはエ
ッチングによって露出したＳｉＯ２層部分のことである）（図２）。小さなＳｉ
Ｏ２窓（＜４５×４５μｍ２）が存在する場合には小胞流量は著しく増加してい
た。
【００８１】 変法２： 各測定の前に電極間のオフセット電圧ＶOffsetが修正された。このため、チッ
プと測定電極ないし参照電極との間に５μｌの緩衝液が添加された後、電流フロ
ーが消失する、すなわちＩ（ＶOffset）＝０ｐＡ時の電圧が求められた。
プと測定電極ないし参照電極との間に５μｌの緩衝液が添加された後、電流フロ
ーが消失する、すなわちＩ（ＶOffset）＝０ｐＡ時の電圧が求められた。
【００８２】 続いて小胞を含有した分散液３μｌが開口近傍の測定区画に与えられ、小胞は
平行平面電極配置において測定電極に設けられた円形穴を通って沈降した。開口
近傍（＜２００μｍ）の非常に強い電界（数ｋＶまでに達する）領域内に達した
小胞は電界分布にしたがって直接開口上に加速移動させられ、チップ表面と電気
的に密に結合した後電気分析された。
平行平面電極配置において測定電極に設けられた円形穴を通って沈降した。開口
近傍（＜２００μｍ）の非常に強い電界（数ｋＶまでに達する）領域内に達した
小胞は電界分布にしたがって直接開口上に加速移動させられ、チップ表面と電気
的に密に結合した後電気分析された。
【００８３】 変法１と変法２に述べた電気的ポジショニング法は同様にテストされた細胞／
小胞重力沈降法を以下の点すなわち―必要とされる小胞数ないし細胞数、全体と
しての膜形成速度および膜構成ないし細胞結合が成功する確率―において凌駕し
ていた。
小胞重力沈降法を以下の点すなわち―必要とされる小胞数ないし細胞数、全体と
しての膜形成速度および膜構成ないし細胞結合が成功する確率―において凌駕し
ていた。
【００８４】 ＜ＳｉＯ２表面への小胞結合および吸着＞ ポリリシン修飾されたＳｉＯ２表面への前記小胞の結合が検査された。これは
非常に強固で、適切な接近後に０．５秒以内で生じた。電気的に密なポジショニ
ングの成功確率は開口サイズ、ＳｉＯ２窓サイズならびに小胞の数、サイズおよ
びサイズ分布に非常に依存していた。ｄApertur＜２μｍの開口と＜４０μｍの 窓とを備えたキャリアチップはｄVersikel＞４０μｍの小胞懸濁液とコンビネー
ションされると電気的に密な膜シールの確率＞９０％（ｎ＞１５、ｎはテスト回
数を表わしている）を結果した。チップ毎および小胞懸濁液の相違毎に生ずる密
な開口シール形成のわずかな変動から、開口サイズの縮小ならびに小胞懸濁液の
純化の向上に伴って有効開口シールの高まりが認められるということを推定する
ことができる。
非常に強固で、適切な接近後に０．５秒以内で生じた。電気的に密なポジショニ
ングの成功確率は開口サイズ、ＳｉＯ２窓サイズならびに小胞の数、サイズおよ
びサイズ分布に非常に依存していた。ｄApertur＜２μｍの開口と＜４０μｍの 窓とを備えたキャリアチップはｄVersikel＞４０μｍの小胞懸濁液とコンビネー
ションされると電気的に密な膜シールの確率＞９０％（ｎ＞１５、ｎはテスト回
数を表わしている）を結果した。チップ毎および小胞懸濁液の相違毎に生ずる密
な開口シール形成のわずかな変動から、開口サイズの縮小ならびに小胞懸濁液の
純化の向上に伴って有効開口シールの高まりが認められるということを推定する
ことができる。
【００８５】 表面への小胞の結合に際しこれは引き延ばされて完全にフラットな形成物とな
された（図６および７）。小胞膜は０．５％ローダミンでマーキングされ（レッ
ド）、小胞内容はカルボキシフルオレセインでマーキングされた（グリーン）。
いっさいのカルボキシフルオレセイン放出の消失（着色はもっぱらローダミンの
赤色を示しており、図６では膜片のグレーとして認められる）はカルボキシフル
オレセインの遊離と小胞の破裂、したがってこれらの膜の単層性を示唆している
。この場合にキャリアチップで測定されたＲＭ＞６．４ＧΩ（ｎ＝２６）という
非常に高い膜シール抵抗（シンメトリック８５ｍＭ ＫＣｌ中）から電気的に見
て広範に欠陥のない脂質膜の形成を推定することができる。ポリリシンコーティ
ングされたガラス上での小胞の融合プロセスと融合結果とが共焦点顕微鏡（LSM5
10, Zeiss Jena, Germany）を用いて検査された。
された（図６および７）。小胞膜は０．５％ローダミンでマーキングされ（レッ
ド）、小胞内容はカルボキシフルオレセインでマーキングされた（グリーン）。
いっさいのカルボキシフルオレセイン放出の消失（着色はもっぱらローダミンの
赤色を示しており、図６では膜片のグレーとして認められる）はカルボキシフル
オレセインの遊離と小胞の破裂、したがってこれらの膜の単層性を示唆している
。この場合にキャリアチップで測定されたＲＭ＞６．４ＧΩ（ｎ＝２６）という
非常に高い膜シール抵抗（シンメトリック８５ｍＭ ＫＣｌ中）から電気的に見
て広範に欠陥のない脂質膜の形成を推定することができる。ポリリシンコーティ
ングされたガラス上での小胞の融合プロセスと融合結果とが共焦点顕微鏡（LSM5
