CN113924371A - 核酸序列的直接电读出 - Google Patents

核酸序列的直接电读出 Download PDF

Info

Publication number
CN113924371A
CN113924371A CN202080040977.XA CN202080040977A CN113924371A CN 113924371 A CN113924371 A CN 113924371A CN 202080040977 A CN202080040977 A CN 202080040977A CN 113924371 A CN113924371 A CN 113924371A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymerase
nucleic acid
electrode
acid template
template
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080040977.XA
Other languages
English (en)
Inventor
斯图尔特.林赛
张宾天
邓汉清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arizona State University ASU
Original Assignee
Arizona State University ASU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arizona State University ASU filed Critical Arizona State University ASU
Publication of CN113924371A publication Critical patent/CN113924371A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/116—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties electrical properties of nucleic acids, e.g. impedance, conductivity or resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

公开了用于直接测量聚合酶活性的设备、系统和方法。在一个实例中，设备包括至少第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极被间隙隔开；以及聚合酶，其具有两个附接位点，一个附接位点用于附接到所述第一电极，而第二附接位点用于附接到所述第二电极，其中所述两个附接位点被至少约1nm的距离隔开，并且所述距离不会随着所述聚合酶的构象变化而显著变化。

Description

核酸序列的直接电读出
相关申请的交叉引用
本公开要求于2019年6月20日提交的美国临时专利申请第62/864,174号的较早提交日期的优先权益，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
政府支持条款的确认
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R21HG010522和R01 HG009180下通过政府支持完成的。政府对本发明拥有某些权利。
序列表参考
本申请通过引用并入了以计算机可读形式提交的序列表，该序列表创建于2020年6月19日，包含6千字节。
技术领域
本公开内容涉及测序，尤其涉及用于直接测量聚合酶活性的设备、系统和方法。
发明内容
本文公开了用于直接测量聚合酶活性的设备、系统和方法。
在一些实施方案中，提供了设备，该设备包括：至少第一电极和第二电极，第一电极和第二电极被间隙隔开；以及聚合酶，其包含两个用于附接到第一电极和第二电极的位点，其中两个附接位点被至少约1nm的距离隔开，并且该距离没有随聚合酶的构象变化而明显变化(即总距离的变化小于10％)，诸如当聚合酶处于开放或封闭构象时，该两个附接位点具有相同的原子坐标。
在一些实施方案中，提供了系统，该系统包括如本文所述的并且被配置为实践本文公开的一种或多种方法的设备。
在一些实施方案中，提供了检测核苷酸掺入的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中；(b)测量当对设备施加偏压时产生的第一电流；(c)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；(f)重复步骤(c)至(e)；(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获得信号流；(h)识别在两个电流电平之间波动的一段电流信号，持续超过大约40ms的时间；以及(i)如果信号流包含停顿，则检测到核苷酸已被掺入。
在一些实施方案中，提供了确定核酸模板序列中重复的核酸数量的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中；(b)测量当对设备施加偏压时产生的第一电流；(c)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；(f)重复步骤(c)至(e)；(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获得信号流，其中信号流包含至少一个停顿和至少一个猝发；(h)识别在两个电流电平之间波动的一段电流信号，持续超过大约40ms的时间；以及(i)如果信号流包含约为信号流中多个停顿长度的两倍的停顿，则确定核苷酸已在核酸模板序列中重复。
在一些实施方案中，提供了确定正被掺入到核酸模板序列中的核苷酸的身份(identity)的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中；(b)测量当对设备施加偏压时产生的第一电流；(c)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；(f)重复步骤(c)至(e)；(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获得信号流，其中信号流包含至少一个停顿和至少一个猝发；以及(h)从猝发信号确定掺入的核苷酸的身份。
在一些实施方案中，提供了对核酸序列进行测序的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中，其中核酸模板包含序列中两个连续碱基的全部16个可能组合；(b)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(c)从核酸模板中的重复序列获得信号流，其中信号流包括至少一个停顿和至少一个猝发；(d)使用信号分析来表征每个掺入的dNTP的猝发信号；以及(e)应用信号分析对未知核酸序列进行测序。
本公开的前述和其他特征从以下详细描述来看将变得更加明显，该详细描述参考附图进行。
附图说明
结合附图和随附的权利要求书，通过以下详细描述将很容易理解实施方案。实施方案在附图中通过示例而非限制的方式示出。
图1Ai至图1Aiii示出了具有至少一个接触点的聚合酶的示意图。图1A-i示出了在N末端具有单个Avitag(序列N接触点1)的Ф29聚合酶。图1A-ii示出了在E279和D280之间插入了第二Avitag(序列接触点2)的Ф29聚合酶。图1Ai-iii示出了具有两个Avitag并在N末端序列中具有额外的柔性接头(序列N接触点2)的Ф29聚合酶。
图1B示出了SDS-PAGE凝胶，其在泳道2中显示出Gen III修饰的聚合酶。与链霉亲和素一起孵育时，主要产物(红色箭头)是质量约等于聚合酶加两个链霉亲和素分子的复合物。泳道4是WT链霉亲和素。
图1C示出了琼脂糖DNA凝胶，其显示出来自使用(泳道1)Ge n III聚合酶和(泳道4)与链霉亲和素复合的聚合酶的滚环聚合测定的延长产物。滚环模板是5’-P-CCGTACGATTCGTATCTACTATCGTTCGATTCGCATCATCTA-3’(SEQ ID NO:4)，且用于形成双链区的引物是5’-GGCATGCTAAGCATAGATGAT-3’(SEQ ID NO:5)。
图2示出了所用DNA模板的序列及其折叠结构(SEQ ID NO:6-14)。
图3A和图3B示出了均聚物序列(图3A)和非均聚物序列(图3B)的尿素-PAGE凝胶(变性凝胶(20％聚丙烯酰胺-8M尿素)。所述模板均含有发夹，因此在变性凝胶(20％聚丙烯酰胺-8M尿素)上，如果产物完全延伸，其会显示为尖锐的较高分子量条带。图3A显示A10有时完全延伸，如由第一泳道中存在一些完全延伸的产物所证明的；C10根本不延伸；并且A10C10可形成少量的延伸产物，但聚合通常在两个位置突然停止。均聚物模板未能完全延伸。图3B显示非均聚物序列(ATC)15很容易延伸到完成。
图4示出了DNA序列(SEQ ID NO:15)和形成3、6和9个碱基对(SEQ ID NO:16-18)的切口的引物。
图5A示出了由聚合酶桥接的一对电极的示意图。
图5B示出了由三个聚合酶分子桥接的一对电极的示意图。
图6示出了从如本文所述的设备获得的电流-时间图，该设备包括一个(61)、两个(62)或三个(63)附接至两个电极的聚合酶分子。每个聚合酶分子均产生信号。
图7A至图7E示出了混沌信号和持续性信号的实例。
图8A至图8D示出了当聚合酶正在处理重复(ATC)序列时获得的电信号的数据。图8A示出了以电流-时间绘制的原始数据。图8B示出了导数-时间图。该图示出了聚合酶的不规则速度。图8C示出了电流-时间的高分辨率图。该图显示了信号中平均间隔约11.6ms的规则间隙。图8D示出了显示出间隙(宽度0.5ms)和之间的较快峰值(宽度0.2ms)的数据的一小段的脉冲宽度分布。
图9示出了由(ATC)重复组成的DNA模板的电流-时间图。在图i和iv以及ii和v中观察到重复基序，与三重序列重复一致。
图10A和10B示出了在核糖核苷三磷酸酯不存在(图10A)和存在(图10B)的情况下3D RNA聚合酶的电导分布。
图10C示出了正在加工的RNA模板的序列(SEQ ID NO.19)。
图11A和图11B示出了在核糖核苷三磷酸酯不存在(图11A)和存在(图11B)的情况下3D RNA聚合酶的电流-时间记录。
图12是例示根据本文提供的实施方案的具有桥接一对电极的链霉亲和素接触点的聚合酶的示意图。
图13示出了分子复合物和电极之间不同连接的电流-电压曲线。
图14A至图14D示出了三代聚合酶的电导分布。(图14A)Gen I-一个接触点产生2个峰，大概是因为与Ф29上的表面半胱氨酸有额外的接触。(图14B)Gen II通过硫醇化链霉亲和素连接。(图14C)Gen III通过由硫醇化生物素分子连接到电极的WT链霉亲和素连接。红色箭头指向作为第二接触点的结果出现的额外高电导峰。(图14D)当使用裸末端(Gen II，底物上的硫代链霉亲和素)时，不再观察到峰3。
图15A至图15B显示闭合(15A)至开放(15B)转换改变了聚合酶电导。(图15A)在不存在脱氧核苷三磷酸酯(dNTP)但具有被结合的模板的情况下的分布。聚合酶大多是开放的。(图15B)在被结合的不可水解的dNTP存在的情况下-聚合酶被锁定在闭合构型中。最高电导峰值从5.6nS移动到～15nS。
图16A至图16F示出对当聚合酶被激活时产生的信号的表征。图16A例示了随着STM探针漂移，通过聚合酶的电流随时间显著变化(曲线1602)。用不对称最小二乘(ALS)程序对该漂移基线电流进行拟合，以产生平滑的本底电流(曲线1601叠加在曲线1602上)。(图16B)拟合本底的扣减显示出活化聚合酶中发生的电流的快速变化。通常，动态信号以猝发(b-1603)的形式出现，该猝发中穿插有停顿(p-1604)。图16C示出了在互补核苷三磷酸酯不存在的情况下随时间记录到的电流1605和ALS拟合1606。这些数据被选择为具有与(图16A)和(图16B)中的活性聚合酶大致相同的DC电导。图16D具有扣减了基线的信号，其表明非活性系统中存在噪声1607。噪声在所有情况下都与聚合酶的接触形成一致，因此它不是随机的。图16E示出了从活化聚合酶测量的噪声信号的扩展部分，其显示出两个不同的噪声成分-大波动(LF 1608)和小波动(SF 1609)。图16F是比较来自活性(+dTTP 1610)和非活性(-dTTP1611)聚合酶的尖峰高度分布的直方图。
