CN109154024A - 核酸序列测定方法 - Google Patents

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Abstract

提供了使用受损DNA聚合酶检测同源核苷酸的结合测序方法，所述受损DNA聚合酶具有以模板依赖性方式结合引物下游的下一个正确核苷酸的能力，但不具有促进磷酸二酯键形成所需的活性。受损DNA聚合酶的使用允许每次询问一个核苷酸，而不掺入任何核苷酸。标记的核苷酸，如荧光标记的核苷酸，可联合所述受损DNA聚合酶使用以便以快速方式测定同源核苷酸同一性。

Description

核酸序列测定方法
相关申请
本申请要求2017年1月10日提交的美国临时申请号62/444,733；和2016年4月29日提交的美国临时申请号62/329,489的权益。这些早先申请的公开内容据此以引用的方式整体并入。
技术领域
本发明一般涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及核酸测序技术。
背景
精确的多核苷酸序列测定在许多应用中都非常重要。例如，个体的遗传图谱的全面定义需要测定染色体DNA的长段序列并将其与已知序列的数据库比较。结果可确定倾向性或易感性谱以提供医学见解。同样，肿瘤谱分析也可需要精确的序列测定以测定在治疗开始之前药物治疗方案的功效。同样地，鉴别来自核酸数据库的细菌、病毒或其他病原体也可取决于精确的测序结果。
一个以上相同碱基沿着一条核酸链的序列段在混淆精确序列测定的因素之中。这些“均聚物”段可被一些测序方法所忽视，以致于当实际上存在多个时，单个碱基将被检测。一些测序方法还可存在“定相”问题，这可由均聚物段加剧。由于定相的缘故，均聚物段下游的序列测定可变得不明确。
已经开发了不同的方法来处理并解决均聚物测序问题。已采用可逆终止核苷酸来确保仅单一核苷酸被酶促掺入到生长的引物中。虽然有效，但可需要后续步骤以便在下一轮模板依赖性掺入可能出现之前从引物中除去化学终止部分。其他方法已经涉及每次仅使用一种核苷酸测量掺入信号的幅度。令人遗憾地，此方法对可被测定的序列长度施加了限制。因此，仍然需要可用于核酸测序的新方法，包括通过核酸链内的均聚物段的精确测序。
附图说明
图1是示出了结合信号强度(纵轴)随时间或反应进程(横轴)而变化的干涉测量迹线。迹线表示对照聚合酶(“CBT”)和工程化聚合酶(“TDE”)。CBT聚合酶可形成三元复合物并且掺入同源核苷酸。工程化TDE聚合酶保留在同源核苷酸存在下形成三元复合物的能力，但不能在催化Mg2+金属离子存在下掺入任何核苷酸。在结合反应中测试的核苷酸的同一性在迹线下面示出(A＝dATP；C＝dCTP；T＝dTTP；G＝dGTP)。在掺入步骤之后显示对dCTP的更高结合信号和对dGTP的较低结合信号的迹线对应于修饰的TDE聚合酶。
发明内容
第一方面，本公开涉及一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸具有与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基。所述方法包括以下步骤：(a)使引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和测试核苷酸的第一反应混合物接触。作为接触的结果，如果测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含引物模板核酸、受损DNA聚合酶和测试核苷酸的复合物。用于所述方法中的受损DNA聚合酶大体上不能在镁离子存在下催化磷酸二酯键的形成。还存在以下步骤：(b)测量在测试核苷酸存在下引物模板核酸与受损DNA聚合酶的结合，而测试核苷酸不会化学掺入到引物模板核酸的引物中。接下来有以下步骤：(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。在一个实施方案中，第一反应混合物包含催化二价金属离子。例如，催化二价金属离子可为Mg2+离子或Mn2+离子。在各情况下，测试核苷酸可包含外源性标记。优选地，测试核苷酸的外源性标记具有荧光部分，且步骤(b)涉及测量由测试核苷酸的荧光部分产生的荧光信号。更优选地，受损DNA聚合酶具有外源性标记，且步骤(b)涉及检测受损DNA聚合酶的外源性标记。当在这种情况下，受损DNA聚合酶的外源性标记可包含荧光部分，且步骤(b)可涉及测量由受损DNA聚合酶的荧光部分产生的荧光信号。一般说来，且参考前述实施方案中的任一项，引物可包含游离的3’羟基。更一般说来且参考前述实施方案中的任一项，在步骤(b)之后可有以下另外的步骤：用包含第二聚合酶和第二类型的核苷酸的第二反应混合物替代第一反应混合物，接着将第二类型的核苷酸掺入到引物模板核酸的引物中。例如，第二类型的核苷酸可为可逆终止核苷酸。然而更一般地，且参考前述实施方案中的任一项，第一反应混合物可包含Mg2+离子，且引物可包含3’羟基部分。实际上，所公开的方法的引物可为3’羟基部分。
另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列来代替SEQ ID NO:13。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶包含与此连接的报道部分。
另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列来代替SEQ ID NO:15。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶还包含与此连接的报道部分。
另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，除了在位置355处由谷氨酸替代天冬氨酸之外。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶还包含具有半胱氨酸残基的氨基酸的N端序列。更优选地，半胱氨酸残基化学连接到可检测的标记上。
另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，除了在位置532处由谷氨酸残基替代天冬氨酸残基之外。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶还包含具有半胱氨酸残基的氨基酸的N端序列。更优选地，半胱氨酸残基化学连接到可检测的标记上。
其他方面
本公开的其他方面描述于以下编号段落中。
1.一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸包含与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第一反应混合物接触，
从而如果所述测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含所述引物模板核酸、所述受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的复合物，且
其中所述受损DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；
(b)测量在所述测试核苷酸存在下所述引物模板核酸与所述受损DNA聚合酶的结合，而所述测试核苷酸不会化学掺入到所述引物模板核酸的引物中；以及
(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。
2.段落1的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含含有SEQ ID NO:12的多肽序列或含有SEQ ID NO:14的多肽序列。
3.段落1的方法，其中所述受损DNA聚合酶在二价锰离子存在下催化磷酸二酯键的形成，且其中所述第一反应混合物不含促进磷酸二酯键形成的浓度的二价锰离子。
4.段落1-3中任一项的方法，其中所述测试核苷酸包含外源性标记。
5.段落3的方法，其中所述测试核苷酸的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述测试核苷酸的荧光部分产生的荧光信号。
6.段落1-5中任一项的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含外源性标记，且其中步骤(b)包括检测所述受损DNA聚合酶的外源性标记。
7.段落6的方法，其中所述受损DNA聚合酶的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述受损DNA聚合酶的荧光部分产生的荧光信号。
8.段落1-7中任一项的方法，其中所述引物包含游离的3’羟基部分。
9.段落1-8中任一项的方法，在步骤(b)之后还包括以下步骤：用包含第二聚合酶和第二类型的核苷酸的第二反应混合物替代所述第一反应混合物，接着将所述第二类型的核苷酸掺入到所述引物模板核酸的引物中。
10.段落9的方法，其中所述第二类型的核苷酸是包含可逆终止部分的可逆终止核苷酸，且其中所述可逆终止核苷酸的掺入产生封端的引物模板核酸分子。
11.段落10的方法，还包括从所封端的引物模板核酸分子中除去所述可逆终止部分以再生所述引物模板核酸分子的步骤。
12.段落10的方法，还包括使用所述封端的引物模板核酸分子代替所述引物模板核酸重复步骤(a)-(c)。
13.段落11的方法，还包括重复步骤(a)-(c)。
14.段落1的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置381之外；或SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置558之外。
15.段落1的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置364之外；或SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置541之外。
16.段落1的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置355之外；或SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置532之外。
17.段落1的方法，其中所述第一反应混合物包含二价镁离子。
18.段落1-17中任一项的方法，其中所述第一反应混合物包含Mg2+离子，且其中所述引物包含3’羟基部分。
19.一种用于鉴别有待掺入到引物模板核酸分子中的下一个正确核苷酸的试剂盒，所述试剂盒以一个或多个容器的包装组合形式包含：
(a)受损DNA聚合酶，其与所述引物模板核酸和所述下一个正确的核苷酸形成三元复合物，但其大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；
(b)四种类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子；及
(c)四种类型的可逆终止核苷酸。
20.段落19的试剂盒，其中所述四种可逆终止核苷酸是四种非荧光可逆终止核苷酸。
21.段落19的试剂盒，其中所述受损DNA聚合酶包含可检测的标记。
22.段落19的试剂盒，其中四种类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子中的至少一种包含可检测的标记。
23.段落19的试剂盒，其中所述受损DNA聚合酶在锰离子存在下催化磷酸二酯键形成。
24.段落19的试剂盒，还包含从所述四种类型的可逆终止核苷酸中除去可逆终止部分的化学试剂。
25.段落19的试剂盒，其中所述四种不同类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子各自可由包含镁依赖性聚合酶活性的DNA聚合酶掺入。
26.段落19的试剂盒，还包含将下一个正确核苷酸掺入到所述引物模板核酸分子中的第二DNA聚合酶。
27.段落26的试剂盒，其中所述第二DNA聚合酶将所述四种类型的可逆终止核苷酸中的一种作为下一个正确核苷酸掺入。
28.段落19的试剂盒，还包含流动细胞。
29.段落19的试剂盒，其中所述四种类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子包含dATP、dGTP、dCTP、及dTTP或dUTP；且其中所述四种类型的可逆终止核苷酸包含dATP、dGTP、dCTP、及dTTP或dUTP的类似物，各类似物包含3’-ONH2可逆终止部分。
30.段落19的试剂盒，其中所述受损DNA聚合酶包含含有SEQ ID NO:12的多肽序列或含有SEQ ID NO:14的多肽序列。
31.段落30的试剂盒，其中包含SEQ ID NO:12的所述多肽序列包含SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置355之外。
32.段落30的试剂盒，其中包含SEQ ID NO:14的所述多肽序列包含SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置532之外。
33.一种包含多肽序列的突变体DNA聚合酶，所述多肽序列包含SEQ ID NO:12，
其中所述突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，及
其中所述突变体DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成。
34.段落33的突变体DNA聚合酶，其中所述受损DNA聚合酶在二价锰离子存在下催化磷酸二酯键的形成。
35.段落33的突变体DNA聚合酶，其中所述突变体DNA聚合酶的多肽序列选自由以下组成的组：
SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置381之外，
SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置364之外，及
SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置355之外。
36.段落35的突变体DNA聚合酶，其还包含与此连接的报道部分。
37.一种包含多肽序列的突变体DNA聚合酶，所述多肽序列包含SEQ NO:14，
其中所述突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，及
其中所述突变体DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成。
38.段落37的突变体DNA聚合酶，其中所述突变体DNA聚合酶的多肽序列选自由以下组成的组：
SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置558之外，
SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置541之外，及
SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置532之外。
39.段落38的分离的突变体DNA聚合酶，其还包含与此连接的报道部分。
具体实施方式
以下描述涉及一种结合测序(SBB)技术，其依赖于使用突变体、非催化的DNA聚合酶(“受损”聚合酶)。适用于实践此项技术的受损DNA聚合酶大体上不能催化引物模板核酸的引物链与进入的下一个正确核苷酸之间的镁依赖性的磷酸二酯键形成。虽然没有此催化活性，突变体酶仍保留区分同源核苷酸与非同源核苷酸的能力。在一些实施方案中，突变体聚合酶不能结合通常为催化功能所需的二价阳离子。虽然以下描述例示了在SBB背景下受损聚合酶的有用方面，但应理解聚合酶可具有包括但不限于以下的其他用途：鉴别核酸中的单一核苷酸(例如，检测单一核苷酸多态性)或结合至特定的序列以提供带有所述序列的核酸的聚合酶介导的亲和力分离。有利地，受损DNA聚合酶的使用克服了与不希望有的残余核苷酸掺入(所述残余核苷酸在洗涤步骤之后可保留)或由不完全抑制引起的不希望有的掺入有关的问题，所述不完全抑制可使用抑制聚合酶活性的非催化金属离子实现。因此，受损DNA聚合酶的使用可减少与不希望有的核苷酸掺入有关的测序假象。
简言之，包含引物模板核酸、同源核苷酸和受损DNA聚合酶的稳定复合物的形成可甚至在催化二价阳离子的存在下被检测。引物不必具有延伸封端基团且核苷酸不必具有抑制向引物中的掺入的部分。在已鉴别针对特定位置的同源核苷酸或者在至少已收集进行鉴别所需的监测或测量信息之后，引物模板核酸可与包含第二DNA聚合酶代替受损DNA聚合酶的不同反应混合物接触。当还具有同源核苷酸和适当的二阶阳离子时，第二DNA聚合酶能够将同源核苷酸在游离的3’羟基的位置处连接至引物。如果可逆终止核苷酸用于此步骤中，那么仅将出现单一掺入。
有利地，可使用以下各种类型的核苷酸实践所述技术，包含原生(例如未标记的)核苷酸、具有可检测标记(例如，荧光或其他光学上可检测的标记)的核苷酸、或标记或未标记的核苷酸类似物(例如，含有可逆终止部分的修饰的核苷酸)。此外，所述技术提供受控反应条件、序列的明确测定、试剂的低总成本和仪器的低成本。
所公开的技术可应用于结合反应，结合反应被用来通过任何手段且出于任何原因测定引物模板核酸的下一个碱基的身份。该技术可用于监测DNA聚合酶与同引物模板核酸互补的下一个正确核苷酸(例如dNTP)的特异性结合并且区分特异性结合与非特异性结合。该技术可应用于单一核苷酸测定(例如，SNP测定)，或替代地，应用于更广泛的核酸测序程序，该程序采用每次鉴别一个核苷酸的重复周期。例如，本文所提供的方法可联合结合测序程序使用，如共同拥有的由序列号14/805,381鉴别的美国专利申请(公开为美国专利申请公布号2017/0022553A1)中所述，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
定义
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有如本领域普通技术通常理解的相同含义。为了清楚起见，以下特定术语具有指定的含义。其他术语在本文中的其他部分中定义。
除非上下文另外清楚指出，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括复数个指示物。如说明书和权利要求书中所述，可使用近似的表述修饰任意定量表达，允许定量表达在不改变其所涉及的基本功能的情况下改变。因此，由术语例如“约”修饰的值不限于所规定的精确值。除非另外指出，在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、特性如分子量、反应条件等的所有数值在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，在以下说明书和所附权利要求书中给出的数值参数是近似值，其可根据本公开的组合物、装置或方法寻求获得的所需特性而变化。各数值参数应该至少按照所报道的有效数字并采用常规的四舍五入技术来解释。
如本文所用，“结合测序”是指一种测序技术，其中聚合酶与引物模板核酸的特异性结合被用于鉴别有待掺入到引物模板核酸的引物链中的下一个正确的核苷酸。特异性结合相互作用先于核苷酸向引物链中的化学掺入，且因此下一个正确核苷酸的鉴别可在下一个正确核苷酸未掺入的情况下或在掺入之前进行。
如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或本文所用的语法等价物意指至少两个共价连接在一起的核苷酸。因此，“核酸”是多核苷酸，如DNA、RNA或其任何组合，其可在核酸合成期间受到聚合酶的作用。术语“核酸”包括单链、双链或多链DNA、RNA及其类似物(衍生物)。双链核酸能有利地最小化可防碍核酸合成的二级结构。双链核酸可具有切口或单链缺口。
如本文所用，“模板核酸”是有待使用本文所公开的任何测序方法检测或测序的核酸。
如本文所用，“引物模板核酸”(或替代地，“引物模板核酸分子”)是用引物引发(即杂交至引物)的模板核酸，其中引物是具有与一部分模板核酸互补的3’端序列的寡核苷酸。引物可任选地具有游离的5’端(例如，引物与模板非共价地连接)或者引物可与模板相连(例如，经由发夹结构)。引物模板核酸包含互补引物和与其结合的模板核酸。除非明确说明，引物模板核酸可具有通过聚合酶延伸的3’端或被封端以免延伸的3’端。
如本文所用，“封端的引物模板核酸”(或替代地，“封端的引物模板核酸分子”)是被修饰以排除或防止在引物的3’端处形成磷酸二酯键的引物模板核酸。封端可例如通过在引物的3’端处的五碳糖的3’或2’位置处用封端基团进行化学修饰而完成。替代或另外，排除或防止磷酸二酯键形成的化学修饰也可对核苷酸的含氮碱基进行。包含这类封端基团中的每个的可逆终止核苷酸类似物将为本领域普通技术人员所熟知。这些类似物在引物模板核酸分子的引物的3’端处的掺入产生封端的引物模板核酸分子。封端的引物模板核酸包含互补引物和与其结合的模板核酸，所述互补引物被封端以免在其3’端处延伸。
如本文所用，“核苷酸”是包含含氮碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基的分子。该术语包括但不限于核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰以包含外源性标记或可逆终止子的核苷酸、及核苷酸类似物。
如本文所用，“原生”核苷酸是指不包含外源性标记(例如，荧光染料或其他标记)或如可表征核苷酸类似物的化学修饰的天然存在的核苷酸。适用于进行本文所述的结合测序程序的原生核苷酸的实例包括：dATP(2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸)；dGTP(2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)；dCTP(2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸)；dTTP(2’-脱氧胸苷-5’-三磷酸)；及dUTP(2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸)。
如本文所用，“核苷酸类似物”具有一个或多个修饰，如化学部分，其置换、去除和/或修饰原生核苷酸的任何组分(例如，含氮碱基、五碳糖或磷酸基)。核苷酸类似物可在核酸聚合反应中通过聚合酶而掺入或非掺入。任选地，核苷酸类似物的3’-OH基团是用部分来修饰。所述部分可为聚合酶延伸的3’可逆或不可逆终止子。核苷酸的碱基可为以下任一种或其类似物：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。任选地，核苷酸具有肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)或硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)碱基。核苷酸可包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dUTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。核苷酸还可含有DNA聚合酶的终止抑制子、双脱氧核苷酸或2’,3’双脱氧核苷酸，其缩写为ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddUTP和ddCTP)。