10, Zeiss Jena, Germany）を用いて検査された。
【００８６】 シンメトリック１０ｍＭ ＫＣｌ中での同様な測定シリーズに際し、適切に接
近した後の０．２秒以内の小胞の結合は＞７０％の確率（ｎ＞１５）で測定され
、またＲＭ＞１０ＧΩの膜抵抗が測定された。
近した後の０．２秒以内の小胞の結合は＞７０％の確率（ｎ＞１５）で測定され
、またＲＭ＞１０ＧΩの膜抵抗が測定された。
【００８７】 ＜脂質膜の電気パラメータ＞ 小胞と修飾表面との各融合の前に主として開口によって規定される測定装置の
抵抗が測定された。これは８５ｍＭ ＫＣｌ中で開口サイズに応じ１ＭΩまでに
達した（通常は＜４５０ｋΩ）。これ以上の抵抗は、開口下方の気泡の封入と同
様に、人為結果として評価された。
抵抗が測定された。これは８５ｍＭ ＫＣｌ中で開口サイズに応じ１ＭΩまでに
達した（通常は＜４５０ｋΩ）。これ以上の抵抗は、開口下方の気泡の封入と同
様に、人為結果として評価された。
【００８８】 開口上での小胞融合または細胞結合に際して形成された膜は同一イオン濃度に
てＲＭ＞６．４ＧΩの抵抗を有していた。この場合キャリアチップの容量はわず
かに変化したにすぎなかった。数ｐＦ。
てＲＭ＞６．４ＧΩの抵抗を有していた。この場合キャリアチップの容量はわず
かに変化したにすぎなかった。数ｐＦ。
【００８９】 １ｍＭ ＫＣｌ中で同様にして実施されたテストにおいて同じく開口サイズに
応じ通例１ＭΩまでの膜構造の抵抗が測定された。同一イオン濃度にて、開口上
に形成された膜の抵抗は通例ＲＭ＞４０ＧΩに達し、１０ｍＭ ＫＣｌ中では通
例ＲＭ＞１０ＧΩに達した。キャリアチップの容量はこれらのテストに際しても
わずかに変化したにすぎなかった。１６０−２８０ｐＦ。
応じ通例１ＭΩまでの膜構造の抵抗が測定された。同一イオン濃度にて、開口上
に形成された膜の抵抗は通例ＲＭ＞４０ＧΩに達し、１０ｍＭ ＫＣｌ中では通
例ＲＭ＞１０ＧΩに達した。キャリアチップの容量はこれらのテストに際しても
わずかに変化したにすぎなかった。１６０−２８０ｐＦ。
【００９０】 ＜小胞のマイクロメータ孔通過＞ 負に帯電した表面たとえば無修飾のＳｉＯ２層もしくは開口周囲に融合した小
胞が存在する場合には、小胞の開口通過は抵抗変化に基づいて観察することがで
きる（図１０）。人為結果をチェックするため電圧は転極されたが、抵抗の変化
は観察されなかった。
胞が存在する場合には、小胞の開口通過は抵抗変化に基づいて観察することがで
きる（図１０）。人為結果をチェックするため電圧は転極されたが、抵抗の変化
は観察されなかった。
【００９１】 １８秒までの長い小胞通過は十分流動的な膜を有した非常に大きな小胞の通過
を推定させる。特に、ｄ＞５０μｍ（ｎ＝４、ｎは測定数を表わしている）の小
胞集団およびｄ＝７μｍの開口を使用した場合、小胞サイズに応じて振幅変化の
固定したほぼ特有の通過時間変化が観察された。これから、小胞は開口を通過す
る際に引き伸ばされて、表面の閉じた、定まった直径を有するチューブ状の形成
物になると推定することができる。チューブ長さに反映される小胞サイズは振幅
時間として得ることができる。
を推定させる。特に、ｄ＞５０μｍ（ｎ＝４、ｎは測定数を表わしている）の小
胞集団およびｄ＝７μｍの開口を使用した場合、小胞サイズに応じて振幅変化の
固定したほぼ特有の通過時間変化が観察された。これから、小胞は開口を通過す
る際に引き伸ばされて、表面の閉じた、定まった直径を有するチューブ状の形成
物になると推定することができる。チューブ長さに反映される小胞サイズは振幅
時間として得ることができる。
【００９２】 前記に基づき、大きな小胞（ｄVesikel≫ｄApertur）に典型的な通過時間と小
さな小胞（ｄVesikel〜ｄApertur）に典型的な抵抗振幅変化とを分析することに
より溶液の小胞サイズ構成を決定することが可能である。これにより本方法はさ
らに小胞集団および細胞集団を分析する可能性を切り開くこととなる。
さな小胞（ｄVesikel〜ｄApertur）に典型的な抵抗振幅変化とを分析することに
より溶液の小胞サイズ構成を決定することが可能である。これにより本方法はさ
らに小胞集団および細胞集団を分析する可能性を切り開くこととなる。
【００９３】 ＜アラメチシン孔とニコチン性アセチルコリンレセプターとの観察＞ 本発明に基づくシステムの生物学的機能態様を検証するため、８５ｍＭ ＫＣ
ｌ中にて開口を覆う膜が形成された後、アラメチシン（緩衝剤中の最終濃度０．
１μｇ／ｍｌ）が測定区画に与えられた（R. B. Gennis (1989), Biomembranes:
molecular structure and function, New York, Berlin, Heidelberg, Spring
er Verlag）。アラメチシンに典型的な電流変動（振幅および滞留時間）の発生 ―これは約６００ｐＳというアラメチシン孔の導電率に相当している―は本シス
テムの機能性と高度な感受性を証明している（図１２）。同じくレセプター蛋白