图17A至图17E示出了根据基线电流定义的小波动和大波动。更大的信号是使用更高电导的接触点获得的。为了量化该信号，通过将高斯模型拟合到测得的电流的分布来量化给定运行中的基线电平，其特征在于高斯峰值电流IP(图17A、17C)。双指数拟合(IS，IL)被用于给噪声信号幅度的分布进行建模。在所有情况下，当互补碱基不存在时(图17B)，拟合收敛到一个值IS＝IL。(图17D)在互补核苷酸存在的情况下，13个分子中有9个分子显示出尖峰高度的双峰分布，其中IS<<IL。(e)对IL(线1701)和IS(线1702)的值与相关基线电流值(IP)进行了作图。在线1703附近示出了对-dTTP实验拟合的单指数分布的值。线是线性拟合，产生LF＝0.25(±0.03)Ip和LS 0.07(±0.01)Ip。小波动具有与对照实验(-dTTP)中的Ip基本相同的依赖性。
图18A至图18H例示了对两个序列的噪声特征的比较。d(A)10(图18A)和d(ATC)5(图18E)的代表性原始信号(1801)和扣减了本底的信号(1802)。(图18B)和(图18F)中示出了160ms的噪声样本。这些数据是为具有恒定本底电流所选择的原始数据。它们大致说明了“25％规则”，但所示d(ATC)5数据的运行中似乎不存在小波动。(图18C)和(图18G)约1s的信号迹线的FWHM分布(指数拟合显示为细线)。(图18D)和(图18H)用对数正态分布(线)拟合的信号尖峰之间的间隔。
图19A至图19D例示了生物素结合对链霉亲和素电导的影响。图19A示出了用裸探针以2.5nm间隙测量的硫醇化链霉亲和素的电导分布。当间隙增加到3.5nm时，几乎没有收集到数据(参见图20A和20B)。图19B显示了添加单生物素化Gen I聚合酶后，以较大间隙(3.5nm)获得了完全不同的电导分布。图19C示出了经由硫醇化链霉亲和素与电极接触的Gen III双生物素化聚合酶的电导分布，图19D示出了如被结合到经由硫代生物素配体连接到电极的WT链霉亲和素的Gen III双生物素化聚合酶的电导分布。
图20A和20B例示了Ф29和链霉亲和素的电导分布。图20A示出了与电极上的链霉亲和素结合的Gen I单生物素化Ф29的作为间隙尺寸的函数的电导分布。图20B示出了单独的链霉亲和素的作为间隙尺寸的函数的电导分布。
图21例示了闭合形式的Ф29的电导分布的重复测量。
图22例示了活性聚合酶的电导分布。图22示出了在模板和dNTP存在的情况下Ф29的电导分布。最高电导特征已从～6nS(-dNTPs)移至12nS。当聚合酶以闭合构型与不可水解的dNTP一起冷冻时，这会增加到15到20nS。
图23提供了活性聚合酶的电流-电压曲线。图23示出了从活性聚合酶获得的IV曲线的实例(参见图22)。箭头指向低于±100mV的正常安静区域中的大噪声尖峰(与图13相比)。
图24A至图24E例示了从单生物素化聚合酶获得的信号。使用Gen I单生物素化聚合酶获得的噪声信号。图24A提供了在存在被结合的模板但无dNTP的情况下的电流-时间关系。图24B中扩展了最高电流区域。基线中有很多跳跃，但没有明显的两个电平的电报噪声。图24C是添加了dNTP的电流-时间记录。噪声尖峰更明显，并且当绘制展开迹线时，图24D显示存在两个电平的随机电报噪声的明显猝发。图24E是猝发持续时间的直方图，猝发持续时间在+dNTP情况下明显更长。注意：在这些图中，电流沿向下方向增大。
图25A至图25D例示了本底扣减对聚合酶信号的影响。ALS本底扣减的影响(平滑因子＝0.1ms)。图25A和25C是相对平坦的基线区域的原始数据和扣减后的数据。图25B(原始数据)和图25D(扣减后的数据)说明了甚至在存在大基线变化的情况下噪声特征是如何得到很好的保持的。
图26A和26B显示了均聚物模板未能完全延伸。特别地，图26A和26B示出了在均聚物模板上启动聚合酶的困难。模板都含有发夹，因此在变性凝胶(20％聚丙烯酰胺-8M尿素)上，如果产物完全延伸，其会显示为尖锐的较高分子量条带。图26A，均聚物：A10有时完全延伸，如第一泳道中存在一些完全延伸的产物所证明的。C10没有显著延伸。A10C10可能会形成少量的延伸产物，但聚合通常会在两个位置突然停止。图26B显示非均聚物序列(ATC)15很容易延伸到完成。延伸产物的长度通过使用延伸长度的合成对照运行凝胶来验证。
图27A至图27C显示了尽管聚合不完全，但来自d(C)10的噪声信号是密集的。图27A是密集信号猝发的典型噪声样本。图27B示出了间隔紧密(～1ms)的脉冲，图27C示出了脉冲宽度分布中的快速(0.05ms)和较慢(0.2ms)特征。
图28A和图28B例示了活性聚合酶和非活性聚合酶的波动。针对主动转录d(ATC)5模板的38个Ф29分子(图28A)以及转录d(C)10的25个分子(图28B)，对IL(2801)和IS(2802)值与相关基线电流值(IP)进行了作图。分析遵循图17A至图17E中针对d(A)10所呈现的分析。线是线性拟合，对d(ATC)5产生的iL＝0.27(±0.03)Ip，iS＝0.04(±0.01)Ip，对d(C)10产生的iL＝0.32(±0.03)Ip，iS＝0.05(±0.007)Ip。
图29示出了傅立叶变换红外(FTIR)扫描，其显示出Pd的生物素功能化。
图30A至图30D示出了功能化Pd的CV扫描。电极的工作电势范围是由循环伏安法确定的。
图31A至图31D示出了对使被硫醇结合的吸附物不稳定的负电势的扫描，其说明了如何确定使被硫醇结合的吸附物分子膜不稳定的电极电势。
图32A至图32D显示电极在用于电子测量的电势范围内被生物分子吸附物钝化。
具体实施方式
在下面的详细描述中，参考了形成其一部分的附图，并且这些附图是通过可以实践的说明性实施方案的方式示出的。应当理解，可以使用其他实施方案，并且可以在不偏离范围的情况下作出结构或逻辑改变。因此，以下详细描述不应被视为限制性的，并且实施方案的范围是由随附的权利要求及其等同方案限定。
各项操作可能会作为多个离散操作以有助于理解实施方案的方式依次被描述；但是，描述顺序不应解释为暗示这些操作与顺序有关。
出于描述的目的，“A/B”形式或“A和/或B”形式的短语表示(A)、(B)或(A和B)。出于描述的目的，“A、B和C中的至少一者”形式的短语表示(A)、(B)、(C)、(A和B)、(A和C)、(B和C)或(A、B和C)。出于描述的目的，“(A)B”形式的短语表示(B)或(AB)，即，A是任选的元素。
术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可能意指超过一项。
该描述可能会使用术语“实施方案”或“多个实施方案”，其各自可以指代一个或多个相同或不同的实施方案。此外，针对实施方案所使用的术语“包括/包含(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”等是同义词，并且一般意图作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有(having)”应解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等)。
术语“(大)约”意指在规定值的正或负10％以内。例如，“约100”将指代90至110之间的任何数。
关于本文中任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，本文可能明确阐述了各种单数/复数排列。
除非另有说明，技术术语均按惯例用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以参见Benjamin Lewin,Genes IX,Jones和Bartlet发表，2008(ISBN 0763752223)；Kendrew等人(编者)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.发表，1994(ISBN0632021829)；以及Robert A.Meyers(编者),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers,Inc.发表，1995(ISBN 9780471185710)；以及其他相似参考文献。
下面描述了用于本公开的实践或测试的合适方法和材料。此类方法和材料仅为说明性的，并不意图进行限制。可以使用与本文所述的方法和材料相似或等效的其他方法和材料。此外，所述材料、方法和实例仅为说明性的，并非意图进行限制。
为便于查阅本公开的各种实施方案，提供特定术语的以下解释：
生物样本：从受试者获得的含有基因组DNA、RNA(诸如mRNA)、蛋白质或其组合的生物样本。实例包括但不限于唾液、外周血、尿液、组织活检物、手术标本和尸检材料。在实施方案中，生物样本是体液，诸如血液，或其组分，诸如血浆或血清。
猝发：术语“猝发”是指电流流(current stream)的一部分，其中测得的电流在两个电平之间的变化相对于停顿更频繁，通常在停顿的一半时间内处于高状态。在实施方案中，猝发中峰值的测得的电流大于通过分子的基线电流的约20％。通常，当核苷酸正被掺入到模板序列中时会观察到猝发，因为信号的高状态出现在核苷酸掺入时。
化学修饰：许多涉及分子的化学组成或结构的改变的各种过程。在一个实例中，化学改性电极是表面经过化学转化从而具有改变的电极特性(诸如其物理、化学、电化学、光学、电学和/或传输特性)的电极。
接触：直接物理缔合的方式放置，包括固体和液体形式。
互补性：是指核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或其它非传统类型与另一核酸序列形成一个或多个氢键的能力。互补性百分比是指核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10个残基中有5个、6个、7个、8个、9个、10个残基则为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。如本文所用的“实质上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域中为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性程度，或者是指两个在严格条件下杂交的核酸。
电流流：术语“电流流”是指从本文所述的设备随时间产生的电流信号。
分离的：“分离的”生物成分(诸如核酸分子、蛋白质或细胞)已从生物体的细胞或生物体本身中的其他生物成分实质分离或纯化出来，其中该成分为天然存在，诸如其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞。已“分离的”核酸分子和蛋白质可被理解为已通过标准纯化方法进行纯化。该术语还涵盖在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
标记：能够检测的剂，例如，标记可以附接到核酸分子或蛋白质(间接或直接)，从而允许检测核酸分子或蛋白质。标记的实例包括但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶及其组合。标记方法和适合于各种目的的标记选择的指南在例如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York,1989)和Ausubel等人(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)中有论述。
连接或接头：术语“连接(的)(linked)”是指直接或间接接合(joined)在一起。例如，第一部分可以与第二部分共价或非共价(例如静电)连接。这包括但不限于使一个分子与另一个分子共价键合、使一个分子与另一个分子非共价键合(例如静电键合)、使一个分子与另一个分子通过氢键合来非共价键合、使一个分子与另一个分子通过范德华力来非共价键合，以及此类偶合的任何和所有组合。间接附接是可能的，诸如通过使用“接头”(位于两个部分之间的分子或原子团)来间接附接。
在若干实施方案中，连接的组分以化学或物理方式缔合，使得这些组分不能彼此自由分散。例如，两个组分可以彼此共价结合，因此这两个组分不能被单独地分散或扩散。
缺口：双链DNA分子中的不连续性，其中一条链的相邻核苷酸之间没有磷酸二酯键，通常是由于损伤或酶作用所致。缺口允许该链中的扭转在DNA复制过程中释放。缺口也可能在修复前导子链和滞后子链上的错误的DNA错配修复机制中发挥作用。通过创建缺口，DNA形成圆形形状。
非天然存在的或经工程改造的：此处使用的术语可互换，并表示人工参与。该术语在提及核酸分子或多肽时意指这样的核酸分子或多肽，所述核酸分子或多肽至少实质上不含至少一种在自然界中与它们天然相关且在自然界中被发现的其他成分。
核酸：脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，其可以包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸分子杂交的天然核苷酸的类似物。在特定实例中，核酸分子是单链(ss)DNA或RNA分子，诸如探针或引物。在另一个特定实例中，核酸分子是双链(ds)核酸，诸如靶核酸。术语“核苷酸”是指碱基-糖-磷酸酯组合，并且包括核糖核苷三磷酸酯ATP、UTP、CTG、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸酯，诸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。