如本文所用，“下一个模板核苷酸”(或“下一个模板碱基”)是指在模板核酸中位于紧邻杂交引物的3’端下游处的下一个核苷酸(或碱基)。换句话说，下一个模板核苷酸位于紧邻模板中杂交至引物的3’端的碱基的5’处。
如本文所用，“封端部分”当关于核苷酸类似物使用时是核苷酸在核酸聚合反应的掺入步骤期间抑制或防止核苷酸与第二核苷酸(例如，经由引物核苷酸的3’-OH)形成共价键的一部分。“可逆终止”核苷酸的封端部分可从核苷酸类似物处移走以允许核苷酸掺入。这种封端部分在本文中被称为“可逆终止部分”。示例性可逆终止部分阐述于美国专利号7,427,673；7,414,116；和7,057,026以及PCT公布WO 91/06678和WO 07/123744中，其各自以引用的方式并入。
如本文所用，“测试核苷酸”是针对其参与还包含引物模板核酸和聚合酶的三元复合物的形成的能力进行研究的核苷酸。
如本文所用，“聚合酶”是关于核酸合成酶的通用术语，包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、引发酶和转移酶。通常，聚合酶包含一个或多个活性位点，可在这些活性位点处发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合反应的催化。聚合酶可催化核苷酸与结合至其互补核酸链的引物的3’端的聚合反应。例如，聚合酶可催化下一个正确的核苷酸经由磷酸二酯键向引物的3’氧中的添加，从而将核苷酸化学掺入到引物中。任选地，用于所提供的方法中的聚合酶是进行性聚合酶。任选地，用于所提供的方法中的聚合酶是分配性聚合酶。任选地，聚合酶不一定能够在用于本文所述的方法中的一个或多个条件下实现核苷酸掺入。例如，突变体聚合酶能够形成三元复合物，但不能催化核苷酸掺入。
如本文所用，“提供一价阳离子的盐”是在水溶液中解离以产生具有单个正电荷的阳离子的离子化合物。例如，阳离子可为金属阳离子，其中氧化态是+1。
如本文所用，“谷氨酸盐”是在水溶液中解离以产生谷氨酸阴离子的离子化合物。
如本文所用，“双相”是指其中引物模板核酸与聚合酶和测试核苷酸接触的两阶段过程。所述过程的第一相涉及引物模板核酸与聚合酶在低于饱和水平的核苷酸存在下或甚至在核苷酸不存在下的接触。术语“低于饱和”当关于结合至受体的配体(例如，结合至聚合酶的核苷酸)使用时是指低于造成至少90％的受体在平衡状态下结合至配体所需的配体浓度。例如，低于饱和量的核苷酸可产生至少90％、95％、99％或更多结合至核苷酸的聚合酶。所述过程的第二相涉及来自第一相的引物模板核酸与聚合酶在比第一相中所用更高浓度的核苷酸存在下接触，其中当反应中的核苷酸是下一个正确的核苷酸时，更高浓度将足以产生最多的三元复合物形成。
如本文所用，“提供”模板、引物、引物模板核酸或封端引物模板核酸是指制备并递送一种或许多种核酸聚合物至例如反应混合物或反应室。
如本文所用，“监测”(或有时“测量”)是指检测两个分子种类之间的可测量相互作用或结合的过程。例如，监测可涉及检测在聚合酶与引物模板核酸之间的可测量的相互作用，通常在整个程序中的各个时点。监测可以是间歇的(例如，周期的)或连续的(例如，不中断的)，并且可涉及定量结果的采集。监测可通过在结合事件期间的一段时间内检测多重信号或替代地通过在结合事件期间的单个时点或在结合事件之后检测信号来进行。
如本文所用，“接触”是指将试剂混合在一起(例如，将固定的模板核酸与包含聚合酶或聚合酶与测试核苷酸的组合的缓冲溶液混合)以便可进行物理结合反应或化学反应。
如本文所用，“掺入”或“化学掺入”当关于引物模板和核苷酸使用时指的是通过形成磷酸二酯键将同源核苷酸连接至引物的过程。
如本文所用，“延伸”是指在寡核苷酸引物和模板核酸相互退火之后的过程，其中聚合酶催化在引物的3’端处一个或多个核苷酸的添加。通过延伸添加到核酸中的核苷酸据说是被“掺入”到核酸中。因此，术语“掺入”可用于指代通过形成磷酸二酯键将核苷酸连接至引物的3’端的过程。
如本文所用，“二元复合物”是介于聚合酶与引物模板核酸(或封端引物模板核酸)之间的分子间缔合，其中该复合物不包含核苷酸分子，如下一个正确的核苷酸。
如本文所用，“三元复合物”是介于聚合酶、引物模板核酸(或封端引物模板核酸)与下一个正确的核苷酸之间的分子间缔合，所述下一个正确的核苷酸位于紧邻引物的下游处并且与引物模板核酸或封端引物模板核酸的模板链互补。引物模板核酸可包含例如具有游离的3’-OH的引物或封端引物(例如，在3’端核苷酸的碱基或糖部分上具有化学修饰的引物，其中所述修饰排除酶促磷酸二酯键的形成)。术语“稳定的三元复合物”意指具有促进或延长的存在的三元复合物或针对其的破坏已受到抑制的三元复合物。一般说来，三元复合物的稳定化防止三元复合物的核苷酸组分共价掺入到三元复合物的引物核酸组分中。
如本文所用，“催化金属离子”是指促进通过聚合酶在核酸(例如引物)的3’-OH与引入核苷酸的磷酸之间形成磷酸二酯键的金属离子。“二价催化金属阳离子”是具有二价的催化金属离子。催化金属离子可以使聚合酶、核苷酸与引物模板核酸之间的复合物形成稳定所必需的浓度存在，称为非催化浓度的金属离子。催化浓度的金属离子是指对于聚合酶来说足以催化核酸(例如引物)的3’-OH基团与引入核苷酸的磷酸基之间的反应的金属离子的量。
如本文所用，“非催化金属离子”是指当在聚合酶存在下不促进核苷酸向引物中的化学掺入所需的磷酸二酯键形成的金属离子。通常，非催化金属离子是阳离子。非催化金属离子可抑制通过聚合酶的磷酸二酯键形成，且因此可通过防止核苷酸掺入来使三元复合物稳定。与催化金属离子相比，非催化金属离子可例如经由竞争性结合与聚合酶相互作用。“二价非催化金属离子”是具有二价的非催化金属离子。二价非催化金属离子的实例包括但不限于Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Sr2+。三价Eu3+和Tb3+离子是具有三价的非催化金属离子。
如本文所用，“外源性标记”是指已被添加至测序试剂中的可检测化学部分，如核苷酸或聚合酶(例如DNA聚合酶)。虽然原生dNTP可具有特征性的有限荧光分布，但原生dNTP不包含任何外加的比色或荧光部分。相反，被修饰以包含连接到γ磷酸上的化学接头和荧光部分的dATP(2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸)分子据称包含外源性标记，因为连接的化学组分通常不是核苷酸的一部分。当然，将可检测的标记添加至核苷酸碱基中的化学修饰将被视为外源性标记。同样，被修饰以包含构象敏感性荧光染料(一旦核苷酸结合，该荧光染料便改变其性质)的DNA聚合酶也据称包含外源性标记，因为该标记通常不是聚合酶的一部分。
如本文所用，“未标记的”是指不含外加的或外源性标记或标签的分子种类。当然，未标记的核苷酸将不会包含外源性荧光标记或外源性拉曼散射标签中的任何一个。原生核苷酸是未标记分子种类的另一实例。未标记的分子种类可排除在本文中阐述或另外在与核酸测序或分析生物化学有关的领域中已知的一个或多个标记。
如本文所用，术语“固体支持物”是指不溶于水性液体中的刚性底物。底物可为无孔或多孔的。底物任选地能够吸收液体(例如，由于多孔性)，但通常将具有足够刚性以使得底物当吸收液体时大体上不溶胀并且当通过干燥除去液体时大体上不收缩。无孔固体支持物一般不能渗透液体或气体。示例性固体支持物包括但不限于玻璃和改性或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯及苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性的硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束、及聚合物。
如本文所用，“原生DNA聚合酶”是具有以下能力的修饰或未修饰的DNA聚合酶：区分同源核苷酸与非同源核苷酸；及将同源核苷酸掺入到生长的引物链中，这是通过当还提供有催化二价金属离子(例如Mg2+或Mn2+)时形成连接这两种物质的磷酸二酯键来实现。
如本文所用，“受损DNA聚合酶”是DNA聚合酶的突变形式，其中突变体能够鉴别下一个正确的核苷酸与不正确的核苷酸(例如，能够与引物模板核酸和同源核苷酸形成模板依赖性复合物)，但不能催化引物与同源核苷酸之间的磷酸二酯键形成。例如，原生DNA聚合酶的一个或多个氨基酸位置可被修饰(例如，通过编码相同物质的多核苷酸的定点诱变和/或通过在多核苷酸中的一个或多个位点的化学修饰)以产生受损DNA聚合酶。
如本文所用，“试剂盒”是含有一种或多种组分的包装单位，所述一种或多种组分可用于进行如本文所公开使用受损DNA聚合酶的检测和/或测序反应。典型的试剂盒可在一个或多个容器或小瓶中包括用于程序中的试剂的包装组合。
结合测序
本文描述了基于聚合酶的核酸结合测序(SBB)反应，其中受损DNA聚合酶一旦遇到引物模板核酸分子和下一个正确的核苷酸便会经历构象转变。受损DNA聚合酶不能催化磷酸二酯键形成，且因此逗留在本文中称为“三元”复合物的复合物中。通过任何方法对三元复合物的检测是用于检测同源核苷酸的替代方案。
所公开的方法具有与常规SBB技术(在由序列号14/805,381鉴别的共同拥有的美国专利申请中公开)相同的许多特征，这将在下文中概括地描述。当然，通过用于检查步骤的相同酶进行的基于镁的催化不适用于受损DNA聚合酶。
在一个步骤中，聚合酶结合至引物模板核酸以形成二元复合物，在本文中也称为插入前构象。在后续步骤中，结合引入的核苷酸并且聚合酶指闭合，形成包含聚合酶、引物模板核酸和核苷酸的化学反应前构象；其中结合的核苷酸并未掺入。此步骤(在本文中也称为“检查”步骤)可继之以化学步骤，其中磷酸二酯键是伴随焦磷酸从核苷酸上的裂解而形成(即，核苷酸掺入)。聚合酶、引物模板核酸和新近掺入的核苷酸产生化学反应后的翻译前构象。由于化学反应前构象和易位前构象都包括聚合酶、引物模板核酸和核苷酸，其中聚合酶处于闭合状态，所以任一构象在本文中可被称为闭合复合物或闭合的三元复合物。在闭合的插入前状态下，二价催化金属离子如Mg2+介导快速化学反应，该反应涉及通过引物的3’羟基对焦磷酸(PPi)的亲核置换。一旦PPi释放(即易位后步骤)，聚合酶便回到开放状态，且易位引发下一轮反应。虽然闭合复合物可在二价催化金属离子(例如Mg2+)不存在下形成，但闭合复合物的聚合酶善于在当提供有具有可利用的3’羟基的适当底物时在二价金属离子存在下进行核苷酸的化学添加。低或不足水平的催化金属离子如Mg2+造成下一个正确核苷酸在闭合复合物中的非共价(例如物理)隔离。此闭合复合物可被称为稳定的或捕获的闭合复合物。在如上所述的任何反应步骤中，聚合酶构型和/或与核酸的相互作用可在检查步骤期间监测以便鉴别模板核酸序列中的下一个正确的碱基。在掺入之前或之后，反应条件可转变为使聚合酶从引物模板核酸上脱离，且再次转变为从局部环境中移除抑制聚合酶结合的任何试剂。
一般说来，SBB程序包括鉴别下一个模板碱基的“检查”步骤和任选使用的“掺入”步骤，该步骤将一个或多个互补核苷酸添加到引物模板核酸的引物组分的3’端中。有待添加的下一个正确核苷酸的身份是在所述核苷酸通过共价键化学键联至引物的3’端未发生下或之前进行测定。检查步骤可涉及提供有待用于程序中的引物模板核酸，及使引物模板核酸与聚合酶(例如DNA聚合酶)接触，以及将一个或多个测试核苷酸研究作为可能的下一个正确核苷酸。此外，存在涉及以下的步骤：监测或测量在测试核苷酸存在下聚合酶与引物模板核酸之间的相互作用。任选地，相互作用可在稳定剂存在下发生，由此聚合酶-核酸相互作用在下一个正确的核苷酸存在下是稳定的。再者，检查步骤鉴别或测定下一个正确的核苷酸的身份，而无需掺入所述核苷酸。换句话说，当使用标记或未标记的核苷酸进行一个或多个检查周期时，下一个正确核苷酸的身份可在不将核苷酸化学掺入到引物中的情况下测定。
尽管涉及单个模板核酸分子的方法可出于方便而描述，但这些方法是示例性的。本文所提供的测序方法容易包括多个模板核酸，其中所述多个核酸可为单个核酸或不同核酸(包括组合)的克隆扩增拷贝，如被克隆扩增的不同核酸的群。因此，这种测序方法在本文中完全公开。
检查步骤
根据本文所述的技术的检查步骤通常包括以下子步骤：(1)提供引物模板核酸(即，与引物杂交的模板核酸分子，所述引物任选地可被封端以免在其3’端处延伸)；(2)使引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和至少一个核苷酸的反应混合物接触；(3)在核苷酸存在下且无任何核苷酸化学掺入到引物模板核酸中的情况下监测受损DNA聚合酶与引物模板核酸分子的相互作用；以及(4)使用所监测的相互作用鉴别模板核酸中的下一个碱基(即，下一个正确的核苷酸)。任选地，引物模板核酸分子最初可在接触任何核苷酸之前在核苷酸不存在下与受损DNA聚合酶接触。引物模板核酸的引物可为可延伸的引物。当测试核苷酸的碱基与引物模板核酸分子的下一个碱基互补时，引物模板核酸、受损DNA聚合酶和测试核苷酸能够形成三元复合物。当测试核苷酸的碱基不与引物模板核酸分子的下一个碱基互补时，引物模板核酸和受损DNA聚合酶能够形成二元复合物。任选地，接触在较之二元复合物的形成更有利于三元复合物形成的条件下进行。鉴别步骤可包括鉴别与引物模板核酸的下一个碱基互补的核苷酸的碱基。任选地，这包括使三元复合物与具有不同核苷酸组成的一种或多种洗涤溶液接触，所述核苷酸组成允许三元复合物的选择性维持或解离。
可重复所有这些步骤一次或多次以获得广泛的序列信息。例如，三元复合物最初可通过使引物模板核酸(任选地包含封端的3’端)与受损DNA聚合酶(任选地用外源性标记来标记)和一个或多个核苷酸(任选地包含一个或多个外源性标记)接触而形成。缓冲液条件可改变以便于三元复合物与仅包含用于形成三元复合物的核苷酸子集的洗涤溶液接触。任选地，此缓冲液包含与用于形成三元复合物相同的受损DNA聚合酶。可监测三元复合物中的受损DNA聚合酶和/或核苷酸的相互作用以便测定三元复合物是否保持稳定(由此表明洗涤缓冲液中的一种核苷酸对应于同源核苷酸)或变得不稳定(由此表明缓冲液不再含有同源核苷酸)。可重复洗涤步骤直到三元复合物通过逐渐省去先前洗涤周期过程中存在的一种核苷酸而变得不稳定。任选地，同源核苷酸可在一次或多次试剂交换之后通过第二DNA聚合酶掺入。
可重复所有这些步骤一次或多次以获得广泛的序列信息。例如，可重复接触和监测步骤一次或多次。任选地，使用包含受损DNA聚合酶和第一测试核苷酸的反应混合物重复接触和监测步骤。任选地，使用包含受损DNA聚合酶和第二核苷酸的反应混合物重复接触和监测步骤。任选地，使用包含受损DNA聚合酶和第三核苷酸的反应混合物重复接触和监测步骤。任选地，使用包含受损DNA聚合酶和第四核苷酸的反应混合物重复接触和监测步骤。
在本文所提供的测序方法中，用于形成包含受损DNA聚合酶和至少一个测试核苷酸的三元复合物的反应混合物可包含至少1、2、3或4种类型的核苷酸分子(例如，标记或未标记的核苷酸)。替代或另外，反应混合物可包含至多4、3、2或1种类型的核苷酸分子。任选地，核苷酸是选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP的原生核苷酸。任选地，反应混合物包含一个或多个三磷酸核苷酸和一个或多个二磷酸核苷酸。任选地，在引物模板核酸、受损DNA聚合酶与包含在反应混合物中的四种核苷酸分子中的一种之间形成闭合复合物。
在所提供方法的一个具体实施例中，使引物模板核酸(任选地在3’端处封端)与包含具有一个或多个核苷酸的聚合酶的反应混合物接触。如果一个或多个核苷酸是针对被询问位置的同源核苷酸，那么将形成三元复合物。
在所提供方法的另一具体实施例中，引物模板核酸(任选地在其3’端处封端)最初与包含受损DNA聚合酶而不添加测试核苷酸的反应混合物接触。其后，使引物模板核酸与包含可参与三元复合物形成的受损DNA聚合酶和一个或多个测试核苷酸的反应混合物接触。之后，使任选封端的引物模板核酸与包含聚合酶和比先前反应混合物少一个核苷酸的反应混合物接触。监测任何三元复合物的维持或去稳定化可连续地或在每次反应混合物变化之后进行。
由于在测试步骤期间不发生核苷酸掺入，所以可在测定下一个正确的核苷酸的身份或至少获得进行测定所需的结果之后进行单独的掺入步骤。单独的掺入步骤可在无需监测的情况下完成，因为已经在检查步骤期间鉴别了同源核苷酸。可逆终止核苷酸也可用于防止后续核苷酸的加入。SBB方法允许在使用或不使用标记核苷酸的情况下控制测定模板核酸碱基，因为受损DNA聚合酶与模板核酸之间的相互作用可在核苷酸上有或没有标记的情况下监测。然而，为清楚起见，当执行本发明所公开的程序以允许荧光检测结合的核苷酸时，标记的核苷酸(例如，荧光核苷酸)的使用是任选的。
在本文所提供的测序方法中，测试核苷酸(例如，至少一个测试核苷酸)可包含3’羟基、或防止在引物的3’端处形成磷酸二酯键的封端部分。3’终止部分或2’终止部分可为可逆终止子或不可逆终止子。任选地，在采用包含可逆终止子的测试核苷酸的检查步骤之后的一些时点下置换或移除至少一个核苷酸分子的可逆终止子。
接触步骤
引物模板核酸分子与包含受损DNA聚合酶和一个或多个测试核苷酸分子的反应混合物的接触可在使三元复合物的形成稳定和/或使二元复合物的形成不稳定的条件下发生。任选地，反应混合物包含谷氨酸钾。任选地，使三元复合物的形成稳定的条件包括使引物模板核酸与稳定剂接触。任选地，反应混合物包含稳定剂。稳定剂可为一个或多个非催化金属离子，其抑制聚合酶介导的掺入。适用于此目的的示例性非催化金属离子包括锶离子、锡离子、镍离子和铕离子。例如，检查步骤中包含引物模板核酸、聚合酶和测试核苷酸的反应混合物还可包含0.01mM至30mM氯化锶作为稳定剂。
或者且尤其是当在检查步骤中使用封端引物模板核酸来形成三元复合物时，用于进行检查和监测步骤的反应混合物可任选地包含催化金属离子(例如，Mg2+或Mn2+)。当使用未修饰的(即，未3’封端的)引物时支持聚合活性所需的催化金属离子的浓度将为本领域的普通技术人员所熟知。
在某些实施方案中，将引物模板核酸固定到固体支持物的表面上。该固定可采用介于彼此之间或甚至引物模板核酸的两条链与固体支持物之间的共价或非共价键。例如，当引物模板核酸的模板与引物链是不同分子时，模板链可例如经由其5’端固定。然而，必需的是引物的3’端可用于与聚合酶的相互作用中。
当将引物模板核酸固定到固体支持物上时，存在进行接触步骤的替代方案。例如，固体支持物可在含有不同试剂溶液的不同容器(例如，多孔板的单一孔)之间物理转移。这便利地使用自动化或机器人器械来完成。在另一实施例中，将引物模板核酸固定到流动单元或腔室内部的固体支持物上。在此情况下，可通过控制不同液体试剂流动经过腔室或穿过固定的引物模板核酸来执行不同的接触步骤。
监测步骤
在核苷酸分子存在下对受损DNA聚合酶与引物模板核酸分子的相互作用的监测或测量可以许多不同方式完成。例如，监测可包括测量引物模板核酸、受损DNA聚合酶和核苷酸之间的相互作用的结合动力学。在核苷酸分子存在下对受损DNA聚合酶与引物模板核酸分子的相互作用的监测可包括测量受损DNA聚合酶与引物模板核酸分子(即，在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的平衡结合常数)之间的平衡结合常数。因此，例如，监测包括测量在核苷酸存在下受损DNA聚合酶与引物模板核酸的平衡结合常数。对在核苷酸分子存在下受损DNA聚合酶与引物模板核酸分子的相互作用的监测包括测量在四种核苷酸中的任一种存在下聚合酶从引物模板核酸上的解离动力学。任选地，对在核苷酸分子存在下受损DNA聚合酶与引物模板核酸分子的相互作用的监测包括测量闭合复合物的解离动力学(即，引物模板核酸、聚合酶和核苷酸的解离)。任选地，所测量的结合动力学根据核苷酸分子的身份而不同。任选地，受损DNA聚合酶对于所采用的每种类型核苷酸具有不同亲和力。任选地，受损DNA聚合酶对于在每种类型闭合复合物中的每种类型核苷酸具有不同解离常数。结合、平衡和解离动力学是已知的并且可容易由本领域技术人员测定。参见，例如Markiewicz等人,Nucleic Acids Research 40(16):7975-84(2012)；Xia等人,J.Am.Chem.Soc.135(1):193-202(2013)；Brown等人,J.Nucleic Acids,Article ID 871939,第11页(2010)；Washington等人,Mol.Cell.Biol.24(2):936-43(2004)；Walsh和Beuning,J.Nucleic Acids,ArticleID 530963,第17页(2012)；以及Roettger等人,Biochemistry 47(37):9718-9727(2008)，其以引用的方式整体并入本文。
监测步骤可包括监测在第一核苷酸存在下聚合酶与引物模板核酸的稳态相互作用，而不将第一核苷酸化学掺入到引物模板核酸的引物中。任选地，监测包括监测在第一核苷酸存在下聚合酶从引物模板核酸上的解离，而第一核苷酸不会化学掺入到引物模板核酸的引物中。任选地，监测包括监测在第一核苷酸存在下聚合酶与引物模板核酸的结合，而第一核苷酸不会化学掺入到引物模板核酸的引物中。再者，在这些程序中的测试核苷酸可为原生核苷酸(即，未标记)、标记的核苷酸(例如，荧光标记的核苷酸)、或核苷酸类似物(例如，被修饰以包含可逆或不可逆终止部分的核苷酸)。
由于受损DNA聚合酶大体上不能催化磷酸二酯键形成，所以其是任选的以在检查反应混合物中包含催化金属离子。当然，催化金属离子在反应混合物中的不存在或催化金属离子在聚合酶的活性位点中的不存在防止核苷酸化学掺入到引物模板核酸的引物中。
检查步骤可部分地通过提供反应条件来控制，所述反应条件防止核苷酸的化学掺入，同时容许监测受损DNA聚合酶与引物模板核酸之间的相互作用，从而允许测定核酸模板链的下一个碱基的身份。这种反应条件可被称为“检查反应条件”。任选地，三元复合物或闭合复合物是在检查条件下形成。任选地，稳定的三元复合物或闭合复合物是在检查条件下或以化学反应前构象形成。任选地，稳定的闭合复合物呈易位前构象，其中已经掺入了封闭的核苷酸，但闭合复合物不容许后续核苷酸的掺入。任选地，检查条件强调在不同核苷酸存在下聚合酶对引物模板核酸的亲和力的差异。任选地，检查条件促成在不同核苷酸存在下受损DNA聚合酶对引物模板核酸的差别亲和力。举例来说，造成在不同核苷酸存在下受损DNA聚合酶对于引物模板核酸的差别亲和力的检查条件包括但不限于高盐和谷氨酸钾的纳入。可用于改变聚合酶对于引物模板核酸的亲和力的谷氨酸钾的浓度包括10mM至1.6M的谷氨酸钾，或介于10mM与1.6M之间的任何量。任选地，高盐指的是从50mM至1,500mM盐的盐浓度。
检查通常涉及在监测步骤中检测受损DNA聚合酶与模板核酸或与模板核酸和核苷酸的组合的相互作用。检测可包括光学、电学、热、声学、化学和机械手段。任选地，监测是在缓冲液更换或洗涤步骤之后进行，其中洗涤步骤将任何非结合试剂(例如，未结合的聚合酶和/或核苷酸)从观察区域中除去。任选地，在缓冲液更换或洗涤步骤期间进行监测，以使得聚合酶-核酸或聚合酶-核酸-核苷酸复合物的解离动力学可用于测定下一个碱基的身份。任选地，在添加检查反应混合物或第一反应混合物的过程中进行监测，以使得聚合酶与核酸的结合动力学可用于测定核酸上的下一个碱基的身份。任选地，监测涉及将闭合复合物与聚合酶和引物模板核酸的二元复合物相区分。任选地，监测是在平衡条件下进行，在该条件下所测量的亲和力是平衡亲和力。包括不同或相似检查试剂的多个检查步骤可依次进行以探明下一个模板碱基的身份。在多个模板核酸在一个测序反应中同时被测序的情况下可利用多个检查步骤，其中不同核酸与不同检查试剂不同地反应。任选地，多个检查步骤可提高下一个碱基测定的精确性。
在示例性测序反应中，检查步骤包括闭合复合物的形成和/或稳定化，所述闭合复合物包含受损DNA聚合酶、引物模板核酸和下一个正确的核苷酸。监测闭合复合物的形成和/或释放的特征以鉴别封闭的核苷酸且由此鉴别模板核酸中的下一个碱基。闭合复合物的特征可取决于测序反应组分(例如，受损DNA聚合酶、引物、模板核酸、核苷酸)和/或反应混合物组分和/或条件。任选地，闭合复合物呈化学反应前构象。任选地，闭合复合物呈易位前构象。任选地，闭合复合物呈易位后构象。
检查步骤涉及监测在测试核苷酸存在下受损DNA聚合酶与引物模板核酸的相互作用。可监测闭合复合物的形成。任选地，监测闭合复合物形成的不存在。任选地，监测闭合复合物的解离。任选地，掺入步骤涉及监测核苷酸的掺入。任选地，掺入步骤涉及监测核苷酸掺入的不存在。
可监测检查和/或掺入步骤的任何过程。任选地，受损DNA聚合酶具有外源性标记或“标签”。任选地，在受损DNA聚合酶上可检测的标签或标记是可移除的。任选地，核苷酸或受损DNA聚合酶具有可检测的标记，然而，标记在测序期间未被检测。任选地，测序反应中没有一种组分是用外源性标记可检测地标记。
在不容许核苷酸掺入的条件下对在正确的和不正确的核苷酸存在下受损DNA聚合酶对于模板核酸的亲和力的变化的监测可用于测定核酸的序列。可监测在包括修饰或标记的核苷酸的不同核苷酸存在下受损DNA聚合酶对于模板核酸亲和力作为在各种核苷酸存在下聚合酶-核酸相互作用的解离速率。许多标准聚合酶对各种匹配的/正确的、错配的/不正确的和修饰的核苷酸的亲和力及解离速率是本领域中已知的。克列诺(Klenow)聚合酶的单分子成像揭示模板核酸对于不同核苷酸类型(其中核苷酸类型被阻止以免掺入)的解离速率明显且显著地不同。
任选地，特定类型的核苷酸在引物模板核酸存在下变得可用于受损DNA聚合酶。监测反应，其中如果核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么可使聚合酶稳定以形成闭合复合物。如果核苷酸是不正确的核苷酸，那么仍可形成闭合复合物；然而，在无稳定剂或反应条件的额外辅助下(例如，不存在催化离子、聚合酶抑制因子、盐)，闭合复合物可解离。解离速率取决于聚合酶、模板核酸和核苷酸的具体组合的亲和力以及反应条件。任选地，亲和力被测量为解离速率。任选地，亲和力在不同核苷酸对于闭合复合物之间是不同的。例如，如果在引物的3’端下游的模板核酸中的下一个碱基是G，那么基于是否添加dATP、dCTP、dGTP或dTTP预期被测量为解离速率的聚合酶-核酸亲和力是不同的。在此情况下，dCTP将具有最慢的解离速率，而其他核苷酸提供对于相互作用的不同解离速率。任选地，解离速率根据反应条件(例如，稳定剂(例如抑制性化合物)的存在)或反应条件(例如，核苷酸修饰或修饰的聚合酶)可为不同的。一旦确定下一个正确核苷酸的身份，便可在特异性地靶向闭合复合物形成的条件下将1、2、3、4种或更多种核苷酸类型同时引入反应混合物中。可从反应混合物中移走过量的核苷酸并且调节反应条件(例如，通过利用可逆终止核苷酸)以掺入闭合复合物的下一个正确的核苷酸。此测序反应确保每个测序周期仅掺入一个核苷酸。
在核苷酸存在下受损DNA聚合酶对于模板核酸的亲和力可以本领域技术人员已知的多种方法来测量。任选地，亲和力被测量为解离速率，其中通过在反应被洗涤缓冲液洗涤时监测受损DNA聚合酶从模板核酸上的释放来测量解离速率。聚合酶结合速率在充分低浓度的受损DNA聚合酶下可为扩散受限的，其中如果受损DNA聚合酶从DNA聚合酶复合物上脱落，那么其不会立即装载回去，由此留下足以检测聚合酶已从复合物上释放的时间。对于更高的亲和力相互作用，受损DNA聚合酶缓慢地从核酸上释放，而低亲和力相互作用则导致聚合酶被更快速地释放。在此情况下，亲和力谱被转化成不同的解离速率，其中解离速率是在动态洗涤条件或平衡状态下测量。最小的解离速率对应于与添加的核苷酸互补的碱基，而其他解离速率根据所选的受损DNA聚合酶与核苷酸的组合以已知的方式变化。
任选地，解离速率被测量为在受损DNA聚合酶和核苷酸提供于反应混合物中之后的平衡信号强度，其中与最低解离速率(最高亲和力)核苷酸的相互作用产生最强信号，而与其他解离速率变化的核苷酸的相互作用产生显著不同强度的信号。作为非限制性实例，优选地在全内反射(TIRF)条件下测量的荧光标记的聚合酶根据在适当选择的时间窗中结合至表面固定的核酸分子上的聚合酶分子的数量产生不同的测量荧光强度。也可利用聚合酶的固有荧光，例如色氨酸荧光。高解离速率相互作用产生低测量强度，因为在所选时间窗中的结合的受损DNA聚合酶分子的数量极少，其中高解离速率表明大多数聚合酶从核酸上脱离。可采用任何表面局部测量方案，包括但不限于标记或荧光方案。测量在平衡条件下的亲和力的合适的测量方案包括但不限于结合质量、折射率、表面电荷、介电常数及本领域中已知的其他方案。任选地，工程化的结合速率与解离速率的组合在所提出的方案中产生更高保真度的检测。作为非限制性实例，均匀的低结合速率、碱基依赖性、变化的解离速率导致未结合的聚合酶保持未结合持续较长时间，由此容许辨别在解离速率和测量强度中的变化。结合速率可通过降低添加的受损DNA聚合酶、核苷酸、或聚合酶与核苷酸两者的浓度来操纵。
任选地，经由连接到聚合酶上的可检测的标签监测受损DNA聚合酶与核酸之间的相互作用。标签可通过包括但不限于以下的检测方法来监测：光学、电学、热、质量、大小、电荷、振动和压力。标记可为磁性的、荧光的或带电的。对于外部和内部标记方案，荧光各向异性可用于确定受损DNA聚合酶与核酸在闭合复合物中的稳定结合。
举例来说，用荧光团标记受损DNA聚合酶，其中闭合复合物的形成被监测为稳定的荧光信号。受损DNA聚合酶与模板核酸在不正确的核苷酸存在下的不稳定相互作用导致与在下一个正确的核苷酸存在下形成的闭合复合物相比的显著较弱的信号。然而，在某些优选实施方案中，结合测序程序不依赖于对连接到受损DNA聚合酶上的任何外源性标记(例如，荧光标记)的检测。
任选地，在检查步骤期间使引物模板核酸分子(任选在其3’端处封端)与受损DNA聚合酶和一个或多个外源标记的核苷酸接触。对由于存在标记的核苷酸而生成的信号的监测提供关于包含标记的核苷酸的三元复合物的形成和稳定化/去稳定化的信息。例如，如果外源性标记是荧光标记，且如果引物模板核酸在特定基因座处被固定于固体支持物上，那么监测与那个基因座有关的荧光信号可用于监测在不同反应混合物条件下的三元复合物形成和稳定性。
鉴别步骤
下一个正确的碱基或核苷酸的身份可通过监测三元复合物或闭合复合物的存在、形成和/或解离来测定。下一个碱基的身份可在下一个正确的核苷酸没有化学掺入到引物的3’端中的情况下测定。任选地，下一个碱基的身份是通过监测在添加的核苷酸存在下受损DNA聚合酶对于引物模板核酸的亲和力来测定。任选地，在下一个正确的核苷酸存在下聚合酶对于引物模板核酸的亲和力可用于确定模板核酸上的下一个正确的碱基。任选地，在不正确的核苷酸存在下受损DNA聚合酶对于引物模板核酸的亲和力可用于确定模板核酸上的下一个正确的碱基。
在某些实施方案中，包含引物模板核酸(或封端的引物模板核酸)的三元复合物是在受损DNA聚合酶和多个核苷酸存在下形成。加入三元复合物中的同源核苷酸任选地通过观察复合物的损失来鉴别，复合物的损失是在当同源核苷酸例如通过更换反应混合物从反应混合物中离开时发生。此时，复合物的去稳定化是同源核苷酸身份的指标。结合信号(例如，与固体支持物上的特定基因座有关的荧光结合信号)的损失可在当引物模板核酸暴露于不包含同源核苷酸的反应混合物时发生。任选地，在单一核苷酸存在下三元复合物在反应混合物中的维持也可表明同源核苷酸的身份。
掺入步骤
任选地，本文所提供的方法还包括掺入步骤。举例来说，掺入步骤包括将与模板核酸的下一个碱基互补的单一核苷酸(例如，未标记的核苷酸、可逆终止核苷酸、或可检测标记的核苷酸类似物)掺入到引物模板核酸分子的引物中。任选地，掺入步骤包括使引物模板核酸分子、聚合酶(并非用于检查步骤中的受损DNA聚合酶)和核苷酸与掺入反应混合物接触。掺入反应混合物典型地包含催化金属离子。
所提供的方法还可包括在掺入步骤之后制备用于下一个检查步骤的引物模板核酸分子。任选地，所述制备包括使引物模板核酸或核酸/聚合酶复合物经历一个或多个洗涤步骤；温度变化；机械振动；pH变化；盐或缓冲液组成变化；光刺激；或其组合。任选地，洗涤步骤包括使引物模板核酸或引物模板核酸/聚合酶复合物与一种或多种缓冲剂、清洁剂、蛋白质变性剂、蛋白酶、氧化剂、还原剂或能够释放聚合酶内的内部交联或聚合酶与核酸之间的交联的其他试剂接触。
任选地，所述方法还包括重复检查步骤和掺入步骤以便为模板核酸分子测序。在进行掺入步骤之前，可重复检查步骤一次或多次。任选地，两个连续的检查步骤包括与不同核苷酸分子(例如，标记或未标记的不同核苷酸)的反应混合物。任选地，在将单一核苷酸掺入到引物模板核酸分子中之前，用第二反应混合物替换第一反应混合物，第二反应混合物包含能够实现磷酸二酯键形成的聚合酶和1、2、3或4种类型的核苷酸分子(例如，不同的未标记的核苷酸)。任选地，核苷酸分子是选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP的原生核苷酸。
掺入反应可通过掺入反应混合物实现。任选地，掺入反应混合物包含与检查反应不同的核苷酸组成。例如，检查反应包含一种类型的核苷酸且掺入反应包含另一种类型的核苷酸。作为另一个实例，检查反应包含一种类型的核苷酸且掺入反应包含四种类型的核苷酸，或反之亦然。任选地，检查反应混合物被变更或由掺入反应混合物替换。任选地，掺入反应混合物包含催化金属离子、氯化钾或其组合。
任选地，掺入步骤包括替换来自检查步骤的核苷酸并且将另一种核苷酸掺入到模板核酸引物的3’端中。掺入步骤还可涉及从闭合复合物中释放核苷酸(例如，核苷酸是修饰的核苷酸或核苷酸类似物)并且将不同种类的核苷酸掺入到模板核酸引物的3’端中。任选地，所释放的核苷酸被移除并用包含下一个正确的核苷酸的掺入反应混合物替换。
用于掺入的合适的反应条件可涉及用掺入反应混合物替换检查反应混合物。任选地，存在于检查反应混合物中的核苷酸被掺入反应混合物中的一个或多个核苷酸替换。任选地，检查步骤期间存在的聚合酶在掺入步骤期间被替换。任选地，检查步骤期间存在的聚合酶在掺入步骤期间被修饰。任选地，检查步骤期间存在的一个或多个核苷酸在掺入步骤期间被修饰。在检查步骤期间存在的反应混合物和/或反应条件可在掺入步骤期间通过任何手段改变。这些手段包括但不限于移除试剂、螯合试剂、稀释试剂、添加试剂、改变反应条件如导电性或pH、及其任何组合。反应混合物中包括聚合酶、引物模板核酸和核苷酸的任何组合的试剂可在检查步骤和/或掺入步骤期间被修饰。
任选地，掺入步骤的反应混合物包含竞争性抑制剂，其中竞争性抑制剂减少多次掺入的发生。在某些实施方案中，竞争性抑制剂是不可掺入的核苷酸。在某些实施方案中，竞争性抑制剂是氨基糖苷类。竞争性抑制剂能够替换活性位点中的核苷酸或催化金属离子，以便在第一次掺入之后，竞争性抑制剂占据活性位点，从而防止第二次掺入。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸和竞争性抑制剂都被引入到掺入步骤中，以便可掺入的核苷酸与抑制剂的比率可被调节以确保单一核苷酸掺入到引物的3’端处。
任选地，所提供的反应混合物(包括掺入反应混合物)包含至少一个未标记的核苷酸分子，其为不可掺入的核苷酸。换句话说，所提供的反应混合物可包含一个或多个未标记的核苷酸分子，其不能掺入到引物模板核酸分子的引物中。不能掺入的核苷酸包括例如二磷酸核苷酸。例如，核苷酸可含有对三磷酸基团的修饰，这使得核苷酸不可掺入。不可掺入的核苷酸的实例可见于美国专利号7,482,120中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。任选地，引物可能在其3’端处不含游离羟基，由此使引物变得不能掺入任何核苷酸，且因此使得任何核苷酸都不可掺入。
聚合酶抑制剂任选地可与含有测试核苷酸的反应混合物一起包括在检查步骤中以便在结合下一个正确的核苷酸后捕获核酸上的聚合酶。任选地，聚合酶抑制剂是焦磷酸类似物。任选地，聚合酶抑制剂是变构抑制剂。任选地，聚合酶抑制剂是DNA或RNA适体。任选地，聚合酶抑制剂与聚合酶中的催化离子结合位点竞争。任选地，聚合酶抑制剂是逆转录酶抑制剂。聚合酶抑制剂可以是HIV-1逆转录酶抑制剂或HIV-2逆转录酶抑制剂。HIV-1逆转录酶抑制剂可以是(4/6-卤素/MeO/EtO-取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷-4-酮。
在所提供的测序方法中，在掺入步骤之前鉴别下一个正确的核苷酸，从而使得掺入步骤无需标记的试剂和/或监测。因此，在所提供的方法中，核苷酸任选地不含连接的可检测的标签或标记。任选地，核苷酸含有可检测的标记，但该标记未在方法中检测到。任选地，正确的核苷酸不含可检测的标记；然而，下一个碱基的不正确或非互补核苷酸含有可检测的标记。
可在掺入步骤之前重复测序反应的检查步骤1、2、3、4次或更多次。可重复检查和掺入步骤直到获得模板核酸的所需序列。
反应混合物
核酸测序反应混合物或简称“反应混合物”典型地包含通常存在于基于聚合酶的核酸合成反应中的试剂。反应混合物试剂包括但不限于酶(例如，受损DNA聚合酶或用于掺入步骤中的聚合酶)、dNTP、模板核酸、引物核酸、盐、缓冲液、小分子、辅因子、金属和离子。离子可以是催化离子、二价催化离子、非催化离子、非共价金属离子或其组合。反应混合物可包含盐，如NaCl、KCl、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、NH4Cl或NH4HSO4。反应混合物可包含离子来源，如Mg2+或Mn2+Mg-乙酸盐、Co2+或Ba2+。反应混合物可包含锡离子、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+、Ni2+、或Eu+3。缓冲液包含Tris、Tricine、HEPES、MOPS、ACES、MES、基于磷酸盐的缓冲液、和基于乙酸盐的缓冲液。反应混合物可包含螯合剂，如EDTA、EGTA等。任选地，反应混合物包含交联试剂。本文提供了任选地在检查步骤使用的反应混合物以及在核苷酸掺入期间使用的掺入反应混合物，其可包含上述试剂中的一种或多种。在检查期间使用的反应混合物在本文中可被称为检查反应混合物。任选地，检查反应混合物包含高浓度的盐；高pH；1、2、3、4种或更多种类型的未标记的核苷酸；谷氨酸钾；螯合剂；聚合酶抑制剂；催化金属离子；抑制聚合酶介导的掺入的非催化金属离子；或其任何组合。检查反应混合物可包含10mM至1.6M的谷氨酸钾或介于10mM与1.6M之间的任何量。任选地，掺入反应混合物包含催化金属离子；1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸(例如，未标记的核苷酸)；氯化钾；抑制聚合酶介导的掺入的非催化金属离子；或其任何组合。
任选地，根据所公开技术的反应混合物在检查步骤期间调节闭合复合物的形成和稳定化。例如，检查步骤的反应条件任选地可有利于包封核苷酸的闭合复合物的形成和/或稳定化，并且防碍二元复合物的形成和/或稳定化。聚合酶与模板核酸之间的二元相互作用可通过调节测序反应参数如离子强度、pH、温度或其任何组合，或通过将二元复合物去稳定剂添加到反应中来操纵。任选地，利用高盐(例如，50mM至1,500mM)和/或pH变化来使二元复合物去稳定化。任选地，二元复合物可在测序反应的检查或掺入步骤期间在聚合酶与模板核酸之间形成，而不管核苷酸是否存在。任选地，反应条件有利于闭合的三元复合物的稳定化和二元复合物的去稳定化。举例来说，检查反应混合物的pH可从pH 4.0调整至pH 10.0，以有利于闭合的三元复合物的稳定化和二元复合物的去稳定化。任选地，检查反应混合物的pH为pH 4.0至pH 6.0。任选地，检查反应混合物的pH为pH 6.0至pH 10.0。
所提供的反应混合物和本文所公开的测序方法促使聚合酶与核苷酸和模板核酸以揭示下一个碱基的身份同时控制核苷酸的化学添加的方式相互作用。任选地，所述方法是在可检测标记的核苷酸不存在下或在标记的核苷酸(其中标记未被检测到)存在下进行。任选地，反应混合物包含载有外源性可检测标记(例如，荧光标记)的核苷酸。任选地，在反应混合物中的多个核苷酸载有相同的外源性可检测标记。任选地，在反应混合物中的多个核苷酸载有不同的外源性可检测标记。任选地，反应混合物可包含一种或多种外源性标记的聚合酶。
本文提供了促进闭合复合物的形成和/或稳定化的反应混合物和方法，所述闭合复合物包含在检查反应混合物条件下结合至引物模板核酸的聚合酶和封闭在聚合酶-模板核酸复合物内的核苷酸。检查反应条件可抑制或减少核苷酸掺入。任选地，封闭的核苷酸的掺入受到抑制并且复合物是稳定的或捕获于化学反应前构象或三元复合物中。任选地，掺入封闭的核苷酸且后续的核苷酸掺入受到抑制。在此情况下，复合物是稳定的并且捕获于易位前构象中。对于本文所提供的测序反应，闭合复合物在检查步骤期间是稳定的，由此允许受控的核苷酸掺入。任选地，稳定的闭合复合物是以下复合物：其中封闭的核苷酸的掺入在检查步骤期间瞬时地(例如，为了检查复合物且随后掺入核苷酸)或永久地(例如，仅用于检查)减少。任选地，稳定的闭合复合物允许封闭的核苷酸的掺入，但不允许后续核苷酸的掺入。任选地，闭合复合物是稳定的以便监测在用于鉴别模板核酸中的下一个碱基的核苷酸存在下任何聚合酶与模板核酸的相互作用。
任选地，封闭的核苷酸在闭合复合物中具有严重减少或削弱的与模板核酸的结合。任选地，封闭的核苷酸在下一个碱基处碱基配对至模板核酸。任选地，聚合酶、核苷酸、引物、模板核酸或其任何组合的身份影响在闭合复合物中封闭的核苷酸与模板核酸之间的相互作用。
任选地，封闭的核苷酸结合至闭合复合物的聚合酶上。任选地，封闭的核苷酸与闭合复合物的聚合酶弱结合。任选地，聚合酶、核苷酸、引物、模板核酸或其任何组合的身份影响在闭合复合物中封闭的核苷酸与聚合酶之间的相互作用。对于给定的聚合酶，每种核苷酸对聚合酶与另一种核苷酸相比具有不同的亲和力。任选地，此亲和力部分地取决于模板核酸和/或引物。
瞬时形成闭合复合物。任选地，封闭的核苷酸是下一个正确的核苷酸。在一些方法中，下一个正确的核苷酸的存在部分地促成闭合复合物的稳定化。任选地，封闭的核苷酸不是下一个正确的核苷酸。
任选地，检查反应条件包括多个引物模板核酸、聚合酶、核苷酸、或其任何组合。任选地，所述多个核苷酸包含1、2、3、4种或更多种类型的不同核苷酸，例如dATP、dTTP、dGTP和dCTP。任选地，所述多个模板核酸是模板核酸的克隆群。
可调节闭合复合物的稳定性的反应条件包括但不限于催化金属离子的可利用性、次最佳或抑制性金属离子、离子强度、pH、温度、聚合酶抑制剂、交联试剂、及其任何组合。可调节闭合复合物的稳定性的反应试剂包括但不限于不可掺入的核苷酸、不正确的核苷酸、核苷酸类似物、修饰的聚合酶、具有不可延伸的聚合起始位点的模板核酸、及其任何组合。
检查反应混合物可包含其他分子，包括但不限于酶。任选地，检查反应混合物包含一般存在于核酸聚合反应中的任何试剂或生物分子。反应组分可包括但不限于盐、缓冲液、小分子、金属和离子。任选地，反应混合物的性质可例如电气地、磁性地和/或用振动来操纵。
核苷酸和核苷酸类似物
适用于进行本文所述的结合测序程序的核苷酸包括原生核苷酸、标记的核苷酸(例如，包含外源性荧光染料或其他在原生核苷酸中未见的标记的核苷酸)、及核苷酸类似物(例如，具有可逆终止部分的核苷酸)。
在可结合目前所述技术使用的核苷酸的特性方面存在灵活性。核苷酸可包含以下任一者作为其含氮碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。任选地，核苷酸包含肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)或硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)碱基。有用的核苷酸包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dUDP、dAMP、dTMP、dCMP、dGMP和dUMP。任选地，用一个部分修饰磷酸基。所述部分可包括可检测的标记。任选地，用一个部分修饰核苷酸的3’OH基团，其中所述部分可为3’可逆的或不可逆的终止部分。任选地，用一个部分修饰核苷酸的2’位置，其中所述部分可为2’可逆的或不可逆的终止部分。任选地，核苷酸的碱基被修饰以包括可逆终止部分。核苷酸还可含有DNA聚合酶的终止抑制子、双脱氧核苷酸或2’,3’双脱氧核苷酸，其被缩写为ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP和ddUTP)。
任选地，检查步骤的闭合复合物包含核苷酸类似物或修饰的核苷酸以促进闭合复合物的稳定。任选地，核苷酸类似物包含含氮碱基、五碳糖和磷酸基，并且核苷酸的任何组分都可被修饰和/或置换。核苷酸类似物可为不可掺入的核苷酸。不可掺入的核苷酸可被修饰以变得在测序方法期间的任何时点处可掺入。
核苷酸类似物包括但不限于α-磷酸修饰的核苷酸、α-β核苷酸类似物、β-磷酸修饰的核苷酸、β-γ核苷酸类似物、γ-磷酸修饰的核苷酸、笼蔽的核苷酸或ddNTP。核苷酸类似物的实例描述于美国专利号8,071,755中，该专利以引用的方式整体并入本文。
核苷酸类似物可包含可逆地防止核苷酸向引物的3’端中的掺入的终止子。一种类型的可逆终止子是3’-O-封端的可逆终止子。终止子连接至核苷酸的5碳糖的3’OH端的氧原子上。另一种类型的可逆终止子是3’-未封端的可逆终止子。终止子连接至核苷酸的含氮碱基上。关于具有终止子的核苷酸类似物的综述，参见，例如Mu,R.等人,“The History andAdvances of Reversible Terminators Used in New Generations of SequencingTechnology,”Genomics,Proteomics&Bioinformatics 11(1):34-40(2013)，其以引用的方式整体并入本文。
任选地，核苷酸被具有终止子的修饰的核苷酸类似物取代，所述终止子不可逆地防止核苷酸掺入到引物的3’端中。不可逆核苷酸类似物包括双脱氧核苷酸、ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP)。双脱氧核苷酸缺乏为聚合酶介导的合成所必需的dNTP的3’-OH基团。
任选地，不可掺入的核苷酸包含封端部分，所述封端部分抑制或防止核苷酸在核酸聚合反应的掺入步骤期间与第二核苷酸(引物的3’OH)形成共价键。封端部分可从核苷酸中除去，由此允许核苷酸掺入。
任选地，存在于闭合复合物中的核苷酸类似物使闭合复合物变得稳定。任选地，核苷酸类似物是不可掺入的。任选地，核苷酸类似物被释放并且掺入原生核苷酸。任选地，闭合复合物被释放，核苷酸类似物被修饰，并且掺入修饰的核苷酸类似物。任选地，闭合复合物在对闭合复合物中的核苷酸类似物修饰和/或去稳定化的反应条件下被释放。
任选地，存在于闭合复合物中的核苷酸类似物被掺入且闭合复合物是稳定的。闭合复合物可通过核苷酸类似物或例如通过本文所公开的任何稳定化方法而稳定。任选地，核苷酸类似物不允许后续核苷酸的掺入。闭合复合物可例如通过本文所述的任何方法释放，并且核苷酸类似物被修饰。修饰的核苷酸类似物可允许核苷酸向其3’端的后续掺入。
任选地，核苷酸类似物在检查步骤期间存在于反应混合物中。例如，1、2、3、4种或更多种核苷酸类似物在检查步骤期间存在于反应混合物中。任选地，核苷酸类似物在掺入步骤期间被置换、稀释或多价螯合。任选地，核苷酸类似物被原生核苷酸置换。原生核苷酸可包括下一个正确的核苷酸。任选地，核苷酸类似物在掺入步骤期间被修饰。修饰的核苷酸类似物可与原生核苷酸相似或相同。
