JP7433300B2 - 酵素活性の直接電気測定用のデバイス、システムおよび方法 - Google Patents

酵素活性の直接電気測定用のデバイス、システムおよび方法 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
〔連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載〕
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＨＧ００９１８０に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
〔背景技術〕
天然タンパク質の機能の基礎となる運動の電気的読み出しは、標識化なしで多くの新しいタイプの分析測定を可能にし得る。例えば、酵素の機能的変動をモニターすることは、薬物分子候補のスクリーニングの迅速で簡便な方法を提供する。バイオポリマーを処理するタンパク質の変動をモニターすることは、それらの組成物およびコンフォメーションに関する情報を明らかにするのであろう。
酵素機能の電気的読み出しはChoiら（Choi, Moody et al. 2012）によって実証された。Choiらは、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタに誘起されたテレグラフノイズが、基質であるペプチドグリカンに作用するときの酵素リゾチームの機能的運動を反映していることを示した。このように、ＤＮＡポリメラーゼなどのプレセッシブ酵素（precessive enzyme）の変動をモニターすることで、ＤＮＡ配列を決定する方法が得られる可能性があることが分かった。一つの例が、議論の余地のある論文で与えられた。Huangのグループは、ヌクレオチドが伸長鎖に組み込まれるときにポリメラーゼにおける電気的変動を測定し、伸長しているテンプレートの配列を高精度で伝えるシグナルを測定することを報告した（Chen, Lee et al. 2013）。その後、この論文は撤回された（Nature Nanotechnology 8, 452-458 (2013)；２０１３年５月５日にオンラインで公開され；２０１３年７月１１日および２０１３年８月２８日に印刷後の修正がなされ；２０１５年６月３日に印刷後の撤回がなされた）。しかしながら、タンパク質の構造的変動が電気的読み出しによってモニターされ得る場合にシグナル検出が可能であり得ることを示す。より重要なことは、上記論文での提案の実用的な実現は、ポリメラーゼが繋がれたカーボンナノチューブ電界効果トランジスタを使用したCollinsのグループによってほぼ同時に実証された（Olsen, Choi et al. 2013）。シグナルは、ヌクレオチドが組み込まれたときにポリメラーゼの開閉に関連することが示されたテレグラフノイズから構成された。重要なことは、ノイズの特性は組み込まれている特定のヌクレオチドを反映し、ＤＮＡ配列の電気的な単一分子の読み出しへの道を開いた。
Olsen, Choi et al. 2013において、タンパク質の変動は生成する電界変動を介して間接的に検出され、電界変動はポリメラーゼまたはリゾチームに近接した電界効果トランジスタチャネルによって感知された。図１はChoiらの提案を示す。溶液３中のヌクレオチド三リン酸塩の存在下において、プライムＤＮＡテンプレート（primed DNA template）２と結合したポリメラーゼ１が抗体４によって、電界効果トランジスタのソース６とドレイン７との間のギャップにわたる金ビーズ５に結合し、電界効果トランジスタのチャネル８はゲート電極９の上に形成される。最初の報告の撤回を考慮すると、その発明が実際に機能したかは明らかではないが、コリンズのグループによる成功した発明の要素の多くを含んでいる。この発明は図２Ａに示されている。電界効果トランジスタのソース２１およびドレイン２２が、トランジスタのチャネルを形成するカーボンナノチューブ２３によって連結されている。このカーボンナノチューブには酵素（ここではリゾチーム）２４が付着している。半導体バックゲート２５を使用して、トランジスタをその最も感受性がある動作点に設定し、ターンオンとターンオフの中間にし、ＦＥＴ電流のゆらぎを介して酵素活性を検出する。後の論文において同じグループがカーボンナノチューブチャネル２３に付着し、プライムＤＮＡテンプレート２７によって結合されたポリメラーゼ２６がノイズスパイクをどのように生成したかを示し、ノイズスパイクの各々はポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みに関連していたかを示した（図２Ｂ）。得られたシグナル列の２つの例を図２Ｃに示す（ポリ（ｄＡ）２８およびポリ（ｄＣ）２９）。ＣＮＴ ＦＥＴからのノイズバックグラウンド３０がシグナルレベル３１と比較して有意であるが、シグナルにおける明確な違いによって配列決定が可能であることを示している。MerrimanおよびMolaによって、かなり類似した方法が提案されている（Merriman and Mola, 2016）。この提案を図２Ｃに示す。ポリメラーゼ４３６は、リンカー４３７を介して、電界効果トランジスタのソース４３８およびドレイン４３９に連結される分子ワイヤ４３３に化学的に連結される。分子ワイヤの下には、ゲート電極４４０が配置されている。これらの特許出願に提示されたデータは、Olsenらのデバイスで得られたものよりもさらに低いシグナルレベルを示すように思われる。
明らかに、試験中の酵素へのより直接的な電気的連結を行うことが望ましいであろう。本発明者らは認識トンネリング（recognition tunneling）と呼ばれる技術を開発し、認識分子を使用して、近接して配置された一対の電極のうちの少なくとも１つにタンパク質を結合させた（Zhang, Song et al. 2017）。このアプローチを図３に示す。このデバイスは、薄い誘電体層４３によって離れている第１の電極４１と第２の電極４２とからなる。認識分子４４は例えば、チオール－金属結合によって各電極に強く付着している。分子は、標的タンパク質４５によって特異的に認識されて結合されるように選択される。これらの認識事象は一般に可逆的であるので、タンパク質の機能の研究のためにギャップ中に目的のタンパク質を保持するのに不適切である。したがって、本発明者らの以前の認識トンネリング技術は、未知のタンパク質の到達を検出するために測定デバイスを使用するのではなく、測定デバイスに連結された既知のタンパク質を保持する必要があるので、本発明の問題に適用できず、当該問題に不適切である。さらに限定的には、バイアス自体が電流（４７）のテレグラフノイズ変動が発生するモードにタンパク質を駆動するように、これらのデバイスが十分に高バイアス（Ｖｔ、４６）で操作される必要がある。タンパク質がインテグリンであり、認識分子がＲＧＤペプチドであったこの公開された作業の場合、タンパク質結合は比較的高いバイアス（＞１００ｍＶ）でデバイスを操作し、印加されたバイアスによって誘導される変動を観察することによって検出される。タンパク質結合の検出器としての電圧誘起変動の使用はタンパク質の重要な生体分子機能を可能にするタンパク質の構造およびコンフォメーションの変動を測定するためのこのデバイスの使用を完全に排除する。なぜなら、機能的運動にかかわらず、十分に高い電位差に曝露されたすべてのタンパク質において、これらの電圧誘起変動が生じるからである。よって、上述した技術では、これらの重要な機能的運動からのシグナルが電圧誘起変動と区別することができない。したがって、電圧誘導コンダクタンス変動を排除し、重要で測定可能な機能的変動を生成する化学的刺激に曝露されている間にタンパク質を適所に保持する条件下で、一対の電極にわたるタンパク質分子の結合を検出し、候補薬物またはバイオポリマーなどの他の化学物質に対するそれらの変動の応答を測定するためのシステムおよび方法を見出すことが望ましい。
本セクションにおける任意の参考文献の引用は、これらの参考文献が本開示の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。
〔要約〕
本開示は、タンパク質活性の直接電気測定（direct electrical measurement）用のデバイス、システムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、デバイスが提供される。当該デバイスは、第１の電極および第２の電極を含み、第１の電極および第２の電極はギャップによって離れている。当該デバイスは、一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。第１の電極および第２の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
いくつかの実施形態において、タンパク質は一方の電極に付着している。他の実施形態において、タンパク質は２つの電極に付着している。
いくつかの実施形態において、デバイスはさらに、ギャップ内に配置された絶縁性誘電体層を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼ、および、エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、タンパク質は一方の電極に付着している。他の実施形態において、タンパク質は両方の電極に付着している。
いくつかの実施形態において、タンパク質はリンカーを介して電極に付着している。
いくつかの実施形態において、デバイスは第１の電極および第２の電極を含む。第１の電極および第２の電極はギャップによって離れている。デバイスは一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。タンパク質が化学物質と相互作用するとき、電流変動が生成する。
いくつかの実施形態において、デバイスが提供される。当該デバイスは、（ａ）誘電体基材；（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；（ｃ）第１の電極上に配置された絶縁性誘電体層；（ｄ）絶縁性誘電体層上に配置された第２の電極；（ｅ）第２の電極上に配置されたパッシベーション層；（ｆ）一方または両方の電極に付着したタンパク質；を含む。第１の電極、絶縁性誘電体層、第２の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、第１の電極および第２の電極を含む。第１および第２の電極はギャップによって離れている。デバイスは一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。第１の電極および第２の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、第１の電極および第２の電極を含む。第１の電極および第２の電極は同一平面上にあり、ギャップによって離れている。デバイスは一方または両方の電極に付着したタンパク質を含む。第１の電極および第２の電極は分析対象試料と接触するように構成される。