任选的：术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生但不一定发生，并且该描述包括其中所述事件或情况发生的例子以及所述事件或情况不发生的例子。
停顿：术语“停顿”是指电流流的这样的部分，其中测得的电流的波动被持续时间约为相邻特征的持续时间两倍的较慢特征中断。通常，在核苷酸已被掺入到模板序列中之前和之后观察到停顿，并且随着核苷酸三磷酸酯的浓度降低，该停顿的持续时间相对于相邻的电流脉冲增加。
聚合酶：合成长链聚合物或核酸的酶。DNA聚合酶和RNA聚合酶被用于组装DNA和RNA分子，这分别通过利用碱基配对相互作用复制DNA模板链或者通过半梯形复制(halfladder replication)复制RNA来进行。
引物：短核酸分子，例如长度为10-100个核苷酸(诸如长度为5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个核苷酸)的DNA寡核苷酸。可以通过核酸杂交使引物与互补的靶核酸链退火，以在引物和靶核酸链之间形成杂交。可诸如通过PCR或本领域已知的其他核酸扩增方法来将引物用于扩增核酸序列。
探针：用于通过分子杂交检测互补序列的存在的短核苷酸序列，诸如长度为至少8个、至少10个、至少15个、至少20个或至少21个核苷酸的短核苷酸序列。在特定实例中，寡核苷酸探针包括允许检测寡核苷酸探针:靶序列杂交复合物的标记。实验室标准和值可以基于已知或确定的群体值来设定，并且可以以允许比较测量的、实验确定的值的图形或表格的格式提供。
蛋白质：术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”可互换地指代通过肽键或肽键模拟物接合的氨基酸和/或氨基酸类似物的聚合物。二十种天然存在的氨基酸及其单字母和三字母命名如下：丙氨酸A Ala；半胱氨酸C Cys；天冬氨酸D Asp；谷氨酸E Glu；苯丙氨酸F Phe；甘氨酸G Gly；组氨酸H His；异亮氨酸I He；赖氨酸K Lys；亮氨酸L Leu；甲硫氨酸M Met；天冬酰胺N Asn；脯氨酸P Pro；谷氨酰胺Q Gln；精氨酸R Arg；丝氨酸S Ser；苏氨酸T Thr；缬氨酸VVal；色氨酸wTrp；以及酪氨酸Y Tyr。在一个实施方案中，肽是抗体或片段或其部分，例如，上面列出的任何片段或抗体链。在一些实施方案中，肽可以是经翻译后修饰的。
在足以满足以下的条件下：用于描述允许期望活性的任何环境的短语。
II.设备、系统和使用方法
本公开提供了用于直接测量聚合酶活性的设备、系统和方法。在一些实施方案中，提供了用于直接测量聚合酶活性的设备。在实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是RNA聚合酶。
在实施方案中，设备包括第一电极和第二电极，第一电极和第二电极被间隙隔开；以及附接到一个或两个电极的聚合酶；其中，第一电极和第二电极具有形成于其中的开口。
在实施方案中，设备包括第一电极和第二电极，第一电极和第二电极被间隙隔开；以及附接到一个或两个电极的聚合酶。
在一些实施方案中，设备包括：
(a)介电基板；
(b)第一电极，其设置于介电基板上；
(c)绝缘介电层，其设置于第一电极上；
(d)第二电极，其设置于绝缘介电层上；
(e)钝化层，其设置于第二电极上；以及
(f)聚合酶，其附接到一个或两个电极；
其中，第一电极、绝缘介电层、第二电极和钝化层具有形成于其中的开口。
在一些实施方案中，设备包括：
(a)介电基板；
(b)第一电极，其设置于介电基板上；
(c)第二电极，其设置于绝缘介电层上；
(d)钝化层，其设置于电极顶部上；以及
(e)聚合酶，其附接到一个或两个电极；
其中钝化层具有形成于其中的开口。
在一些实施方案中，设备包括：
(a)第一电极和第二电极，第一电极和第二电极共面且被间隙隔开，且与第二电极一起位于一个平面内；
(b)聚合酶，其附接于第一电极或第二电极中的至少一者，诸如通过第一附接位点附接到第一电极并在第二附接位点处附接到第二电极，使得当聚合酶经受开放至闭合的构象变化时第一附接位点和第二附接位点相对于彼此不移动；并且
其中第一电极和第二电极被配置为与待分析的样品接触。
在电极是平面的实施方案中，所述设备的有利之处是不需要介电层。需要介电层的设备可能存在缺陷。介电层需要粘附层粘附到电极上。这些粘附层在暴露于空气中后可能会氧化，这实际上会增加电极之间的间隙尺寸。为了补偿该影响，可以将介电层做得更薄。然而，薄介电层容易出现可能难以消除的针孔。
在本文所述设备实施方案的每一个中，第一电极和/或第二电极包含选自由金、铂、钯和钌或其合金组成的组的金属。在一些实施方案中，金属是钯。
在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约10.0nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约7.5nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约1.0nm至约5.0nm的宽度。在一些实施方案中，所述间隙具有约4.0nm至约5.0nm的宽度。
聚合酶上的附接点
聚合酶在一个实施方案中可以附接到一个电极，而在第二实施方案中可以附接到两个电极。聚合酶可以直接或间接附接到一个或多个电极。在一些实施方案中，聚合酶在第一附接位点处附接到第一电极，而在第二附接位点处附接到第二电极。在一些实施方案中，聚合酶在聚合酶的第一位点(诸如在聚合酶的n末端)和位于聚合酶的非活性区中的第二位点处附接到电极。在一些实施方案中，第一附接位点被特异性修饰用于在一个电极处附接，而第二附接位点是非特异性的，但在聚合酶的非活性区域内。在一些实施方案中，聚合酶是通过接头附接到一个或多个电极。在一些实施方案中，聚合酶是通过与附接到电极的配体相互作用而间接附接到电极。在一些实施方案中，聚合酶被修饰成掺入了配体结合位点。在一些方面，聚合酶是生物素化聚合酶。在一些方面，聚合酶包含Avitag。在一些方面，聚合酶是生物素化聚合酶，并且通过链霉亲和素附接到电极。在一些实施方案中，聚合酶被修饰成掺入了Streptag。
在一些实施方案中，聚合酶被修饰成掺入了允许其他化学基团与电极进行以点击化学方式附接的氨基酸残基(例如，4-叠氮基-L-苯丙氨酸)。当聚合酶附接到两个电极时，两个附接点之间的距离为至少约1nm至约聚合酶的总尺寸。在一个实施方案中，所述距离是从约1nm至约20nm。在实施方案中，所述距离是约1nm至约10nm。在实施方案中，所述距离是约1nm至约5nm。在实施方案中，所述距离是从约3nm至约7nm。在另一个实施方案中，所述距离是从约5nm至约6nm。在实施方案中，所述距离是约1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm。在实施方案中，所述距离是不超过约10nm，诸如不超过10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm或3nm。
当聚合酶附接到两个电极时，当聚合酶经受开放至闭合的构象变化时，两个附接点不得相对于彼此移动。许多聚合酶的晶体结构都有开放式和闭合式两种形式(例如，参见www.rcsb.org/)。因此，当选择两个附接点时，两个残基(例如，附接点)必须彼此隔开，并且在开放式和闭合式两种形式下具有相同的原子坐标。在实施方案中，附接位点在聚合酶的非活性区域中。
当聚合酶包含两个Avitag接头时，结合两个链霉亲和素分子的能力是由在蛋白质凝胶上形成适当的产物来证明，如图1B所示。
经修饰的聚合酶必须有效地起作用，如图1C中的滚环扩增测定所示出的。注意，该测定表明，附接到链霉亲和素分子线的经修饰的聚合酶在环状模板上连续重复地进行聚合。因此，环状模板可以用于给定分子的重复测序。
在一些实施方案中，聚合酶掺入有插入的柔性序列，如图1A所示。考虑了任何肽都可以用作柔性序列，只要(a)它不形成α螺旋或β折叠以及(b)序列中的残基不会使pI相对于未修饰的聚合酶的pI发生实质性改变(即，变化小于一个pH点)即可。示例性柔性序列是GASSGNSTNGTSNGSS(SEQ ID NO:20)。
聚合酶模板
在一些实施方案中，设备进一步包含核酸模板。核酸模板在一个实施方案中是DNA模板，而在第二实施方案中，核酸模板是RNA模板，诸如具有9个或更多个核苷酸或碱基(诸如9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个等核苷酸或碱基)的核酸模板。
为了使聚合酶以最大速度运行，并且为了使电信号易于被处理，要求聚合酶不会被DNA模板形成的二级结构阻滞或阻碍。在模板含有单链区域的情况下尤其如此。图2以及实施例部分提供了可以使用的示例性引物模板。图3示出了变性凝胶上聚合反应的产物。因为模板是由发夹自引发的(图2)，聚合酶对模板的完全延伸仅产生一种处于完全聚合链的分子量下的产物。图3显示这仅仅是均聚物d(ATC)5的情况。
为了使该技术对基因组DNA起作用，模板必须是双链的，以去除由单链DNA形成的二级结构。尽管如此，预计阻碍仍将存在。下面讨论从信号中识别那些区域的方法。聚合酶Ф29具有极好的链置换活性，但不能在具有仅一个核苷酸的缺口处有效启动。为了解决该问题，可以使用具有更大缺口的引物库。图4中提供了示例性引物。
本公开还提供了用于直接测量聚合酶活性的系统。该系统包括如本文所述的设备；用于引入核酸模板和dNTP的装置；用于在有价值的第一电极和第二电极之间施加偏压的装置；以及用于监测随着dNTP与聚合酶相互作用而发生的波动的装置。
使用方法
本公开提供了使用本文所述设备的方法。在第一实施方案中，本公开提供了用于检测核苷酸掺入的方法。在第二实施方案中，本公开提供了确定核酸模板中重复的核苷酸数量的方法。在第三实施方案中，本公开提供了确定正被掺入到核酸模板序列中的核苷酸的身份的方法。在第四实施方案中，本公开提供了对核苷酸进行测序的方法。还公开了通过计数在单个核苷酸存在的情况下停顿-猝发-停顿序列的重复次数来对均聚物序列进行测序的方法。进一步地，公开了在间隙/结合处(junction)中存在超过一个分子的情况下分析电流信号的方法，其中对信号电平进行计数，诸如信号电平为2表示结合处中存在1个分子，信号电平为3表示存在2个分子等。
活性聚合酶的识别标志(signature)是存在毫秒时间尺度的电流波动，该电流波动是流经聚合酶的直流电流的25％或更多。请参见“工程改造酶用于活性的直接电监测”。始终存在在DC电流的大约10％的数量级上的小波动，即使在不存在对聚合酶的功能至关重要的成分的情况下亦是如此。因此，10％或更小的波动表明聚合酶是无活性的。当连接到电路中时，所研究的分子中有50％至70％是有活性的。第二个限制发生在使“较宽”的电极功能化以便有足够的空间供超过一个的聚合酶分子桥接电极间隙并附接到两个电极上时。例如，如果电极长度为10nm，则只有一个聚合酶可以附接到两个电极。然而，如果电极长度为20nm，则2个聚合酶分子可以附接到两个电极。
参考图5，通过使电极足够窄，可以确保只有一个分子(2)桥接电极(1)中的间隙。然而，使窄电极功能化是困难的，因为在窄间隙中存在合适的耦合几何形状的可能性很小。然而，在较宽的电极(3)中，超过1个的聚合物可以结合。然而，如下文所讨论，由活性聚合物产生的优选信号由两个定义明确的信号电平组成。当间隙中有超过一个分子时，信号是相加的，如图6中所示，该图示出了一个设备中一个分子(61)、两个分子(62)和三个分子(63)的代表性信号。由于来自每个分子的电流由两个电平组成，因此识别含有超过一个分子的设备简单直接。此外，每个设备中的分子数量可以通过计数离散的电流电平(64)来计数。对于少数(2、3或4)个分子，可以使用已知模板序列训练机器学习算法3，以辨别出(recognize)这些来自间隙中多个分子的更复杂的信号。
过滤信号
大的信号只在活性聚合酶中观察到，但信号的性质却发生了巨大的变化，这取决于聚合酶处理模板的能力。如图3A所示，d(C)10模板几乎根本不延伸，并且d(A)10模板偶尔延伸。d(ATC)5模板有效地延伸(图3B)。相应地，来自d(A)10模板和d(C)10模板的信号是不规则的，幅度和脉冲宽度均有波动，信号在图7A和7B中被标记为“混沌(chaotic)”。相比之下，用经有效处理的d(ATC)5获得的信号在幅度上随时间是均匀的(图7C)，并被标记为“持续性(Processive)”。持续性信号是聚合酶正在通过模板进行工作的信号，而混沌信号表明聚合酶正试图安装模板。所公开的设备、系统和方法允许评估两者之间的差异。
如果模板被有效地处理，则持续性信号在延长的时间内持续，如图7E中较长的运行所证明的。在被至少部分地完全处理的模板(即d(A)10-图3A)中，混沌信号中穿插有持续性信号(图7E)。双链模板上的测序被大大简化，其中许多类型的序列都被Ф29聚合酶有效处理，产生长运行的持续性信号。即使在双链DNA中，二级结构也将阻滞聚合酶，例如在G四链体形成的G碱基的运行中。这些结构很容易通过返回到混沌信号类型来识别。在实施方案中，混沌尖峰被去除/拒绝。