任选地，核苷酸类似物与原生核苷酸相比对于受损DNA聚合酶具有不同的结合亲和力。任选地，核苷酸类似物与原生核苷酸相比具有不同的与下一个碱基的相互作用。核苷酸类似物和/或不可掺入的核苷酸可与模板核酸的互补碱基进行碱基配对。
任选地，核苷酸类似物是融合至聚合酶的修饰的或原生核苷酸。任选地，多个核苷酸类似物包含与多种聚合酶的融合物，其中每种核苷酸类似物包含不同的聚合酶。
核苷酸可被修饰以较之二元复合物的形成更有利于闭合复合物的形成。核苷酸可被选择或修饰以对受损DNA聚合酶具有高亲和力，其中聚合酶在结合至模板核酸之前结合至核苷酸。
捕获闭合复合物中的受损DNA聚合酶的任何核苷酸修饰都可用于本文所公开的方法中。核苷酸可被永久地或瞬时地捕获。任选地，核苷酸类似物不是使闭合复合物稳定化的手段。任何闭合复合物稳定化方法可于利用核苷酸类似物的反应中组合。
任选地，将允许闭合复合物的稳定化的核苷酸类似物与通常释放闭合复合物的反应条件组合。所述条件包括但不限于释放试剂(例如，催化金属离子，如镁或锰)的存在。任选地，甚至在催化金属离子存在下使闭合复合物稳定。任选地，甚至在核苷酸类似物存在下释放闭合复合物。任选地，闭合复合物的稳定化部分地取决于稳定试剂和/或释放试剂的浓度和/或身份、及其任何组合。任选地，将使用核苷酸类似物使闭合复合物的稳定化与另外的反应条件组合，所述反应条件是用于使闭合复合物稳定，包括但不限于多价螯合、移除、减少、省去和/或螯合催化金属离子；聚合酶抑制剂、交联剂的存在；及其任何组合。
任选地，一个或多个核苷酸可用辨别和/或可检测的标签或标记来标记；然而，这种标签或标记在检查、碱基的鉴别或碱基的掺入期间没有检测到，并且在本文所公开的测序方法期间没有检测到。标签可借助于它们在荧光、拉曼光谱、电荷、质量、折射率、发光、长度或任何其他可测性质中的差异来辨别。标签可连接到核苷酸上的一个或多个不同位置处，只要结合至聚合酶-核酸复合物的保真度得到充分保留以便能够正确地鉴别模板核酸上的互补碱基。任选地，标签被连接到核苷酸的碱基位置上。在合适的反应条件下，标记的核苷酸可被封装在具有聚合酶和引物模板核酸的闭合复合物中。或者，标签被连接到核苷酸的γ磷酸位置上。
聚合酶
适用于进行所公开的结合测序技术的受损DNA聚合酶包括天然存在的聚合酶的修饰变体，包括但不限于突变体、重组体、融合物、基因修饰物、化学修饰物、合成物和类似物。任选地，修饰的变体具有增强其DNA测序能力的特殊性质：包括提高的对核酸的结合亲和力、降低的对核酸的结合亲和力、提高的催化速率、降低的催化速率等等。突变体聚合酶包括以下聚合物：其中一个或多个氨基酸被其他氨基酸(天然或非天然存在的)置换；一个或多个氨基酸在化学上被修饰；和/或一个或多个氨基酸被插入或缺失。修饰的聚合酶包括含有外部标签的聚合酶，所述外部标签可用于监测聚合酶的存在和相互作用。任选地，来自聚合酶的固有信号可用于监测它们的存在和相互作用。因此，所提供的方法可包括通过检测来自聚合酶的固有信号来监测聚合酶、核苷酸和模板核酸的相互作用。任选地，固有信号是光散射信号。例如，固有信号包括某些氨基酸如色氨酸的天然荧光，其中在来自聚合酶的固有信号中的变化可指示闭合复合物的形成。因此，在所提供的方法中，聚合酶可为未标记的聚合酶，并且监测可在与聚合酶有关的可检测的标记不存在下进行。
如本文所用的术语聚合酶及其变体还指的是包含至少两个彼此连接的部分的融合蛋白，例如，其中包含可催化核苷酸聚合到核酸链中的多肽的一个部分被连接到包含第二部分如报道酶或改良持续合成能力的结构域的另一个部分上。例如，T7 DNA聚合酶包含核酸聚合结构域和硫氧还原蛋白结合结构域，其中硫氧还原蛋白结合提高聚合酶的持续合成能力。在硫氧还原蛋白结合不存在下，T7 DNA聚合酶是具有仅一个至几个碱基的持续合成能力的分配聚合酶。虽然DNA聚合酶在细节上不同，但它们具有相似的手样总体形状，其中特定的区域被称为手指、手掌和拇指；和相似的总体结构转变，包括在核酸合成期间拇指和/或手指结构域的运动。
可被修饰以产生受损DNA聚合酶的DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶、真核DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。细菌DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III、IV和V、大肠杆菌DNA聚合酶的克列诺片段、粪堆梭菌(Cst)DNA聚合酶、热纤梭菌(Cth)DNA聚合酶及硫磺矿硫化叶菌(Sso)DNA聚合酶。真核DNA聚合酶包括DNA聚合酶α、β、γ、δ、€、η、ζ、λ、σ、μ和k以及Revl聚合酶(末端脱氧胞苷转移酶)和末端转脱氧核苷酰酶(TdT)。病毒DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、phi-29DNA聚合酶、GA-l,phi-29样DNA聚合酶、PZA DNA聚合酶、phi-15DNA聚合酶、Cpl DNA聚合酶、Cp7 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和T4聚合酶。其他DNA聚合酶包括热稳定的和/或耐热的DNA聚合酶，如由以下分离的DNA聚合酶：栖热水生菌(Taq)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Tfi)DNA聚合酶、zilligi热球菌(Tzi)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、黄色栖热菌(Thermus flavusu)(Tfl)DNA聚合酶、乌兹炽热球菌(Pwo)DNA聚合酶、强烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和Turbo Pfu DNA聚合酶、嗜热高温球菌(Tli)DNA聚合酶、火球菌属GB-D聚合酶、海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、鹿儿岛火球菌(KOD)DNA聚合酶、pfx DNA聚合酶、热球菌属JDF-3(JDF-3)DNA聚合酶、刺毛热球菌(Tgo)DNA聚合酶、嗜酸热球菌DNA聚合酶；嗜酸热硫化叶菌DNA聚合酶；热球菌属go N-7DNA聚合酶；隐蔽热网菌DNA聚合酶；沃氏甲烷球菌DNA聚合酶；自体热甲氧基球菌DNA聚合酶；詹氏甲烷球菌DNA聚合酶；硫还原球菌菌株TOK DNA聚合酶(D.Tok Pol)；深海火球菌DNA聚合酶；超嗜热古菌DNA聚合酶；海岛火球菌DNA聚合酶；fumicolans热球菌DNA聚合酶；敏捷气热菌DNA聚合酶；及异二聚DNA聚合酶DP1/DP2。工程化的和修饰的聚合酶也适用于所公开的技术。例如，可使用修饰形式的极其耐热的海生古细菌热球菌物种9°N(例如，来自New England BioLabs Inc.；Ipswich,MA的Therminator DNA聚合酶)。还有一些有用的DNA聚合酶(包括3PDX聚合酶)公开于美国8,703,461中，其公开内容以引用的方式整体并入。
RNA聚合酶包括但不限于病毒RNA聚合酶，如T7RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶和Kll聚合酶；真核RNA聚合酶，如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；以及古细菌RNA聚合酶。
逆转录酶包括但不限于来自人免疫缺陷病毒1型(PDB 1HMV)的HIV-1逆转录酶、来自人免疫缺陷病毒2型的HIV-2逆转录酶、来自莫洛尼鼠科白血病病毒的M-MLV逆转录酶、来自鸟类成髓细胞白血病病毒的AMV逆转录酶、和保留真核染色体的端粒的端粒酶逆转录酶。
对无催化活性的聚合酶突变体建模
下文描述了由嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst-f)的热稳定家族菌株制备DNA聚合酶I(polI)大片段突变体，其中突变体与同源核苷酸恰当地形成三元复合物，但不能在Mg2+离子存在下掺入那些核苷酸。Bst-f酶是与其他充分表征的高保真度聚合酶具有同源性的A家族聚合酶，包括大肠杆菌DNA pol I(KF)、水生栖热菌DNA pol I(Taq)和枯草芽孢杆菌DNA pol I(Bsu-f)。这些聚合酶享有实现不同功能(包括核苷酸结合和聚合)所需的保守蛋白质序列基序。
此外，A家族聚合酶具有被称为手指、拇指和手掌亚结构域的共同的结构体系。手掌亚结构域在DNA聚合酶之中高度保守，因为其包含将为本领域普通技术人员所熟知的催化核心。手掌还含有来自基序A和C的催化羧酸类。在基序A和C中的保守酸性氨基酸残基天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)被认为充当由聚合酶催化的磷酰基转移反应期间的二价阳离子的金属配体。基序A在β链和α螺旋的接合点处含有严格保守的天冬氨酸，且基序C具有负电荷的双联体，位于β-转向-β二级结构中。
用于制备突变体的亲本酶(“CBT”)是工程化形式的Bst聚合酶，其已关于半胱氨酸含量及促进蛋白质纯化和加工的N端序列被优化。更具体地说，经鉴定为SEQ ID NO:1的多肽序列包含具有以下的修饰的N端：(1)在位置5-10处的工程化的“His-tag”基序；(2)在位置17与18之间的凝血酶裂解位点；及(3)在位置23处的半胱氨酸残基。天然存在的Bst聚合酶序列从位置27延伸至C-端(经受天然存在的半胱氨酸残基的移除)。应理解，根据本公开的工程化的聚合酶任选地包含或省去上述N端修饰。例如，有用的聚合酶可构建在SEQ IDNO:2(省去凝血酶裂解位点上游的序列)或SEQ ID NO:3(省去原生Bst聚合酶的第一氨基酸上游的序列)的母体支架上。因此，可参考这些蛋白质序列支架来理解影响磷酸二酯键形成的能力的有用修饰。
常规A和C基序的排列在下文中示出。使用标准多肽序列比对软件工具进行两者比对。在基序A中加下划线且粗体的天冬氨酸(D)残基对应于Bst聚合酶(UniProt号P52026，蛋白质数据库号3EZ5)的晶体结构中的氨基酸位置653。在基序C中加下划线且粗体的天冬氨酸和谷氨酸(DE)残基对应于Bst聚合酶(UniProt号P52026，蛋白质数据库号3EZ5)的晶体结构中的氨基酸位置830-831。
基序A
基序C
粗体且加下划线的基序A天冬氨酸(D)残基的Bst-f编号是SEQ ID NO:1中的残基381(或SEQ ID NO:2中的残基364；或SEQ ID NO:3中的残基355)。基序C天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)残基在SEQ ID NO:1中分别编号为558和559(或在SEQ ID NO:2中的残基541和542；或在SEQ ID NO:3中的残基532和533)。虽然已知大多数DNA聚合酶包含在基序A和C中提供三个羧酸侧链的氨基酸，但一些在催化期间仅需要两个羧酸侧链。SEQ ID NO:1的残基381和558被挑选用于诱变以研究它们对聚合酶活性的作用。使用定点诱变和编码聚合酶蛋白的表达载体，用谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)取代这些残基。再者，目标是容许维持DNA和dNTP结合性质，同时抑制聚合化学反应步骤。关键突变的概述示于表1中。
表1
关键突变的概述
如下文中简单地说，TDE和BDE突变体聚合酶大体上类似地表现。更具体地说，两种突变体都适用于在检查反应期间结合并鉴别同源核苷酸，而没有掺入。同样，两种突变体在Mg2+离子存在下都不具有催化掺入活性。相反，TDN突变体是无活性的(即，不能在检查步骤中鉴别同源核苷酸)。
受损DNA聚合酶报道分子
任选地，用发光标签标记受损DNA聚合酶，其中闭合复合物形成在适当的发光触发物(例如，辐射触发物或在化学发光标签的情况下，化学触发物)存在下被监测为稳定的发光信号。受损DNA聚合酶与模板核酸在不正确的核苷酸存在下的不稳定相互作用导致与在下一个正确的核苷酸存在下形成的闭合复合物相比的显著较弱的信号。另外，在触发发光之前的洗涤步骤可将未结合于稳定的闭合复合物中的所有聚合酶分子都除去。
任选地，用光散射标签标记受损DNA聚合酶，其中闭合复合物的形成被监测为稳定的光散射信号。受损DNA聚合酶与模板核酸在不正确的核苷酸存在下的不稳定相互作用导致与在下一个正确的核苷酸存在下形成的闭合复合物相比的显著较弱的信号。
任选地，用等离子体纳米颗粒标签标记受损DNA聚合酶，其中闭合复合物的形成被监测为不同于在闭合复合物不存在下或在包含不正确的核苷酸的闭合复合物存在下的等离子体共振的等离子体共振的位移。等离子体共振的变化可能是由于闭合复合物中的局部介电环境的变化，或这可能是由于在一簇克隆扩增的核酸分子上的等离子体纳米颗粒的同时聚集或在闭合复合物构型中不同地影响等离子体的另一手段。
任选地，用拉曼散射标签标记受损DNA聚合酶，其中闭合复合物的形成被监测为稳定的拉曼散射信号。受损DNA聚合酶与核酸在不正确的核苷酸存在下的不稳定相互作用导致与在下一个正确的核苷酸存在下形成的闭合复合物相比的显著较弱的信号。
任选地，下一个正确的核苷酸是由被选出或修饰以对核苷酸具有高亲和力的受损DNA聚合酶上的标签来鉴别，其中聚合酶在结合至模板核酸之前结合至核苷酸。例如，来自非洲猪瘟病毒的DNA聚合酶X具有改变顺序的底物结合，其中聚合酶首先结合至核苷酸，然后结合至模板核酸。任选地，将聚合酶与一种类型的核苷酸在单独的隔室中培育，其中每个隔室含有不同类型的核苷酸且其中根据与其一起培育的核苷酸，聚合酶是用标签不同地标记。在这些条件下，未标记的核苷酸结合至不同标记的聚合酶。聚合酶可为结合至每个核苷酸类型的相同种类的聚合酶或结合至每个核苷酸类型的不同聚合酶。不同标记的聚合酶-核苷酸复合物可同时添加到测序反应的任何步骤中。每个聚合酶-核苷酸复合物结合至模板核酸，其下一个碱基与聚合酶-核苷酸复合物中的核苷酸互补。下一个正确的核苷酸是由携带核苷酸的聚合酶上的标签来鉴别。通过标记的聚合酶-核苷酸复合物对下一个模板碱基的询问可在不掺入和/或检查条件下进行，其中一旦确定下一个模板碱基的身份，便将复合物去稳定化并移除、多价螯合和/或稀释，并且以确保仅掺入一个核苷酸的方式进行单独的掺入步骤。
将可检测的标签引入聚合酶上的常用方法任选地涉及化学缀合至存在于聚合酶的非活性区域中的胺或半胱氨酸上。这种缀合方法在本领域中是公知的。作为非限制性实例，n-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)通常用于标记可见于酶上的胺基。半胱氨酸容易与硫醇或顺丁烯二酰亚胺基团反应，而羧基可通过用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐)激活它们而与胺反应。任选地，在其中仅N端胺有反应性以便每聚合酶仅添加单个标签的pH范围(例如，pH 7)下采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学过程。
任选地，连接到受损DNA聚合酶上的标签是电荷标签，以便稳定的闭合复合物的形成可通过电学手段通过测量模板核酸周围的局部电荷密度的变化来检测。用于检测电荷的方法在本领域中是公知的，包括如场效应晶体管、介电谱、阻抗测量及pH测量等方法。场效应晶体管包括但不限于离子敏感场效应晶体管(ISFET)、电荷调制场效应晶体管、绝缘栅场效应晶体管、金属氧化物半导体场效应晶体管及使用半导体单壁碳纳米管制造的场效应晶体管。
任选地，电荷标签是具有低于约4或高于约10的等电点的肽标签。任选地，包含肽标签的受损DNA聚合酶具有低于约5或高于约9的总等电点。电荷标签可为带正电或带负电的任何部分。电荷标签可包含包括质量和/或标记如染料的额外的部分。任选地，电荷标签仅在某些反应条件(如pH的改变)下具有正电荷或负电荷。
受损DNA聚合酶可用荧光团和/或猝灭剂来标记。任选地，用荧光团和/或猝灭剂标记核酸。任选地，用荧光团和/或猝灭剂标记一个或多个核苷酸。示例性荧光团包括但不限于荧光纳米晶体；量子点；d-玫瑰红受体染料，包括二氯[R110]、二氯[R6G]、二氯[TAMRA]、二氯[ROX]或其类似物；荧光素供体染料，包括荧光素、6-FAM或其类似物；花青染料，如Cy3B；Alexa染料、SETA染料、Atto染料如atto 647N，其与Cy3B形成FRET对；等等。荧光团包括但不限于MDCC(7-二乙基氨基-3-[([(2-马来酰亚胺基)乙基]氨基)羰基]香豆素)、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、德克萨斯红、Cy5、LC red 705和LC red 640。荧光团及它们的使用方法(包括与聚合酶及其他分子的连接)描述于The MolecularHandbook(LifeTechnologies；Carlsbad Calif.)和Fluorophores Guide(Promega；Madison,WI)中，这些参考文献以引用的方式整体并入本文。示例性猝灭物包括但不限于ZEN、IBFQ、BHQ-1、BHQ-2、DDQ-I、DDQ-11、Dabcyl、Qxl猝灭剂、Iowa Black RQ和IRDye QC-1。
任选地，构象敏感的染料可靠近受损DNA聚合酶的活性位点连接，而不会影响聚合酶的聚合能力或保真度；其中构象的变化或由于闭合复合物形成所致的极性环境的变化反映了染料的荧光或吸光度性质的变化。已知常用的荧光团如Cy3和荧光素对聚合酶结合及闭合复合物形成具有强溶剂色(solvatochromatic)反应，在此程度上闭合复合物的形成可明显区别于二元聚合酶-核酸复合物。任选地，基于来自构象敏感染料的荧光或吸光度信号中的差异，闭合复合物可区别于二元复合物。任选地，溶剂色染料可用于监测构象转变；其中由构象变化诱导的局部极性环境中的变化可用作报道分子信号。溶剂色染料包括但不限于Reichart’s染料、IR44、部花青染料(例如部花青540)、4-[2-N-取代的-1,4-氢吡啶-4-亚基)亚乙基]环己-2,5-二烯-1-酮、红色吡唑啉酮染料、偶氮甲碱染料、靛苯胺染料、二氮杂部花青染料、靛类染料(如由槐蓝所例示)、及其他染料以及其混合物。将染料或荧光团引入聚合酶的特异性位点中的方法在本领域中是公知的。作为非限制性实例，用染料位点特异性标记T7 DNA聚合酶的程序提供于Tsai等人,“Site-Specific Labeling of T7 DNAPolymerase with a Conformationally Sensitive Fluorophore and Its Use inDetecting Single-Nucleotide Polymorphisms,”Analytical Biochemistry 384:136-144(2009)中，该参考文献以引用的方式整体并入本文。
任选地，在可感测闭合复合物形成而不会干扰反应的位置处用荧光团标记聚合酶。聚合酶可为原生或修饰的聚合酶。修饰的聚合酶包括具有一个或多个氨基酸化学修饰、突变、添加和/或缺失的那些。任选地，一个或多个而并非所有半胱氨酸氨基酸突变成另一种氨基酸，如丙氨酸。在此情况下，剩余的一个或多个半胱氨酸用于与荧光团的位点特异性缀合。或者，一个或多个氨基酸突变成适用于荧光团缀合的反应性氨基酸，如半胱氨酸或包括伯胺的氨基酸。
任选地，在正确的核苷酸存在下受损DNA聚合酶与模板核酸之间的结合可诱导荧光减少，而与不正确的核苷酸的结合则引起荧光增加。在正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的结合可诱导荧光增加，而与不正确的核苷酸的结合则引起荧光减少。荧光信号可用于监测核苷酸诱导的构象变化的动力学并鉴别模板核酸序列中的下一个碱基。
任选地，受损DNA聚合酶/核酸相互作用可通过来源于聚合酶或连接到聚合酶上的标签(例如，纳米颗粒标签)的散射信号来监测。
用于形成和操纵闭合复合物的条件
如本文所用，闭合复合物可为包含受损DNA聚合酶、引物模板核酸和核苷酸的三元复合物。闭合复合物可呈化学反应前构象，其中核苷酸是多价螯合的，而不是掺入的。闭合复合物可或者呈易位前构象，其中核苷酸是通过与引物模板核酸中的引物的3’端形成磷酸二酯键而掺入。闭合复合物可在催化金属离子不存在下或在不足水平的催化金属离子下形成，由此物理上多价螯合聚合酶活性位点内的下一个正确的核苷酸，而没有化学掺入。任选地，多价螯合的核苷酸可为不可掺入的核苷酸。闭合复合物可在催化金属离子存在下形成，其中闭合复合物包含掺入的核苷酸类似物，但PPi不能释放。在此情况下，闭合复合物在易位前构象下是稳定的。任选地，易位前构象通过化学交联聚合酶而稳定。任选地，闭合复合物可通过外部手段而稳定。在一些情况下，闭合复合物可通过小分子或大分子如抗体或适体的变构结合而稳定。任选地，闭合复合物可通过焦磷酸类似物而稳定，所述焦磷酸类似物以高亲和力结合接近至活性位点，从而防止聚合酶的易位。
如本文所用，稳定的闭合复合物或稳定的三元复合物是指在引物模板核酸的聚合起始位点(引物的3’端)处由包括但不限于以下一种手段或其组合捕获的聚合酶：在闭合构象中交联拇指与手指结构域；防止聚合酶返回到开放构象的变构抑制剂的结合；在易位前步骤中捕获聚合酶的焦磷酸类似物的结合；在聚合酶的活性位点中不存在催化金属离子；以及添加金属离子如镍、锡和Sr2+作为催化金属离子的替代。因而，聚合酶可甚至在核苷酸掺入之后在聚合起始位点处被捕获。因此，聚合酶可在化学反应前构象、易位前步骤、易位后步骤或其任何中间步骤中被捕获。因此，允许下一个正确的核苷酸或碱基的充分检查和鉴别。
如本文所述，基于聚合酶的结合测序反应一般涉及提供具有聚合酶和一种或多种类型的核苷酸的引物模板核酸，其中核苷酸可与或可不与引物模板核酸的下一个碱基互补；及在其中核苷酸向引物模板核酸中的化学掺入在化学反应前构象中减损或严重受抑制或一次或多次互补核苷酸掺入发生在引物的3’端处的条件下检查聚合酶与引物模板核酸的相互作用。任选地，其中化学反应前构象在核苷酸掺入之前优选地使用稳定剂是稳定的，单独的掺入步骤可在检查步骤之后以便将单一核苷酸掺入到引物的3’端中。任选地，当发生单次核苷酸掺入时，易位前构象可为稳定的以便于检查和/或防止后续的核苷酸掺入。
如上所指出，本发明描述的用于核酸测序的方法包括检查步骤。检查步骤涉及聚合酶在包含一个或多个核苷酸的反应混合物中与引物模板核酸的聚合起始位点的结合以及监测相互作用。任选地，核苷酸在聚合酶-引物模板核酸复合物内多价螯合以便在其中封闭的核苷酸通过聚合酶的掺入减少或受抑制的条件下形成闭合复合物。任选地，在下一个正确的核苷酸存在下添加稳定剂以使三元复合物稳定。此闭合复合物呈稳定的或聚合酶捕获的化学反应前构象。闭合复合物允许封闭的核苷酸的掺入，但不允许后续核苷酸的掺入。此闭合复合物呈稳定的或捕获的易位前构象。任选地，聚合酶是通过包括但不限于以下的一种手段或其组合在其闭合复合物中的聚合位点处被捕获：聚合酶结构域的交联、聚合酶与核酸的交联、通过小分子的变构抑制、反竞争性抑制剂、竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、及变性；其中捕获的闭合复合物的形成提供有关核酸模板上的下一个碱基的身份的信息。
任选地，闭合复合物是从其捕获或稳定的构象中释放，这可允许核苷酸掺入到模板核酸引物的3’端中。闭合复合物可通过调整反应条件的组成来去稳定化和/或释放。另外，闭合复合物可通过电力、磁性和/或机械手段去稳定化。机械手段包括机械搅动，例如，通过使用超声搅动。机械振动使闭合复合物不稳定并且抑制聚合酶与DNA的结合。因此，不使用其中检查反应混合物用掺入混合物替换的洗涤步骤，而是机械搅动可用于将聚合酶从模板核酸中除去，使得能够循环通过连续的掺入步骤，每步添加单一核苷酸。