質たとえばｎＡＣｈＲも―たとえばＣａ２＋を介した―小さな小胞（small, med
ium and large unilammelare vesicles）との融合を経て膜中に取り込まれて測 定が可能である。このためｎＡＣｈＲは純化され、Schurholzにしたがって小胞 中で再構成された（Schurholz, T., J. Kehne et al., (1992), “Functional r
econstitution of the nicotinic acetylcholine receptor by CHAPS dialysis
depends on the concentrations of salt,lipid,and protein”, Biochemistry
31(21):5067-77; Schurholz,T. (1996), “Critical dependence of the solubi
lization of lipid vesicles by the detergent CHAPS on the lipid compositi
on. Functional reconstitution of the nicotinic acetylcholine receptor in
to preformed vesicles above the critical micellization concentraion", Bi
ophys Chem 58(1-2):87-96）。これらの小胞は測定区画に与えられ、試料チャン
バのＣａ２＋濃度の＞１ｍＭへの引上げおよび場合により続いての一時的な浸透
圧勾配の形成による補強（以下参照：Eray,Dogan et al., 1995 a.a.O.）によっ
て膜と融合された。アゴニストが欠如している場合に典型的なレセプター開放が
認められたが（図１３Ａ）、これはカルバモイルコリン（２０μＭ最終濃度）の
添加後短時間のうちに（ｔ＜１００sec）広範に消失した（図１３Ｂ、脱感作） 。
ｌ中にて開口を覆う膜が形成された後、アラメチシン（緩衝剤中の最終濃度０．
１μｇ／ｍｌ）が測定区画に与えられた（R. B. Gennis (1989), Biomembranes:
molecular structure and function, New York, Berlin, Heidelberg, Spring
er Verlag）。アラメチシンに典型的な電流変動（振幅および滞留時間）の発生 ―これは約６００ｐＳというアラメチシン孔の導電率に相当している―は本シス
テムの機能性と高度な感受性を証明している（図１２）。同じくレセプター蛋白
質たとえばｎＡＣｈＲも―たとえばＣａ２＋を介した―小さな小胞（small, med
ium and large unilammelare vesicles）との融合を経て膜中に取り込まれて測 定が可能である。このためｎＡＣｈＲは純化され、Schurholzにしたがって小胞 中で再構成された（Schurholz, T., J. Kehne et al., (1992), “Functional r
econstitution of the nicotinic acetylcholine receptor by CHAPS dialysis
depends on the concentrations of salt,lipid,and protein”, Biochemistry
31(21):5067-77; Schurholz,T. (1996), “Critical dependence of the solubi
lization of lipid vesicles by the detergent CHAPS on the lipid compositi
on. Functional reconstitution of the nicotinic acetylcholine receptor in
to preformed vesicles above the critical micellization concentraion", Bi
ophys Chem 58(1-2):87-96）。これらの小胞は測定区画に与えられ、試料チャン
バのＣａ２＋濃度の＞１ｍＭへの引上げおよび場合により続いての一時的な浸透
圧勾配の形成による補強（以下参照：Eray,Dogan et al., 1995 a.a.O.）によっ
て膜と融合された。アゴニストが欠如している場合に典型的なレセプター開放が
認められたが（図１３Ａ）、これはカルバモイルコリン（２０μＭ最終濃度）の
添加後短時間のうちに（ｔ＜１００sec）広範に消失した（図１３Ｂ、脱感作） 。
【００９４】 ＜細胞の結合＞ 小胞を生体細胞によって置換する場合にもこれらを、使用された小胞と同様に
、ポジショニングし、電気的に特性決定することが可能である。ただし細胞膜は
細胞骨格によって支持されていることから、細胞が自動的に破裂するには至らな
い。したがってこれにより、チップ表面に細胞が結合した後、セルアタッチド技
法（CAT, Hamill, Marty et al., a.a.O., 1981）に類似した構成が実現される 。この場合、雑音のない測定を実現するための前提条件はなかんずく膜表面が相
対的にスムーズであることである。したがってたとえば植物細胞を使用する場合
には必ず細胞壁が取り去られなければならない。
、ポジショニングし、電気的に特性決定することが可能である。ただし細胞膜は
細胞骨格によって支持されていることから、細胞が自動的に破裂するには至らな
い。したがってこれにより、チップ表面に細胞が結合した後、セルアタッチド技
法（CAT, Hamill, Marty et al., a.a.O., 1981）に類似した構成が実現される 。この場合、雑音のない測定を実現するための前提条件はなかんずく膜表面が相
対的にスムーズであることである。したがってたとえば植物細胞を使用する場合
には必ず細胞壁が取り去られなければならない。
【００９５】 ＣＡＴを出発点として、たとえば開口を覆う膜パッチの電気的破壊によって細
胞膜全体におよぶ電気的測定（Whole Cell Recording）を実施することができる
。孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたはニスタチンの添加と、したがって開
口を覆う膜パッチの透過孔形成は同じく全細胞測定にも使用することが可能であ
る（多孔パッチ技法）。
胞膜全体におよぶ電気的測定（Whole Cell Recording）を実施することができる
。孔形成剤たとえばアムホテリシンＢまたはニスタチンの添加と、したがって開
口を覆う膜パッチの透過孔形成は同じく全細胞測定にも使用することが可能であ
る（多孔パッチ技法）。
【００９６】 さらに、細胞溶解により、サイトゾル膜側が測定液に曝露されているいわゆる
ウィズィン−ウィズアウト−構成による個別チャネル事象の記録が可能である。
ウィズィン−ウィズアウト−構成による個別チャネル事象の記録が可能である。
【図１】 図１はＳｉ／ＳｉＯ２で製造されたキャリアチップの見取り図であり、縮尺な
らびに詳細は正確には表現されていない。
らびに詳細は正確には表現されていない。
【図２】 図２はＳｉＯ２層にエッチングされた開口をさまざまな側から撮影した電子顕
微鏡写真である：（Ａ）ＳｉＯ２表面側から撮影した開口（Ｂ）Ｓｉ側から撮影
した開口（Ｃ）ＳｉＯ２側の概観（Ｄ）異方性エッチングされたＳｉ側の概観
微鏡写真である：（Ａ）ＳｉＯ２表面側から撮影した開口（Ｂ）Ｓｉ側から撮影
した開口（Ｃ）ＳｉＯ２側の概観（Ｄ）異方性エッチングされたＳｉ側の概観
【図３】 図３は平行平面電極を備えた測定構成の断面図であり、縮尺ならびに詳細は正
確には表現されていない。
確には表現されていない。
【図４】 図４は点状電極または線状電極を備えた測定構成の断面図であり、縮尺ならび
に詳細は正確には表現されていない。
に詳細は正確には表現されていない。
【図５】 図５は２４時間浄化後のローダミン・マーキングされた小胞（膜はナチュラル
レッド、図上ではライトグレー）を示しており、この場合小胞（ｄ＜５μｍ）の
数は非浄化液に比較して大幅に減少した。小胞はカルボキシフルオレセイン（ナ
チュラルグリーン、図上ではミドルグレー）で蛍光マーキングされた２００ｍＭ
のソルビトール溶液を含んでいる。
レッド、図上ではライトグレー）を示しており、この場合小胞（ｄ＜５μｍ）の
数は非浄化液に比較して大幅に減少した。小胞はカルボキシフルオレセイン（ナ
チュラルグリーン、図上ではミドルグレー）で蛍光マーキングされた２００ｍＭ
のソルビトール溶液を含んでいる。
【図６】 図６は引き延ばされて非常にフラットな形成物とされた、ポリ−Ｌ−リシン・
コーティング表面に結合した後の小胞を示しており、これはカルボキシフルオレ
セイン蛍光を有していない。
コーティング表面に結合した後の小胞を示しており、これはカルボキシフルオレ
セイン蛍光を有していない。
【図７】 図７は融合された小胞の断面と５μｍの長さのキャリブレーションバーを示し
ている。
ている。
【図８】 図８は平行電極間の４μｍの開口を備えたチップ周囲の電界分布の有限要素シ
ミュレーション（ＦＥＭ）を示している。以下がパラメータとして使用された：
Ｃpuffer＝１０ ｍＭ ＫＣｌ、ｄApertur＝４μｍ、チップ開口（４）―電極 （６、９）の間隔＝１ｍｍ。等電位線の間隔は４ｍＶであり、電極間の電位差は
８０ｍＶである。このシミュレーションでは磁力線はキャリアチップ周辺部にお
ける漏れ電流の仮定によって楕円状に歪ませられている（正常：円形）。
ミュレーション（ＦＥＭ）を示している。以下がパラメータとして使用された：
Ｃpuffer＝１０ ｍＭ ＫＣｌ、ｄApertur＝４μｍ、チップ開口（４）―電極 （６、９）の間隔＝１ｍｍ。等電位線の間隔は４ｍＶであり、電極間の電位差は
８０ｍＶである。このシミュレーションでは磁力線はキャリアチップ周辺部にお
ける漏れ電流の仮定によって楕円状に歪ませられている（正常：円形）。
【図９Ａ】 図９Ａは、４μｍの開口（図９Ａ）および７μｍの開口（図９Ｂ）ならびに１
０ｍＭ ＫＣｌ、クランプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面（
ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗が非常に高い場合の小胞結
合と膜形成との時間カーブを示している。
０ｍＭ ＫＣｌ、クランプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面（
ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗が非常に高い場合の小胞結
合と膜形成との時間カーブを示している。
【図９Ｂ】 図９Ｂは、４μｍの開口（図９Ａ）および７μｍの開口（図９Ｂ）ならびに１
０ｍＭ ＫＣｌ、クランプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面（
ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗が非常に高い場合の小胞結
合と膜形成との時間カーブを示している。
０ｍＭ ＫＣｌ、クランプ電圧−８０ｍＶ、ＰＬＬコーティングＳｉＯ２表面（
ＰＬＬ＝ポリ−Ｌ−臭化リシン）にて電気シール抵抗が非常に高い場合の小胞結
合と膜形成との時間カーブを示している。
【図１０】 図１０はクランプ電圧ＶＣ＝−８０ｍＶ一定時の７μｍの開口を通る小胞の通
過を電流−時間−線図による変化として表わしている。
過を電流−時間−線図による変化として表わしている。
【図１１】 図１１は最終濃度４ｍＭを有したＣａ２＋の添加が無修飾の開口（７μｍ）に
小胞がドッキングした後にチップ表面と小胞膜との間の電気的に非常に密なシー
ルを結果することを電流−時間−線図で表わしている。
小胞がドッキングした後にチップ表面と小胞膜との間の電気的に非常に密なシー
ルを結果することを電流−時間−線図で表わしている。
【図１２】 図１２は負のポテンシャル時の、チップ上に作られた膜（ＣAlamethicin＝０ ．１μｇ／ｍｌ、８５ｍＭ ＫＣｌ）中のアラメチシン孔の時間・電圧依存開閉
を示している。
を示している。
【図１３】 図１３はｎＡＣｈＲ（ニコチン性アセチルコリン受容体）を含んだ小胞との融
合後のＳｉ／ＳｉＯ２キャリアチップ上に作られた膜の膜抵抗の変化を表わして
いる。 （Ａ）４００ｍＭ ＫＣｌおよび正のポテンシャルにてリガンドが欠けている
場合の偶然的なレセプター開放。 （Ｂ）ｎＡＣｈＲアゴニスト、カルバモイルコリン（最終濃度２０μＭ）の添
加１５０秒後にはもはやレセプター開放は観察されない（脱感作）。
合後のＳｉ／ＳｉＯ２キャリアチップ上に作られた膜の膜抵抗の変化を表わして
いる。 （Ａ）４００ｍＭ ＫＣｌおよび正のポテンシャルにてリガンドが欠けている
場合の偶然的なレセプター開放。 （Ｂ）ｎＡＣｈＲアゴニスト、カルバモイルコリン（最終濃度２０μＭ）の添
加１５０秒後にはもはやレセプター開放は観察されない（脱感作）。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月１日（２００１．６．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】 ただし作用物質スクリーニングと関連して伝統的なパッチクランプ技法は決定
的な短所も有している。パッチクランプ測定はきわめて時間がかかると共にこの
分野での長い経験を有した特別に訓練された要員を要し、しかもそれは実際には
ＨＴＳに使用することができない。 生体細胞膜の電気特性および誘電特性を測定する方法はＵＳ−Ａ−４ ０５５ ７９９より周知である。公開された前記装置は１つの容器であり、該容器は電位 差用の２つの測定電極、電圧／電流パルス送出用の２つの電極、容器を２つのチ ャンバに分割すると共に１個もしくは複数個の穴を有した１枚の隔壁、生理的溶 液用の接続口および電解液供給用の接続口を含んでいる。測定のため細胞は部分 的に隔壁の穴内に置かれ、その結果、穴を覆うフラットな膜は形成されない。Ｅ Ｐ−Ａ−０ ０９４ １９３とＷＯ−Ａ−８ ５０２ ２０１もキャリアの穴内への 細胞の固定を開示している。この場合の固定はキャリアの帯電によって行われる が、これは測定対象たる細胞または小胞の直径よりも小さな直径を有する前以っ て定められた点（開口）上への測定対象の必然的に正確なポジショニングを結果 するものではない。
的な短所も有している。パッチクランプ測定はきわめて時間がかかると共にこの
分野での長い経験を有した特別に訓練された要員を要し、しかもそれは実際には
ＨＴＳに使用することができない。 生体細胞膜の電気特性および誘電特性を測定する方法はＵＳ−Ａ−４ ０５５ ７９９より周知である。公開された前記装置は１つの容器であり、該容器は電位 差用の２つの測定電極、電圧／電流パルス送出用の２つの電極、容器を２つのチ ャンバに分割すると共に１個もしくは複数個の穴を有した１枚の隔壁、生理的溶 液用の接続口および電解液供給用の接続口を含んでいる。測定のため細胞は部分 的に隔壁の穴内に置かれ、その結果、穴を覆うフラットな膜は形成されない。Ｅ Ｐ−Ａ−０ ０９４ １９３とＷＯ−Ａ−８ ５０２ ２０１もキャリアの穴内への 細胞の固定を開示している。この場合の固定はキャリアの帯電によって行われる が、これは測定対象たる細胞または小胞の直径よりも小さな直径を有する前以っ て定められた点（開口）上への測定対象の必然的に正確なポジショニングを結果 するものではない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】 前記装置はキャリア１の片側または両側に、液体添加、液体貯蔵および場合に
より液体交換を可能にすると共にキャリアと電極との間に細胞、小胞、その他の
生体オルガネラまたはそれらの一部を添加することを可能とする手段を有してい
るのが好ましい。開口３はチップ上に電位差が存在する場合に電極６、９を介し
、開口に接近するにしたがって徐々に強くなり、開口近傍において小胞、細胞、
細胞片または生体オルガネラを電気泳動によって開口に向かって移動させること
のできる不均質な電界が開口の周囲に形成されるような直径を有している。さら
にその他に、キャリア１は生体膜を引き付ける帯電した表面５を有するかまたは
表面と細胞、小胞、膜片または生体オルガネラとの分子固有の結合もしくは多価
イオンを介した結合を可能にする表面５を有しているのが好ましい。こうしたキ
ャリアはたとえば酸化層またはオキシ窒化層でコーティングされたシリコンキャ
リアチップである。帯電した表面５は修飾、特にポリカチオンおよび／またはシ
ランたとえばアミノシランによる修飾によってもつくりだすことが可能であり、
あるいはキャリアを帯電した表面５でコーティング２することも可能である。キ
ャリア１はさらにその表面の修飾前にまたはその直接の利用前に酸素プラズマ中
で浄化され、部分的または全面的に親水化することができる。
より液体交換を可能にすると共にキャリアと電極との間に細胞、小胞、その他の
生体オルガネラまたはそれらの一部を添加することを可能とする手段を有してい
るのが好ましい。開口３はチップ上に電位差が存在する場合に電極６、９を介し
、開口に接近するにしたがって徐々に強くなり、開口近傍において小胞、細胞、
細胞片または生体オルガネラを電気泳動によって開口に向かって移動させること
のできる不均質な電界が開口の周囲に形成されるような直径を有している。さら
にその他に、キャリア１は生体膜を引き付ける帯電した表面５を有するかまたは
表面と細胞、小胞、膜片または生体オルガネラとの分子固有の結合もしくは多価
イオンを介した結合を可能にする表面５を有しているのが好ましい。こうしたキ
ャリアはたとえば酸化層またはオキシ窒化層でコーティングされたシリコンキャ
リアチップである。帯電した表面５は修飾、特にポリカチオンおよび／またはシ
ランたとえばアミノシランによる修飾によってもつくりだすことが可能であり、
あるいはキャリアを帯電した表面５でコーティング２することも可能である。キ
ャリア１はさらにその表面の修飾前にまたはその直接の利用前に酸素プラズマ中
で浄化され、部分的または全面的に親水化することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シュミット、クリスチアン スイス国、シーエイチ − 1024 エキュ ブレン、シュマン・ドゥ・ラ・コカルド 11 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB15 BB16 BB45 BB60 CB01 CB30 DA36 DA80 FA11 FA16 FA34 FB05 FB06 FB11 FB12 FB15 FB20 GC12 GC16 GC19 GC30 HA09 JA01 JA20 4B029 AA07 AA23 AA27 BB01 BB15 BB20 CC01 FA15
Claims (30)
- 【請求項１】 少なくとも２つの電極（６、９）と、液体の収容に適した分
離した区画とを有する測定装置において、それぞれ少なくとも１つの区画内に達
するかまたは１つの区画に接するかする任意の形状の対向した２つの電極（６、
９）の間に１つのキャリア（１）が存在し、該キャリアは少なくとも１個の開口
（３）を有し且つそれぞれ少なくとも２つの区画を互いに切離していることを特
徴とする測定装置。 - 【請求項２】 前記キャリアは片側または両側に、液体添加および／または
液体貯蔵および／または液体交換および／またはキャリアと電極との間に細胞、
小胞、その他の生体オルガネラまたはそれらの一部を添加することを可能にする
手段を有することを特徴とする請求項１に記載の測定装置。 - 【請求項３】 開口（３）は前記チップ上に電位差が存在する場合に電極（
６、９）を介し、開口に接近するにしたがって徐々に強くなり、開口近傍におい
て小胞、細胞、細胞片または生体オルガネラを電気泳動によって開口上に移動さ
せることのできる不均質な電界が該開口周囲に形成されるような直径を有するこ
とを特徴とする請求項１または２に記載の測定装置。 - 【請求項４】 キャリア（１）は生体膜を引き付ける帯電した表面（５）を
有するかまたは表面と細胞、小胞、膜片または生体オルガネラとの分子固有の結
合もしくは多価イオンを介した結合を可能にする表面（５）を有することを特徴
する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の装置。 - 【請求項５】 前記キャリアは酸化層またはオキシ窒化層でコーティングさ
れたシリコンキャリアチップであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれ
か１項に記載の測定装置。 - 【請求項６】 帯電した表面（５）は修飾、特にポリカチオンおよび／また
はシランたとえばアミノシランによる修飾によってつくりだされたことを特徴と
する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項７】 前記キャリアは帯電した表面（５）を生ずるコーティング層
（２）を有することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の測定
装置。 - 【請求項８】 キャリア（１）はその表面の修飾前にまたはその直接の利用
前に酸素プラズマ中で浄化され、部分的または全面的に親水化されたことを特徴
とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項９】 それぞれ１つの電極とキャリア（１）に設けられた少なくと
も１個の開口（３）とはスペーサ（７，１０）に設けられた通路またはチャンバ
（８）を経て、開いたもしくは閉じた区画を形成しつつ互いに連結されているこ
とを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項１０】 前記区画は物理的境界を有していないことを特徴とする請
求項１ないし９のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項１１】 ３つ以上の電極（６、９）と２個以上の開口（３）とを設
け、少なくとも１つの電極たとえば基準電極が２個以上の開口（３）を介した測
定に使用されることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の測
定装置。 - 【請求項１２】 キャリア（１）は２個以上の開口（３）と開口（３）の倍
の数の電極（６、９）とを有し、それぞれ１個の開口がそれぞれ２つの電極の間
に配置されることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の測定
装置。 - 【請求項１３】 前記区画はチューブを経てポンプシステムまたは、静水圧
ベースまたはピエゾドロップ方式ないしインキジェット方式またはコンタクトト
ランスファー方式または電気浸透方式または温度制御方式で作動する器具と連結
され、液体ないし試料を任意の区画に添加しもしくは同所で交換できるように構
成したことを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項１４】 試料の分離、特に毛管電気泳動（ＣＥ）およびＨＰＬＣを
行なう装置と連結され、分離された物質の分析に利用されることを特徴とする請
求項１ないし１３のいずれか１項に記載の測定装置。 - 【請求項１５】 区画内液位を連続的もしくは定期的にチェックするための
手段ならびに前以って適宜調整された注入パラメータを再調整するための手段を
装備していることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の測定
装置。 - 【請求項１６】 キャリア（１）の表面（５）は親水性領域と疎水性領域と
が生ずるように構造化され、親水性領域は好ましくは前記開口周囲に形成される
ように構成したことを特徴とする請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の測
定装置。 - 【請求項１７】 請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の測定装置によ
って細胞または小胞をポジショニングする方法において、細胞ないし小胞または
その他の生体オルガネラは隔壁ないし前記キャリアチップと前記電極との間にあ
って前以って緩衝剤で満たされたもしくは満たされていない空隙に与えられ、２
つの前記電極の間に電位差特に−２００ｍＶ〜＋２００ｍＶの範囲内の電位差が
存在し、該電位差によって電界が形成され、該電界の影響下で前記開口に向かう
小胞または細胞の指向的運動が生ずることを特徴とする方法。 - 【請求項１８】 前記電極は区画液中にまで達する球状もしくは任意の形状
の空間域内で前記開口の周囲に電界強度＞１００Ｖ／ｍが生ずるような間隔で互
いに配置され、前記区画ならびに前記開口も同様にして緩衝剤ないし液で満たさ
れることを特徴とする請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 天然のまたは人工の脂質膜、小胞、細胞または生体オルガ
ネラの電気分析法において、前記の膜は請求項１７または１８に記載の方法に基
づいてポジショニングされて開口（３）上でキャリア（１）の表面（５）と電気
的に密に結合し、すぐれた信号雑音比による膜抵抗の記録を可能にすることを特
徴とする方法。 - 【請求項２０】 天然のまたは人工の脂質膜、小胞、細胞または生体オルガ
ネラに関する相互作用の電気的測定法において、前記の膜は請求項１７または１
８に記載の方法に基づいて作製され、測定液または基準液または双方の液が別の
液と交換され、あるいは分析される物質が測定側および／または基準側の液に加
えられることを特徴とする方法。 - 【請求項２１】 孔形成剤が一方のまたは双方の区画に添加されて前記の膜
の導電率ないし特定のイオンに対する膜の透過性が高められることを特徴とする
請求項１９または２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 少なくとも１つの区画に任意のサイズのプロテリオリポソ
ームが与えられて開口（３）上の膜と融合させられ、これによって膜中に含まれ
ている任意の膜蛋白質の電気的測定または光学的測定を可能とすることを特徴と
する請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２３】 膜蛋白質は開口（３）を覆う膜が構成された後にその中に
組み込まれることを特徴とする請求項１９ないし２２のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２４】 開口（３）を覆う膜を光学的、特に蛍光測定に利用し得る
ようにして膜の当該測定を実施することを特徴とする請求項１９ないし２３のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２５】 １つのキャリアに複数の開口（３）を備えた測定装置また
は測定システムが利用され、測定は少なくとも２個の開口（３）を介して逐次お
よび／または平行して行われることを特徴とする請求項１９ないし２４のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項２６】 キャリア（１）の一方の側のすべての電極は一つの共通の
電位を有するかもしくはそれらが単一の電極にまとめられることを特徴とする請
求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 少なくとも１個の開口を種々の膜パラメータの測定に使用
することが可能であって、チューブを介して任意の区画と連結されているポンプ
システムによるかまたは静水圧をベースとした方式またはピエゾドロップ方式な
いしインキジェット方式またはコンタクトトランスファー方式または電気浸透方
式または温度制御方式によって液体ないし試料が任意の区画に添加されまたは交
換されることを特徴とする請求項１９ないし２６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２８】 試料分離プロセス、特に毛管電気泳動（ＣＥ）およびＨＰ
ＬＣと直接に連結されて実施され、分離された物質の分析に利用されることを特
徴とする請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２９】 区画内液位が連続的または定期的にチェックされ、前以っ
て適宜調整された注入パラメータが再調整されることを特徴とする請求項１９な
いし２８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３０】 キャリア（１）の表面（５）は親水性領域と疎水性領域と
が生ずるように構造化され、親水性領域は好ましくは前記開口周囲に形成される
ことを特徴とする請求項１９ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CH290397 | 1997-12-17 | ||
| CH2903/97 | 1997-12-17 | ||
| PCT/IB1998/001150 WO1999031503A1 (de) | 1997-12-17 | 1998-07-28 | Positionierung und elektrophysiologische charakterisierung einzelner zellen und rekonstituierter membransysteme auf mikrostrukturierten trägern |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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