判读信号
持续性运行很容易判读。高时间分辨率信号示于图8中。存在间隔约12ms的明显停顿，其对应于在饱和浓度的此处所用dNTP中的Ф29聚合酶4的已知核苷酸掺入速率(图8C中用箭头标记)。因此，持续性信号允许以简单直接的方式计数每个核苷酸掺入。这对于判读众所周知难以用现有方法进行分析的来自重复序列运行的信号极其有利。更有趣的仍是每个脉冲内的丰富细节。图9示出了来自d(ATC)5聚合物的脉冲的时间序列，该脉冲是以用罗马数字示出的时间序列采集的。信号中存在明显的三重重复(标记为1、2、3)。
三重重复在序列中具有三重重复的聚合物中的存在本身不足以识别杂聚物中的碱基。聚合酶选择性的主要因素是倒数第二个碱基和正被掺入的dNTP之间的堆积，因此与聚合酶的接触在四个核苷酸之间不会发生太大变化-也就是说，聚合酶-核苷酸接触(其可能产生核苷酸特异性信号)本身并不具有非常高的核苷酸特异性。在掺入动力学上存在序列特异性差异，而dNTP和倒数第二个碱基的各种组合在掺入动力学上的可测量的差异已被证明是聚合酶结合口袋中的碱基堆积相互作用的结果，因为进入的dNTP被装载在先前掺入的核苷酸之上。每个脉冲都是核苷酸掺入。
对这些信号进行解码的方法包括：
(a)构建双链模板，包括所有可能的16个碱基堆积组合的重复(例如，A上的A、T上的A、C上的A、G上的A等)；
(b)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；
(c)从重复序列的全部16个组合获得信号流，其中该信号流包括至少一个停顿和至少一个猝发；
(d)训练机器学习算法(Chang,S.；Huang,S.；Liu,H.；Zhang,P.；Liang,F.；Akahori,R.；Li,S.；Gyarfas,B.；Shumway,J.；Ashcroft,B.；He,J.；Lindsay,S.，Chemicalrecognition and binding kinetics in afunctionalized tunneljunction.Nanotechnology 2012,23(23),235101，其通过引用方式整体并入本文)，以辨别出与16种信号类型中的每一种相关联的猝发；以及
(e)使用该算法通过找到利用16种可能堆积组合开发的训练模型的最佳拟合来在来自杂聚物的信号中识别出每个核苷酸。因为引物模板的序列是已知的，所以起点(即紧接在掺入的第一个新核苷酸之前的核苷酸)是已知的。
该算法分析信号流以根据脉冲数量、脉冲的持续时间、如通过傅立叶变换表征的锐度(sharpness)、脉冲间隔来表征介于每个停顿之间的猝发，然后训练机器学习算法将信号特征与特定的核苷酸或核酸序列关联。
核酸
图10示出了在RNA依赖性RNA聚合酶、脊髓灰质炎病毒3Dpol(RSCPDB结构1RDR)上测量的电导分布。该聚合酶已被修饰为在其C末端包含称为Strep标签的肽序列。这与链霉亲和素结合，从而允许与电极的单一特定连接，如以下实施例中所述。图11示出了用发夹RNA模板引发的3D pol的电导分布(图10C)。聚合酶的电导显著增大，当聚合酶有活性时，其电导大于通过聚合酶的基线电流的25％，正如之前对DNA聚合酶所观察到的那样。类似地，只有当聚合酶正在使RNA模板聚合时才观察到大的电流波动，如图11所示。
实施例
实施例1
用于实施例2和代表性实施方案的材料和方法
此实施例提供了用于实施例2中所公开的研究以及用于本文所公开的代表性实施方案的材料和方法。
Avitag
Figure BDA0003389232110000231
DNA聚合酶的表达与纯化。用嵌入pET15b质粒中的不同版本的
Figure BDA0003389232110000232
基因转化大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)(Novagen)，并使其在含有氨苄西林(50μg/ml)的LB琼脂平皿(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl和1.5％琼脂)上生长以选择转化体。使细胞在LB培养基(20ml)中在37℃在振荡下生长12小时。将一部分培养物以1:1000稀释到新鲜LB培养基(1L)中，并使其在37℃在振荡下生长。当OD600达到0.6时，通过添加0.5mMIPTG诱导1L培养物，并将其在18℃保持振摇过夜。通过在1L离心瓶中在4℃以5,710g离心20分钟收获细胞，并将其储存在-80℃直到需要。
Avitag
Figure BDA0003389232110000233
DNA聚合酶的生物素化。为进行随后的BirA生物素化，将纯化蛋白质交换到含有20mM磷酸钾缓冲液pH 7.0、200mM L-谷氨酸钾盐和1mM DTT的缓冲液中。体外酶促生物素化是通过将100μg聚合酶在相同缓冲液中与10mM ATP、10mM Mg(OAc)2、50mM生物素和15个单位的BirA(亲和力)以30℃孵育1小时来进行。通过脱盐柱(GE Life Sciences)去除游离生物素。
滚环复制(RCR)ssDNA模板和引物。线性单链寡核苷酸RCR(5’-p-CCGTACGATTCGTATCTACTATCGTTCGATTCGCATCATCTA-3’；SEQ ID NO:21)被用于通过与环化连接酶(Epicentre)的酶促自连接形成环状RCR模板。将0.1nmol线性单链PCR DNA在含有50μM ATP和2.5mM MnCl2的1X反应缓冲液中与100单位的环状连接酶混合。在60℃下孵育2小时后，将产物加热至80℃，持续10分钟以灭活环状连接酶。用Exo I(NEB)消化留在溶液中的线性ssDNA。通过在含有8M尿素和20％聚丙烯酰胺的变性凝胶上电泳对RCR模板进行分析以进行质量控制。通过加热至95℃保持5分钟并逐渐冷却至室温(降低0.1℃/s)来将2.5pmol PCR模板与50pmol PCR引物(5’-GGCATGCTAAGCATAGATGAT-3’；SEQ ID NO:22)退火，并在-20℃下储存以备后用。
Avitag
Figure BDA0003389232110000241
DNA聚合酶的活性测定。针对所有版本的
Figure BDA0003389232110000242
DNA聚合酶的活性检验执行滚环复制反应。将1.25pmol RCR模板和引物复合物在含有50mM Tris-HCl pH 7.5、10mMMgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT的1X反应缓冲液中与500μM dNTP和4pmol
Figure BDA0003389232110000243
DNA聚合酶混合。将该混合物以30℃孵育1小时。将产物在0.8％琼脂糖凝胶上通过GelRed(Biotium)染色进行可视化。
功能化基底和STM探针。用于STM测量的钯基底是通过使用电子束蒸发器(LeskerPVD 75)，将200nm钯膜蒸发到带有10nm钛粘附层的硅晶片上制备的。临功能化之前用氢火焰处理基底，然后将其在硫醇化链霉亲和素(ProteinMods)或硫醇化生物素的溶液中浸没过夜。制备硫醇化生物素并将其在新鲜脱气的纯乙醇中溶解至最终浓度为50μM。用1μM的在1mM PB缓冲液中的硫醇化链霉亲和素溶液进行基底功能化。所有缓冲液和溶液都是在电导率为18.2MΩ的Milli-Q水中制备的。对于所有测量，使用氩气对1mM PB缓冲液(pH 7.4)进行脱气以避免氧气干扰。聚合缓冲液是1mM磷酸盐缓冲液pH＝7.4，4mM TCEP，10mM MgCl2和1mM dNTP和1μM模板。图1Ai至图1Aiii中示出了所用自引发模板的序列。通过傅里叶变换红外(FTIR)光谱法表征基底功能化。通过AC电化学方法，从0.25mm Pd线(California FineWires)蚀刻STM探针。为避免电流泄漏，按照前面针对金探针描述的方法，用高密度聚乙烯对探针进行绝缘。在1mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中以+0.5V偏压通过STM测试每个探针，以确保泄漏电流<1pA。为了进行功能化，将探针在配体溶液中浸渍4小时或过夜。之后将其取出，用水冲洗，用氮气轻轻吹干，立即使用。利用循环伏安法检查所使用的电势区域(+50至-50mV与Ag/AgCl，10mM KCl)是否在装配件的各个组件存在的情况下都没有法拉第电流。
STM测量。STM测量是在PicoSPM扫描探针显微镜(Agilent Technologies)上进行，使用DAQ卡(PCI-6821或PCIE-7842R，National Instruments)进行数据采集。将添加有缓冲溶液和分析物的特氟隆池(Teflon cell)用Piranha溶液清洗，然后在Milli-Q水中超声处理3次以去除残留物(注意：Piranha溶液具有高腐蚀性，操作时必须格外小心)。为了更好地控制表面电势，将带有10mM KCl盐桥的Ag/AgCl参比电极连接到基底上。首先以-0.2V的偏压将探头接合至4pA设定点电流，然后让探头在测量前保持稳定2小时。对于STM IV扫描测量，首先关闭伺服系统，并以1nm/s的速度使探头缩回ΔZ nm。之后，将探头在该高度悬挂1分钟，在此期间使用定制的Labview程序监测电流变化。一旦电流超过50pA的阈值，我们将这视为结合事件，IV扫描从-0.2V到+0.2V开始，然后返回，扫描速率为1V/s，然后是0.2s静息。随后，再次检查电流。如果电流仍然超出噪声电平的两倍(6pA)，则连续记录IV曲线，直到被结合的蛋白质分子逃逸。测量一分钟后，打开伺服系统以使探头重新接合，然后重复整个过程。在每次测量中，至少收集1000条IV曲线，从中选择出在向上扫描和向下扫描时重现的曲线(占总数的80％)，以构建电导分布直方图。电流与时间关系的迹线由另一个具有相似程序的Labview编程记录，但使偏压在探针保持过程中保持恒定。模拟-数字采样率为50KHz，大约是STM电子器件固有响应的5倍。
实施例2
蛋白质已被证明具有导电性，如果通过特异性粘合剂将蛋白质栓连到电极上，则开启了构建可通过活性的直接读出探索酶的显著化学多功能性的电子设备的可能性。如果进行两次特异性接触，单分子电导会增加十倍(二价抗体情况下可能如此)。在这里，解决了与蛋白质形成接触的问题，蛋白质与抗体不同，不具有多个天然结合位点。特别是，接触点被工程改造到Ф29聚合酶中，其中接触点被选择为使活性位点保持游离。通过将可生物素化的肽序列引入到Ф29中并用链霉亲和素将电极功能化来形成接触。Ф29由一个生物素化接触点和一个非特异性接触点连接，在被激活时显示出电流的快速小波动。信号因两个特异性接触点而大大增强，这是聚合酶的开放和闭合构象之间电导分布变化>9nS的一个特征。聚合酶活性伴随着毫秒时间尺度内电导的巨大变化。
蛋白质被普遍认为是绝缘体。细菌线中的金属传导和蛋白质多层中的长距离传导的报告被认为是例外。然而，许多仅因没有氧化还原活性(即，没有电子传输功能，没有氧化还原活性中心)而被选择的蛋白质，如果与能将电荷载体注入其内部的结合剂接触，则能很好地导电。此电导仅限于电子(或孔)，因为我们迄今为止研究的蛋白质在循环伏安法研究中起到钝化电极的作用。此外，蛋白质的内部电导对构象变化是敏感的。这些实验的关键是将抗体与利用该抗体的两个结合结构域能够结合的表位进行功能化的电极一起使用。通过记录来自大约1000个分子的电流-电压(IV)曲线并绘制从IV曲线导出的电导直方图，测量电导的扩展(归因于接触点几何形状的范围)。抗体的分布有两个峰，一个在～0.2nS(与在仅被一种配体结合的蛋白质中观察到的单峰的值相似)处，第二个峰在～10倍电导(～2nS)处。第二个峰被判读为归因于抗体的每个结合结构域处的特异性结合事件，其被附接成使得抗体桥接电极间隙。使用Fab片段(一个结合头)或用表位将两个电极中的仅一个电极功能化，证实了这一判读。还发现通过特异性结合剂接触的蛋白质的内部电导高于与接触区域相关联的电导，因此测得的电子特性不会随间隙尺寸大幅变化，直到与蛋白质失去接触。蛋白质是用途广泛的分子机器，能够进行分子识别、高选择性催化、定向能量转移、定向聚合物合成和许多其他功能，因此将蛋白质整合到生物电子设备中已成为长期追求的目标，并且在这里解决了实现与不具有多个配体结合位点的蛋白质进行特异性接触的问题，目的是展示将酶活性直接转换为电信号的设备。
选择Ф29聚合酶进行评价。它是用于DNA测序应用的优选的聚合酶，因为它具有高持续合成能力，具有高链置换活性(仅需要一个缺口来启动聚合)并且非常准确(百万分之一)。它也很快，在核苷酸三磷酸酯(dNTP)和模板的饱和浓度下每秒转换超过100个核苷酸。一旦模板和匹配的dNTP被组装并作好掺入准备，酶的主要运动就涉及将“手指”结构域封闭到“手掌”和“拇指”中。在开放-闭合-开放转换的某个时刻，酶使模板移位，使得下一个可用位点被定位用于结合互补性dNTP。