可组合闭合复合物稳定化或闭合复合物释放反应条件和/或方法的任何组合。例如，使闭合复合物稳定的聚合酶抑制剂可与催化离子一起存在于检查反应中，所述催化离子用于释放闭合复合物。在上述实施例中，闭合复合物可为稳定的或被释放，这取决于聚合酶抑制剂的性质和浓度、催化金属离子的浓度、其他试剂和/或反应混合物的条件、及其任何组合。
闭合复合物在其中核苷酸与引物模板核酸中的引物的3’端的共价连接减少的反应条件下可为稳定的。任选地，闭合复合物呈化学反应前构象或为三元复合物。任选地，闭合复合物呈易位前构象。此闭合复合物的形成可通过调节催化金属离子的利用率来引发和/或稳定，所述催化金属离子允许闭合复合物释放和/或核苷酸化学掺入到反应混合物的引物中。示例性金属离子包括但不限于镁、锰、钴和钡。催化离子可为任何制剂，例如盐，如MgCl2、Mg(CH3CO2)2和MnCl2。
催化金属离子的选择和/或浓度可基于测序反应中的聚合酶和/或核苷酸。例如，HIV逆转录酶利用镁来进行核苷酸掺入(N Kaushik,Biochemistry 35:11536-11546(1996)及H P Patel,Biochemistry 34:5351-5363(1995)，其以引用的方式整体并入本文)。使用镁对比锰的闭合复合物形成的速率可根据聚合酶及核苷酸的身份而不同。因此，闭合复合物的稳定性可根据催化金属离子、聚合酶和/或核苷酸身份而不同。此外，为闭合复合物稳定化所必需的催化离子的浓度可根据催化金属离子、聚合酶和/或核苷酸身份而变化并且可容易使用本文所提供的指导来测定。例如，核苷酸掺入可在高催化离子浓度的一种金属离子下发生，但不在低浓度的同样金属离子下发生，或反之亦然。因此，修改金属离子身份、金属离子浓度、聚合酶身份和/或核苷酸身份允许受控的检查反应条件。
闭合复合物可通过在测序反应的检查步骤期间多价螯合、移除、减少、省去和/或螯合催化金属离子以使得闭合复合物释放和/或不发生化学掺入而形成和/或稳定化。螯合包括致使催化金属离子不能用于核苷酸掺入的任何过程，包括使用EDTA和/或EGTA。减少包括稀释反应混合物中的催化金属离子的浓度。反应混合物可被稀释或用包含非催化离子的溶液置换，所述非催化离子允许闭合复合物形成，但抑制核苷酸掺入。非催化离子包括但不限于钙、锶、钪、钛、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑和锶。任选地，在检查反应中提供Ni2+以促进闭合复合物形成。任选地，在检查反应中提供Sr2+以促进闭合复合物形成。任选地，抑制聚合酶介导的掺入的非催化金属离子和催化金属离子都存在于反应混合物中，其中一种离子以比其他更高的有效浓度存在。在所提供的方法中，非催化离子如钴在高浓度下可变为催化性的(即，促进核苷酸掺入)。因此，任选地，低浓度的抑制聚合酶介导的掺入的非催化金属离子用于促进三元复合物形成，且更高浓度的非催化金属离子用于促进掺入。
非催化离子可在检查条件下添加到反应混合物中。反应可能已经包括核苷酸。任选地，非催化离子与一个或多个核苷酸复合并且将复合的核苷酸添加到反应混合物中。非催化离子可通过将核苷酸与非催化离子在高温(约80℃)下混合而复合至核苷酸。例如，铬核苷酸复合物可被添加到混合物中以促进闭合复合物形成和稳定。任选地，铬核苷酸复合物是铬单齿、二齿或三齿复合物。任选地，铬核苷酸复合物是α-单齿或β-γ-二齿核苷酸。
任选地，在包括Sr2+的反应条件下在受损DNA聚合酶、引物模板核酸与核苷酸之间形成闭合复合物，其中Sr2+促进闭合复合物的形成。Sr2+的存在可允许包含下一个正确的核苷酸的闭合复合物优于包含不正确的核苷酸的复合物的形成的有利形成。Sr2+离子可以约0.01mM至约30mM的浓度存在。任选地，Sr2+表示为10mM SrCl2。在鉴别闭合复合物的模板核酸中的下一个碱基的检查条件下监测闭合复合物的形成。在Sr2+存在下聚合酶(例如，大肠杆菌DNA聚合酶I,Bst的克列诺片段)对于每种dNTP(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可不同。因此，检查可涉及测量聚合酶-模板核酸与dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一个碱基。任选地，可在使受损DNA聚合酶与引物模板核酸之间的二元相互作用去稳定化的条件下进行结合相互作用。任选地，可在使聚合酶、引物模板核酸与下一个正确的核苷酸之间的三元相互作用稳定化的条件下进行结合相互作用。在检查以后，洗涤步骤除去未结合的核苷酸，并且将Mg2+添加到反应中以诱导焦磷酸(PPi)裂解和核苷酸掺入。任选地，洗涤步骤包含Sr2+以保持三元复合物的稳定性，从而防止三元复合物的解离。可重复反应直到获得所需序列读取长度。
任选地，在包括Ni2+的反应条件下在受损DNA聚合酶、引物模板核酸与核苷酸之间形成闭合复合物，其中Ni2+促进闭合复合物的形成。Ni2+的存在可允许包含下一个正确的核苷酸的闭合复合物优于包含不正确的核苷酸的复合物的形成的有利形成。Ni2+离子可以约0.01mM至约30mM的浓度存在。任选地，Ni2+表示为10mM NiCl2。在鉴别闭合复合物的模板核酸中的下一个碱基的检查条件下监测闭合复合物的形成。在Sr2+存在下聚合酶(例如，大肠杆菌DNA聚合酶I,Bst的克列诺片段)对于每种dNTP(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可不同。因此，检查可涉及测量聚合酶-模板核酸与dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一个碱基。任选地，可在使聚合酶与引物模板核酸之间的二元相互作用去稳定化的条件下进行结合相互作用。任选地，可在使聚合酶、引物模板核酸与下一个正确的核苷酸之间的三元相互作用稳定化的条件下进行结合相互作用。在检查以后，洗涤除去未结合的核苷酸和聚合酶，并且将Mg2+添加到反应中以诱导焦磷酸(PPi)裂解和核苷酸掺入。任选地，洗涤缓冲液包含Ni2+以保持三元复合物的稳定性，从而防止三元复合物的解离。可重复反应直到获得所需序列读取长度。
任选地，在包括非催化浓度的Co2+的反应条件下在受损DNA聚合酶、引物模板核酸和核苷酸之间形成闭合复合物，其中Co2+促进闭合复合物的形成。非催化浓度的Co2+的存在可允许包含下一个正确的核苷酸的闭合复合物优于包含不正确的核苷酸的复合物的形成的有利形成。Co2+离子可以约0.01mM至约0.5mM的浓度存在。任选地，Co2+表示为0.5mMCoCl2。在鉴别闭合复合物的模板核酸中的下一个碱基的检查条件下监测闭合复合物的形成。在Co2+存在下聚合酶(例如，大肠杆菌DNA聚合酶I,Bst的克列诺片段)对于每种dNTP(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可不同。因此，检查可涉及测量聚合酶-模板核酸与dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一个碱基。任选地，可在使聚合酶与引物模板核酸之间的二元相互作用去稳定化的条件下进行结合相互作用。任选地，可在使聚合酶、引物模板核酸与下一个正确的核苷酸之间的三元相互作用稳定化的条件下进行结合相互作用。在检查以后，洗涤除去未结合的核苷酸和聚合酶，并且将Co2+以催化浓度添加到反应中以诱导焦磷酸(PPi)裂解和核苷酸掺入。任选地，洗涤缓冲液包含非催化量的Co2+以保持三元复合物的稳定性，从而防止三元复合物的解离。可重复反应直到获得所需序列读取长度。
任选地，催化金属离子可促进闭合复合物的形成，而没有后续的核苷酸掺入和闭合复合物释放。任选地，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10μM Mg2+在反应混合物中的浓度可诱导聚合酶的构象变化以形成闭合复合物，而没有后续的核苷酸掺入、PPi和闭合复合物释放。任选地，Mg2+的浓度为约0.5μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.5μM至约4μM、约0.5μM至约3μM、约μM至约5μM、约1μM至约4μM、及约1μM至约3μM。
任选地，容许核苷酸掺入所必需的测序反应中可利用的催化金属离子的浓度为约0.001mM至约10mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约3mM、约0.01mM至约2mM、约0.01mM至约1mM、约0.05mM至约10mM、约0.05mM至约5mM、约0.05mM至约3mM、约0.05至约2mM、或约0.05mM至约1mM。任选地，催化金属离子的浓度为5mM至50mM。任选地，催化金属离子的浓度为5mM至15mM、或约10mM。
非催化离子可在包括任何以下反应步骤之前、期间或之后的任何阶段被添加到反应混合物中：提供引物模板核酸、提供聚合酶、形成二元复合物、提供核苷酸、形成化学反应前闭合复合物、核苷酸掺入、形成易位前闭合复合物、以及形成易位后构象。非催化离子可在洗涤步骤期间添加到反应混合物中。非催化离子可通过反应存在于反应混合物中。例如，催化离子是以稀释抑制聚合酶介导的掺入的非催化金属离子以允许核苷酸掺入的浓度添加到反应混合物中。
催化和非催化离子调节核苷酸掺入的能力可取决于反应混合物中的条件，包括但不限于pH、离子强度、螯合剂、化学交联、修饰的聚合酶、不可掺入的核苷酸、机械或振动能、及电场。
任选地，在测序反应中抑制聚合酶介导的掺入的非催化金属离子的浓度(该浓度为允许闭合复合物形成而无核苷酸掺入所必需)为约0.1mM至约50mM、约0.1mM至约40mM、约0.1mM至约30mM、约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约5mM、约0.1至约1mM、约1mM至约50mM、约1至约40mM、约1mM至约30mM、约1mM至约20mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约2mM至约30mM、约2mM至约20mM、约2mM至约10mM、或在这些范围内的任何浓度。
闭合复合物可通过添加聚合酶抑制剂到检查反应混合物中而形成和/或稳定。抑制剂分子膦酰乙酸盐(膦酰乙酸)和膦酰甲酸盐(膦酰甲酸，通用名称膦甲酸)、苏拉明、氨基糖苷类、INDOPY-1和塔吉阿毒素(Tagetitoxin)是聚合酶活性的反竞争性或非竞争性抑制剂的非限制性实例。抑制剂分子靠近酶的活性位点的结合在核苷酸掺入周期的易位前或易位后步骤中捕获聚合酶，从而使聚合酶在核苷酸掺入之前或之后在其闭合复合物构象中稳定，且迫使聚合酶结合至模板核酸直到抑制剂分子不可通过移除、稀释或螯合用于反应混合物中。
因此，提供了一种用于为模板核酸分子测序的方法，所述方法包括检查步骤，其包括提供用引物引发的模板核酸分子；使引物模板核酸分子与第一反应混合物接触，所述第一反应混合物包含聚合酶、聚合酶抑制剂和至少一个未标记的核苷酸分子；监测在未标记的核苷酸分子存在下而无核苷酸掺入到引物模板核酸分子的引物中的情况下聚合酶与引物模板核酸分子的相互作用；以及通过所监测的相互作用鉴别与引物模板核酸分子的下一个碱基互补的核苷酸。聚合酶抑制剂防止未标记的核苷酸分子掺入到引物模板核酸的引物中。任选地，抑制剂是非竞争性抑制剂、变构抑制剂或反竞争性变构抑制剂。任选地，聚合酶抑制剂与聚合酶中的催化离子结合位点竞争。
检测平台：用于检测闭合复合物的仪器
可在不使用外源性标记的情况下监测在核苷酸存在下受损DNA聚合酶与模板核酸之间的相互作用。例如，测序反应可通过检测折射率的变化、荧光发射、电荷检测、拉曼散射检测、椭圆光度法检测、pH检测、尺寸检测、质量检测、表面等离子体共振、导向模式共振、纳米孔光学干涉测量法、回音壁模式共振、纳米颗粒散射、光子晶体、石英晶体微量天平、生物层干涉测量法、振动检测、压力检测及其他无标记检测方案，该方案检测由于闭合复合物中的聚合酶与模板核酸结合所致的附加质量或折射率。
任选地，检测折射率的变化是通过包括但不限于以下一种手段或其组合实现：表面等离子体共振感测、定位等离子体共振感测、等离子体光子耦合感测、通过亚波长纳米孔的传输感测(增强的光透射)、光子晶体感测、干涉测量法感测、折射感测、导向模式共振感测、环形谐振器感测或椭圆光度法感测。任选地，核酸分子可定位于表面，其中在各种核苷酸存在下聚合酶与核酸的相互作用可被测量为局部折射率的变化。
任选地，模板核酸被栓接到或适当地定位于表面上或附近，以使得在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的相互作用改变透射穿过表面或由表面反射的光。所述表面可含有纳米结构。任选地，表面能够维持等离子体或等离子体共振。任选地，表面是光子衬底，不限于谐振腔、谐振环或光子晶体平板。任选地，表面是导向模式共振传感器。任选地，核酸被栓接到或适当地定位于纳米孔阵列、纳米颗粒或微粒上或附近，以使得在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的相互作用改变与微粒或纳米颗粒交互的光的吸光度、散射、反射或共振。
任选地，金表面上的纳米孔阵列被用作折射率传感器。模板核酸可通过标准硫醇化学作用附着于金属表面上，即，将硫醇基掺入用于PCR反应中的一个引物上以扩增DNA。当将纳米孔阵列的尺寸针对入射光适当调整时，在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的结合可被监测为传送穿过纳米孔的光的变化。对于标记的和无标记的方案，平衡信号强度的简便直接测量可揭示稳定的闭合复合物的形成。
任选地，核酸分子被定位至能够维持表面等离子体的表面，其中由聚合酶与定位核酸的相互作用所引起的折射率的变化可通过表面等离子体性质的变化来监测，其中进一步，表面等离子体的所述性质可包括表面等离子体共振。表面等离子体、局部表面等离子体(LSP)或表面等离子极化激元(SPP)是由电磁波耦合至表面电荷的等离子体振荡而产生。LSP局限于纳米颗粒表面，而SPP局限于高电子密度表面，在高电子迁移表面与电介质之间的界面处。表面等离子体可沿着界面的方向传播，而它们仅以倏逝的方式渗透到电介质中。当入射电磁辐射的频率匹配表面电子振荡的固有频率时，建立表面等离子体共振条件。在界面处的介电性质的变化(例如，归因于结合或分子拥挤)影响表面电子的振荡，由此改变表面等离子体共振波长。能够进行表面等离子体共振的表面以非限制性方式包括纳米颗粒、纳米颗粒的簇和聚集体、连续的平坦表面、纳米结构表面和微结构表面。材料如金、银、铝、高导电性金属氧化物(例如，氧化铟锡、氧化锌、氧化钨)能够在它们的表面处支持表面等离子体共振。
任选地，单个核酸分子或多个克隆拷贝的核酸附着于纳米颗粒，以使得聚合酶与核酸的结合引起局部表面等离子体共振(LSPR)的移位。入射在纳米颗粒上的光诱导其中的传导电子以共振频率集体振荡，所述共振频率取决于纳米颗粒的大小、形状和组成。所关注的纳米颗粒采取不同形状，包括球形纳米颗粒、纳米棒、纳米棱锥、纳米钻石和纳米盘。作为这些LSPR模式的结果，纳米颗粒强烈地吸收并散射光，由此使得容易使用暗视野(光散射)显微术通过眼睛来观察单个纳米颗粒。例如，单个80-nm银纳米球散射445-nm蓝光，其中散射截面为3 x 10-2m2，百万倍大于荧光素分子的荧光截面，且千倍大于用荧光素填充至自猝灭限值的类似尺寸的纳米球的截面。任选地，纳米颗粒是等离子体-共振粒子，其被配置为超亮的纳米级光学散射，具有在可见光谱中的任何地方处的散射峰。等离子体-共振粒子之所以有利是因为它们不漂白(bleach)。任选地，制备等离子体-共振粒子，用模板核酸包被，并且提供于包含聚合酶和一个或多个核苷酸的反应混合物中，其中检测聚合酶-模板核酸-粒子相互作用。一个或多个上述步骤可基于或源自于由Schultz等人,PNAS 97:996-1001(2000)所公开的一种或多种方法，该文献以引用的方式整体并入本文。
在共振波长下的极大消光系数使得贵金属纳米颗粒能够用作近表面相互作用的极强标记。任选地，聚合酶与纳米颗粒定位的DNA的相互作用造成共振波长的移位。由于结合或结合相互作用所致的共振波长的变化可以许多方式中的一种来测量。任选地，照射是通过一系列波长进行扫描以鉴别在成像装置处观察到最大散射的波长。任选地，宽带照射是结合靠近成像装置的色散元件一起使用，以便利用光谱方法鉴别共振峰。任选地，纳米颗粒系统可在其共振波长下或其共振波长附近照射，并且任何结合相互作用可被观察为随着新共振波长移位远离照射波长而散射的光的强度的下降。根据照射波长的位置，相互作用甚至可以表现为随着共振峰移位接近照射波长而散射的纳米颗粒的增加。任选地，DNA附着的纳米颗粒可定位于表面，或替代地，DNA附着的纳米颗粒可悬浮于溶液中。使用纳米颗粒的生物感测的全面综述是由Anker等人,in Nature Materials 7:442-453(2008)描述，该文献以引用的方式整体并入本文。
任选地，能够LSPR的纳米特征是光刻图案化于平面衬底上。纳米特征的二维图案在大量不同核酸分子的多路调制和高通量分析中具有优势。任选地，金纳米柱是用于聚合酶-模板核酸相互作用的表面等离子体共振成像检测的衬底，其中核酸附着于纳米柱。纳米结构尺寸和周期可影响表面等离子体共振信号增强，任选地提供与对照薄膜相比2、3、4、5、6、7、8倍或更高倍的信号放大。
任选地，表面等离子体共振可维持在平坦表面中。基于克里施曼配置(例如，Biacore,Uppsala,Sweden)和表面等离子体共振成像(例如，GWC Technologies；Madison,WI；或Horiba；Kyoto,Japan)的许多商用仪器可获得并且已经充分确定用于将DNA作为单点且在多重阵列图案中附着于其表面的方案。在克里施曼配置中，金属薄膜(典型的是金)蒸发于棱镜之侧面上并且入射辐射以激发表面等离子体的角度发射。倏逝波穿透激发另一侧等离子体的金属薄膜，其中它可用于监测靠近金薄膜的近表面和表面相互作用。在共振角度下，由棱镜-金界面反射的光严重衰减。假设固定的波长照射，结合相互作用可通过监测在靠近共振角度的固定角度下的反射光的强度以及监测建立表面等离子体共振条件(最小反射率)所需的入射角的变化来检查。当利用2D成像装置如CCD或CMOS摄像机来监测反射光时，整个照射区域可以高分辨率成像。此方法被称作表面等离子体共振成像(SPRi)。其容许同时对表面上的独立区域进行高通量分析。宽带照射也可在固定的角度配置下使用，其中耦合到表面等离子体共振的波长是通过查找反射光谱中的骤降利用光谱方法鉴别。通过共振波长的移位监测表面间相互作用。
表面等离子体共振是用于监测蛋白质-核酸相互作用的充分确立的方法，并且存在许多既用于核酸附着也用于分析数据的标准方案。来自文献的说明性参考包括Cho等人,“Binding Kinetics of DNA-Protein Interaction Using Surface PlasmonResonance,”Protocol Exchange,2013年5月22日；及Brockman等人,“A MultistepChemical Modification Procedure To Create DNA Arrays on Gold Surfaces for theStudy of Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance Imaging,”Journal of the American Chemical Society 121:8044-51(1999)，其都以引用的方式整体并入本文。
聚合酶/核酸相互作用可在能够维持局部表面等离子体的纳米结构表面上监测。任选地，聚合酶/核酸相互作用可在能够维持表面等离子极化激元的纳米结构表面上监测。
任选地，聚合酶/核酸相互作用可在能够维持局部表面等离子体的纳米结构表面上监测。任选地，聚合酶/核酸相互作用可在能够维持表面等离子极化激元的纳米结构表面上监测。
任选地，穿过纳米孔阵列的超常光透射(EOT)可用于监测核酸/聚合酶相互作用。穿过等离子体金属薄膜中的亚波长纳米孔传输的光比由电磁经典理论所预期的更高。此增强的光透射可通过以下认识来解释：等离子体共振耦合至入射辐射，借此在共振波长下，大于预期部分的光透射穿过金属纳米孔。增强的光透射取决于纳米孔的尺寸和间距、金属的性质以及在带有纳米孔的金属薄膜两侧的介质的介电性质。在生物传感器的背景下，金属纳米孔阵列的透射率取决于接触金属薄膜的介质的折射率，从而例如聚合酶与附着于金属表面的核酸的相互作用可被监测为透射过纳米孔阵列的光强度的变化。当使用表面等离子体共振的EOT/等离子体纳米孔阵列方法时，可采用使用非常紧凑的光学器件和成像元件的仪器和对准要求。低功率LED照射和CMOS或CCD摄像机可足以实施耐用的EOT等离子体传感器。示例性基于纳米孔阵列的表面等离子体共振传感装置描述于Escobedo等人,“Integrated Nanohole Array Surface Plasmon Resonance Sensing Device Using aDual-Wavelength Source,”Journal of Micromechanics and Microengineering 21:115001(2011)中，其以引用的方式整体并入本文。
等离子体纳米孔阵列图案化于沉积在玻璃表面上的金的光学不透明层(厚度大于50nm)上。任选地，等离子体纳米孔阵列可图案化于沉积在玻璃上的铝或银的光学厚膜上。任选地，将纳米孔阵列图案化于沉积在低折射率塑料上的光学厚金属层上。等离子体纳米孔阵列图案化于低折射率塑料上通过最佳匹配金属层两侧上的折射率提高装置对折射率变化的敏感性。任选地，通过增加孔之间的距离提高纳米孔阵列的折射率敏感性。任选地，通过复制，例如通过模压、浇注、压印平版印刷术或模板剥离制造纳米孔阵列。任选地，使用胶体通过自动装配制造纳米孔阵列。任选地，通过投影直接图案化如激光干扰平版印刷术制造纳米孔阵列。
纳米桶配置可优于纳米孔配置。在纳米孔配置中，纳米特征的底部是玻璃或塑料或其他适当的电介质，而在纳米桶配置中，纳米特征的底部包括等离子体金属。有利的是，纳米桶阵列制造起来相对简单，同时保持对局部折射率的透射灵敏度。
任选地，将纳米孔阵列等离子体感测与无透镜全息成像组合用于以廉价的方式进行大面积成像。任选地，等离子体生物感测平台包括具有纳米孔阵列的等离子体芯片、被配置来照射芯片的发光二极管源、及记录纳米孔的衍射图案的CMOS成像器芯片，其是通过表面上的分子结合事件来调整。结合事件可为在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的闭合复合物的形成。
使表面官能化(供核酸附着)以用于表面等离子体共振感测的方法可直接应用于EOT纳米孔阵列，因为两种感测方案都采用需要核酸附着的相似金属表面。