いくつかの実施形態において、デバイスは、ギャップ内に配置された絶縁性誘電体層をさらに含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質は一方の電極に付着している。本実施形態のいくつかの態様において、タンパク質はポリメラーゼである。本実施形態のいくつかの態様において、ポリメラーゼはリンカーを介して電極に付着している。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼであり、ストレプトアビジンを介して電極に付着している。
デバイスのいくつかの実施形態において、第１の電極および／または第２の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約２０．０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約１０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約２．０ｎｍ～約１０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約７．５ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約４．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約５．０ｎｍ～約６．０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、デバイスは単一の分子を検出するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、システムが提供される。当該システムは、本明細書に記載のデバイスと、タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段と、重要である第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加する手段と、化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動をモニターする手段とを含む。
いくつかの実施形態において、バイアスは１ｍＶ～５０ｍＶである。
いくつかの実施形態において、バイアスが１ｍＶ～１００ｍＶである。
いくつかの実施形態において、方法が提供される。当該方法は、（ａ）本明細書に記載のシステムを提供する工程と、（ｂ）タンパク質を化学物質と接触させる工程と、（ｃ）電極間の電流の自然変動が生じないように、重要である第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加する工程と、（ｄ）化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動を検出する工程と、を含む。
本開示の方法は、単一のタンパク質分子の活性を検出するために使用され得る。当該方法はまた、バイオポリマーの配列を決定するために使用され得る。当該方法はまた、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。有利には、当該方法は標識または特殊な化学作用を必要としない。
バイオポリマーの配列を決定する方法は長い読み取り（＞１０ｋＢ）を提供し、ポリメラーゼは天然ポリメラーゼの速度（１００ｎｔ／ｓ）で処理する。
本開示のデバイスは簡易なデバイス形状を有する。このことによって、容易なスケールアップを可能にする。
本開示は、単一のプロセッシブタンパク質（processive protein）についての直接電気測定によってバイオポリマーの配列を決定するアレイ、システム、および方法に関する。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載の複数のデバイスの配置を含む、バイオポリマーの配列を決定するアレイを提供する。本実施形態の一態様において、アレイはＤＮＡの配列を決定する。
本開示は、タンパク質活性の直接測定用のシステムを提供する。当該システムは、（ａ）本明細書に記載のアレイ、（ｂ）任意に、溶液をアレイに導入し除去する手段、（ｃ）第１の電極および第２の電極間にバイアスを印加する手段、（ｄ）第１の電極および第２の電極間に生成される電流をモニターする手段を含む。本実施形態の一態様において、本システムは、ポリメラーゼ活性の直接測定用である。
本開示はまた、バイオポリマーの配列を決定する方法を提供する。一実施形態において、当該方法はＤＮＡの配列を決定する方法である。この方法は（ａ）ＤＮＡテンプレートを含む溶液を本明細書に記載のシステムに導入する工程；（ｂ）本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第１の電流を測定する工程；（ｂ）ＤＮＡテンプレートに相補的なｄＮＴＰの組み込みを可能にする条件下において、ｄＮＴＰを含む溶液をシステムに導入する工程；（ｃ）工程（ｂ）において生成する第２の電流を測定する工程；（ｄ）組み込まれていないｄＮＴＰを含む溶液を除去する工程；（ｅ）工程（ｂ）において使用されなかった残りの３つの種類のｄＮＴＰの各々を用いて工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返す工程；（ｆ）工程（ｂ）～（ｅ）を繰り返す工程；を含む。この方法において、生成した電流シグナルからＤＮＡの配列が決定される。
別の実施形態において、本方法は、（ａ）ＤＮＡテンプレートを含む溶液を本明細書に記載のシステムに導入する工程；（ｂ）本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第１の電流を測定する工程；（ｂ）ＤＮＡテンプレートに相補的なｄＮＴＰの組み込みを可能にする条件下において、少なくとも２種類のｄＮＴＰを含む溶液をシステムに導入する工程であって、各種類のｄＮＴＰが異なる濃度において溶液に存在している、工程；（ｃ）工程（ｂ）において生成する第２の電流を測定する工程；（ｄ）組み込まれていないｄＮＴＰを含む溶液を除去する工程；（ｅ）工程（ｂ）において使用されなかった残りの種類のｄＮＴＰを用いて工程（ｂ）～（ｄ）を繰り返す工程；（ｆ）工程（ｂ）～（ｅ）を繰り返す工程；を含む。この方法において、生成した電流シグナルからＤＮＡの配列が決定される。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Chenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。
図２ＡはChoiらによる、公知のリソチーム変動用の検出システムを示す。図２ＢはOlsenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。図２ＣはOlsonらによる、ヌクレオチド配列依存性データを示す。図２Ｄは、MerrimanおよびMolaによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。
図３は、公知のタンパク質検出用デバイスを示す。
図４は、本開示の実施形態の概略図を示す。
図５Ａは、図４に示すように、タンパク質が２点で結合しているときに得られる直線電流電圧特性を示す。図５Ｂは、多数の単一分子測定の直線領域の勾配の分布を示す。
図６は、タンパク質変動を表すシグナルを示す。
図７は、タンパク質がポリメラーゼである、本開示の実施形態の概略図を示す。
図８Ａは、ポリメラーゼ活性を測定するために使用される蛍光活性アッセイの原理を示す。ポリメラーゼ活性が存在しない限り、ＦＡＭ（Ｆ）蛍光は消光する。図８Ｂは、野生型酵素、エキソヌクレアーゼを含まない酵素（Ｄ１２Ａ、Ｅ１４Ａ）または、ストレプトアビジンに結合したエキソヌクレアーゼを含まない酵素と６０分間インキュベート後の基板上のＦＡＭの蛍光強度を示す。
図９は、チオール化ストレプトアビジン（左）およびビオチン化ｐｈｉ２９ポリメラーゼの付着後（右）について測定したコンダクタンスの分布を示す。ストレプトアビジン測定を２．５ｎｍのギャップで行い、ストレプトアビジン＋ｐｈｉ２９の測定を３．５ｎｍのギャップで行った。
図１０は、コンフォメーションによるコンダクタンス変化を示す。左のパネルはチオ－ストレプトアビジンについてであり、右のパネルはビオチンを添加した後の分子の同じフィルムから得られたデータである。コンダクタンス変化は、ビオチン結合によって誘導されるコンフォメーション変化に感受性であることを示す。
図１１は、ＳＴＭギャップ（左）および固体チップ（右）におけるタンパク質変動の高コントラスト、高時間分解能記録を示す。試料は、電極上にＤＮＰを有する抗ＤＮＰ ＩｇＥである。デバイスは４．６ｎｍのギャップで２００ｍＶにて操作した。
図１２は、一定のギャップで収集された電流（各パネルの左下にマークされている）およびｐｈｉ２９－ストレプトアビジン複合体における５０ｍＮバイアスが、テンプレートＤＮＡおよびｄＮＴＰの非存在下での接触変動（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ならびに、テンプレートＤＮＡおよびｄＮＴＰが添加されるときに見られる追加のテレグラフノイズ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を示す。右の挿入図は、２０～４０秒の持続時間のフル走行を示す。赤い円は、左図のトレースにおいて拡大された高電流点を示す。
図１３は約４．５ｎｍのギャップでＰｄ電極上のペプチドリガンド（表１に列挙されている）に結合した３つの抗体およびインテグリンについて測定したコンダクタンス（対数スケール）の分布を示す。約２．５ｎｍのギャップでデータが取得された、チオール結合によって電極に結合したストレプトアビジンについてのデータは除く。分布を明確にするために、垂直方向に任意に分布を移動させている。挿入図は、電極に付着するペプチドの２つの結合部位を有する抗体がどのようにしてギャップを埋めることができるかを示している。その結果、第２の高いコンダクタンスのピーク（「２」と表示）が生じた。単一の連結も起こり得る（「１」）。これらのデータは、２つの化学的連結がタンパク質と電極との間で発生する場合（各電極に対して１つ）、長い距離（抗体の結合部位間の１３ｎｍ）にわたって、どれほど高いコンダクタンス（約２ｎＳ）を得ることができるかを示す。
図１４は、マークを付したように、異なるギャップサイズで採取したストレプトアビジン（左）およびストレプトアビジン－ポリメラーゼ複合体（右）のコンダクタンス分布のギャップ距離依存性を示す。コンダクタンス分布はギャップサイズによってほとんど変化せず、これらのタンパク質における伝導は非局在化輸送メカニズムによることを示した。挿入図はタンパク質の高さの推定値を示しており、ストレプトアビジンの高さは約４ｎｍであり、ストレプトアビジンと結合したｐｈｉ２９の複合体の高さは約９ｎｍである。シグナルは５．５ｎｍほどの大きなギャップから得られる。このことは、プローブがこれらのデータセットにおいてポリメラーゼ内部とほぼ確実に接触しているが、伝導経路が部分的にはｐｈｉ２９を通っているに違いないことを示す。
図１５は、５ｎｍ離れた、ポリメラーゼ上の２つのビオチン化部位を介するポリメラーゼの、電極上の２つのストレプトアビジン分子への結合を示す。ストレプトアビジン分子は、チオール部分を介して電極に結合する。
図１６は、ＤＮＡテンプレートと結合したポリメラーゼ分子のアレイを示し、各ポリメラーゼは個々に整列された電極対に連結している。