在这里，报道了将特异性结合位点工程改造成与Ф29聚合酶电接触，这通过将Avitag序列插入到该聚合酶的克隆中，随后利用BirA酶将Avitag肽序列内的赖氨酸生物素化来进行。然后，这允许与链霉亲和素进行强且特异性的结合。最初，仅在N末端(Gen I)测试了生物素化Ф29，并使其与已被硫醇化链霉亲和素覆盖的电极结合。被生物素结合的链霉亲和素成为极好的分子线，并且也有助于使Ф29(带有七个表面半胱氨酸)远离金属电极。第二接触点是在距离第一接触点(Gen II)约5nm处在(非活化)外切核酸酶结构域中的位点处引入的。第三类聚合酶(Gen III)是通过在N末端Avitag旁边掺入柔性接头来制备。最后，将硫醇化链霉亲和素与电极的直接栓连与通过使用硫醇化生物素分子使电极功能化进行的间接栓连进行了比较。测量了这两种电导分布(通过记录电流-电压(IV)曲线)，并且通过在标称恒定尺寸的间隙中通过记录被结合的聚合酶的电流-时间(I(t))来测量动态响应。两个结合位点的引入在电导分布中引入了新的高电导特征，类似于对具有两个结合结构域的抗体自然发现的第二个峰。还发现链霉亲和素经由硫醇化生物素的间接连接比经由链霉亲和素的表面硫醇化的直接连接产生更高的电导。发现Ф29的电导在闭合构象中大大增加。所测得的DC电导在开放和闭合状态之间的变化与在酶具有活性时随着时间的变化记录的通过酶的电流的大动态摆动的尺度一致。
结果和讨论
含插入的Avitag的重组Ф29DNA聚合酶构建体
起始酶是Ф29DNA聚合酶，呈现出具有D12A和D66A突变的外切核酸酶缺陷。使用Q5定点诱变试剂盒(NEB)将Avitag DNA序列插入到含有突变聚合酶基因的pET15b质粒中。图1Ai至图1C中示出了具有侧翼接头序列的等效的插入的肽序列。中心赖氨酸(K，图1Aii-iii中用箭头标记)的ε-胺使用BirA酶进行生物素化。测试了三代经修饰的酶。第一代(图1Ai)仅在蛋白质的N末端被生物素化。第二代(图1Aii)在E279和D280之间距N末端大约5nm处含有第二个Avitag。此第二个位点位于失活的核酸外切酶结构域中，因为其位置在开放至闭合转换中相对于N末端无变化而被选择。第三代(图1Aiii)含有与N末端Avitag相邻的额外柔性连接序列(GNSTNGTSNGSS；SEQ ID NO:22)，以允许接触点几何形状有更大的灵活性。通过游离的和被链霉亲和素结合的聚合酶的SDS-PAGE凝胶分析验证生物素化。图1B示出了当两个链霉亲和素与Gen III聚合酶结合时发生的分子量增加(但更高的分子量特征可能是交替的聚合酶和链霉亲和素的聚合物聚集体)。使用滚环扩增测定在体外验证了经修饰的聚合酶的活性(图1C)。
扫描隧道显微镜电导测量。
使用具有绝缘钯(Pd)探针和Pd基底的电化学扫描隧道显微镜(Pico STM，Agilent)进行测量，该绝缘钯(Pd)探针和Pd基底均处在使用盐桥接的参比电极进行的电势控制下(图12)。将电极用硫醇化生物素(SH-生物素)或硫醇化链霉亲和素修饰，然后与生物素化聚合酶溶液一起孵育(方法)。在含有MgCl2和三(2-羧乙基)膦)(TCEP)的反应缓冲液中进行测量以防止聚合酶氧化。加入核苷酸三磷酸酯以激活聚合酶。使用固定间隙(无伺服控制)测量电流-电压(IV)特性。该间隙在大约1分钟内保持恒定在约0.1nm以内，并且偏压在-0.2和+0.2V之间扫描，然后以1V/s的速率返回。没有尝试捕获蛋白质或推动或拉动蛋白质。因此，产生信号的所捕获蛋白质是处于平衡构象或接近平衡构象的跨越间隙结合的分子。1分钟后，间隙恢复到设定点值。重复此循环以获得进一步的IV扫描。80％的这些扫描完全在反转扫描方向时重现。(在多次运行中，在重新启动伺服之前记录电流以确认没有明显漂移。)
在本实施例中，探针和底物两者均用链霉亲和素功能化。因此，两个链霉亲和素分子可以跨越间隙相互接触。当链霉亲和素成功地接触时，它们重现了观察到的单个链霉亲和素分子的分布，而对于大于3.5nm的间隙，未观察到单独链霉亲和素的信号。然而，当允许生物素化聚合酶与链霉亲和素复合时，对大于4.5nm的间隙距离测量到显著电流，其电导分布与链霉亲和素的电导分布完全不同。除非另有说明，本实施例中报告的数据是在4.5nm的间隙下获得的。
图12示出了具有桥接一对电极的链霉亲和素接触点的聚合酶。如图12所示，STM探针1200被保持在导电基底1201上方约4.5nm处，被浸入在电解质中并处在经由连接到Ag/AgCl参比电极1203的盐桥(SB)1202进行的电势控制下。将该电极用硫醇化生物素1204功能化，硫醇化生物素1204捕获链霉亲和素分子(SA)1205，其然后捕获聚合酶(Ф29)1206。在电极之间施加偏压Vb 1207。保持电势以避免法拉第电流。
图13示出了Gen I和Gen II聚合酶的IV曲线的选择。正向和反向扫描叠加，这证明了重现性。来自捕获的单分子聚合酶的典型电流-电压曲线。每条迹线均是针对从-0.2V到+0.2V，然后返回到-0.2V的扫描。从这些迹线的斜率获得单个分子的电导。与Gen I聚合酶(1个生物素接触点，图1Ai-扫描被标记为1302)相比，Gen III聚合酶(2个生物素接触点，图1Aiii-扫描被标记为1301)的电流增加了大约一个数量级。
该响应是线性的，但因电压诱导的接触波动而出现±100mV以上的噪声尖峰(spike)除外。每条迹线的斜率用于计算电导G＝I/V，并且图14A至图14D中示出了三代聚合酶的电导直方图(基于各约1000次测量)。
Gen I聚合酶仅形成一个特异性接触点，但与我们过去对具有单个结合位点的蛋白质观察到的结果不同，电导分布中有两个峰值，一个在大约0.2nS处(弱非特异性结合的特征)，第二个峰在～1nS处。据信，第二个峰是由于该聚合酶中的七个表面半胱氨酸而产生的额外表面连接的结果(通过硫醇化链霉亲和素的电导在此间隙尺寸下极不可能)。该第二个峰仅在存在聚合酶时出现，并且电流分布与在较小间隙尺寸下通过单独链霉亲和素测量的电流分布完全不同。正如对其他蛋白质所观察到的那样，这些分布随间隙尺寸变化很小，直到与蛋白质失去接触。图14D示出了对在表面上具有硫醇化链霉亲和素但具有裸露(非功能化)探针的Gen II测量的电导分布。目前不存在图14B中观察到的3nS峰。总之，这些实验表明，当(a)聚合酶具有两个生物素化接触点并且(b)探针和基底两者上都存在链霉亲和素时，电导分布中出现额外的高电导特征。因此，该最高电导峰归因于桥接电极间隙的生物素介导的结合事件。
图14C示出了使用硫醇化生物素分子将链霉亲和素附接至电极表面的Gen III聚合酶的电导直方图。最高电导特征已移至5.6nS。这是生物素介导的链霉亲和素附接至电极的结果。图19A至图19C示出了如由硫醇化链霉亲和素(19C-较大峰＝3.7nS)或结合到生物素化电极(19D-峰3＝7nS)的野生型(WT)链霉亲和素连接的Gen III聚合酶的电导分布，其显示当使用特异性配体进行接触时电导增加。此外，得出的结论是，对于给定的耦合化学，额外的柔性接头的引入稍微降低了复合物的整体电导(Gen III为5.6nS–图14C，Gen II为7nS–图19D-在这两种情况下都具有生物素介导的与电极的耦合)。这些数据证明了双功能化聚合酶的成功工程改造，该酶保留了聚合酶活性同时显示出增加的电导率。
接下来评价了电子信号的构象敏感性。前面已经表明，配体结合显著改变了链霉亲和素分子的电导分布：聚合酶也是如此吗？为了探明这一点，Gen III聚合酶通过如下方式而被制作成以闭合形式稳定化：将被模板结合的聚合酶与不可水解的核苷酸三磷酸酯(NH-dNTP)一起孵育。NH-dNTP结合模板-聚合酶复合物，从而使聚合酶闭合，该聚合酶然后因不可水解的三磷酸酯而保持处于闭合构型。图15A和图15B中示出了正常、开放(-dNTP)和闭合(+NHdNTP)形式的电导分布。最高电导特征存在很大的变化(从5.6nS到大约15nS)。
最高电导特征非常小，因此重复实验以验证其存在(图21)。有趣的是，由活性形式读取的IV曲线(使用正常dNTP)产生中间电导(图22)，这意味着活性聚合酶可以保持在高电导状态足够长的时间，以在IV测量中产生增加的电导(其需要0.4s)。总之，这些测量结果表明电导分布受聚合酶构象的影响。测量活性酶的IV曲线的一个有趣结果(如图22所示)是噪声现在出现在曲线上低于100mV的通常安静的区域中(图23)。
综上所述，这些观察结果表明，由于聚合酶掺入有进入的核苷酸，因此有可能在随时间进行的电流记录中观察到聚合酶活性的迹象(I(t))。对于由15碱基对发夹引发的单链模板，I(t)是在恒定50mV偏压(低于接触噪声阈值)下记录的(方法)。为此，按照上述相同的程序概述获得IV曲线，但保持偏压恒定，并在撤回探头和重新建立伺服控制之前记录电流90s。从伺服控制下的2.5nm的间隙开始，将间隙增加到6nm，然后将尖端降低到4.5nm，然后记录电流60s。通常，前10-20s记录不到电流，之后接触得以形成并获得I(t)曲线。在这些“捕获(fishing)”尝试中>50％的尝试中，与分子形成了接触。电流在与分子接触时突然跳跃，但随后随着接触点的漂移而发生重大变化。典型的电流-时间迹线在图16A示出。通过比较在电流-时间迹线中测量的电流分布和从与分子多次重复接触获得的电导分布，我们已证明电流-时间迹线的变化可以通过接触点的变化来解释。
噪声分析。
首先研究了具有单一接触点的Gen I聚合酶。当通过添加互补dNTP激活聚合酶时，噪声的猝发清晰可见(图24A)。然而，电流一般较低(参见图14A中的电导分布)，信号电平也是如此。正是出于这个原因，我们构建了双功能化聚合酶，其产生了更高的电导特征，如图14B和图14C中所见。图16A示出了在聚合缓冲液中在存在全部四种dNTP时d(A)10单链模板的典型I(t)迹线(黑色迹线，大部分被重叠的红色迹线掩盖)(方法)。本底电流的大变化掩盖了波动，因此使用非对称最小二乘(ALS)拟合去除本底。ALS准确地跟踪本底而不会使噪声信号失真(图25A至图25D)。(尝试用中值滤波器去除本底会使噪声信号失真。)在图16A中，原始数据的ALS拟合叠加在原始数据上。图16B中示出了通过从原始数据中扣减ALS拟合获得的平坦噪声迹线。噪声信号非常大，在这种情况下超过了nA，并且以猝发的形式出现，它们之间有停顿，但没有发现可辨别的重复模式。选择相似总DC电导的对照信号(图16C)，将其置于仅含有dATP、dCTP和dGTP但不含必要的dTTP的缓冲液中。按照针对活性分子概述的相同扣减程序，获得了噪声迹线，如图16D所示。结果显然不是随机噪声，因为它与分子被接触的时间完全一致。在其他八个对照实验中观察到了相同的行为。因此很明显，活性聚合酶和非活性聚合酶两者都会产生电噪声。鉴于可变的本底信号和波动的随机性，我们能否区分活性聚合酶和非活性聚合酶？以更高的时间分辨率检查噪声信号的细节提供了线索。图16E示出了含有大波动(LF)和小波动(SF)的迹线。如果将对照实验(-dTTP)的波动尺寸与活性聚合酶(+dTTP)的波动尺寸分布(在大约相同的本底电流下测量)进行比较，活性聚合酶的电流波动会大很多(图16F)。比较了相似本底电流的运行，因为对许多迹线的检查表明电流波动的尺寸随着本底电流的增加而增加。
为了量化波动尺寸与本底电流之间的关系，在缓冲溶液中存在和不存在dTTP的情况下对许多分子研究了这两者的分布。对于每个分子，ALS拟合的基线电流被分箱，如图17A和17C中的实例所示。这些分布中的许多都可以通过高斯分布进行拟合。但是，有些分布则不能用高斯分布拟合-例如，本底可以在两个或三个电平之间跳跃。在这些情况下，拟合了清除了本底的最大峰。然后使用拟合的高斯分布的峰Ip来表征该运行的基线。图17B和图17D中列出了分箱噪声信号的实例。为了表征这些噪声信号，使用了双指数分布：
Figure BDA0003389232110000331
其中i是直方图电流分布的给定箱中的电流。在保留dTTP的实验的情况下(例如，图17B)，拟合全都收敛到单个指数(is＝iL)。对于存在dTTP时的记录，大多数拟合收敛于具有is＜iL的双指数分布(13个分子中有4个分子仅显示出小峰)。结果总结于图17E中。活化分子(+dTTP)显示出大波动和小波动。对照(-dTTP)仅显示出小波动，基本上等于在活性聚合酶中也可看到的小波动。如三个线性拟合所示，本底电流和波动幅度之间存在近似线性关系。对于大波动，活性聚合酶的特征，iL＝(0.25±0.026)ip(i是拟合的1/e值，因此也观察到较大尖峰和较小尖峰)。对于小波动，在活性聚合酶和非活性聚合酶中均存在，iS＝(0.06±0.01)ip。因此，活性状态可以由为基线电流的约25％的波动的存在来识别，而非活性状态下的波动为基线电流的约10％。正如所研究的13个分子中有4个分子没有大波动所指示的，并非所有发生接触的聚合酶分子都是有活性的。另一方面，八次-dTTP对照运行中没有一次显示出大波动(表1)。
使用在以d(ATC)5作为模板的38次运行中获得的数据重复该分析，结果显示在图28A至图28B中。大波动(LF)的拟合幅度分布显示出相当大的变化，但对于小幅度而言，对d(A)10观察到的趋势(图17A至图17E)重现良好，iL＝0.27(±0.03)Ip和is＝0.04(±0.01)Ip。