任选地，与聚合酶/核酸相互作用有关的折射率变化可在不支持等离子体的纳米结构表面上监测。任选地，导向模式共振可用于监测聚合酶/核酸相互作用。导向模式共振或波导模式共振是一种现象，其中光波导的导向模式可被激发并且通过引入相位匹配元件如衍射光栅或棱镜而同时被提取。这种导向模式也被称为“泄漏模式”，因为它们不会保持导向并且已在一维和二维光子晶体平板中观察到。导向模式共振可被认为是相邻于彼此或在彼此顶部上放置的两种光学结构的衍射模式与波导模式的耦合。例如，对于置于光波导顶部上的衍射光栅，一种衍射模式可完全耦合到光波导的导向模式中，从而造成那个模式沿波导的传播。对于偏共振条件，光不耦合到波导中，所以结构可呈现完全透明(如果使用电介质波导的话)。在共振时，共振波长强耦合到波导中并可从结构中耦合出来，这取决于来自光栅波导界面的下游元件。在光栅耦合器延伸遍布波导的整个表面的情况下，光不能被导向，因为内耦合的任何光都耦合向外耦合于下一个光栅元件处。因此，在光栅波导结构中，共振被观察为强反射峰，而结构在偏共振条件下是透明的。共振条件取决于入射光的角度、光栅性质、偏振和波长。对于例如由于光栅耦合到波导的整个表面而不存在导向模式传播的情况，共振模式也可被称作泄漏模式共振，鉴于强光学限制和辐射在来自波导层的横向方向上的倏逝传播。例如由于生物分子的结合所致的光栅附近的介电性质的变化影响至波导中的耦合，由此改变共振条件。任选地，当核酸分子附着于光栅波导结构的表面时，聚合酶/核酸相互作用可被监测为泄漏模式共振的波长的变化。
衍射元件可直接用于透明衬底上，而没有对波导元件的明确需要。因在光栅纳米结构附近的相互作用所致的共振条件的变化可被监测为反射或透射辐射中的共振波长移位。
来自核酸附着的导向模式共振传感器的反射光可用于监测聚合酶/核酸相互作用。宽带照射源可用于照射，并且反射光的光谱检查可揭示由于聚合酶结合所致的局部折射率的变化。
任选地，可使用宽带照射并且可检查透射光以鉴别由于聚合酶相互作用所致的共振移位。可使用线性偏振窄带照射，并且透射光可滤过交叉偏光器；其中透射光由于交叉偏振器而完全衰减，除了其偏振被改变的泄漏模式反应外。此实施将折射率监测转换为可在便宜的成像系统上监测的简单透射测定。所公开的材料描述了光学部件的组装。参见，Nazirizadeh等人,“Low-Cost Label-Free Biosensors Using Photonic CrystalsEmbedded between Crossed Polarizers,”Optics Express 18:19120-19128(2010)，其以引用的方式整体并入本文。
除纳米结构表面之外，平坦的未结构化表面也可有利地用于监测折射率调制。任选地，干涉测量法可用于监测聚合酶与结合至未结构化的光学透明衬底上的核酸的相互作用。核酸分子可通过本领域中已知的任何手段附着于载玻片的顶部表面上，并且从载玻片的底部表面侧照射系统。在这个配置中存在两个反射表面，一个是从载玻片的底部表面反射，而另一个是从附着有核酸分子的顶部表面反射。两个反射波可相互干涉，由此基于路径长度差引起相长或相消干涉，其中从顶部表面反射的波是通过由于结合的核酸分子引起的介电常数变化(且随后通过聚合酶与结合的核酸分子的相互作用)来调节。在来自底部表面的反射不变的情况下，与核酸分子的任何结合可反映在从顶部和底部表面反射的光束之间的相位差上，这反过来影响所观察的干涉图案。任选地，将生物层干涉测量法用于监测核酸/聚合酶相互作用。生物层干涉测量法可在商用装置如由Pall Forte Bio corporation(Menlo Park,CA)出售的那些上进行。
任选地，通过使用聚焦光学器件选择性地选择来自顶部表面的反射光。来自底部表面的反射光忽略不计，因为其不在焦平面中。仅聚焦于核酸附着的顶部表面，通过聚焦透镜收集的光包括平面波，其对应于部分反射的入射辐射；和散射波，其对应于通过焦平面中的分子在收集方向上散射的辐射。如果入射辐射是相干的，那么这两种组分可变得干扰。此基于散射的干涉检测是极其敏感的并且可用于检测低至单个蛋白质分子。
任选地，场效应晶体管(FET)被配置为生物传感器以用于检测闭合复合物。FET的栅极端子是通过添加模板核酸来修饰。包含带电标签的聚合酶的结合造成电化学信号的变化。在下一个正确的核苷酸下聚合酶与模板核酸的结合提供与在其他不正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的结合不同的信号，其中每个不正确的核苷酸也可提供不同的信号。任选地，使用FET，而不使用在聚合酶、引物模板核酸或核苷酸上的外源性标记来监测聚合酶与模板核酸的相互作用。任选地，使用FET检测掺入反应期间由于H+离子的释放而发生的pH变化。任选地，聚合酶包含生成连续的H+离子的标签，所述连续的H+离子是通过FET来检测。任选地，生成连续的H+离子的标签是ATP合酶。任选地，连续的H+离子生成标签是钯、铜或另一种催化剂。任选地，使用FET检测核苷酸掺入之后的PPi释放。例如，每次可向反应提供一种类型的核苷酸。一旦添加下一个正确的核苷酸并且条件允许掺入，那么PPi便裂解、释放并且使用FET检测，由此鉴别下一个正确的核苷酸和下一个碱基。任选地，模板核酸结合至纳米管的壁。任选地，聚合酶结合至纳米管的壁。FET由于其小尺寸和低重量而有利地用作测序传感器，使得其适用作便携式测序监测组件。分子间相互作用的FET检测的细节描述于Kim等人,“An FET-Type Charge Sensor for Highly Sensitive Detection of DNASequence,”Biosensors and Bioelectronics,Microsensors and Microsystems 20:69-74(2004),doi:10.1016/j.bios.2004.01.025；及Star等人,“Electronic Detection ofSpecific Protein Binding Using Nanotube FET Devices,”Nano Letters 3:459-63(2003),doi:10.1021/nl0340172中，该等文献以引用的方式整体并入本文。
任选地，受损DNA聚合酶包含荧光标签。为了监测具有高信噪比的聚合酶-核酸相互作用，可采用倏逝照射或共焦成像。闭合复合物在局部模板核酸上的形成可被观察为例如与背景相比的荧光增加，而在一些情况下，其也可被观察为由于猝灭或局部极性环境中的变化所致的荧光减少。任选地，一部分聚合酶分子可用荧光团标记，而在相同反应混合物中的另一部分可用猝灭剂标记；其中，闭合复合物在核酸的局部克隆群上的形成展示为与背景相比的荧光减少。核酸的克隆群可附着于支持表面如平坦衬底、微粒或纳米颗粒上。任选地，用荧光团、发光体、化学发光团、发色团或生物发光团标记聚合酶。包含引物模板核酸分子、同源核苷酸和荧光标志或标记的聚合酶的三元复合物可通过检测附着于聚合酶上的荧光标记部分来检测或监测。
任选地，多个模板核酸被栓接到表面上并且一种(或更多种)dNTP依次流过。亲和力谱揭示下一个正确核苷酸的身份及由此模板核酸中的下一个碱基。任选地，在无需移除和更换反应混合物条件(即，洗涤步骤)的情况下测量亲和力。例如结合相互作用的测量强度的自相关可容易揭示核酸序列的动态。任选地，检查包括监测在核苷酸存在下聚合酶对引物模板核酸的亲和力。任选地，聚合酶瞬时与核酸结合并且结合动力学和亲和力提供关于模板核酸上的下一个碱基的身份的信息。任选地，形成闭合复合物，其中涉及闭合复合物形成的反应条件提供关于核酸上的下一个碱基的信息。任选地，聚合酶是在其相互作用中在聚合位点处被捕获，由此在无需洗涤步骤的情况下揭示亲和力以测量解离速率。
可测量受损DNA聚合酶与核酸之间的动态相互作用的任何技术都可用于测量亲和力并且能够实现本文所公开的测序反应方法。
用于检测核苷酸-特异性三元复合物形成的系统
所提供的方法可使用一个平台进行，在其中核酸聚合反应的任何组分都被定位于表面。任选地，模板核酸附着于平坦衬底、纳米孔阵列、微粒或纳米颗粒。任选地，所有反应组分都自由地悬浮于反应混合物中，而不是固定于固体支持物衬底上。
任选地，模板核酸被固定于表面。所述表面可为平坦衬底、水凝胶、纳米孔阵列、微粒或纳米颗粒。任选地，反应混合物含有多个克隆扩增的模板核酸分子。任选地，反应混合物含有多个可区分的模板核酸。
本文尤其提供了用于进行测序反应的系统，其涉及对在核苷酸存在下聚合酶与引物模板核酸之间的相互作用的检查以通过包括但不限于以下的一种手段或其组合来鉴别模板闭合组合物中的下一个碱基：聚合酶结构域的交联、聚合酶与核酸的交联、通过小分子的变构抑制、反竞争性抑制剂、竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、及变性；其中捕获的聚合酶复合物的形成提供有关核酸模板上的下一个碱基的身份的信息。
还提供了一种用于进行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下进行聚合酶与模板核酸结合检定所必需的组分和试剂，其中模板核酸提供于纳米结构上。任选地，所述系统包括为将模板DNA分子结合至纳米结构上所必需的一种或多种试剂和说明书。例如，所述系统提供一种纳米结构如芯片，其被配置供表面等离子体共振使用以测定结合动力学。这种芯片的一个实例是CM5传感器S芯片(GE Healthcare；Piscatawany,N.J).。所述系统可提供仪器如表面等离子体共振仪器。所述系统可提供链霉抗生物素和/或生物素。任选地，所述系统提供生物素-DNA、DNA连接酶、缓冲液和/或DNA聚合酶以用于制备生物素化的模板DNA。任选地，所述系统提供凝胶或试剂(例如，苯酚:氯仿)以用于生物素化DNA的纯化。或者，所述系统提供用于生物素化模板DNA表征(例如质谱法或HPLC)的试剂。任选地，所述系统包括链霉抗生物素、芯片、试剂、仪器和/或说明书以用于将链霉抗生物素固定在芯片上。任选地，芯片提供于已配置用于模板DNA包被的系统中，其中用能够结合模板核酸或修饰的模板核酸(例如，生物素化模板DNA)的试剂固定芯片。任选地，所述系统提供用于芯片再生的试剂。
还提供了一种用于进行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下进行聚合酶与模板核酸结合检定所必需的组分和试剂，其中模板核酸提供于纳米颗粒上。任选地，所述系统包括为将模板DNA分子结合至纳米颗粒上所必需的一种或多种试剂和说明书。纳米颗粒可被配置用于核酸-聚合酶相互作用的电化学检测，例如通过使用金纳米颗粒。任选地，DNA-纳米颗粒缀合物形成于金胶体水溶液与模板DNA分子之间，所述模板DNA分子在它们的末端处包含例如游离的硫醇或二硫化物基。缀合物可包含相同的核酸序列。任选地，纳米颗粒缀合物对于在高温(例如，大于60℃)和高离子强度(例如，1M Na+)下的絮凝和沉淀是稳定的。任选地，所述系统提供用于制备模板DNA分子的试剂以供纳米颗粒附着之用，包括生成具有二硫化物或硫醇的模板DNA分子。可使用例如3’-硫醇修饰剂可控孔度玻璃(CPG)或通过从通用载体CPG开始并添加二硫化物修饰剂亚磷酰胺作为序列中的第一单体来合成含有二硫化物的模板核酸。所述系统可提供用于获得二硫化物修饰的模板核酸的核酸合成试剂和/或说明书。含有硫醇的模板核酸也可在核酸合成期间用5’-三苯甲基硫醇修饰剂亚磷酰胺生成。所述系统可提供用于使用例如电泳或离心进行纳米颗粒缀合物纯化的试剂和/或说明书。任选地，将纳米颗粒缀合物用于通过比色法监测聚合酶-模板核酸相互作用。在此情况下，纳米颗粒缀合物的解链温度在强聚合酶结合存在下升高。因此，DNA结合的强度可通过此解链转变的变化来测定，所述解链转变可通过颜色变化观察到。所述系统任选地包括用于检测解链转变的试剂和仪器。
还提供了一种用于进行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括使用可检测的聚合酶在核苷酸存在下进行聚合酶与模板核酸结合检定所必需的组分和试剂。任选地，聚合酶是可检测标记的。任选地，使用聚合酶的固有性质(例如，芳香族氨基酸)检测聚合酶。任选地，存在于系统中的聚合酶和模板核酸被配置用于溶液中，而不缀合至支持物上。在聚合酶上的可检测标记可为荧光团，其中荧光被用于监测聚合酶-模板核酸结合事件。任选地，可检测的聚合酶可与溶液中的模板核酸或缀合至支持结构的模板核酸组合使用。任选地，用Cy3-马来酰亚胺标记聚合酶的一个或多个半胱氨酸残基。任选地，所述系统包括为制备荧光标记的聚合酶分子所必需的试剂和/或说明书。所述系统可包括用于纯化荧光标记的聚合酶的试剂和/或说明书。
方法的程序特征
在检查步骤之后，当下一个碱基的身份已经由闭合复合物的形成来鉴别时，视情况而定可对反应条件复位、再充或修改以便为任选的掺入步骤或附加的检查步骤作准备。任选地，已在没有化学掺入核苷酸的情况下鉴别下一个碱基的身份。任选地，在化学掺入核苷酸的情况下鉴别下一个碱基的身份，其中后续的核苷酸掺入已受到抑制。任选地，将排除被测序的模板核酸的检查步骤的所有组分除去或洗掉，使系统恢复检查前条件。任选地，检查步骤的部分组分被除去。任选地，将附加的组分添加到检查步骤中。
任选地，将可逆终止核苷酸用于掺入步骤中以确保每个循环掺入一个且仅一个核苷酸。可逆终止核苷酸上不需要标记，因为碱基身份已从检查步骤已知。非荧光标记的可逆终止子容易获自商业供应商。非标记的可逆终止核苷酸预期与标记的可逆终止子相比具有快得多的掺入动力学，这归因于它们较小的立体足迹及与天然核苷酸相似的尺寸。
本文部分地公开了试剂循环测序方法，其中将测序试剂相继地引入检查和/或掺入的每个周期。任选地，测序反应混合物包含聚合酶、引物模板核酸和至少一种类型的核苷酸。任选地，将核苷酸和/或聚合酶循环地引入测序反应混合物中。任选地，测序反应混合物包含多种聚合酶、引物模板核酸和核苷酸。任选地，将多种核苷酸和/或多种聚合酶循环地引入测序反应混合物中。任选地，测序反应的检查步骤具有与测序反应的掺入步骤不同的组成。
任选地，将一个或多个核苷酸依次添加到测序反应中并从测序反应中移除。任选地，将1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸添加到反应混合物中并从反应混合物中移除。例如，将一种类型的核苷酸添加到测序反应中、从中移除并用另一种类型的核苷酸置换。任选地，在检查步骤期间存在的核苷酸类型不同于掺入步骤期间存在的核苷酸类型。任选地，一个检查步骤期间存在的核苷酸类型不同于连续的检查步骤(即，连续的检查步骤是在掺入步骤之前进行)期间存在的核苷酸类型。任选地，1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸存在于检查反应混合物中且1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸存在于掺入反应混合物中。
任选地，将受损DNA聚合酶循环地添加到测序反应中并从中移除。一种或多种不同类型的聚合酶可被循环地添加到测序反应中并从中移除。任选地，在检查步骤期间存在的聚合酶类型不同于掺入步骤期间存在的聚合酶类型。在一个检查步骤期间存在的聚合酶类型可不同于连续的检查步骤(即，连续的检查步骤是在掺入步骤之前进行)期间存在的聚合酶类型。
任选地，条件如试剂的存在、pH、温度和离子强度在测序反应期间是变化的。任选地，将金属循环地添加到测序反应中并从中移除。例如，催化金属离子可不存在于检查步骤期间而存在于掺入步骤期间。或者，聚合酶抑制剂可存在于检查步骤期间而不存在于掺入步骤期间。任选地，在测序反应期间消耗的反应组分是通过在测序反应期间的任何时点添加新的组分来补充。
每次可将一种类型核苷酸与受损DNA聚合酶一起添加到有利于闭合复合物形成的反应条件中。如果存在下一个正确的核苷酸，那么聚合酶仅结合至模板核酸。每次核苷酸添加之后的洗涤步骤确保未涉及于闭合复合物中的所有过量的聚合酶和核苷酸被从反应混合物中除去。如果以已知的顺序每次添加一种核苷酸，那么当所添加的核苷酸是下一个正确的核苷酸时通过闭合复合物的形成测定模板核酸上的下一个碱基。可通过聚合酶-模板核酸-核苷酸相互作用的构象变化和稳定性的提高来鉴别闭合复合物。任选地，在下一个正确的核苷酸存在下形成的闭合复合物的稳定性比在不正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的不稳定相互作用大至少一个数量级。洗涤步骤的使用确保不存在未结合的核苷酸和聚合酶并且存在于反应中的唯一核苷酸是在闭合复合物中与聚合酶和模板核酸多价螯合的那些。一旦测定模板核酸上的下一个碱基，在闭合复合物中多价螯合的下一个正确的核苷酸便可通过在有利于闭合复合物的解离或去稳定化的反应条件下流动并且通过一个碱基(掺入)延伸模板核酸引物链而掺入。因此，洗涤步骤确保掺入的唯一的核苷酸是来自闭合复合物的下一个正确的核苷酸。可重复此试剂循环方法并且测定核酸序列。此试剂循环方法可应用于单个模板核酸分子，或应用于克隆群如PCR产物或滚环扩增的DNA的集合。如果将许多不同的模板排列在例如固体支持物上，那么可对它们进行平行测序。任选地，洗涤步骤使二元复合物的形成不稳定。任选地，进行洗涤持续确保二元复合物被除去而留下稳定的闭合复合物在反应混合物中的一段时间。任选地，洗涤步骤包括用高离子强度或高pH溶液洗涤反应。
任选地，掺入步骤是三阶段过程。在第一阶段中，将所有四种核苷酸类型与受损DNA聚合酶一起在有利于闭合复合物形成的反应条件下引入包含引物模板核酸的反应中，并且容许下一个正确的核苷酸与模板核酸一起形成稳定的闭合复合物。在第二阶段中，除去受损DNA聚合酶和可能已存在的任何同源核苷酸，且接着用第二聚合酶和一个或多个核苷酸(例如可逆终止核苷酸)置换除去的组分。在第三阶段中，将同源核苷酸掺入到模板核酸引物的3’端中。在掺入步骤中紧密的聚合酶-核酸复合物的形成可通过标准技术实现，如将非特异性DNA结合结构域融合至聚合酶(例如，Phusion聚合酶，其可获自Thermo FisherScientific；Waltham,MA)，并且利用高浓度的核苷酸以确保正确的核苷酸一直存在于闭合复合物中。
聚合酶分子在下一个正确的核苷酸存在下，甚至在典型地为聚合酶合成反应所需的二价金属离子不存在下在手指闭合构象中结合至引物模板核酸分子。构象变化捕获在聚合酶的活性位点内与下一个模板碱基互补的核苷酸。任选地，闭合复合物的形成可用于测定模板核酸上的下一个碱基的身份。任选地，引物模板核酸可在聚合酶存在下，在催化二价金属离子不存在下由不同的核苷酸连续接触；其中闭合复合物的形成指示目前与模板核酸接触的核苷酸是与核酸上的下一个碱基互补的核苷酸。使核苷酸(在聚合酶存在下且在催化金属离子不存在下)与模板核酸接触的已知顺序确保容易基于在诱导闭合复合物形成的顺序中的特定位置鉴别互补核苷酸。任选地，可在每次核苷酸添加之后进行适当的洗涤步骤以确保所有过量酶和核苷酸的除去，仅留下在活性位点处具有下一个正确的核苷酸的闭合复合物中结合至核酸的聚合酶。闭合复合物可通过揭示闭合构象中的聚合酶的构象变化的手段或通过揭示与二元聚合酶-核酸复合物相比或与聚合酶、引物模板核酸与不正确的核苷酸之间的不稳定相互作用相比聚合酶/核酸/下一个正确的核苷酸复合物的稳定性提高的手段来鉴别。
任选地，鉴别下一个互补核苷酸的过程(检查步骤)包括以下步骤：使固定的引物模板核酸与包含聚合酶和一种核苷酸的检查混合物在抑制核苷酸的化学掺入的条件下接触，通过洗涤步骤除去未结合的试剂，检测聚合酶闭合复合物在固定的核酸上的存在或不存在，以及用不同种类的核苷酸连续地重复这些步骤直到检测到闭合复合物形成。可通过聚合酶/核酸/下一个正确的核苷酸复合物的构象变化和稳定性的提高来鉴别闭合复合物。连续的核苷酸添加之间的洗涤步骤可通过利用检测机构来消除，所述检测机构可以高保真度检测闭合复合物的形成，例如，倏逝波感测方法或选择性地监测来自闭合复合物的信号的方法。上述检查步骤可继之以包括以下的掺入步骤：使闭合复合物与催化金属离子(例如Mn2+)接触以便将在闭合复合物中多价螯合的核苷酸共价地添加到引物的3’端。任选地，掺入步骤可包括使固定的核酸与包含多种类型的核苷酸与聚合酶的组合的掺入前混合物在抑制核苷酸的化学掺入的条件下接触；其中掺入前混合物可含有添加剂和溶液条件以确保高效的闭合复合物形成(例如，低盐条件)。所述方法还可包括进行洗涤步骤以除去未结合的试剂并且向固定的复合物提供包含催化金属离子的掺入混合物以便化学掺入在聚合酶的活性位点内多价螯合的核苷酸。掺入前混合物确保高效的闭合复合物形成，而洗涤步骤和掺入混合物确保单一核苷酸添加到引物的3’端中。任选地，掺入步骤可直接出现在检查一种类型的核苷酸的添加之后。例如，用于测序的重复模式可包括以下流程模式：(i)dATP+/聚合酶，(ii)洗涤，(iii)Mn+2，(iv)洗涤，(v)dTTP+/聚合酶，(vi)洗涤，(vii)Mn+2，(viii)洗涤，(ix)dCTP+/聚合酶，(x)洗涤，(xi)Mn+2，(xii)洗涤，(xiii)dGTP+/聚合酶，(xiv)洗涤，(xv)Mn+2，(xvi)洗涤。任选地，用于测序的重复模式可包括(i)dATP+/聚合酶，(ii)洗涤，(iii)dTTP+/聚合酶，(iv)洗涤，(v)dGTP+/聚合酶，(vi)洗涤，(vii)dCTP+/聚合酶，(viii)洗涤，(ix)掺入前混合物，(x)洗涤，(xi)Mn2+，(xii)洗涤。洗涤步骤任选地含有金属离子螯合剂及其他小分子以防止检查步骤期间的偶然掺入。在掺入步骤之后，引物链典型地通过碱基延伸。重复此过程，可鉴别核酸的连续核酸碱基，从而有效地测定核酸序列。任选地，检查步骤是在高盐条件，例如在50mM至1,500mM盐的条件下进行。
对于测序应用，减少或消除流体和试剂交换可为有利的。除去泵、阀门和试剂容器可允许更小型装置的简化制造。本文部分地公开了“一体式”测序方法，其中消除对将试剂相继地引入检查和/或掺入的每个周期的需要。仅将试剂添加到反应中一次，并且通过操纵已封闭在测序反应内的试剂来进行合成测序。像这样的方案需要辨别不同核苷酸的方法、使核苷酸在核酸的克隆群中和/或不同核酸分子中的掺入同步化的方法、以及确保每个循环仅添加一种核苷酸的方法。
任选地，测序反应混合物包含受损DNA聚合酶、引物模板核酸和至少一种类型的核苷酸。任选地，测序反应混合物包含多种聚合酶、引物模板核酸和核苷酸。如本文所提供，聚合酶是指单一聚合酶或多种聚合酶。如本文所提供，引物模板核酸或模板核酸是指单一引物模板核酸或单一模板核酸，或多种引物模板核酸或多种模板核酸。如本文所提供，核苷酸是指一种核苷酸或多种核苷酸。如本文所提供，单一核苷酸是一种核苷酸。任选地，测序反应核苷酸包括但不限于1、2、3、或4种以下核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
任选地，1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP)同时一起存在于反应混合物中，其中一种类型的核苷酸是下一个正确的核苷酸。反应混合物还包含至少一种受损DNA聚合酶和至少一种引物模板核酸。任选地，模板核酸是模板核酸的克隆群。任选地，受损DNA聚合酶、引物模板核酸和核苷酸在检查反应条件下形成闭合复合物。
在所提供的方法中，四种类型的核苷酸可以不同浓度存在，其中由于四种核苷酸的不同浓度，倘若它们为下一个正确的核苷酸，那么聚合酶与模板核酸的扩散和结合次数对于四种核苷酸中的每种是不同的。例如，在最高浓度下的核苷酸将以很快的时间结合至其在模板核酸上的互补碱基，且在最低浓度下的核苷酸将以较慢时间结合至其在模板核酸上的互补碱基；其中与模板核酸上的互补碱基的结合是指聚合酶将在闭合复合物中的下一个正确的核苷酸下结合至模板核酸。下一个正确的核苷酸的身份因此通过监测聚合酶与闭合复合物中的模板核酸的结合速率或时间来测定。任选地，四种类型的核苷酸可通过它们的浓度来辨别，其中不同浓度的核苷酸造成聚合酶与核酸结合的结合速率的显著不同。任选地，四种类型的核苷酸可通过它们的浓度来辨别，其中不同浓度的核苷酸造成稳定的闭合复合物形成的结合速率的显著不同。
任选地，受损DNA聚合酶是标记的。在一些情况下，聚合酶没被标记(即，不载有外源性标记，如荧光标记)并且采用本文所公开的或本领域中已知的任何无标记检测方法。任选地，经由受损DNA聚合酶的可检测的特征监测聚合酶与核酸的结合。任选地，经由聚合酶的可检测的特征监测稳定的闭合复合物的形成。聚合酶的可检测的特征可包括但不限于光学、电学、热、比色、质量及其任何组合。