図１７は、各部位における各テンプレート分子の配列を決定するための、ヌクレオチド三リン酸への配列の曝露およびすすぎを示す。
図１８は、同一の塩基を含む部位における２つの同一のヌクレオチドの連続的な取り込みに特徴的な２つのテレグラフノイズのバーストを示す。
〔詳細な説明〕
本開示は、少なくとも以下の（１）～（４３）を含む。
（１）実質的に図示および記載される、デバイス。
（２）図示および記載される、タンパク質活性の直接電気測定用システム。
（３）図示および記載される、タンパク質活性を検出する方法。
（４）図示および記載される、バイオポリマーの配列を決定する方法。
（５）タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、第１の電極および第２の電極と、一方または両方の電極に付着したタンパク質と、を含み、第１の電極および第２の電極はギャップによって離れており、第１の電極および第２の電極には、それらを通過する開口が形成されている、デバイス。
（６）ギャップの幅が約１．０ｎｍ～約２０．０ｎｍである、上記（５）のデバイス。
（７）タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
（ａ）誘電体基材；
（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；
（ｃ）第１の電極上に配置された絶縁性誘電体層；
（ｄ）絶縁性誘電体層上に配置された第２の電極；
（ｅ）第２の電極上に配置されたパッシベーション層；
（ｆ）一方または両方の電極に付着したタンパク質；を含み、
第１の電極、絶縁性誘電体層、第２の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、デバイス。
（８）タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
（ａ）同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第１の電極および第２の電極；
（ｂ）少なくとも一方の電極に付着したタンパク質；を含み、
第１の電極および第２の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、デバイス。
（９）タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、上記（５）～（８）のいずれかのデバイス。
（１０）タンパク質がポリメラーゼである、上記（９）のデバイス。
（１１）ポリメラーゼが一方の電極に付着している、上記（１０）のデバイス。
（１２）ポリメラーゼがリンカーを介して電極に結合している、上記（１０）または（１１）のデバイス。
（１３）タンパク質がビオチン化ポリメラーゼである、上記（１０）～（１２）のいずれかのデバイス。
（１４）ビオチン化ポリメラーゼが、チオ－ストレプトアビジンリンカーを介して電極に結合している、上記（１３）のデバイス。
（１５）第１の電極および／または第２の電極が、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む、上記（５）～（１４）のいずれかのデバイス。
（１６）第１の電極および／または第２の電極がパラジウムを含む、上記（１５）のデバイス。
（１７）タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
（ａ）誘電体基材；
（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；
（ｃ）誘電体基材上に配置された第２の電極であって、第１の電極および第２の電極は１ｎｍ～１０ｎｍのギャップによって離れている、第２の電極；
（ｄ）電極の上に配置されたパッシベーション層；
（ｅ）一方または両方の電極に付着したタンパク質；を含み、
第１の電極と第２の電極との間のギャップに試料が移動できる位置に、パッシベーション層を通過する開口が形成されている、デバイス。
（１８）タンパク質活性の直接電気測定用システムであって、
（ａ）上記（５）～（７）のいずれかのデバイス；
（ｂ）タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段；
（ｃ）第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加する手段；
（ｄ）化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる変動をモニターする手段；を含む、システム。
（１９）タンパク質がポリメラーゼである、上記（１８）のシステム。
（２０）タンパク質がエキソヌクレアーゼ、プロテアソーム、またはグリカンである、上記（１８）のシステム。
（２１）タンパク質がキナーゼである、上記（１８）のシステム。
（２２）単一のタンパク質分子の活性を検出する方法であって、
（ａ）上記（１８）のシステムとタンパク質分子を相互作用させることができる化学物質を導入する工程；
（ｂ）２つの電極間に定常ＤＣ電流が観察されるように選択されたバイアスを印加する工程；
（ｃ）化学物質がタンパク質と相互作用するときに生じる２つの電極間の電流の変動を観察する工程；を含む、方法。
（２３）タンパク質が、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、上記（２２）の方法。
（２４）化学物質が、ヌクレオチド三リン酸、核酸、ペプチド、グリカンおよびキナーゼからなる群から選択される、上記（２２）または（２３）の方法。
（２５）ＤＮＡの配列を決定する方法であって、
（ａ）プライムＤＮＡテンプレートを上記（１８）のシステムに導入する工程；
（ｂ）４つのｄＮＴＰを含む溶液を導入する工程；
（ｃ）２つの電極間に定常ＤＣ電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程；
（ｄ）新しいヌクレオチドそれぞれがプライマーに組み込まれたときに生じる２つの電極間の電流の変動を検出する工程；
（ｅ）組み込まれている各ヌクレオチドのアイデンティティ（identity）を決定する工程；を含む方法。
（２６）溶液が、互いにおおよそ同じ濃度である４つのｄＮＴＰを含む、上記（２５）の方法。
（２７）ｄＮＴＰの濃度がテンプレートに結合するポリメラーゼの飽和濃度とおおよそ同じ濃度以上である、上記（２５）または（２６）の方法。
（２８）工程（ｄ）が、１つ以上の電流スパイクの存在を検出する工程を含む、上記（２５）～（２７）のいずれかの方法。
（２９）工程（ｅ）が、各スパイクの特性を使用する工程を含む、上記（２５）～（２７）のいずれかの方法。
（３０）バイオポリマーの配列を決定する方法であって、
（ａ）上記（１８）のシステムにバイオポリマーを導入する工程；
（ｂ）２つの電極間に定常ＤＣ電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程；
（ｃ）モノマーがバイオポリマーの末端から除去されるときに生じる２つの電極間の電流の変動を検出する工程；
（ｄ）バイオポリマーから除去された各モノマーのアイデンティティを決定する工程；を含む、方法。
（３１）バイオポリマーが、ＤＮＡ、ペプチド、またはグリカンである、上記（３０）の方法。
（３２）キナーゼの活性を検出する方法であって、
（ａ）キナーゼ阻害剤候補を上記（２０）のシステムに導入する工程；
（ｂ）２つの電極間に定常ＤＣ電流が観測されるように選択されたバイアスを印加する工程；
（ｃ）キナーゼがキナーゼ阻害剤候補分子と相互作用するときに生じる２つの電極間の電流の変動を検出する工程；
（ｄ）キナーゼ阻害剤候補分子の存在下でキナーゼが活性を有するか否かを決定する工程；を含む、方法。
（３３）本明細書に記載される、バイオポリマーの配列を決定するアレイ。
（３４）本明細書に記載される、ＤＮＡの配列を決定するアレイ。
（３５）ＤＮＡの配列を決定するアレイであって、
（ａ）誘電体基材；
（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；
（ｃ）第１の電極上に配置された絶縁性誘電体層；
（ｄ）絶縁性誘電体層上に配置された第２の電極；
（ｅ）第２の電極上に配置されたパッシベーション層；
（ｆ）第１の電極および第２の電極に付着したポリメラーゼ分子；を含み、
第１の電極、絶縁性誘電体層、第２の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている、アレイ。
（３６）ＤＮＡの配列を決定するアレイであって、複数のデバイスの配置を含み、
デバイスは、
（ａ）誘電体基材；
（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；
（ｃ）誘電体基材上に配置された第２の電極；
（ｄ）電極の上に配置されたパッシベーション層；
（ｅ）一方または両方の電極に付着したポリメラーゼ分子；を含み、
パッシベーション層を通過する開口が形成されている、アレイ。
（３７）ＤＮＡの配列を決定するアレイであって、複数のデバイスの配置を含み、
デバイスは、
（ａ）同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第１の電極および第２の電極；
（ｂ）少なくとも一方の電極に付着したポリメラーゼ；を含み、
第１の電極および第２の電極は分析対象試料と接触するように構成されている、アレイ。
（３８）配置が格子状である、上記（３３）～（３７）のいずれかのアレイ。
（３９）ポリメラーゼ活性の直接測定用システムであって、
（ａ）本明細書に記載のアレイ；
（ｂ）任意に、溶液をアレイに導入し除去する手段；
（ｃ）第１の電極および第２の電極間にバイアスを印加する手段；
（ｄ）第１の電極および第２の電極間に生成される電流をモニターする手段；を含む、アレイ。
（４０）ＤＮＡの配列を決定する方法であって、
（ａ）本明細書に記載のシステムにＤＮＡテンプレートを含む溶液を導入する工程；
（ｂ）本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第１の電流を測定する工程；
（ｃ）ＤＮＡテンプレートに相補的なｄＮＴＰの組み込みを可能にする条件下において、ｄＮＴＰを含む溶液をシステムに導入する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において生成する第２の電流を測定する工程；
（ｅ）組み込まれていないｄＮＴＰを含む溶液を除去する工程；
（ｆ）工程（ｃ）において使用されなかった残りの３つの種類のｄＮＴＰの各々を用いて工程（ｃ）～（ｅ）を繰り返す工程；
（ｇ）工程（ｃ）～（ｆ）を繰り返す工程；を含み、
生成した電流シグナルからＤＮＡの配列を決定する、方法。
（４１）ＤＮＡの配列を決定する方法であって、
（ａ）本明細書に記載のシステムにＤＮＡテンプレートを含む溶液を導入する工程；
（ｂ）本明細書に記載のシステムにバイアスを印加するときに生成する第１の電流を測定する工程；
（ｃ）ＤＮＡテンプレートに相補的なｄＮＴＰの組み込みを可能にする条件下において、少なくとも２種類のｄＮＴＰを含む溶液をシステムに導入する工程であって、各種類のｄＮＴＰが異なる濃度において溶液に存在している、工程；
（ｄ）工程（ｂ）において生成する第２の電流を測定する工程；
（ｅ）組み込まれていないｄＮＴＰを含む溶液を除去する工程；
（ｆ）工程（ｃ）において使用されなかった残りの種類のｄＮＴＰの各々を用いて工程（ｃ）～（ｅ）を繰り返す工程；
（ｇ）工程（ｃ）～（ｆ）を繰り返す工程；を含み、
生成した電流シグナルからＤＮＡの配列を決定する、方法。
（４２）工程（ｃ）の溶液が４種類のｄＮＴＰを含む、上記（４１）の方法。
（４３）工程（ｃ）の溶液が少なくとも２種類のｄＮＴＰを含む、上記（４１）の方法。
〔定義〕
別段の定義がない同様、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法および例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書を通して、「含む（comprise）」という用語または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などのバリエーションは一定の整数または整数の一群を含むが、他の整数または整数の一群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上の項目を意味することがある。
「および（and）」および「または（or）」という用語は、接続詞または離接的接続詞のいずれかを指し、「および／または（and/or）」を意味することがある。
「約（about）」という用語は、規定値の±１０％以内を意味する。例えば、「約１００」は、９０～１１０の任意の数字を示す。
「ヌクレオチド」という用語は、塩基－糖－リン酸の組合せを示し、リボヌクレオシド三リン酸ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰまたはそれらの誘導体などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
〔タンパク質活性の直接測定用であるデバイスおよびシステム〕
本開示は、タンパク質活性の直接測定用デバイスを提供する。一実施形態において、デバイスは、第１の電極および第２の電極と、一方または両方の電極に付着されたタンパク質と、を含む。第１の電極および第２の電極はギャップによって離れている。第１の電極および第２の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
別の実施形態において、デバイスは、第１の電極および第２の電極と、一方または両方の電極に付着されたタンパク質と、を含む。第１の電極および第２の電極はギャップによって離れている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、
（ａ）誘電体基材；
（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；
（ｃ）第１の電極上に配置された絶縁性誘電体層；
（ｄ）絶縁性誘電体層上に配置された第２の電極；
（ｅ）第２の電極上に配置されたパッシベーション層；
（ｆ）一方または両方の電極に付着したタンパク質；を含む。
第１の電極、絶縁性誘電体層、第２の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、
（ａ）誘電体基材；
（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；
（ｃ）絶縁性誘電体層上に配置された第２の電極；
（ｄ）一方または両方の電極に付着したタンパク質；を含む。
パッシベーション層を通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、
（ａ）同一平面上にあり、ギャップによって離れており、第２の電極と共に平面内にある、第１の電極および第２の電極；
（ｂ）少なくとも一方の電極に付着したタンパク質；を含む。
第１の電極および第２の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
電極が平面にある実施形態において、有利にはデバイスは誘電体層を必要としない。誘電体層を必要とするデバイスは、欠点を有する可能性がある。誘電体層は、電極に接着するために接着層を必要とする。これらの接着層は空気に曝されると酸化され、実際には、電極間のギャップのサイズを増大させる。この影響を補償するために、誘電体層をより薄くし得る。しかしながら、誘電体層が薄いとピンホールの影響を受け易く、当該影響を除去することは困難である。
本明細書中に記載されるデバイスの実施形態の各々において、タンパク質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
タンパク質は、一方の電極に直接または間接的に付着し得る。いくつかの実施形態において、リンカーを介してタンパク質は電極に付着する。いくつかの実施形態において、電極に付着したリガンドとの相互作用を介して、タンパク質は間接的に電極に付着する。いくつかの実施形態において、タンパク質がリガンド結合部位を組み込むように改変される。
一実施形態において、デバイスは第１の電極および第２の電極と、一方または両方の電極に付着したポリメラーゼと、を含む。第１の電極および第２の電極はギャップによって離れている。第１の電極および第２の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは一方の電極に付着している。本実施形態のいくつかの態様において、リンカーを介してポリメラーゼは電極に付着している。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼであり、ストレプトアビジンを介して電極に付着している。
本明細書に記載のデバイスの実施形態のそれぞれにおいて、第１の電極および／または第２の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約２０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約１０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約７．５ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約４．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、デバイスは、単一の分子を検出するために使用され得る。
本開示はまた、タンパク質活性の直接測定用システムを提供する。本システムは、本明細書に記載のデバイスと、タンパク質と相互作用することができる化学物質を導入する手段と、第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加する手段と、化学物質がタンパク質と相互作用するときに第１の電極と第２の電極との間に生成する電流をモニターする手段と、を含む。
本明細書に記載のシステムの実施形態の各々において、タンパク質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。一実施形態において、タンパク質はポリメラーゼである。
タンパク質がポリメラーゼであるとき、ポリメラーゼは、一方の電極（好ましくは、両方の電極）に付着している。本実施形態のいくつかの態様において、１つ以上のリンカーを介して、ポリメラーゼは電極に付着している。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼはビオチン化ポリメラーゼであり、ストレプトアビジンを介して電極に付着している。
本明細書に記載のシステムの実施形態の各々において、第１の電極および／または第２の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約２０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約１０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約７．５ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約４．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。
図４は、本開示の一実施形態によるシステムの概略図を示す。タンパク質分子５１は、特定の部位５３および５４で共有結合的に修飾されている。このような部位は、マレイミドとの反応によって修飾された表面システイン残基、ＮＨＳエステルによって、または、ニトリロトリ酢酸に結合するためのタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端へのヒスチジンタグの挿入によって、または、タンパク質のビオチン化および電極に付着するチオール化ストレプトアビジン分子を介した結合によって修飾された表面リジン残基であり得る。本技術分野で周知のように、ＭｙｃタグまたはＧＳＴタグなどの他の結合手段も使用し得る。本実施形態の重要でありユニークな設計態様は、タンパク質自体が検出器として利用され、その目的のために、強力で永久的な化学的拘束（chemical tether）を使用してタンパク質を電極に付着させる。修飾部位は、可撓性リンカーに結合している。当該リンカーは、短い（１～１０反復）アルカンオリゴマーまたはポリエチレングリコールオリゴマーまたはタンパク質に組換え的に組み込まれる短いペプチド鎖であり得る。次に、これらは、リンカー分子を金属電極５７および５８に繋ぐ反応性基５６によって終結される。種々の結合が可能であるが、チオール結合が好ましく、ビオチン－ストレプトアビジン結合が可能であるように、アミンも使用され得る。バイアス５９が２つの電極間に印加され、電極間を通過する電流をモニター６０する。本システムを、酵素機能に必要なイオンを含む緩衝液に浸漬し、化学物質６１（酵素の基質および／または薬物など）の導入による影響を記録する。
本開示の基礎は、上記のようにタンパク質が２つの電極に強く繋がれているときに、大きなギャップ（約４．５ｎｍ）におけるタンパク質の挙動について、著しく予想外であって非常に最新の観察にある。テレグラフノイズシグナルの開始について以前に報告した臨界バイアス電圧未満で、単純な直線（抵抗）応答を見出した。これは、タンパク質が、電子輸送モードがトンネリングのみであるべき分子固体であると考えられるため、全く予想外である。しかしながら、トンネリングは、タンパク質が図４で説明した態様で繋がっているときに観察される直線電流－電圧を有する大きな電流を説明することができない。単一のタンパク質分子について測定した典型的な電流－電圧曲線の一例を図５に示す。以前に報告されたように約±１００ｍＶ超で大きなノイズ変動が観測されるが、±１００ｍＶ未満（図５Ａにおいて７１と標識された囲み領域）ではこの大きな（４．５ｎｍ）距離にわたってさえ、タンパク質に対して著しく高いＤＣコンダクタンスを意味する直線領域が存在する。この直線領域がフィットされ、得られたフィットコンダクタンス（fitted conductance）の分布が得られると、コンダクタンス分布は図５Ｂに示されるような指数分布によってフィットし得る（実線はフィットを示す）。この場合、平均コンダクタンスＫは、１．５ｎＳの値を有することに留意されたい。
多くの測定値の収集によって、図１３に示すように、コンダクタンスのより複雑な分布を明らかにする。この図は、様々な手段によって電極に結合された一連のタンパク質について、所与のコンダクタンスの周波数対コンダクタンスのヒストグラムをプロットする。コンダクタンスのスケールは対数（ベース１０）で、線で示されるようにフィットするピークはガウス分布であるため、これらのコンダクタンスは対数正規分布に従って分布する。（分布を明確にするために、垂直方向に任意に分布を移動させている。）特定のタンパク質に対する特定のリガンドに結合することによって、または、ストレプトアビジンの場合はチオール結合によって、タンパク質が電極に繋がる。リガンドは、チオール（システイン）結合を介して電極に化学的に付着させた。種々のタンパク質、それらのリガンド、タンパク質－リガンド複合体の解離定数、特異的結合を検証するために使用した対照（コントロール）、および分布をフィットすることによって得られるコンダクタンスのピーク値を表１に列挙する。
Figure 0007433300000001
電極を列挙した対照分子に曝露したときにコンダクタンスは観察されなかった。このことは、電子コンダクタンスを観察するためには、電極へのタンパク質の特定の化学的拘束が必要であることを示した。
３つの抗体の場合、２つの結合部位が利用可能であり、２つの結合ドメインの各１つずつ、１３ｎｍ離れている。結果として、第２の、より高いコンダクタンスピークが、これらの３つの分子の分布において観察される。これにより、これらの分子について表１に列挙した第２のピークコンダクタンスが得られる。その結果、タンパク質が両方の電極に化学的に繋がっていれば、長い距離（１３ｎｍ）にわたって高いコンダクタンスを得ることができる。
約１００ｍＶの電圧駆動変動の開始についてのこの閾値は、今日までに研究された多くのタンパク質について見出されている。したがって、自然的な変動の開始についてのこの閾値未満（すなわち、ＶＣが約１００ｍＶである、図４におけるＶ＜ＶＣ）の接合部を操作することによって、ＤＣ電流は、タンパク質がその静止状態で捕捉されていることを示すように作用する。このシグナルは非常に大きく、ここに示した一例では５０ｍＶのバイアスにおいて平均７５ｐＡであり、タンパク質が電極ギャップを架橋するように化学的に繋がれている場合には実質的にさらに大きい。
タンパク質の変動は、電子輸送用のさらなるチャネルを開く。したがって、タンパク質がＶＣ未満にバイアスされるが、基質分子を導入することによって刺激される場合、大きな電流変動が生じ得る。タンパク質変動によって誘導される電流シグナルの一例を図６に示す。図２Ｃと比較すると、ノイズ８１に対するシグナル８２が大きく改善されていることに留意されたい。誘導されたタンパク質変動のさらなる一例を図１２に示す。この図は、電極表面に結合したチオール化ストレプトアビジン分子に結合するビオチン化Ｎ末端を介してパラジウム電極に結合したｐｈｉ２９ポリメラーゼの単分子層の上に、３．５または４．５ｎｍの一定の高さに保持されたＳＴＭプローブによって収集されたデータを示す。パネルＡ、ＢおよびＣは、ポリメラーゼとの接触点の変動の結果として生じる電流の変動を示す。時間の経過と共に（右の挿入図）、電流の大きな変化につながり得るが、バイアスがＶＣ未満である場合にはｍｓ－タイムスケールのテレグラフノイズが観察されない。左側の拡大した電流－時間トレースは、ピーク電流領域から得られる（右側に挿入した長時間スケールプロット上に赤色丸で囲まれている）。一本鎖プライムＤＮＡテンプレートおよびｄＮＴＰを添加すると、パネルＤ、ＥおよびＦに示すように、ｍｓ－タイムスケールのテレグラフノイズが誘発される。
図１２に示すシグナルは、ポリメラーゼについての単一の化学的付着点を用いて得られた。結果として、第２の電極への連結は図１２Ａ、ＢおよびＣの電流変動によって示されるように、非常に可変である。単一の化学的接触の別の重要な欠点は、タンパク質と第２の電極との間の物理的接触の不十分な性能である。これを図１４に示す。この図は、電極ギャップがマークされたギャップ値について１ｎｍずつ増加するときに、ストレプトアビジン単層（左側）にわたって、および、ビオチン化ｐｈｉ２９ポリメラーゼ結合後の同じ単層（右側）にわたって測定されたコンダクタンス分布を示す（分布を明確にするために、垂直方向に任意に分布を移動させている。）。ストレプトアビジンの場合、３．５ｎｍのギャップ距離で記録される曲線は非常に少ない。ｐｈｉ２９がストレプトアビジンに結合している場合、曲線は４．５ｎｍまで記録される（５．５ｎｍでの数回の記録を伴う－図示せず）。しかしながら、この長さは、約９ｎｍのポリメラーゼ－ストレプトアビジン複合体の全高よりも実質的に短い（挿入図に示す）。この結果は、２つの結合ドメインが分かれている１３ｎｍの経路にわたって高いコンダクタンスが得られた、図１３に示す抗体データとは明らかに対照的である。この結果は、２つの化学的に明確な接触点を、対である各電極に１つずつ形成することが望ましいことを示している。
〔本開示のデバイスの製造方法〕
本開示のデバイスは、Ａｕ、Ｐｔ、またはＰｄなどの貴金属元素の層を、ケイ素、ガラス、またはサファイアウェハ（または他の誘電体基材）上に堆積させ、次いで、接着用である反応性金属（クロムまたはチタンなど）の薄層（典型的には１ｎｍ）を堆積させ、次いで、貴金属元素の１～１０ｎｍ、または１～２０ｎｍ、または１～５０ｎｍの層を堆積させることによって容易に製造することができる。この下部電極は絶縁性誘電体層、好ましくはアルミナで覆われているが、ＳｉＯ２または酸化ハフニウムなどの他の酸化物を使用してもよい。この層の厚さは２～１０ｎｍであるべきである。貴金属元素の底部電極を１～１．５ｎｍのアルミニウムで被覆し、それを大気中で酸化させることによって、厚さが２～３ｎｍであるＡｌ２Ｏ３層が形成し、２ｎｍの層を堆積させることができる。さらに厚い誘電体が必要とされる場合、本技術分野で周知のように、水／トリメチルアルミニウムサイクルを用いた原子層堆積によって、さらなるＡｌ２Ｏ３を加えることができる。
次に、再度薄い接着層（クロムまたはチタン）を使用して第２の貴金属電極を堆積させるが、この接着層が酸化するデバイスのエッジに存在するギャップを著しく変化させないように、最大でも接着層は１ｎｍである。
最後に、上部電極の上にパッシベーション層を配置する。この層は、アルミナ、ＳｉＯ２、酸化ハフニウム、またはＰＭＭＡもしくはＳＵ８などのレジスト物質であり得る。
露出電極（exposed electrode）の領域が１つのポリメラーゼのみが付着するようなものであることを確実にするのに十分に小さいキャビティを作製するために、次いで、本技術分野で周知である反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を使用して、小さい開口が作製される。この開口の直径は１０～５００ｎｍであってもよく、約５０ｎｍが好ましい。開口の深さは、パッシベーション層、上部電極、電極を分離する誘電体層、および下部電極を通り抜けるように十分に大きくすべきである。
露出電極の領域の量を制限する第２の方法は、電極のうちの１つ（上部電極または下部電極、上部電極が好ましい）を幅５０～１００ｎｍの細いワイヤにすることである。そして、露出電極が電極の小さな幅によって制限されるため、ＲＩＥ開口ははるかに大きくすることができる（例えば、従来のリソグラフィを可能にするミクロンサイズ）。
第３の方法は、接合部がポリメラーゼ分子に曝露される時間および／またはポリメラーゼの濃度を制御することによって、化学的機能化（functionalization chemistry）を制御することである。印加バイアスが１００ｍＶ超のとき、接触変動によって誘導されるテレグラフノイズをモニターすることによって各接合部のローディングを評価することができる。２つのシグナルレベルの存在は、単一の分子のみが捕捉されていることを示す。３つのレベルの存在は２つの分子が捕捉されていることを示し、以下同様である。このようにして、濃度および曝露時間は、部位の約３０％が単独で占有される理想的なポアソンローディングに調整することができる。
酸素プラズマで洗浄した後、開口内の電極の露出領域をタンパク質で官能基化してもよい。これは、タンパク質の表面上の天然チオールを使用するかもしくはスルフヒドリル基をタンパク質に結合させる化学修飾を介することによって直接的な官能基化、または、チオール化ストレプトアビジンを結合させ次いでビオチン化タンパク質を捕捉することによる間接的な官能基化のいずれかであり得る。
デバイスを作るための第２のアプローチは、２つの電極の間に小さなギャップを有するように同一平面内に当該２つの電極を形成することである。この形成は、本技術分野で周知である、電子ビームリソグラフィーおよびリフトオフまたは反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を使用して、単一ワイヤにわたってトレンチを開くことによって行うことができる。他のアプローチは、ヘリウムイオンミリング、すなわち、ギャップが自然に形成されるようにステップエッジにわたる金属の斜め堆積（angled deposition）を使用することである。次いで、電極対は電極ギャップが露出するように、パッシベーション層およびＲＩＥによって形成された開口で覆われる。次いで、電極は、上記のように機能化され得る。
露出電極の幅は重要である。なぜなら、本明細書に記載のデバイスは一般に、ただ１つの分子に連結することに依存するからである。配列情報を抽出する場合、単一分子シグナルのこの要件は特に重要である。電極が単一の分子（５～１５ｎｍ）よりもあまり広くない場合、ギャップにわたる複数の分子の付着は不可能である。しかしながら、このような小さな電極の信頼性のある機能化および製造は非常に困難である。実際には、１００ｎｍまでの幅の電極が２つ以上のタンパク質分子を捕捉する可能性が低いことを本発明者らは見出した。特に、所望の（架橋）構成における結合の確率が低い場合、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍの幅、または１０００ｎｍでさえの幅である幅広い電極を有することがさらに望ましい場合がある。一対の電極を架橋するのではなく、ただ一つの電極に結合したタンパク質分子は、比較的少量の電流を供給する。
〔ポリメラーゼの電極への付着方法〕
タンパク質がポリメラーゼであるとき、ｐｈｉ２９ポリメラーゼなどの、連続反応性が高いポリメラーゼであるべきである。当該ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能は以下に述べるように不能であるべきである。
野生型（ＷＴ）ポリメラーゼは、（ａ）当該ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を消失し、（ｂ）所望であれば化学的結合点（付着点）を付加するために改変を必要とする。本改変は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）発現系を使用する組換えＤＮＡによって改変ポリメラーゼを産生することによって達成される。
ｐｈｉ２９のエキソヌクレアーゼ活性は、次の酸性アミノ酸を必要とする：Ｄ１２、Ｅ１４、Ｄ６６およびＤ１６９。これらのいずれかを変異させると、エキソヌクレアーゼ活性が消失し、Ｄ１２およびＥ１４をアラニンに変異させた。
使用したクローンは、Ｎ末端に、ｈｉｓタグとａｖｉタグ（ビオチン化用）の両方を有する（すなわち、Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ－Ｐｈｉ２９）。その結果、以下の配列が酵素のＮ末端に付加された：ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＡＳＳ。
６つのヒスチジン残基がｈｉｓタグであり（所望の酵素製品の精製に使用される）、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥはＡｖｉタグである。ビオチンは、ビオチンリガーゼＢｉｒＡ（Avidit, Lansing, MI）によってＡｖｉタグのＫに結合している。活性アッセイは、ストレプトアビジンに結合したビオチン化酵素が依然として活性を有することを示す（図８Ｂ）。
本開示の別の有用であり予想外の特徴は、ストレプトアビジンおよびポリメラーゼの両方が導電性タンパク質であるため、以下に示すように、ポリメラーゼを電極に間接的に付着させることができることである。最初に、チオールで修飾されたストレプトアビジンを電極に結合させ、次いでビオチン化ポリメラーゼを導入する。このことによって、ストレプトアビジンに結合し、電極への伝導経路を提供する。
また、同じ組換え方法によってポリメラーゼのＣ末端が修飾され得る。ａｖｉタグに加えて、ＧＳＴタグ、ＭｙｃタグおよびＨｉｓタグなどの他のペプチドをベースとした結合タグを使用し得る。これらのタグはすべて、ポリメラーゼのＮ末端またはＣ末端のいずれかに組み込まれ得る。Ｃ末端における組み込みは、プライムテンプレートが捕捉される部位の近くのタグ部位を配置するので、オリゴアラニンまたはグリシン－グリシン－セリンのスペーサー配列はＣ末端とタグとの間に組み込まれて、ポリメラーゼのテンプレート捕捉活性との干渉を減少させる。
同じ技術を使用して、本開示の方法を使用して活性をモニターすべき他のタンパク質（例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、またはグリカンを処理する分子など）を付着させてもよい。
Ｎ末端またはＣ末端における修飾に加え、ｐｈｉ２９には７つのシステインがある。ジスルフィド結合はないので、すべてのシステインがジスルフィド結合を形成する可能性を有し、電極への付着のためのさらなる部位を提供する。テンプレートおよびプライマーＣ４４８を有するｐｈｉ２９の構造に基づいて、Ｃ１０６およびＣ２２は、最も表面に露出しており、マレイミドによるビオチン化またはスルフヒドリル基に結合する重金属への直接結合のいずれかのための良好な候補のように思われる。問題は特異性をどのように制御するかである。１つのシステイン以外のすべてのシステインを一度に変異させようとしたが、得られたタンパク質は不溶性タンパク質であった。しかしながら、４つまでは溶解度に影響を及ぼすことなく除去することができ、Ｃ４４８、Ｃ１０６およびＣ２２を付着点の標的として残す。
本開示は一方の電極へのただ１つの化学的付着部位で機能し、第２の接触はタンパク質と金属との物理的接触によって行われるが、２つの電極間のギャップにわたる態様で２つの化学的に明確な接触を行うことが望ましい。Ｃ末端はＮ末端から約５ｎｍ離れており、ａｖｉタグによるビオチン化を用いると、同じポリメラーゼのＮ末端とＣ末端の両方による同じストレプトアビジン分子への付着はあり得ない。したがって、チオ－ストレプトアビジンで機能化された両方の電極を用いて、Ｎ末端が一方の電極に連結され、Ｃ末端が第２の電極に連結される構造を形成するための架橋の機会が存在する。
別のアプローチは広く離間しているが、タンパク質の不活性領域にある２つの付着点を使用することである。Ｄ１２とＥ１４の変異によってエキソヌクレアーゼドメインが不能となったｐｈｉ２９ポリメラーゼの場合には、Ｇ１１１とＫ１１２の間、およびＥ２７９とＤ２８０の間が５ｎｍ超離れた、エキソヌクレアーゼドメインの２つの点が認められる。したがって、Ａｖｉタグ配列であるＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥをこれらの２点に挿入し、ＢｉｒＡによってビオチン化されたＡｖｉタグのリジンを用いて、図１５に示すように、ポリメラーゼを一対の電極に結合させることができる。この図は、Ｇ１１１とＫ１１２の間およびＥ２７９とＤ２８０の間（１５０２と１５０３）に設定されたＡｖｉタグを用いてビオチン化されたｐｈｉ２９ポリメラーゼ１５０１を示す。硫黄結合１５０６および１５０７を介して電極１５０８および１５０９に接着するチオール化ストレプトアビジン分子１５０４および１５０５に、これらのビオチンが結合する。これらの付着点（図１５の両方向矢印）間のギャップは５ｎｍを少し超えるので、この付着点の形状（geometry）は５ｎｍを少し満たないギャップ１５１０を必要とする。
ポリメラーゼに「導電性ウィスカー」を付加することによって、ポリメラーゼと電極との間に決定的な接触（deterministic contact）を作る。
Ｎ末端に次の配列を組換え的に付加する：ＣＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＦＴＬＩＥＬＬＩＶＶＡＩＩＧＩＬＡＡＩＡＩＰＱＦＳＡＹＲＶＫＡＹＮＳＡＡＳＳＤＲＬＮＬＫＴＡＬＥＳＡＦＡＤＤＱＴＹＰＰＥＳＧＬＶＰＲＧＳＧＡＳＳ－ｆ２９
末端のＣは、第１の電極に接着するためのシステインである。
ｈｉｓタグは、タンパク質抽出および精製のためである。
ＳＳに続く６１個のアミノ酸配列は、金属ワイヤとして作用する、ジオバクター・スルフェリダクタンス（geobacter sulferreductans）由来の線毛タンパク質の配列である。
Ｃ末端に次の配列を組換え的に付加する：ｆ２９－ＡＡＦＴＬＩＥＬＬＩＶＶＡＩＩＧＩＬＡＡＩＡＩＰＱＦＳＡＹＲＶＫＡＹＮＳＡＡＳＳＤＲＬＮＬＫＴＡＬＥＳＡＦＡＤＤＱＴＹＰＰＥＳＣ
ＡＡに続く６１個のアミノ酸配列は、ジオバクター・スルフェリダクタンス由来の線毛タンパク質の配列である。
末端のＣは、第１の電極に接着するためのシステインである。
〔複合体の導電性〕
本開示の重要なポイントは、ポリメラーゼを介して良好な電子コンダクタンスを得ることができることである。図９は、チオール結合を介して基質に連結したストレプトアビジンによるコンダクタンスの分布を示す（左パネル）。これらのデータは、２．５ｎｍの電極ギャップで得られた。ギャップを３．５ｎｍに増加させた場合、読み取りはほとんど起こらない。ギャップをさらに４．５ｎｍに増加させると、全く読み取りが得られない。この結果は、表面上に平坦に存在するストレプトアビジン分子の高さが約４ｎｍであるという事実と一致する。図９の右側は、Ｐｄ電極上のストレプトアビジンとビオチン化ｐｈｉ２９ポリメラーゼとの複合体についてのデータを示す。これらのデータは、３．５ｎｍのギャップサイズで得られた。複合体について４．５ｎｍのギャップサイズで同様のデータを記録した（ストレプトアビジンについてコンダクタンスが記録されなかったギャップ）。これらの距離はストレプトアビジン単独が強固なシグナルを与えるギャップよりも大きいので、これらの結果はストレプトアビジンと直列に配線されたポリメラーゼを介して伝導が起こっていることを示す。コンダクタンスの分布がストレプトアビジン単独と比較して複合体においてどのように変化するかに注目されたい。
〔コンフォメーションによる伝導率の変化〕
図１０は、ストレプトアビジン単独（左パネル）およびビオチンへの曝露後のストレプトアビジンについての、測定したコンダクタンス分布を示す。ストレプトアビジンがビオチンに結合した後に測定されたコンダクタンスの分布が変化した。この結果は、タンパク質のコンダクタンスがタンパク質のコンフォメーション変化に感受性があることを示している。
〔タンパク質コンフォメーションの動的モニタリング〕
図１１は、４．５ｎｍのギャップを用いて、走査型トンネリング顕微鏡で記録した電圧誘起コンフォメーション変動（左側のパネル）と、固体チップで記録した電圧誘起コンフォメーション変動（右側のパネル）の記録を示す。バイアスはＶＣより高い、２００ｍＶ、１００ｍＶであった。タンパク質は、電極に接着した抗ジニトロフェノール分子結合ジニトロフェノール（ＤＮＰ）である。ミリ秒タイムスケールでの非常に大きなコンダクタンスの変化は、優れたシグナル対ノイズ比で容易に記録される。図１２Ｄ、ＥおよびＦはバイアスがＶＣ未満に低下し（この場合５０ｍＶまで）、基質の添加によってタンパク質が活性化されたときに生じる電流の変動を示す。テレグラフノイズは、シグナル対ノイズ比が非常に高いｍｓタイムスケールで発生する。
〔デバイスおよびシステムの使用方法〕
本開示は、バイオポリマーの配列を決定する方法を提供する。図７は、ポリメラーゼによって伸長される核酸鎖の特定の場合について説明する。図７では、ポリメラーゼ９６が２つの点５３、５２において修飾されている。特定の一例は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼにおいて利用可能な２つの表面露出システインである。別の一例は、図１５に示すビオチン官能基化である。マレイミド修飾アルカンまたはＰＥＧリンカー５４、５５は、強力なチオール結合（例えば）５６を介して電極５７、５８にポリメラーゼを結合させるために使用される。電極ギャップにおけるポリメラーゼの結合は、Ｖ＜ＶＣ（５９）のときに定常ＤＣ電流６０によって確認される。ポリメラーゼ９６がプライムテンプレート９１と複合体を形成し、４つのヌクレオチド三リン酸９２、９３、９４、９５の各々を含む溶液に曝露されるとき、特徴的な電流変動は、所与のヌクレオチドの取り込みをシグナル伝達する。代替の実施形態において、表面システインを使用して、直接接着の１つを作製し得る。
使用に際しては、デバイスを調製したら、当該デバイスをすすいで、配列決定対象のプライムテンプレートＤＮＡに曝露すべきである。本技術分野で周知である、ヘアピンプライマーを連結することによって、配列決定対象の試料からこのＤＮＡを調製する。４つのｄＮＴＰおよびＭｇ２＋を含む緩衝液をデバイスに導入すべきである。ｄＮＴＰは、緩衝液中においておおよそ等しい濃度で存在する。一実施形態において、ｄＮＴＰの濃度が、第２の実施形態のテンプレート結合ポリメラーゼの飽和濃度においてテンプレート結合ポリメラーゼの飽和濃度にほぼ等しく、第３の実施形態の飽和濃度より高い。ｄＮＴＰの濃度が飽和濃度以上であるとき、ポリメラーゼは素早く作動する（すなわち、毎秒１００ヌクレオチドの取り込み）。
ｄＮＴＰを含む緩衝液がデバイスに導入されると、重合反応が開始され、捕捉されたテンプレートがプライマーにコピーされ、一連の電流スパイクが生成する。各新しいヌクレオチドがプライマーに組み込まれるときに各スパイク（またはスパイクのクラスター）が生じ、各スパイクの特性（持続時間、振幅、形状）は組み込まれているヌクレオチドのアイデンティティを解読するために使用される。ヌクレオチドの飽和濃度（＞３０μＭ）における典型的な配列決定速度は、約１００ヌクレオチド／秒である。テンプレートの飽和濃度は約１０ｎＭであり、新しいテンプレートは、前のテンプレートの完了のほぼ直後に組み込まれる。各分子は溶液中に利用可能なテンプレートが存在する限り、テンプレートを引き継ぎ続ける。したがって、デバイスが操作される限り、１つの分子は連続的に配列決定され得る。
デバイス形状はそれぞれの接合部に対して、離れている流体区画を有する必要がなく、極めて簡便である。したがって、１つの接合部は約１マイクロ２しか占有しない。相互接続、絶縁、およびオンチップ処理エレクトロニクスを可能にすると、単一の読み取りデバイスを１００ミクロン×１００ミクロンの領域に容易にフィットさせることができる。したがって、１ｃｍ２の活性チップ領域は、１０，０００個のデバイスを収容することになる。１時間操作されるチップ上に１０，０００個の接合部を有するチップは、ヒトゲノム全体を配列決定する（１０，０００×３６００×１００＝３．６×１０９）。より高密度であるデバイス形状またはより大きなチップはかなりの画分の不活性デバイスでさえも収容し、１時間以下の時間で１つの小さなデバイス上でのゲノムスケールの配列決定を依然として可能にする。
上記の例は核酸ポリマーの配列決定を例示するが、ポリマーを処理する他の酵素が使用され得るように適用することもできる。例えば、エキソヌクレアーゼにおける電流変動は、それらが分解している核酸の組成を反映する。ペプチドを消化するプロテアソームについても同様である。一例はプロテアソーム２０Ｓ ＣＰであり、図４のシステムに組み込まれ、ペプチド分子を供給し、低ＶＣにバイアスされたときに生成される電気シグナルをモニターすることによって、単一分子ペプチド配列決定に当該プロテアソームを使用し得る。
グリコシダーゼと呼ばれる類似の酵素が、グリカンを消化するために存在する。図４のデバイスへのグリコシダーゼの組み込みは、グリカンの電子配列決定を可能にする。グリカンの結合のバリエーションは配列の直接的な直線読み出しの妨げとなり得るが、時間内の切断事象の組織化はグリカンの同定を可能にし得る。
さらに別の実施形態において、本開示は、キナーゼ活性を検出する方法を提供する。本実施形態において、キナーゼは、図４のデバイスに組み込まれ、その基板に曝露され、ＶＣ未満にバイアスされたときにキナーゼ活性は大きな電流変動の生成によってシグナル伝達される。その後、本システムは、変動がモニターされるときにキナーゼ阻害薬候補に曝露され、どの薬物がキナーゼの活性を「不活化させる（kill）」かを発見することができるのであろう。本技術分野において、蛍光標識方法の使用はタンパク質酵素とその基質の相互作用を阻害し、本開示はタンパク質の標識の必要性を除去する。
これらのすべての方法において、（ＦＥＴ構成とは対照的に）簡便な接合部を使用することにより、両方の製造が大幅に単純化され、デバイスの大規模な並列アレイへのスケールアップが可能になる。本開示のデバイスは以下に記載されるように、接合デバイスの大規模に実現可能な製造方法を使用して、大規模な並列製造において調製されてもよい。
〔ＤＮＡまたは他のポリマーの配列を決定するアレイおよびシステム〕
本開示は、ヌクレアーゼ、プロテアソーム、グリコペプチダーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼおよびエンドヌクレアーゼなどの分子テンプレートと連続的に相互作用する酵素のいずれかを用いて、バイオポリマーの配列を決定するアレイを提供する。以下の実施形態は、ポリメラーゼを使用してＤＮＡの配列を決定するアレイを例示する。アレイ中のポリメラーゼの代わりに、任意のプロセッシブ酵素を用いることができることを理解されたい。
アレイは、複数のデバイスの配置を含む。本開示のアレイに使用されるデバイスは以下を含む。
一実施形態において、デバイスは第１の電極および第２の電極を含み、第１の電極および第２の電極はギャップによって離れている。デバイスはさらに、一方または両方の電極に付着したポリメラーゼを含む。第１の電極および第２の電極には、それらを通過する開口が形成されている。
別の実施形態において、デバイスは第１の電極および第２の電極を含み、第１の電極および第２の電極はギャップによって離れている。デバイスはさらに、第１の電極および第２の電極の両方に付着したポリメラーゼを含む。
いくつかの実施形態において、デバイスは、（ａ）誘電体基材；（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；（ｃ）第１の電極上に配置された絶縁性誘電体層；（ｄ）絶縁性誘電体層上に配置された第２の電極；（ｅ）第２の電極上に配置されたパッシベーション層；（ｆ）第１の電極および第２の電極に付着したタンパク質；を含む。第１の電極、絶縁性誘電体層、第２の電極およびパッシベーション層には、それらを通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、（ａ）誘電体基材；（ｂ）誘電体基材上に配置された第１の電極；（ｃ）誘電体基材上に配置された第２の電極；（ｄ）電極の上に配置されたパッシベーション層；（ｅ）一方または両方の電極に付着したポリメラーゼ分子；を含み、パッシベーション層を通過する開口が形成されている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、（ａ）同一平面上にあり、ギャップによって離れている、第１の電極および第２の電極；（ｂ）少なくとも一方の電極に付着したタンパク質；を含み、第１の電極および第２の電極は分析対象試料と接触するように構成されている。
本明細書に記載のデバイスの実施形態のそれぞれにおいて、第１の電極および／または第２の電極は、金、白金、パラジウム、およびルテニウムからなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、金属はパラジウムである。
いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約２０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約１０．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約７．５ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約１．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ギャップの幅は約４．０ｎｍ～約５．０ｎｍである。
デバイスのアレイは任意の適切な様式（例えば、格子状）に配置され得る。
いくつかの実施形態において、アレイは、テンプレートＤＮＡと結合したポリメラーゼ分子を含む。このようなテンプレートは、本技術分野で周知である、ゲノムＤＮＡ断片（例えば、超音波処理によって生成される）とポリメラーゼによる結合用のニックを含むプライマー配列とを連結することによって作製することができる。結果は必要であれば、全ゲノムにわたるテンプレートのライブラリーである。次いで、各テンプレートは、アレイ中の１つのポリメラーゼにランダムに結合する。
次に、図１６を参照すると、格子の接触点１０１、１０２が、本技術分野で周知である、誘電体によって離れている２層の接触金属から形成され、パッシベーション層によって覆われる。次に、パッシベーションを選択的に除去することによって各交差部を露出させ、ポリメラーゼ分子１０３が各接合部に結合する。これらの生体分子接合は、前述のセクションで論じた方法によって調製することができる。電極を十分に狭くする（約１ミクロンの幅）ことによって、通常、１つのポリメラーゼのみ（または全く）が結合する。２つまたは少数が結合する場合、シグナルは依然としてデコンボリューションすることができる。
本開示はまた、ポリメラーゼ活性の直接測定用のアレイのシステムを提供する。本システムは、本明細書に記載のアレイ；任意に、溶液をアレイに導入し除去する手段；第１の電極および第２の電極間にバイアスを印加する手段；第１の電極および第２の電極間に生成される電流をモニターする手段；を含む。
再び図１６を参照すると、手段１０６は、小さなバイアス（典型的には５０ｍＶ）を印加し、それぞれの接合部から電流を読み取って、コンピュータストレージシステムによって記録するために設けられている。
〔アレイのシステムを用いたＤＮＡの配列を決定する方法〕
本開示はまた、本明細書に記載のアレイのシステムを使用する、ＤＮＡ配列を決定する方法を提供する。
配列決定は、１つのヌクレオチド一リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのうちの１つ）を含む溶液をマグネシウムと共にアレイに導入することによって進行する。相補的ヌクレオチドと結合した各ポリメラーゼはシグナルを生成し、シグナルは、各ポリメラーゼが結合したユニークな電極対によって読み取られる。例えば、付加したヌクレオチドがｄＣＴＰである場合、Ｇ塩基に結合したすべてのテンプレートは伸長鎖にＣを組み込み、シグナルを生成する。一方、他の配列は、明確に異なるシグナルを生成する。例えば、ミスマッチ塩基が捕捉されるときは、非マッチ塩基を有するポリメラーゼは短いバーストのシグナルを生成する。しかしながら、ミスマッチが拒絶され、重合および転位のプロセスが中止するときは、シグナル列は早期に終結する。対照的に、組み込みおよび転位のプロセスが完了するときは、一致する塩基の組み込みは、はるかに長いパルス列を生じる。第２の工程として、アレイをすすいで過剰のヌクレオチドを除去し、次のヌクレオチドを含む溶液を導入する（例えば、ｄＡＴＰ、その結果、Ｔを有するすべての部位がシグナルを生成する）。このサイクルは、すべての４つのｄＮＴＰがデバイスを通って循環するまで続き、その後このサイクルが繰り返される。このサイクルはすべてのテンプレートＤＮＡが使い果たされるまで繰り返すことができ、断片のライブラリー全体についての配列データが生成される。
図１７は、ＤＮＡの配列を決定する方法を示す。アレイ２０１にｄＡＴＰを添加すると、Ａが伸長鎖に組み込まれるときに、図示される分子はシグナル２０４を生成する。次にアレイをすすいでｄＡＴＰ２０２を除去し、次のヌクレオチド（ここではｄＴＴＰとして示す）を添加する（２０３）。図示のようにサイクルは継続する。ｄＡＴＰ、次いでｄＣＴＰ、次いでｄＡＴＰの付加はすべて、塩基取り込みのシグナル２０４を与える一方、他のヌクレオチドの存在はない２０５。したがって、その特定の位置におけるシーケンスは、ＴＧＴとして記録される。
本アプローチが、ｄＮＴＰの循環（cycling）を使用する現在の配列決定ストラテジーに対して２つの主要な利点を有することが、認識される。１つ目は、ポリメラーゼの塩基取り込み速度よりも速いタイムスケールで単一の分子読み取りを利用することによって、同じ塩基の反復を計数することが容易になることである。したがって、配列ＡＡＡＡＡは、ｄＴＴＰの存在下において５つの別個のバーストのシグナルを与え、以下同様である。２つ目は、既知の光学読み出し方式とは対照的に、読み出されるテンプレートの長さが実装基板からの距離によって制約されないので、潜在的な読み出しの長さはポリメラーゼの処理性（ｐｈｉ２９の場合は１０ｋＢ）と同程度に高い。
図１８は、個々の連続的な取り込みを読み取る能力、したがって、配列のホモポリマーランを読み取る能力を示す。電流対時間記録３００は、２つの連続する塩基の組み込みを示す（ここで、電気データは２つの連続するＡ部位に組み込まれているｄＴＴＰについて示す）。各シグナルは約２０ｍｓの持続時間のテレグラフノイズのバースト３０１からなり、バースト間のギャップによって離れており、ヌクレオチド三リン酸のマイクロモル濃度で平均約１０～２０ｍｓである。したがって、図１７に示す化学循環の任意の所与の工程において、ただ１つのヌクレオチド三リン酸が存在する場合、テンプレート鎖におけるその相補体の反復塩基の数は単に、このようなテレグラフノイズのバーストの数を記録することによってカウントされ得る。
別の実施形態において、溶液は２つ以上のｄＮＴＰを含み、ｄＮＴＰは異なる濃度で存在する。例えば、溶液は、１ｍＭのｄＡＴＰ、１００μＭのｄＧＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、および０．１μＭのｄＴＴＰを含む。本実施形態において、アレイ中のポリメラーゼは、各テンプレートが伸長するときに連続的にシグナルを生成する。ＴがテンプレートＤＮＡ中に存在する点において、取り込みのシグナルは、テレグラフノイズの以前のバーストに迅速に（一般に１０ｍｓ以内に）続く。次の塩基がＣであったテンプレートＤＮＡは低濃度によるｄＧＴＰのより遅い到達のために、より遅いテレグラフノイズのバーストを示す。同様に、Ｇを含むテンプレートは、ｄＣＴＰの濃度がさらに低いため、より長い遅延が先行する。ｄＴＴＰの濃度が最も低いので、最も長い遅延はＡ塩基に先行する。
さらに別の実施形態において、２サイクルのすすぎを使用し、第１のサイクルで等しくない濃度のヌクレオチドの一方の対を使用して、次いで、第２のサイクルで等しくない濃度の他方の２つのヌクレオチドを使用して、２つのアプローチを組み合わせることができる。
前述のセクションはポリメラーゼを含むアレイのシステムを使用してＤＮＡの配列を決定する方法が記載されているが、アレイのシステムは他のポリマーの配列を決定するために容易に改変され得る。
本発明は前述の例示的な実施形態において説明および例示されているが、本開示は例としてのみ示されたものであり、本発明の実施の詳細における多くの変更は本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。開示される実施形態の特徴は、様々な方法で組み合わされまたは再配置されてもよい。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。
〔参考文献〕
以下の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：
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Chenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。 Choiらによる、公知のリソチーム変動用の検出システムを示す。 Olsenらによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。 Olsonらによる、ヌクレオチド配列依存性データを示す。 MerrimanおよびMolaによる、公知のポリメラーゼ変動用の検出システムを示す。 公知のタンパク質検出用デバイスを示す。 本開示の実施形態の概略図を示す。 タンパク質が２点で結合しているときに得られる直線電流電圧特性を示す。 多数の単一分子測定の直線領域の勾配の分布を示す。 タンパク質変動を表すシグナルを示す。 タンパク質がポリメラーゼである、本開示の実施形態の概略図を示す。 ポリメラーゼ活性を測定するために使用される蛍光活性アッセイの原理を示す。 野生型酵素、エキソヌクレアーゼを含まない酵素（Ｄ１２Ａ、Ｅ１４Ａ）または、ストレプトアビジンに結合したエキソヌクレアーゼを含まない酵素と６０分間インキュベート後の基板上のＦＡＭの蛍光強度を示す。 チオール化ストレプトアビジン（左）およびビオチン化ｐｈｉ２９ポリメラーゼの付着後（右）について測定したコンダクタンスの分布を示す。 コンフォメーションによるコンダクタンス変化を示す。 ＳＴＭギャップ（左）および固体チップ（右）におけるタンパク質変動の高コントラスト、高時間分解能記録を示す。 一定のギャップで収集された電流（各パネルの左下にマークされている）およびｐｈｉ２９－ストレプトアビジン複合体における５０ｍＮバイアスが、テンプレートＤＮＡおよびｄＮＴＰの非存在下での接触変動（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ならびに、テンプレートＤＮＡおよびｄＮＴＰが添加されるときに見られる追加のテレグラフノイズ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を示す。 約４．５ｎｍのギャップでＰｄ電極上のペプチドリガンド（表１に列挙されている）に結合した３つの抗体およびインテグリンについて測定したコンダクタンス（対数スケール）の分布を示す。 マークを付したように、異なるギャップサイズで採取したストレプトアビジン（左）およびストレプトアビジン－ポリメラーゼ複合体（右）のコンダクタンス分布のギャップ距離依存性を示す。 ５ｎｍ離れた、ポリメラーゼ上の２つのビオチン化部位を介するポリメラーゼの、電極上の２つのストレプトアビジン分子への結合を示す。 ＤＮＡテンプレートと結合したポリメラーゼ分子のアレイを示す。 各部位における各テンプレート分子の配列決定するための、ヌクレオチド三リン酸への配列の曝露およびすすぎを示す。 同一の塩基を含む部位における２つの同一のヌクレオチドの連続的な取り込みに特徴的な２つのテレグラフノイズのバーストを示す。

Claims (20)

  1. タンパク質活性の直接測定用デバイスであって、
    第１の電極および第２の電極；
    リンカーを介して、前記第１の電極および前記第２の電極にそれぞれの付着点で付着したポリメラーゼ；を含み、
    前記第１の電極および前記第２の電極は、幅が１．０ｎｍ～２０．０ｎｍであるギャップによって離れており、
    前記リンカーは少なくとも１つの化学結合を有し、前記ポリメラーゼの不活性である領域に付着しており、前記ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が不能である、デバイス。
  2. 前記第１の電極および前記第２の電極が誘電体層によって離れており、
    前記第１の電極および前記第２の電極上にパッシベーション層が備えられている、請求項１に記載のデバイス。
  3. 前記リンカーが化学共有結合を有する、請求項１または２に記載のデバイス。
  4. 前記ポリメラーゼがビオチン化されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のデバイス。
  5. 前記リンカーがチオ－ストレプトアビジンを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のデバイス。
  6. 前記ポリメラーゼおよび前記電極がビオチン化されており、
    前記リンカーが、少なくとも２つのビオチン結合部位を含むストレプトアビジン分子を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のデバイス。
  7. 前記第１の電極および／または前記第２の電極が、金、白金、パラジウムおよびルテニウム、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される金属を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のデバイス。
  8. 前記化学結合が前記ポリメラーゼのＮ末端領域に存在する、請求項１～７のいずれか１項に記載のデバイス。
  9. 前記化学結合が前記ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ領域に存在する、請求項１に記載のデバイス。
  10. タンパク質活性の直接電気測定用システムであって、
    （ａ）請求項１～９のいずれか１項に記載のデバイス；
    （ｂ）前記ポリメラーゼと相互作用することができる化学物質を導入する手段；
    （ｃ）前記第１の電極と前記第２の電極との間に、１００ｍＶ以下である電圧バイアスを印加する手段；
    （ｄ）前記化学物質が前記ポリメラーゼと相互作用するときに生じる変動をモニターする手段；を含む、システム。
  11. タンパク質活性の直接測定方法であって、
    （ａ）請求項１～９のいずれか１項に記載のデバイスに、前記ポリメラーゼと相互作用することができる化学物質を導入する工程；
    （ｂ）前記第１の電極と前記第２の電極との間に、１００ｍＶ以下である電圧バイアスを印加する工程；
    （ｃ）前記化学物質が前記ポリメラーゼと相互作用するときに生じる、前記第１の電極と前記第２の電極との間の電流の変動を観察する工程；を含む、方法。
  12. バイオポリマーの配列を決定する方法であって、
    （ａ）請求項１～９のいずれか１項に記載のデバイスに、バイオポリマーを導入する工程；
    （ｂ）前記第１の電極と前記第２の電極との間に、１００ｍＶ以下である電圧バイアスを印加する工程；
    （ｃ）モノマーが前記バイオポリマーの末端から除去されるときに生じる前記２つの電極間の電流の変動を検出する工程；
    （ｄ）前記バイオポリマーから除去された各モノマーのアイデンティティを決定する工程；を含む、方法。
  13. 前記バイオポリマーが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド、またはグリカンである、請求項１２に記載の方法。
  14. ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
    （ａ）請求項１～９のいずれか１項に記載のデバイスに、プライムポリヌクレオチドのテンプレートを導入する工程であって、前記ポリメラーゼがテンプレートに結合している、工程；
    （ｂ）ｄＮＴＰを含む溶液を導入する工程；
    （ｃ）前記第１の電極と前記第２の電極との間に、１００ｍＶ以下である電圧バイアスを印加する工程；
    （ｄ）前記ポリヌクレオチドのテンプレートにおける対応するヌクレオチドと相補的である追加のヌクレオチドとして各ｄＮＴＰが組み込まれたときに生じる前記第１の電極と前記第２の電極との間の電流の変動を検出する工程；
    （ｅ）組み込まれる各追加のヌクレオチドのアイデンティティを決定する工程；を含む方法。
  15. おおよそ同じ濃度において各ｄＮＴＰが溶液中に存在する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記テンプレートに結合するポリメラーゼの飽和濃度とおおよそ同じ濃度以上において各ｄＮＴＰが溶液中に存在する、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記工程（ｄ）が、１つ以上の電流スパイクの存在を検出する工程を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記工程（ｅ）が、各スパイクの特性を使用する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記追加のヌクレオチドが順番に導入される、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 各ｄＮＴＰが同時に導入され、
    少なくとも１つのｄＮＴＰの濃度が、他のｄＮＴＰの濃度よりも低い、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の方法。
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