为了确认大波动(我们现在指的是基线电流的25％或更多)与聚合酶活性的关联，在不同条件下用不同模板进行了实验。在每种情况下，DNA模板都由15个碱基的双链区域组成，该区域通过9个碱基的环连接，其中ssDNA模板从发夹的5'末端延伸。ssDNA模板是(dA)10、(dC)10、(dA)10(dC)10和(dTAC)5。在反应缓冲液(1mM磷酸盐缓冲液pH＝7.4、4mMTCEP、10mM MgCl2，含1mM dNTP和1μM模板)中进行阳性实验。在对照实验中，一种关键成分被保留，如下表1中所列(其中它们被标记为对照C)。此外，使用不可水解的dNTP进行测量。对于(dA)10±dTTP，按照上文所述的那样对每次运行进行分析。
Figure BDA0003389232110000341
表1：各种实验条件下大波动的发生率(被测量分子的分数)。NH＝不可水解的dNTP。大波动是通过机器拟合来识别，该拟合收敛于双组分波动分布。
保留对聚合酶功能至关重要的任何一种成分似乎都可以消除大波动。有趣的例外是仅dTTP存在时的(dA)10(dC)10。有人预计聚合酶会到达A束的末端，然后因缺乏缺失的dGTP核苷酸而停止，但事实并非如此。为了进一步研究聚合酶的行为，对所有四种模板运行聚合反应的变性凝胶。由于引物终止于发夹，因此变性聚合产物在凝胶上产生更高分子量的特征，如果反应完成，则引物的分子量没有特征。结果见于图26A和图26B。虽然单链均聚物以前已用于不同聚合酶运动的研究，但众所周知，聚合酶在遇到单链DNA模板中的二级结构时往往会停滞。凝胶显示完全延伸的唯一模板是d(ATC)5。d(A)10在很大一部分事件中完全延伸。d(C)10似乎根本没有延伸，这非常令人惊讶，因为来自该模板的噪声信号非常密集(图27A至图27C)。d(A)10d(C)10在一部分情况下延伸，但仅延伸到A束(tract)的末端。因此，聚合酶很可能从该模板上脱落，仅在dTTP存在的情况下允许再次开始聚合，解释了不存在dGTP时观察到的活性(表1)。在该实验中观察到更长的停顿，这可能与聚合酶脱落并必须结合新模板一致。
研究了两个不同序列的噪声细节，以研究当改变模板序列时是否有任何噪声特征改变。由于酶对C束的活性较差，无法比较均聚物模板，因此我们比较了d(A)10和d(ATC)5。图18A示出了d(A)10(a)和d(ATC)5(e)的原始数据，其中提取的噪声识别标志绘制在下面。尽管展平算法不会显著扭曲信号，但波动幅度会受到基线电流变化的影响，如上所述。为此，寻找基线恒定且噪声信号密集的区域。图18B和图18F示出了两个代表性样品。这些噪声信号的差异是显而易见的。在A或C均聚物中与此类似的所有运行都有显著的幅度波动。由于基线电流(以及接触点)在所检查区域中是恒定的，因此这些波动反映了聚合酶的行为。另一方面，ATC聚合物信号具有许多波动幅度(在恒定基线电流下)恒定长达0.5秒的区域，这是获得的最长的恒定基线信号。该差异可能与在生化测量中观察到的持续合成能力上的差异有关(图26A和26B)。令人惊讶的是，尽管存在d(C)10几乎没有延伸的事实，但从模板d(C)10获得的信号与从d(A)10获得的信号相似(图27A至图27C)。因此，在A和C均聚物中观察到的相当混沌的信号可能反映了聚合酶在这些模板上的随机运动。相比之下，易于处理的d(ATC)5产生可能更容易判读的稳定信号区域。峰宽(图18C和图18G)和脉冲之间的间隔分布(图18D和图18H)表明，两个模板之间的峰特征和峰频率存在一些差异。
此外，图29示出了傅立叶变换红外(FTIR)扫描，其显示出Pd的生物素功能化。进一步地，图30A至图30D示出了功能化Pd的CV扫描。电极的工作电势范围是由循环伏安法确定的。将Pd基底切成0.5cm×4.0cm尺寸并用作工作电极，活性电池面积约为0.5cm×1.0cm。在功能化之前，用氢火焰处理基底。在恒电位仪(型号AFCBP1，Pine Instruments)上，使用Pt丝作为对电极、Ag/AgCl(3M KCl)作为参比电极进行循环伏安测量。最大扫描范围是从-0.5V至+0.5V，扫描速率为10mV/s，从±0.05V开始，以0.05V增量增加扫描范围。(图30A)裸Pd。(图30B))用SH-生物素(50μM，过夜)功能化。(图30C)添加有链霉亲和素(1μM，0.5h)。(图30D)和加入Gen IIIФ29聚合酶(1μM，2小时)后。示出了最高偏压下的两次重复扫描，其显示吸附物有些不稳定。
图31A至图31D显示了对使被硫醇结合的吸附物不稳定的负电势的扫描，说明了如何确定使被硫醇结合的吸附物分子膜不稳定的电极电势。图31A示出了对裸Pd重现孔的重复扫描(HA是氢吸附峰)。在用生物素(图31B)、生物素加链霉亲和素(图31C)和生物素加链霉亲和素加Ф29聚合酶(图31D)功能化时，HA峰最初移动到相对于裸Pd更负的电势，向上移动到在裸Pd中观察到的电势，与通过硫醇还原对吸附物的剥离一致。
图32A至图32D显示电极在用于电子测量的电势范围内被生物分子吸附物钝化。特别地，图32A至图32D显示了如何使用循环伏安法来确定电极被生物分子吸附物钝化的电势范围。(图32A)裸Pd上的重复扫描。用生物素(图32B)、生物素加链霉亲和素(图32C)和生物素加链霉亲和素加Ф29聚合酶(图32D)功能化时，电极变得越来越钝化。这些测量结果说明这些电子导电膜不与溶液中的离子交换电荷。
总结
通过将两个接触点工程改造到聚合酶中产生了比仅用一个经工程改造的接触点和第二个非特异性接触点观察到的电导分布特征大约3至10倍的电导分布特征。如果使用生物素将链霉亲和素锚定到电极上，而不是通过硫醇化表面赖氨酸进行通常的锚定，则链霉亲和素和双生物素化Ф29的复合物的电导会进一步增加。当聚合酶Ф29发生从开放到闭合的转换时，电导率发生显著变化，并且这些变化可以随着幅度为本底电流的大约25％(或更大)的快速噪声尖峰的发生而被动态地检测。当聚合酶没有活性时，会产生类似但小很多的信号。这些小信号也与本底电流成正比(大约6％)，并且存在于静息聚合酶和活性聚合酶两者中。信号幅度和本底电流之间比例关系的这项观测结果对信号产生机制的模型有影响。蛋白质分子中电子衰变长度的测量结果表明，小接触点电导对总电导有很大贡献，这显著限制了总电导。电子衰变长度的测量结果还表明，衰变长度在蛋白质尺寸的数量级上，因此无法区分缓慢的指数衰减和其中电流衰减与1/(长度)成比例的电阻模型。这两个模型预测了测得的电流对分子内部变化的不同依赖性。在电阻器模型中，接触电阻为RC，内部分子电阻为R，并且与构象转换相关联的变化为δR，发生转换时电流的分数变化为δi/i＝δR/(RC+R+δR)。在基于转换概率的模型中，电流波动与与构象传递(conformationaltransmission)相关联的变化和电荷注入概率的乘积值成正比，因此再次与基线电流成正比。然而，由于斜率对Rc的依赖性，因此电阻模型意味着δi和i之间为非线性关系。
虽然本文已经说明和描述了某些实施方案，但本领域的普通技术人员将理解，考虑用为实现相同目的而计算的各种替代和/或等同实施方案或实现替换所示和所述的实施方案，而不偏离该范围。本领域技术人员将容易理解，实施方案可以以非常广泛的多种方式实现。本申请旨在涵盖本文讨论的实施方案的任何修改或变化。因此，显然意图实施方案仅受权利要求及其等同方案来限制。
序列表
<110> 代表亚利桑那大学的亚利桑那校董事会(Arizona Board of Regents onbehalf of Arizona State University)
林赛，斯图尔特(Lindsay, Stuart)
张宾天(Zhang, Bintian)
邓汉清(Deng, Hanqing)
<120> 核酸序列的直接电读出
<130> 131849-254918
<150> 62/864174
<151> 2019-06-20
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
20 25 30
His Glu Gly Ala Ser Ser
35
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
20 25 30
His Glu Gly Ala Ser Ser Gly Asn Ser Thr Asn Gly Thr Ser Asn Gly
35 40 45
Ser Ser
50
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 3
Ser Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His
1 5 10 15
Glu Gly Ala Ser Ser
20
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸滚环模板
<400> 4
ccgtacgatt cgtatctact atcgttcgat tcgcatcatc ta 42
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸引物
<400> 5
ggcatgctaa gcatagatga t 21
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 6
cccccccccc aactggccgt cgttttacat atgtaaacga cggccagt 48
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 7
acattttgct gcccggtcaa cccccccccc 30
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 8
atgtaaacga cggccagtt 19
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 9
aaaaaaaaaa aactggccgt cgttttacat atgtaaacga cggccagt 48
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 10
acattttgct gccggtcaaa aaaaaaaaa 29
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 11
cccccccccc aaaaaaaaaa aactggccgt cgttttacat atgtaaacga cggccacgt 59
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 12
acattttgct gccggtcaaa aaaaaaaaac ccccccccc 39
<210> 13
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 13
atcatcatca tcatcaactg gccgtcgttt tacatatgta aacgacggcc agt 53
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 14
acattttgct gccggtcaac tactactact acta 34
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 15
tacatttgct gccggtcaat ggcattacta ctaaggcgca tcatc 45
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 16
atgatgatga tgatgatgat gatgatgatt ccgcgtagta gtag 44
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 17
atgatgatga tgatgatgat gatgcttacg cgtagtag 38
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 18
atgatgatga tgatgatgat gcttccgagt agtag 35
<210> 19
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成RNA序列
<400> 19
ggcggaauca ucucacucua caucauggcc ggccggguaa ucggccggc 49
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 20
Gly Ala Ser Ser Gly Asn Ser Thr Asn Gly Thr Ser Asn Gly Ser Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸引物
<400> 21
ccgtacgatt cgtatctact atcgttcgat tcgcatcatc ta 42
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸引物
<400> 22
ggcatgctaa gcatagatga t 21