任选地，1、2、3、4种或更多种核苷酸类型(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)被拴接到1、2、3、4种或更多种不同的受损DNA聚合酶；其中每个核苷酸类型栓接到不同的聚合酶且每个聚合酶具有不同的外源性标记或来自其他聚合酶的可检测特征以便实现其鉴别。可将所有拴接的核苷酸类型一起添加到测序反应混合物中以形成包含拴接的核苷酸-聚合酶的闭合复合物；监测闭合复合物以鉴别聚合酶，由此鉴别聚合酶所拴接至的下一个正确的核苷酸。拴接可在核苷酸的γ磷酸处通过多磷酸基和接头分子发生。这种γ-磷酸连接方法在本领域中是标准的，其中荧光团附着于γ磷酸接头上。任选地，通过可区分的外源性标记鉴别不同的核苷酸类型。任选地，可区分的外源性标记附着于每个核苷酸的γ磷酸位置处。
任选地，测序反应混合物包含催化金属离子。任选地，催化金属离子是Mn2+离子。任选地，催化金属离子可用来与受损DNA聚合酶在测序反应的任何时点以瞬时方式反应。为了确保稳健的测序，催化金属离子可在短时期内使用，以允许与模板核酸中的下一个碱基互补的单一核苷酸在掺入步骤期间被掺入到引物的3’端中。在此情况下，没有别的核苷酸，例如与模板核酸中的下一个碱基下游处的碱基互补的核苷酸掺入。任选地，催化金属离子镁在测序反应混合物中作为光笼蔽复合物(例如，DM-Nitrophen)存在以使得局部UV照射释放镁，使得其可供聚合酶用于核苷酸掺入。此外，测序反应混合物可含有EDTA，其中镁在催化核苷酸掺入之后从聚合酶活性位点上释放并且由测序反应混合物中的EDTA捕获，由此使镁变得不能催化后续核苷酸掺入。
因此，在所提供的方法中，催化金属离子可以螯合或笼蔽形式存在于测序反应中，催化金属离子可通过触发物从所述螯合或笼蔽形式中释放。例如，催化金属离子催化闭合复合物下一个正确核苷酸的掺入，并且当催化金属离子从活性位点处释放时，其被第二螯合剂或笼蔽剂多价螯合，从而使得金属离子不能催化后续掺入。催化金属离子由其螯合或笼蔽复合物的局部释放是通过使用局部解除笼蔽或去螯合方案(如倏逝波照射或结构照射)来保证。催化金属离子的受控释放可例如通过热手段来进行。催化金属离子从它们的光笼蔽复合物中的受控释放可通过限制光场，例如通过倏逝照射如波导或全内反射显微术在靠近模板核酸处局部地释放。催化金属离子的受控释放可例如通过改变靠近模板核酸附近处的溶液的pH来进行。螯合剂如EDTA和EGTA是pH依赖性的。在低于5的pH下，二价阳离子Mg2+和Mn2+没有有效地被EDTA螯合。可控地操纵靠近模板核酸处的pH的方法容许催化金属离子从螯合剂中的受控释放。任选地，通过将电压施加于核酸所附着于的表面来诱导局部pH变化。pH方法提供的优势在于当pH恢复到螯合范围时金属回到其螯合形式。
上文描述了用于鉴别核酸序列的聚合酶-核酸结合反应。然而，核酸序列鉴别可包括关于核酸修饰的信息，包括甲基化和羟甲基化。甲基化可出现在模板核酸的胞嘧啶碱基上。DNA甲基化可稳定地改变基因的表达。DNA甲基化也显示在各种类型的癌症、动脉粥样硬化和衰老的发展中。DNA甲基化因此可充当人类疾病的表观遗传生物标记。
任选地，在测序期间，通过本文所提供的结合方法鉴别模板核酸上的一个或多个胞嘧啶甲基化。在测序之前，可对模板核酸进行克隆扩增，其中扩增子包含与它们的模板核酸相同的甲基化。模板核酸的扩增可包括使用DNA甲基转移酶以实现扩增子甲基化。向包含聚合酶和一个或多个核苷酸类型的反应混合物提供模板核酸或扩增的模板核酸，其中监测聚合酶与核酸之间的相互作用。任选地，在甲基化胞嘧啶存在下聚合酶与模板核酸之间的相互作用不同于在未修饰的胞嘧啶存在下的相互作用。因此，基于对聚合酶-核酸相互作用的检查，确定修饰的核苷酸的身份。
任选地，在一个或多个检查和/或掺入步骤之后，添加核苷酸的子集以减少或重置相位。因此，所述方法可包括以下一个或多个步骤：使被测序的模板核酸分子与包含核苷酸子集和用于将核苷酸掺入到核酸分子的模板链相对的链中的酶的组合物接触。所述接触可在减少核酸分子中的相位的条件下发生。任选地，接触模板核酸分子的步骤是在掺入步骤之后和/或检查步骤之后发生。任选地，接触是在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95或100轮或更多轮测序(即，检查和掺入的轮次)之后发生。任选地，接触是在30至60轮测序之后发生。任选地，接触是在每轮测序之后(即，一组检查和掺入步骤之后)发生。任选地，多个接触步骤在每轮测序之后发生，其中每个接触步骤可包含不同的核苷酸子集。任选地，所述方法还包括在接触之后的一个或多个洗涤步骤。任选地，所述子集包含两个或三个核苷酸。任选地，所述子集包含三个核苷酸。任选地，所述核苷酸子集选自以下中的三个：dATP、dGTP、dCTP、dTTP或其衍生物。任选地，三个核苷酸包括腺苷、胞嘧啶和鸟嘌呤。任选地，三个核苷酸包括腺苷、胞嘧啶和胸腺嘧啶。任选地，三个核苷酸包括胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。任选地，三个核苷酸包括腺苷、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。任选地，每轮接触包含相同子集或不同子集的核苷酸。任选地，监测核酸模板的测序并且在相位检测后发生与核苷酸子集的接触。也参见例如，美国专利号8,236,532，其以引用的方式整体并入本文。
任选地，测序反应涉及多种模板核酸、聚合酶和/或核苷酸，其中监测多种闭合复合物。可将克隆扩增的模板核酸在一起测序，其中克隆被定位得非常靠近以允许测序期间的增强监测。任选地，闭合复合物的形成确保碱基延伸穿过多个克隆扩增的模板核酸的同步性。碱基延伸的同步性允许每个测序循环仅添加一个碱基。
基因分型应用
所公开的受损DNA聚合酶的示例性使用涉及SNP检测和基因分型应用，而无需广泛的序列测定。在此，受损DNA聚合酶可在无掺入的情况下用于测定经历检查的引物模板核酸分子的下一个正确的核苷酸的身份。任选地，所述工序涉及使引物杂交至靶核酸以产生引物模板核酸分子。然后可使引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和一个或多个核苷酸的组合物接触。任选地，受损DNA聚合酶包含可检测的标记，如荧光可检测的标记。任选地，一种以上受损DNA聚合酶包含在组合物中，其中至少两种受损DNA聚合酶被区别标记。任选地，组合物包含至少一种载有可检测的标记(如可检测的荧光标记)的核苷酸。任选地，组合物中的一种以上核苷酸包含可检测的标记。任选地，组合物中的两种不同的核苷酸各自载有可相互区分的不同的可检测标记。由序列号62/448,630(2017年1月20日提交)表示的共同拥有的美国专利申请阐述了许多基因分型工序，其中可使用本发明的受损DNA聚合酶，其公开内容以引用的方式并入。
采用受损DNA聚合酶的说明性测序方法
根据所公开的技术的检查反应任选地可在Mg+2离子存在下进行。受损DNA聚合酶在此离子存在下不能催化磷酸二酯键形成的事实意味着其可被包括在检查步骤期间，而不会破坏瞬时结合(即，无掺入的结合)。催化金属离子的存在可提高通常在DNA聚合反应期间很重要的差别活性。虽然非催化离子也可包括在内或取代催化离子，但抑制聚合酶介导的掺入的非催化金属离子的包括是任选的。
使用所公开的技术的检查反应可任选地使用原生核苷酸进行。一般说来，用于检测包含受损DNA聚合酶的三元复合物的任何方法都将适用于核苷酸序列测定方案中。检测折射率的变化的光学技术(例如，干涉测量法或表面等离子体共振感测)将能够实现无标记的检测，且因此可在检查步骤中使用未标记的原生核苷酸进行。任选地，如果受损DNA聚合酶载有外源性标记(例如，荧光标记)，那么可使用常规的荧光监测技术检测定位在固体支持物或表面(例如，在平面阵列或珠粒阵列上的基因座)上的确定位置处的三元复合物的形成。
使用受损聚合酶进行的检查反应任选地可使用载有外源性标记(例如荧光标记)的核苷酸进行。当与荧光检测平台一起使用时，载有与引物模板核酸和受损聚合酶共定位的荧光化学部分的核苷酸类似物可指示三元复合物的形成。
可使用引物模板核酸进行检查，其中双链体的引物链载有游离的3’羟基部分，其可用于参与在具有形成磷酸二酯键能力的同源核苷酸和原生DNA聚合酶存在下磷酸二酯键的形成。
测序技术的示例性工作流程涉及首先使引物模板核酸与一个或多个测试核苷酸(即，被测试作为同源核苷酸候选物的核苷酸)和受损聚合酶接触。如果测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么将形成包含所有三种组分的三元复合物。三元复合物的肯定检测指示测试核苷酸是载有与沿着模板链的那个位置互补的碱基的同源核苷酸。由于受损DNA聚合酶不能催化磷酸二酯键，所以下一个正确的核苷酸的鉴别必须在同源核苷酸不掺入到引物中的情况下进行。引物通过掺入同源核苷酸进行的延伸可通过不同的方法完成。例如，一旦已经收集鉴别下一个正确的核苷酸所需的信息，便可实现反应混合物的交换，从而将受损聚合酶交换成能促进磷酸二酯键形成的第二聚合酶。如果还提供有同源核苷酸和二阶阳离子，那么第二聚合酶将能影响同源核苷酸向引物中的掺入。
应理解，所公开的技术将需要一种活性DNA聚合酶以用于将同源核苷酸掺入到生长的引物中。
在所公开的技术的某些实施方案中，一旦已收集了证实同源核苷酸的身份所需的信息，对应于同源核苷酸的可逆终止核苷酸便可被掺入到生长的引物中。
一方面，所公开的技术的特征是通过依赖于使用受损DNA聚合酶的工序进行的核苷酸鉴别。任选地，Mg2+离子可包含在检查反应混合物中，所述反应混合物还包含引物模板核酸、受损DNA聚合酶和测试核苷酸。任选地，引物模板核酸可被固定在平坦表面或珠粒上的固定位置处。任选地，检查步骤中使用的测试核苷酸是原生核苷酸。任选地，测试核苷酸包含外源性标记，如荧光标记。任选地，不同的测试核苷酸是用可相互区分的不同的外源性标记来标记。任选地，引物模板核酸的引物包含游离的3’羟基。任选地，受损DNA聚合酶载有外源性标记，如荧光标记。任选地，一旦已收集足够的信息以鉴别存在于包含引物模板核酸、受损DNA聚合酶和核苷酸的三元复合物中的同源核苷酸，便可将受损DNA聚合酶和核苷酸从引物模板核酸(例如，通过利用EDTA和高离子强度条件)中移除并用第二聚合酶和一种或另一种类型的核苷酸置换。第二DNA聚合酶任选地将能够催化磷酸二酯键形成。联合第二DNA聚合酶使用的核苷酸可以是原生核苷酸或核苷酸类似物(例如，可逆终止核苷酸)。任选地，在循环方案中使用受损DNA聚合酶和第二DNA聚合酶允许引物通过掺入一个或多个核苷酸进行延伸。任选地，第二DNA聚合酶与可逆终止核苷酸组合的使用限制单一核苷酸的掺入。任选地，可逆终止部分可被移除以便允许另一个核苷酸或核苷酸类似物的后续掺入。
实施例1说明了受损聚合酶可怎样用于利用荧光标记的核苷酸的DNA测序方法中。
实施例1
使用受损DNA聚合酶和荧光核苷酸的DNA序列测定
获得具有同源核苷酸结合和辨别活性而不是首先形成磷酸二酯键的能力的受损DNA聚合酶。使固定在呈流动单元的阵列形式的固体支持物上的确定位置处的引物模板核酸与包含受损聚合酶和在γ磷酸上用荧光部分标记的dATP的第一反应混合物接触。荧光监测指示没有超过背景的荧光信号。这表明dATP不是下一个正确的核苷酸。用包含受损聚合酶和在γ磷酸上用荧光部分标记的dGTP的第二反应混合物替代流动单元内的第一反应混合物。荧光监测指示超过背景的实质性荧光。这表明dGTP是下一个正确的核苷酸。将第二反应混合物从流动单元中冲洗并且由包含终止DNA聚合酶(New England BioLabs)和四种可逆终止核苷酸(各自具有3’-ONH2封端基团)的掺入反应混合物替代。掺入具有鸟嘌呤作为其碱基的可逆终止核苷酸。任选地，得到的封端引物模板核酸分子在后一轮的核苷酸检查中与受损DNA聚合酶一起直接使用以获得更广泛的序列信息。任选地，通过标准工序化学上裂解可逆终止部分以暴露原生引物，并且将得到的引物模板核酸分子与受损DNA聚合酶一起用于后一轮核苷酸检查中以获得更广泛的序列信息。
实施例2说明了当受损聚合酶被荧光标记时受损聚合酶可怎样用于DNA测序方法中。
实施例2
使用荧光标记的受损DNA聚合酶的DNA序列测定
获得具有同源核苷酸结合和辨别活性而不是首先形成磷酸二酯键的能力的受损DNA聚合酶。将受损DNA聚合酶用表面可及的半胱氨酸氨基酸的官能团上的荧光部分标记。使固定在呈流动单元的阵列形式的固体支持物上的确定位置处的引物模板核酸与包含荧光受损DNA聚合酶和原生dATP的第一反应混合物接触。荧光监测指示没有超过背景的荧光信号。这表明dATP不是下一个正确的核苷酸。将流动单元内的第一反应混合物用包含荧光受损聚合酶和原生dGTP的第二反应混合物替代。荧光监测指示超过背景的实质性荧光。这表明dGTP是下一个正确的核苷酸。将第二反应混合物从流动单元中冲洗并且由包含终止DNA聚合酶(New England BioLabs)和四种可逆终止核苷酸(各自具有3’-ONH2封端基团)的掺入反应混合物替代。掺入具有鸟嘌呤作为其碱基的可逆终止核苷酸。
使用本领域普通技术人员所熟知的标准技术制备和纯化上述TDE突变体聚合酶。用于程序中的Bst-f蛋白质主链(即SEQ ID NO:1)已被修饰以包含在位置23处的优化半胱氨酸(cys)残基、在N端(即，位置5-10)处的组氨酸标记序列以帮助蛋白质纯化、及在位置16-17之间的凝血酶裂解位点。没有一种在原生Bst DNA聚合酶的第一蛋氨酸(即，SEQ IDNO:1的位置27)上游处的蛋白质序列修饰被认为是在无Mg2+催化的掺入下正确的核苷酸鉴别的期望组合所必需的。因此，这些修饰的纳入在加工产物中是任选的，且因此在表1中(即，使用SEQ ID No:1-3中任一个的母体支架)示出的三种TDE突变体可任选地用于进行检测或测序程序。
实施例3描述了在涉及检查周期的结合测序方案中受损DNA聚合酶的使用以鉴别同源核苷酸，并且显示突变体在另外的催化性Mg2+金属离子存在下不掺入同源核苷酸。如上所述，TDE突变体在Bst-f酶(SEQ ID NO:1)的位置381处包含单个氨基酸改变。因此，TDE突变体包含序列EYSQIELR(SEQ ID NO:12)以代替基序A内的DYSQIELR(SEQ ID NO:13)。BDE突变体包含序列QVHEEL(SEQ ID NO:14)以代替基序C内的QVHDEL(SEQ ID NO:15)。包含外源性半胱氨酸残基和N端His-标签但不含任何聚合受损突变的亲本酶充当此工序中的对照。在替代方案中，包含修饰的基序A的工程化聚合酶在工序中可被取代。例如，工程化的聚合酶可包含SEQ ID NO:12的序列，所述SEQ ID NO:12的序列包含在SEQ ID NO:3的序列内且位置355被谷氨酸取代。位置364被谷氨酸取代的SEQ ID NO:2的序列是一个实例，而位置381被谷氨酸取代的SEQ ID NO:1的序列是另一个实例。同样，包含修饰的基序C的工程化聚合酶在工序中可被取代。例如，工程化的聚合酶可包含SEQ ID NO:14的序列，所述SEQ IDNO:14的序列包含在SEQ ID NO:3的序列内且位置532被谷氨酸取代。位置541被谷氨酸取代的SEQ ID NO:2的序列是一个实例，而位置558被谷氨酸取代的SEQ ID NO:1的序列是另一个实例。
实施例3
使用受损DNA聚合酶在无掺入下对同源核苷酸鉴别的示范
将采用生物层干涉测量法来测量光学纤维端部的表面上的结合反应的(Menlo Park,CA)Octet仪器以多孔板形式使用以说明测序技术。将在模板链的5’端处生物素化的引物模板核酸分子使用标准工序固定在用链霉抗生物素(SA)功能化的光学纤维端部上。在此工序中的引物模板核酸分子具有CG作为引物下游的下一个正确的核苷酸。
循环工序涉及以下步骤：(1)洗涤/再生传感器端部；(2)形成包含聚合酶和同源核苷酸的三元复合物；以及(3)用EDTA溶液洗涤以从引物模板核酸分子中剥离复合物。掺入步骤是在一轮完整的结合和检查之后，使用四种dNTP进行，每次一种。在开始循环方案之前，将传感器端部在包含KCl、谷氨酸钾和0.01％Tween-20的Tris-缓冲溶液(pH 8.0)中洗涤/再生。将首先进入的核苷酸在检查缓冲液(30mM Tris-HCl(pH 8.0)、420mM KCl、160mM谷氨酸钾、2mM SrCl2、0.01％Tween-20、0.1mg/mL乙酰化BSA和1mMβ-巯基乙醇)存在下用500nM的TDE或500nM的CBT询问。将原生核苷酸用于工序中，并且以如下顺序接触传感器端部：dATP、dCTP、dTTP和dGTP。每种dNTP以100μM的浓度存在，而dTTP除外，其以200μM的浓度使用。将核苷酸结合步骤在30℃下使用持续约30秒时间。在每个核苷酸结合和检查步骤结束时，使用含有KCl以螯合二价阳离子的EDTA溶液将任何所形成的复合物从传感器端部上洗涤持续45秒。此后，使生物传感器在移到下一个dNTP检查之前再生30秒。
在检查所有四种dNTP以确定三元复合物是否形成之后，进行掺入反应以研究TDE突变体的可能残余聚合酶活性。在此，亲本CBT酶充当核苷酸结合和掺入活性的阳性对照。首先，通过使传感器端部与同源核苷酸(即dCTP)在100μM的浓度下接触30秒来制备三元复合物。接着，将生物传感器端部转移到掺入缓冲液(30mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mM KCl、50mM Mg2+)中持续30秒。最后，使用含有KCl以螯合二价阳离子的EDTA溶液将复合物从传感器端部上洗涤持续45秒。再次，在移到下一系列的检查反应之前使用所有四种dNTP(每次一种)使生物传感器再生30秒。来自后一组检查反应的结果是关于突变体酶的结合和掺入活性的信息。
来自图1中所示工序的结果证实受损聚合酶正确地鉴别同源核苷酸，但不能掺入那个核苷酸，甚至在催化性Mg2+金属离子存在下。该图示出了使用TDE和CBT聚合酶进行的所有四种核苷酸的检查迹线。在添加核苷酸之前二元复合物的形成建立了用于比较的基线值。在dNTP存在下生成的三元复合物表明两种聚合酶将dCTP正确地鉴别为同源核苷酸。在所有情况下，非同源核苷酸与大体基线结合信号有关。在允许掺入的步骤之后，仅亲本CBT酶显示具有催化活性。更具体地说，突变体TDE酶再次将dCTP鉴别为用于引物模板核酸分子的同源核苷酸。这表明没有核苷酸在掺入条件下通过突变体酶被掺入。相反，亲本CBT酶将dGTP鉴别为掺入之后的下一个正确的核苷酸。因此，受损聚合酶正确地执行检查步骤，而不能掺入同源核苷酸。当然，进行广泛序列测定的重复循环工序可使用不同的酶用于掺入步骤。可逆终止核苷酸(例如，未标记的可逆终止核苷酸)可用于掺入过程中。
在较低浓度的催化金属离子下进行另外的测试以研究受损TDE聚合酶通过磷酸二酯键形成掺入同源核苷酸的能力。在此，将10mM浓度的MgCl2或MnCl2在掺入步骤中测试。再次，受损TDE突变体未能在催化性Mg2+金属离子存在下掺入同源核苷酸。然而，TDE突变体在催化性Mn2+金属离子存在下掺入同源核苷酸。值得注意地，平行检验显示BDE突变体在检查步骤期间正确地鉴别同源核苷酸，但像TDE突变体则在Mg2+离子存在下无催化活性。TDN突变体既不能鉴别同源核苷酸，也不能催化磷酸二酯键形成。
上文公开了可用于、可结合用于、可用于制备或得自所公开方法和组合物的材料、组合物及组分。应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等等时，虽然这些化合物的每个不同单独的和共同的组合及置换未必明确地公开，但在本文中特定地包括和描述每一个。例如，如果公开并论述一种方法并且论述了对许多分子包括方法可以进行许多修饰，除非明确另外指出，否则明确地包括可能的方法及修饰的每个组合与置换。同样，还具体地预期和公开这些的任何子集或组合。此概念适用于本公开内容的所有方面，包括使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果有许多可进行的附加步骤，则应该理解，可以在所公开方法的任何具体方法步骤或方法步骤组合中进行这些附加步骤中的每一个，如同已经具体预期和公开了这些组合中的每一个或组合的子集。
本文中引用的出版物及其引用的材料特此具体来说以引用的方式整体并入本文中。在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用的方式并入一般。
应理解，文中使用的标题是为了组织的目的，并非意图限制说明书或权利要求书。
已经描述了许多实施方案。尽管如此，应了解可做出各种修改。因此，其他实施方案在权利要求书的范围内。
序列表
<110> 欧姆尼欧美公司(Omniome, Inc.)
康达斯瓦米·维加亚恩(Vijayan, Kandaswamy)
皮纳尔·伊伊多根(Iyidogan, Pinar)
<120> 核酸序列测定方法
<130> OMNI-008
<150> US 62/444,733
<151> 2017-01-10
<150> US 62/329,489
<151> 2016-04-29
<160> 15
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 工程化的DNA聚合酶
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Cys Gly Ala Ala Met Ala Phe Thr Leu Ala
20 25 30
Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val
35 40 45
Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala
50 55 60
Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu
65 70 75 80
Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys
85 90 95
Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly
100 105 110
Ile Glu Leu Ala Gly Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu
115 120 125
Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met
130 135 140
Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly
145 150 155 160
Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val
165 170 175
Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Glu Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu
180 185 190
Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro
195 200 205
Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val Asp
210 215 220
Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Gly
225 230 235 240
Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile
245 250 255
Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu
260 265 270
Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val
275 280 285
Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu Asn Ile Leu His
290 295 300
Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu
305 310 315 320
Lys Val Val Arg Pro Ala Thr Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln
325 330 335
Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln
340 345 350
Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe
355 360 365
Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln
370 375 380
Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met
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Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile
450 455 460
Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr Met Glu Asn
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Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu His
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys
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<210> 2
<211> 587
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 工程化的DNA聚合酶
<220>
<221> SITE
<223> 工程化的DNA聚合酶
<400> 2
Gly Ser His Met Ser Cys Gly Ala Ala Met Ala Phe Thr Leu Ala Asp
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Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp
565 570 575
Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys
580 585
<210> 3
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 工程化的DNA聚合酶
<400> 3
Met Ala Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp
1 5 10 15
Lys Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala
20 25 30
Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu
35 40 45
Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly
50 55 60
Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val
65 70 75 80
Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Ala Gly Val Ser Phe Asp Leu
85 90 95
Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu
115 120 125
Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val
130 135 140
Leu Ala Glu His Leu Val Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Glu Leu Glu
145 150 155 160
Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu
165 170 175
Val Glu Leu Glu Gln Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe
180 185 190
Ala Gly Val Lys Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Lys Glu
195 200 205
Leu Ala Glu Gln Leu Gly Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala
210 215 220
Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu
225 230 235 240
Phe Glu Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr
245 250 255
Ser Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile
260 265 270
Val Glu Asn Ile Leu His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr
275 280 285
Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Ala Thr Lys Lys Val
290 295 300
His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser
305 310 315 320
Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg
325 330 335
Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe
340 345 350
Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala
355 360 365
Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His
370 375 380
Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr
385 390 395 400
Pro Asn Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Tyr Gly Ile Val Tyr
405 410 415
Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys
420 425 430
Glu Ala Ala Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val
435 440 445
Lys Arg Tyr Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr
450 455 460
Val Thr Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser
465 470 475 480
Arg Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr
485 490 495
Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp
500 505 510
Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala His Leu Leu Leu
515 520 525
Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu
530 535 540
Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu
545 550 555 560
Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp
565 570 575
Ala Lys
<210> 4
<211> 26
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
Asp Tyr Val Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile
1 5 10 15
Met Ala His Leu Ser Arg Asp Lys Gly Leu
20 25
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 栖热水生菌(Thermus aquaticus)
<400> 5
Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu
20 25
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)
<400> 6
Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu
20 25
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 7
Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Leu Ala His Ile Ser Lys Asp Glu Asn Leu
20 25
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 8
Met Ile Met Gln Val His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val His Lys Asp
1 5 10 15
Asp Val Asp
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> 栖热水生菌(Thermus aquaticus)
<400> 9
Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu
1 5 10 15
Arg Ala Glu
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)
<400> 10
Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu
1 5 10 15
Glu Ile Glu
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 11
Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Phe Glu Ala Pro Lys Glu
1 5 10 15
Glu Ile Glu
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> DNA聚合酶基序A的突变体
<400> 12
Glu Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)
<400> 13
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> DNA聚合酶基序C的突变体
<400> 14
Gln Val His Glu Glu Leu
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)
<400> 15
Gln Val His Asp Glu Leu
1 5

Claims (39)

1.一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸包含与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第一反应混合物接触，
从而如果所述测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含所述引物模板核酸、所述受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的复合物，且
其中所述受损DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；
(b)测量在所述测试核苷酸存在下所述引物模板核酸与所述受损DNA聚合酶的结合，而所述测试核苷酸不会化学掺入到所述引物模板核酸的引物中；以及
(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含含有SEQ ID NO:12的多肽序列或含有SEQ ID NO:14的多肽序列。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶在二价锰离子存在下催化磷酸二酯键的形成，且其中所述第一反应混合物不含促进磷酸二酯键形成的浓度的二价锰离子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述测试核苷酸包含外源性标记。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述测试核苷酸的荧光部分产生的荧光信号。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含外源性标记，且其中步骤(b)包括检测所述受损DNA聚合酶的外源性标记。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述受损DNA聚合酶的荧光部分产生的荧光信号。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述引物包含游离的3’羟基部分。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其在步骤(b)之后还包括以下步骤：用包含第二聚合酶和第二类型的核苷酸的第二反应混合物替代所述第一反应混合物，接着将所述第二类型的核苷酸掺入到所述引物模板核酸的引物中。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述第二类型的核苷酸是包含可逆终止部分的可逆终止核苷酸，且其中所述可逆终止核苷酸的掺入产生封端的引物模板核酸分子。
11.如权利要求10所述的方法，还包括从所述封端的引物模板核酸分子中除去所述可逆终止部分以再生所述引物模板核酸分子的步骤。
12.如权利要求10所述的方法，还包括使用所述封端的引物模板核酸分子代替所述引物模板核酸重复步骤(a)-(c)。
13.如权利要求11所述的方法，还包括重复步骤(a)-(c)。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置381之外；或SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置558之外。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置364之外；或SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置541之外。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置355之外；或SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置532之外。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物包含二价镁离子。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含Mg2+离子，且其中所述引物包含3’羟基部分。
19.一种用于鉴别有待掺入到引物模板核酸分子中的下一个正确核苷酸的试剂盒，所述试剂盒以一个或多个容器的包装组合形式包含：
(a)受损DNA聚合酶，其与所述引物模板核酸和所述下一个正确的核苷酸形成三元复合物，但其大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；
(b)四种类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子；及
(c)四种类型的可逆终止核苷酸。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述四种可逆终止核苷酸是四种非荧光可逆终止核苷酸。
21.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述受损DNA聚合酶包含可检测的标记。
22.如权利要求19所述的试剂盒，其中四种类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子中的至少一种包含可检测的标记。
23.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述受损DNA聚合酶在锰离子存在下催化磷酸二酯键形成。
24.如权利要求19所述的试剂盒，还包含从所述四种类型的可逆终止核苷酸中除去可逆终止部分的化学试剂。
25.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述四种不同类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子各自可由包含镁依赖性聚合酶活性的DNA聚合酶掺入。
26.如权利要求19所述的试剂盒，还包含将下一个正确核苷酸掺入到所述引物模板核酸分子中的第二DNA聚合酶。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述第二DNA聚合酶将所述四种类型的可逆终止核苷酸中的一种作为下一个正确核苷酸掺入。
28.如权利要求19所述的试剂盒，还包括流动单元。
29.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述四种类型的脱氧核糖核苷酸三磷酸分子包含dATP、dGTP、dCTP、及dTTP或dUTP；且其中所述四种类型的可逆终止核苷酸包含dATP、dGTP、dCTP、及dTTP或dUTP的类似物，各类似物包含3’-ONH2可逆终止部分。
30.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述受损DNA聚合酶包含含有SEQ ID NO:12的多肽序列或含有SEQ ID NO:14的多肽序列。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中包含SEQ ID NO:12的所述多肽序列包含SEQ IDNO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置355之外。
32.如权利要求30所述的试剂盒，其中包含SEQ ID NO:14的所述多肽序列包含SEQ IDNO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置532之外。
33.一种包含多肽序列的突变体DNA聚合酶，所述多肽序列包含SEQ ID NO:12，
其中所述突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，及
其中所述突变体DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成。
34.如权利要求33所述的突变体DNA聚合酶，其中所述受损DNA聚合酶在二价锰离子存在下催化磷酸二酯键的形成。
35.如权利要求33所述的突变体DNA聚合酶，其中所述突变体DNA聚合酶的多肽序列选自由以下组成的组：
SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置381之外，
SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置364之外，及
SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置355之外。
36.如权利要求35所述的突变体DNA聚合酶，其还包含与此连接的报道部分。
37.一种包含多肽序列的突变体DNA聚合酶，所述多肽序列包含SEQ NO:14，
其中所述突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，及
其中所述突变体DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成。
38.如权利要求37所述的突变体DNA聚合酶，其中所述突变体DNA聚合酶的多肽序列选自由以下组成的组：
SEQ ID NO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置558之外，
SEQ ID NO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置541之外，及
SEQ ID NO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置532之外。
39.如权利要求38所述的分离的突变体DNA聚合酶，其还包含与此连接的报道部分。
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