Claims (31)

1.一种用于对核酸进行测序的设备，其包括：
至少第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极被间隙隔开；以及
聚合酶，其包含两个附接位点，第一附接位点用于将所述聚合酶附接到所述第一电极，而第二附接位点用于将所述聚合酶附接到所述第二电极，其中所述两个附接位点被至少约1nm的距离隔开，并且当所述聚合酶附接到所述第一电极和第二电极时，所述第一附接位点和所述第二附接位点在所述聚合物经受开放至闭合的构象变化时不会发生超过它们的离距(separation)的10％的相对于彼此的运动。
2.如权利要求1所述的设备，其中所述聚合酶的所述两个附接位点都在所述聚合酶的非活性区中。
3.如权利要求1或权利要求2所述的设备，其中所述两个附接位点之一位于所述聚合酶的n末端。
4.如权利要求1-3中任一项所述的设备，其中所述聚合酶的至少所述第一附接位点被特异性地化学修饰成附接至所述第一电极。
5.如权利要求1-4中任一项所述的设备，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
6.如权利要求5所述的设备，其中所述DNA聚合酶是phi29聚合酶。
7.如权利要求1-4中任一项所述的设备，其中所述聚合酶是RNA聚合酶。
8.如权利要求7所述的设备，其中所述RNA聚合酶是脊髓灰质炎病毒3D RNA依赖性RNA聚合酶。
9.如权利要求1-8中任一项所述的设备，其中所述聚合酶被修饰成掺入了配体结合位点。
10.如权利要求1-9中任一项所述的设备，其中所述聚合酶是生物素化聚合酶。
11.如权利要求10所述的设备，其中所述聚合酶是生物素化聚合酶，并且通过链霉亲和素附接到所述第一电极和/或第二电极。
12.如权利要求1-11中任一项所述的设备，其中所述聚合酶被修饰成掺入了非典型氨基酸残基，所述非典型氨基酸残基允许将一个或多个其他化学基团以点击化学方式附接至所述第一电极和/或第二电极。
13.如权利要求12所述的设备，其中所述非典型氨基酸是4-叠氮基-L-苯丙氨酸。
14.如权利要求1-13中任一项所述的设备，其中当所述聚合酶处于开放或闭合构象时，所述第一附接点和第二附接点的原子坐标相同到差异在10％以内。
15.如权利要求1-14中任一项所述的设备，其中所述第一电极和第二电极包含选自由金、铂、钯和钌或其合金组成的组的金属。
16.如权利要求1-15中任一项所述的设备，其中所述第一电极和第二电极是共面的。
17.如权利要求1-15中任一项所述的设备，其进一步包含介电基底，其中所述第一电极设置在所述介电基底上，并且绝缘介电层设置在所述第一电极上，并且所述第二电极设置在所述绝缘介电层上；以及设置在所述第二电极上的钝化层。
18.一种系统，其包括权利要求1-17中任一项所述的设备和核酸模板。
19.如权利要求18所述的系统，其中所述核酸模板是双链DNA模板，其包含至少一个超过一个核苷酸的缺口。
20.如权利要求19所述的系统，其中所述至少一个超过一个核苷酸的缺口具有九个或更多个核苷酸。
21.如权利要求18所述的系统，其中所述核酸模板是包含双链区域的环状DNA。
22.如权利要求18所述的系统，其中所述核酸模板是引发的单链RNA。
23.一种确定核酸模板序列中重复的核酸数量的方法，其包括：
(a)将包含核酸模板的溶液引入到权利要求1-17中任一项所述的设备中；
(b)测量当向所述设备施加偏压时产生的第一电流；
(c)在允许掺入与所述核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含所述dNTP的溶液引入到所述设备中；
(d)测量在步骤(c)中产生的第二电流；
(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；
(f)重复步骤(c)至(e)；
(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获取信号流，其中所述信号流包括至少一个停顿和至少一个猝发；
(h)识别在两个电流电平之间波动时间大于约40ms的电流信号部分；以及
(i)如果信号流包含大约是所述信号流中多个停顿长度两倍的停顿，则确定所述核苷酸已在所述核酸模板序列中重复。
24.一种确定正被掺入到核酸模板序列中的核苷酸的身份的方法，所述方法包括：
(a)将包含核酸模板的溶液引入到权利要求1-17中任一项所述的设备中；
(b)测量当向所述设备施加偏压时产生的第一电流；
(c)在允许掺入与所述核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含所述dNTP的溶液引入到所述设备中；
(d)测量在步骤(c)中产生的第二电流；
(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；
(f)重复步骤(c)至(e)；
(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获取信号流，其中所述信号流包括至少一个停顿和至少一个猝发；
(h)从所述猝发信号确定掺入的核苷酸的身份。
25.一种对核酸进行测序的方法，其包括：
(a)将包含核酸模板的溶液引入到权利要求1-17中任一项所述的设备中，其中所述核酸模板包含所述序列中两个连续碱基的所有可能的16种组合；
(b)在允许掺入与所述核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含所述dNTP的溶液引入到所述设备中；
(c)从所述核酸模板中的重复序列获得信号流，其中所述信号流包括至少一个停顿和至少一个猝发；
(d)使用信号分析来表征每个掺入的dNTP的猝发信号；以及
(e)应用所述信号分析对未知序列的核酸进行测序。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中预示活性聚合酶活性的波动是本底电流的25％或更多，而最高10％的波动则是无活性聚合酶的特征。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述核酸模板是双链DNA模板，其包含至少一个超过一个核苷酸的缺口。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一个超过一个核苷酸的缺口具有九个或更多个核苷酸，并且所述聚合酶是phi29 DNA聚合酶。
29.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述核酸模板是包含双链区域的环状DNA。
30.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述核酸模板是引发的单链RNA，并且所述聚合酶是RNA聚合酶，诸如脊髓灰质炎病毒3D RNA依赖性RNA聚合酶。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述引发的单链RNA是发夹引发的单链RNA。
CN202080040977.XA 2019-06-20 2020-06-19 核酸序列的直接电读出 Pending CN113924371A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962864174P 2019-06-20 2019-06-20
US62/864,174 2019-06-20
PCT/US2020/038740 WO2020257654A1 (en) 2019-06-20 2020-06-19 Direct electrical readout of nucleic acid sequences

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113924371A true CN113924371A (zh) 2022-01-11

Family

ID=74037425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080040977.XA Pending CN113924371A (zh) 2019-06-20 2020-06-19 核酸序列的直接电读出

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220316002A1 (zh)
EP (1) EP3986908A4 (zh)
JP (1) JP2022537381A (zh)
KR (1) KR20220023350A (zh)
CN (1) CN113924371A (zh)
AU (1) AU2020294800A1 (zh)
BR (1) BR112021024958A2 (zh)
CA (1) CA3140279A1 (zh)
IL (1) IL289026A (zh)
MX (1) MX2021014843A (zh)
SG (1) SG11202112851RA (zh)
WO (1) WO2020257654A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019269615B2 (en) 2018-05-17 2023-04-06 Recognition AnalytiX, Inc. Device, system and method for direct electrical measurement of enzyme activity
AU2021228647A1 (en) 2020-02-28 2022-09-22 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods for sequencing biopolymers
WO2021222791A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods for sequencing biopolymers
WO2024110463A1 (en) * 2022-11-21 2024-05-30 Gnothis Holding Ag Multiple molecular binding sites

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050074871A1 (en) * 2003-08-06 2005-04-07 Fred Albert Bridged element for detection of a target substance
US20050266456A1 (en) * 2004-04-30 2005-12-01 Li-Cor, Inc. Field-switch sequencing
US20110312529A1 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
US20120288948A1 (en) * 2010-02-02 2012-11-15 Arizona Board Of Regents Controlled tunnel gap device for sequencing polymers
CN108018270A (zh) * 2016-11-01 2018-05-11 Pgi股份有限公司 用以提升核苷酸类似物并入的重组dna聚合酶
WO2018132457A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods and systems for dna data storage
WO2018200687A1 (en) * 2017-04-25 2018-11-01 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
CN109154024A (zh) * 2016-04-29 2019-01-04 欧姆尼欧美公司 核酸序列测定方法
WO2019046589A1 (en) * 2017-08-30 2019-03-07 Roswell Biotechnologies, Inc. PROCESSIVE ENZYME MOLECULAR ELECTRONIC SENSORS FOR STORING DNA DATA

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220251638A1 (en) 2019-05-27 2022-08-11 Universal Sequencing Technology Corporation Methods to Identify Components in Nucleic Acid Sequences

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050074871A1 (en) * 2003-08-06 2005-04-07 Fred Albert Bridged element for detection of a target substance
US20050266456A1 (en) * 2004-04-30 2005-12-01 Li-Cor, Inc. Field-switch sequencing
US20120288948A1 (en) * 2010-02-02 2012-11-15 Arizona Board Of Regents Controlled tunnel gap device for sequencing polymers
US20110312529A1 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
CN109154024A (zh) * 2016-04-29 2019-01-04 欧姆尼欧美公司 核酸序列测定方法
CN108018270A (zh) * 2016-11-01 2018-05-11 Pgi股份有限公司 用以提升核苷酸类似物并入的重组dna聚合酶
WO2018132457A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods and systems for dna data storage
WO2018200687A1 (en) * 2017-04-25 2018-11-01 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
WO2019046589A1 (en) * 2017-08-30 2019-03-07 Roswell Biotechnologies, Inc. PROCESSIVE ENZYME MOLECULAR ELECTRONIC SENSORS FOR STORING DNA DATA

Also Published As

Publication number Publication date
MX2021014843A (es) 2022-01-18
EP3986908A1 (en) 2022-04-27
US20220316002A1 (en) 2022-10-06
KR20220023350A (ko) 2022-03-02
IL289026A (en) 2022-02-01
BR112021024958A2 (pt) 2022-01-25
WO2020257654A1 (en) 2020-12-24
SG11202112851RA (en) 2021-12-30
AU2020294800A1 (en) 2022-02-10
EP3986908A4 (en) 2023-07-19
CA3140279A1 (en) 2020-12-24
JP2022537381A (ja) 2022-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113924371A (zh) 核酸序列的直接电读出
US10948454B2 (en) Nanopore-based analysis of protein characteristics
JP7433300B2 (ja) 酵素活性の直接電気測定用のデバイス、システムおよび方法
AU2020277162B2 (en) Selective modification of polymer subunits to improve nanopore-based analysis
KR20180089499A (ko) 변형된 나노세공, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 용도
US20170159115A1 (en) Single molecule nucleic acid sequencing with molecular sensor complexes
RU2679494C1 (ru) Способ безметочного одномолекулярного секвенирования ДНК и устройство для его реализации
EP3802877A1 (en) Method
JP2023524079A (ja) 生体高分子の配列決定のための方法
Chang DNA sequencing by recognition tunnelling

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination