KR102231977B1 - 핵산 서열의 결정 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 주형-의존적 방식으로 프라이머의 하류에서 다음 정확한 뉴클레오티드를 결합시키는 능력을 소유하지만, 포스포다이에스터 결합 형성을 촉진시키는데 필요한 활성을 소유하지 않는 손상된 DNA 중합 효소를 사용하는 동족 뉴클레오티드의 검출의 결합에-의한-서열결정 방법이 제공된다. 상기 손상된 DNA 폴리머라제의 용도는, 임의의 뉴클레오티드의 혼입 없이, 한번에 하나의 뉴클레오티드의 문의를 허용한다. 표지된 뉴클레오티드, 예컨대 형광적으로 표지된 뉴클레오티드는 손상된 DNA 폴리머라제와 함께 사용되어 신속 방식으로 동족 뉴클레오티드 동일성을 확립시킬 수 있다.

Description

핵산 서열의 결정 방법
관련 출원
본원은 2017년 1월 10일자 출원된 미국 가출원 제62/444,733호; 및 2016년 4월 29일자 출원된 미국 가출원 제62/329,489호를 우선권 주장한다. 이들 출원의 개시내용은 이들의 전체내용이 본원에 참고로 혼입된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 생물공학의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 핵산 서열결정 기술에 관한 것이다.
정확한 폴리뉴클레오티드 서열결정은 많은 적용에서 결정적으로 중요하다. 예를 들어, 개체의 유전적 프로파일의 포괄적인 정의는 염색체 DNA의 긴 스트레치가 공지된 서열의 데이터베이스에 대해 결정되고 비교되는 것을 요구한다. 결과는 의료 통찰력을 제공하기 위해 소인 또는 감수성의 프로파일을 확립시킬 수 있다. 마찬가지로, 종양 프로파일링은 또한 치료가 시작되기 전 약물 치료 레지멘의 효능을 확립시키기 위해 정확한 서열결정을 요구할 수 있다. 또한, 핵산 데이터베이스로부터 박테리아, 바이러스성, 또는 다른 병원체의 확인은 또한 정확한 서열결정 결과에 의존할 수 있다.
핵산의 가닥을 따라 동일한 염기의 1 초과의 스트레치는 정확한 서열결정을 혼동하는 인자 중이다. 이들 "단독중합체" 스트레치는 일부 서열결정 접근법에 의해 간과될 수 있고, 이로써 다중 염기가 실제로 존재하는 경우 단일 염기가 검출될 것이다. 일부 서열결정 방법은 추가로 단독중합체 스트레치에 의해 악화될 수 있는 "페이싱" 사안을 경험할 수 있다. 페이싱의 결과로서, 단독중합체 스트레치의 서열결정 하류는 모호하게 될 수 있다.
상이한 접근법은 단독중합체 서열결정 사안을 다루고 해결하기 위해 개발되어 왔다. 가역적 종결자 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드만이 성장하는 프라이머에 효소적으로 혼입되는 것을 확보하기 위해 이용되어 왔다. 주형-의존적 혼입의 다음 라운드가 발생할 수 있기 전 효과적인 동안, 후속 단계가 프라이머로부터 화학적 종결자 모이어티를 제거하도록 요구될 수 있다. 다른 접근법은 한번에 뉴클레오티드의 단 하나의 종을 사용하는 혼입 신호의 진폭 측정에 관여하였다. 불행하게도, 이러한 접근법은 결정될 수 있는 서열의 길이에 제한을 둔다. 따라서, 핵산 가닥 내에 단독중합체 스트레치를 통해 정확한 서열결정을 포함하는, 서열결정 핵산에 사용될 수 있는 신규한 접근법에 대한 요구가 남아 있다.
제1 양상에서, 본 개시내용은 시험 뉴클레오티드가 프라이밍(priming)된 주형 핵산에서 프라이머의 바로 하류의 주형 가닥에서 다음 염기(next base)에 상보적인 염기를 갖는 다음 정확한 뉴클레오티드(next correct nucleotide)인지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 손상된 DNA 폴리머라제 및 시험 뉴클레오티드를 포함하는 제1 반응 혼합물과 프라이밍된 주형 핵산을 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉의 결과로서, 시험 뉴클레오티드가 다음 정확한 뉴클레오티드일 때, 프라이밍된 주형 핵산, 손상된 DNA 폴리머라제 및 시험 뉴클레오티드를 포함하는 복합체가 형성된다. 상기 방법에서 사용된 손상된 DNA 폴리머라제는 실질적으로 마그네슘 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합의 형성을 촉매화시킬 수 없다. (b) 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머로의 시험 뉴클레오티드의 화학적 혼입 없이, 시험 뉴클레오티드의 존재 하에 손상된 DNA 폴리머라제로의 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계가 또한 있다. 이어서, (c) 시험 뉴클레오티드가 다음 정확한 뉴클레오티드인지를 단계 (b)의 결과로부터 결정하는 단계가 있다. 일 구현예에서, 제1 반응 혼합물은 촉매적 2가 금속 이온을 포함한다. 예를 들어, 촉매적 2가 금속 이온은 Mg2 + 이온 또는 Mn2 + 이온일 수 있다. 각 경우에, 시험 뉴클레오티드는 외인성 표지를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 시험 뉴클레오티드의 외인성 표지는 형광성 모이어티를 갖고, 단계 (b)는 시험 뉴클레오티드의 형광성 모이어티에 의해 생산된 형광성 신호의 측정을 포함한다. 더 바람직하게는, 손상된 DNA 폴리머라제는 외인성 표지를 갖고, 단계 (b)는 손상된 DNA 폴리머라제의 외인성 표지의 검출을 포함한다. 이것이 그 사례인 경우, 손상된 DNA 폴리머라제의 외인성 표지는 형광성 모이어티를 포함할 수 있고, 단계 (b)는 손상된 DNA 폴리머라제의 형광성 모이어티에 의해 생산된 형광성 신호의 측정을 포함할 수 있다. 일반적으로, 그리고 임의의 이전의 구현예와 관련하여, 프라이머는 자유 3' 하이드록실 기를 포함할 수 있다. 더욱더 일반적으로, 그리고 임의의 이전의 구현예와 관련하여, 단계 (b) 후, 제2 폴리머라제 및 제2 유형의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 반응 혼합물로 제1 반응 혼합물을 대체하고, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머에 제2 유형의 뉴클레오티드를 혼입하는 추가의 단계가 있을 수 있다. 예를 들어, 제2 유형의 뉴클레오티드는 가역적 종결자 뉴클레오티드일 수 있다. 추가의 더욱 일반적으로, 그리고 임의의 이전의 구현예와 관련하여, 제1 반응 혼합물은 Mg2 + 이온을 포함할 수 있고, 프라이머는 3' 하이드록실 모이어티를 포함할 수 있다. 사실상, 개시된 방법의 프라이머는 3' 하이드록실 모이어티일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 13 대신에 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하고, Mg2 + 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시키지 않는다. 바람직하게는, 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 거기에 부착된 리포터 모이어티를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 15 대신에 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하고, Mg2 + 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시키지 않는다. 바람직하게는, 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 추가로 거기에 부착된 리포터 모이어티를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은, 위치 355에서 글루타메이트에 의한 아스파르테이트의 대체를 제외하고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하고, Mg2 + 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시키지 않는다. 바람직하게는, 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 추가로 시스테인 잔기를 갖는 아미노산의 N-말단 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 시스테인 잔기는 검출가능한 표지에 화학적으로 연결된다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 위치 532에서 글루타메이트 잔기에 의한 아스파르테이트 잔기의 대체를 제외하고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하고, Mg2 + 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시키지 않는다. 바람직하게는, 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제는 추가로 시스테인 잔기를 갖는 아미노산의 N-말단 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 시스테인 잔기는 검출가능한 표지에 화학적으로 연결된다.
추가 양상
본 개시내용의 추가 양상은 하기 넘버링된 항에서 기재된다.
1. 시험 뉴클레오티드가 프라이밍(priming)된 주형 핵산에서 프라이머의 바로 하류의 주형 가닥에서 다음 염기(next base)에 상보적인 염기를 포함하는 다음 정확한 뉴클레오티드(next correct nucleotide)인지를 결정하는 방법으로서, (a) 상기 프라이밍된 주형 핵산을, 손상된 DNA 폴리머라제 및 상기 시험 뉴클레오티드를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시킴으로써, 상기 시험 뉴클레오티드가 상기 다음 정확한 뉴클레오티드일 때, 상기 프라이밍된 주형 핵산, 상기 손상된 DNA 폴리머라제 및 상기 시험 뉴클레오티드를 포함하는 복합체가 형성되는 단계로서, 상기 손상된 DNA 폴리머라제가 실질적으로 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는, 단계; (b) 상기 프라이밍된 주형 핵산의 상기 프라이머로의 상기 시험 뉴클레오티드의 화학적 혼입 없이, 상기 시험 뉴클레오티드의 존재 하에 상기 손상된 DNA 폴리머라제로의 상기 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시험 뉴클레오티드가 상기 다음 정확한 뉴클레오티드인지를 단계 (b)의 결과로부터 결정하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제가 서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열, 또는 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제가 2가 망간 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합의 형성을 촉매화시키고, 제1 반응 혼합물이 포스포다이에스터 결합의 형성을 촉진시키는 농도의 2가 망간 이온을 함유하지 않는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 뉴클레오티드가 외인성 표지를 포함하는, 방법.
5. 제3항에 있어서, 시험 뉴클레오티드의 외인성 표지가 형광성 모이어티를 포함하고, 단계 (b)가 상기 시험 뉴클레오티드의 상기 형광성 모이어티에 의해 생산된 형광성 신호의 측정을 포함하는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제가 외인성 표지를 포함하고, 단계 (b)가 상기 손상된 DNA 폴리머라제의 상기 외인성 표지의 검출을 포함하는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제의 외인성 표지가 형광성 모이어티를 포함하고, 단계 (b)가 상기 손상된 DNA 폴리머라제의 상기 형광성 모이어티에 의해 생산된 형광성 신호의 측정을 포함하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머가 자유 3' 하이드록실 모이어티를 포함하는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 후, 제2 폴리머라제 및 제2 유형의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 반응 혼합물로 제1 반응 혼합물을 대체하고, 이어서 상기 제2 유형의 뉴클레오티드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머에 혼입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 제2 유형의 뉴클레오티드가 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 가역적 종결자 뉴클레오티드이고, 상기 가역적 종결자 뉴클레오티드의 혼입이 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생산하는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 가역적 종결자 모이어티를 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 제거하여 프라이밍된 주형 핵산 분자를 재생하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 프라이밍된 주형 핵산 대신에 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 사용하여 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 381을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1이거나, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 558을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1인, 방법.
15. 제1항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 364를 갖는 것을 제외하고 서열번호 2이거나, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 541을 갖는 것을 제외하고 서열번호 2인, 방법.
16. 제1항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 355를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3이거나, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 532를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3인, 방법.
17. 제1항에 있어서, 제1 반응 혼합물이 2가 마그네슘 이온을 포함하는, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 반응 혼합물이 Mg2 + 이온을 포함하고, 프라이머가 3' 하이드록실 모이어티를 포함하는, 방법.
19. 프라이밍된 주형 핵산 분자에 혼입되는 다음 정확한 뉴클레오티드를 확인하기 위한 키트로서, (a) 상기 프라이밍된 주형 핵산 및 상기 다음 정확한 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하지만, 실질적으로 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는 손상된 DNA 폴리머라제; (b) 4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자; 및 (c) 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드를 하나 이상의 용기의 포장된 조합으로 포함하는 키트.
20. 제19항에 있어서, 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드가 4개의 비-형광성 가역적 종결자 뉴클레오티드인, 키트.
21. 제19항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제가 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
22. 제19항에 있어서, 4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자 중 하나 이상이 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
23. 제19항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제가 망간 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시키는, 키트.
24. 제19항에 있어서, 가역적 종결자 모이어티를 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드로부터 제거하는 화학 시약을 추가로 포함하는 키트.
25. 제19항에 있어서, 각각의 상이한 4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자가 마그네슘-의존적 폴리머라제 활성을 포함하는 DNA 폴리머라제에 의해 혼입가능한, 키트.
26. 제19항에 있어서, 다음 정확한 뉴클레오티드를 프라이밍된 주형 핵산 분자에 혼입하는 제2 DNA 폴리머라제를 추가로 포함하는 키트.
27. 제26항에 있어서, 제2 DNA 폴리머라제가 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드 중 하나를 다음 정확한 뉴클레오티드로서 혼입하는, 키트.
28. 제19항에 있어서, 유동 세포를 추가로 포함하는 키트.
29. 제19항에 있어서, 4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자가 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP 또는 dUTP를 포함하고; 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드가 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP 또는 dUTP의 유사체를 포함하고, 각각의 상기 유사체가 3'-ONH2 가역적 종결자 모이어티를 포함하는, 키트.
30. 제19항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제가 서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열, 또는 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 키트.
31. 제30항에 있어서, 서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 355를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3을 포함하는, 키트.
32. 제30항에 있어서, 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 532를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3을 포함하는, 키트.
33. 서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이체 DNA 폴리머라제로서, 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하지만, 실질적으로 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는 돌연변이체 DNA 폴리머라제.
34. 제33항에 있어서, 손상된 DNA 폴리머라제가 2가 망간 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합의 형성을 촉매화시키는, 돌연변이체 DNA 폴리머라제.
35. 제33항에 있어서, 돌연변이체 DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 381을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 364를 갖는 것을 제외하고 서열번호 2, 및 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 355를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 돌연변이체 DNA 폴리머라제.
36. 제35항에 있어서, 돌연변이체 DNA 폴리머라제에 부착된 리포터 모이어티를 추가로 포함하는 돌연변이체 DNA 폴리머라제.
37. 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이체 DNA 폴리머라제로서, 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하지만, 실질적으로 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는 돌연변이체 DNA 폴리머라제.
38. 제37항에 있어서, 돌연변이체 DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 558을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 541을 갖는 것을 제외하고 서열번호 2, 및 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 532를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 돌연변이체 DNA 폴리머라제.
39. 제38항에 있어서, 돌연변이체 DNA 폴리머라제에 부착된 리포터 모이어티를 추가로 포함하는 단리된 돌연변이체 DNA 폴리머라제.
도 1은 시간의 함수로서 결합 신호의 강도(세로축) 또는 반응 진행(가로축)을 보여주는 간섭법 도형이다. 도형은 대조군 폴리머라제("CBT")에 대하여 그리고 조작된 폴리머라제("TDE")에 대하여 제시된다. CBT 폴리머라제는 3원 복합체를 형성할 수 있고 동족 뉴클레오티드를 혼입할 수 있다. 조작된 TDE 폴리머라제는 동족 뉴클레오티드의 존재 하에 3원 복합체를 형성하는 능력을 보유하지만, 촉매적 Mg2 + 금속 이온의 존재 하에 임의의 뉴클레오티드를 혼입할 수 있다. 결합 반응에서 시험된 뉴클레오티드의 동일성은 도형 아래 명시된다(A = dATP; C = dCTP; T = dTTP; G = dGTP). 혼입 단계 이후 dCTP에 대하여 더 높은 결합 신호, 및 dGTP에 대하여 더 낮은 결합 신호를 보여주는 도형은 변형된 TDE 폴리머라제에 상응한다.
하기 설명은 돌연변이체, 비-촉매적 DNA 폴리머라제("손상된" 폴리머라제)의 사용에 의존하는 결합에-의한-서열결정(sequencing-by-binding, SBB) 기술에 관한 것이다. 기술 실시에 유용한 손상된 DNA 폴리머라제 효소는 실질적으로 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 가닥과, 들어오는 다음 정확한 뉴클레오티드 사이 포스포다이에스터 결합의 마그네슘-의존적 형성을 촉매화시킬 수 없다. 이러한 촉매적 활성 없이도, 돌연변이체 효소는 비-동족 뉴클레오티드로부터 동족을 식별하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 폴리머라제는 촉매적 기능에 통상적으로 필요한 2가 양이온을 결합시킬 수 없다. 하기 설명이 SBB의 문맥에서 손상된 폴리머라제의 유용한 양상을 예시하여도, 폴리머라제가, 비제한적으로, 핵산에서 개별 뉴클레오티드 확인(예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성 검출) 또는 서열을 보유하는 핵산의 폴리머라제-매개된 친화도 분리를 제공하기 위해 특정 서열로의 결합을 포함하는 다른 용도를 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 유익하게는, 손상된 DNA 폴리머라제의 사용은 세정 단계 이후 잔류할 수 있는 잔존 뉴클레오티드의 원하지 않는 혼입, 또는 폴리머라제 활성을 억제하는 비-촉매적 금속 이온을 사용하여 달성될 수 있는 불완전한 억제에서 비롯하는 원하지 않는 혼입과 관련된 문제를 극복한다. 따라서, 손상된 DNA 폴리머라제의 사용은 뉴클레오티드의 원하지 않는 혼입과 관련된 서열결정 인공물을 감소시킬 수 있다.
간단히, 프라이밍된 주형 핵산, 동족 뉴클레오티드, 및 손상된 DNA 폴리머라제를 포함하는 안정한 복합체의 형성은 촉매적 2가 양이온의 존재 하에 검출될 수 있다. 프라이머는 연장 차단 기를 가질 필요가 없고 뉴클레오티드는 프라이머로의 혼입을 억제하는 모이어티를 가질 필요가 없다. 특정 위치에 대하여 동족 뉴클레오티드가 확인된 후, 또는 확인하는데 필요한 정보의 적어도 모니터링 또는 측정이 수집된 후, 프라이밍된 주형 핵산은 손상된 DNA 폴리머라제 대신에 제2 DNA 폴리머라제를 포함하는 상이한 반응 혼합물과 접촉될 수 있다. 제2 DNA 폴리머라제는, 동족 뉴클레오티드 및 적절한 2가 양이온과 추가로 제공된 경우, 자유 3' 하이드록실 기의 위치에서 프라이머에 동족 뉴클레오티드를 연결시킬 수 있다. 가역적 종결자 뉴클레오티드가 이 단계에서 이용되면, 단지 단일 혼입이 발생할 것이다.
유익하게는, 상기 기술은, 원상태(예를 들어, 미표지된) 뉴클레오티드, 검출가능한 표지(예를 들어, 형광성 또는 다른 임의로 검출가능한 표지)를 가진 뉴클레오티드, 또는 표지된 또는 미표지된 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 함유하는 변형된 뉴클레오티드)를 포함하는, 다양한 유형의 뉴클레오티드를 이용하여 실시될 수 있다. 또한, 상기 기술은 제어된 반응 조건, 서열의 명백한 결정, 시약의 적은 전반적인 비용, 및 적은 기기 비용을 제공한다.
개시된 기술은 임의의 이유로 그리고 임의의 수단에 의해 프라이밍된 주형 핵산의 다음 염기의 동일성 결정에 사용된 결합 반응에 적용될 수 있다. 상기 기술은 프라이밍된 주형 핵산에 상보적인 다음 정확한 뉴클레오티드(예를 들어, dNTP) 및 DNA 폴리머라제의 특이적 결합을 모니터링하는데, 그리고 비특이적 결합과 특이적 결합을 구별하는데 사용될 수 있다. 상기 기술은 단일 뉴클레오티드 결정(예를 들어, SNP 결정)에, 또는 다르게는 한번에 하나의 뉴클레오티드를 확인하는 반복적인 사이클을 사용하는 더욱 광범위한 핵산 서열결정 절차에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 방법은, (미국 특허출원공개 제2017/0022553 A1호로서 공개된) US 14/805,381에 의해 확인된 통상적으로 소유된 미국 특허출원에서 기재된 바와 같이, 결합에-의한-서열결정 절차와 함께 사용될 수 있고, 이의 개시내용은 이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 명백하게 하기 위해, 하기 특정 용어는 지정된 의미를 갖는다. 다른 용어는 본 명세서에서 다른 섹션에 정의된다.
단수 형태는 문맥상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 근사하는 언어는 관련되는 기본적 기능에서 변화의 초래 없이 허용가능하게 다양할 수 있는 임의의 정량적 표현을 변형시키는데 적용될 수 있다. 따라서, 용어, 예컨대　"약"에 의해 변형된 값은 지정된 정확한 값으로 제한되지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대　분자량, 반응 조건, 기타 등등을 표현하는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 사례에서 수식되는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 하기 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 제시된 대수적 파라미터는 본 개시내용의 조성물, 장치, 또는 방법에 의해 수득되도록 구해지는 원하는 특성에 의존하여 다양할 수 있는 근사치이다. 적어도, 각각의 대수적 파라미터는 보고된 유효숫자의 수의 면에서 그리고 통상적인 반올림 기술 적용에 의해 적어도 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합에-의한-서열결정"은 프라이밍된 주형 핵산으로의 폴리머라제의 특이적 결합이 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 가닥에 혼입되는 다음 정확한 뉴클레오티드의 확인에 사용되는 서열결정 기술을 지칭한다. 특이적 결합 상호작용은 프라이머 가닥으로의 뉴클레오티드의 화학적 혼입을 선행하고, 따라서 다음 정확한 뉴클레오티드의 확인은 다음 정확한 뉴클레오티드의 혼입 없이 또는 이전에 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 본 명세서에서 사용된 문법적 등가물은 함께 공유결합된 2개 이상의 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, "핵산"은, 핵산 합성 동안 중합화 효소에 의해 작용될 수 있는, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA, RNA, 또는 이들의 임의의 조합이다. 용어 "핵산"은 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA, RNA 및 이의 유사체(유도체)를 포함한다. 이중-가닥 핵산은 유익하게는 핵산 합성을 방해할 수 있는 2차 구조를 최소화시킬 수 있다. 이중가닥 핵산은 닉(nick) 또는 단일-가닥 갭을 소유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "주형 핵산"은 본 명세서에서 개시된 임의의 서열결정 방법을 사용하여 검출 또는 서열결정되는 핵산이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "프라이밍된 주형 핵산"(또는 다르게는, "프라이밍된 주형 핵산 분자")은 프라이머로 프라이밍된(즉, 프라이머에 하이브리드화된) 주형 핵산이고, 여기서 상기 프라이머는 주형 핵산의 부분에 상보적인 서열을 가진 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 프라이머는 임의로 자유 5'-말단을 가질 수 있거나(예를 들어, 프라이머는 주형와 비공유적으로 관련되거나) 프라이머는 (예를 들어, 헤어핀 구조를 통해) 주형과 연속적일 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산은 결합되는 상보적 프라이머 및 주형 핵산을 포함한다. 명백하게 언급되지 않는 한, 프라이밍된 주형 핵산은 폴리머라제에 의해 연장가능한 3'-말단, 또는 연장으로부터 차단되는 3'-말단을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "차단된 프라이밍된 주형 핵산"(또는 다르게는, "차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자")은 프라이머의 3'-말단에서 포스포다이에스터 결합 형성을 배제 또는 방지하기 위해 변형된 프라이밍된 주형 핵산이다. 차단은, 예를 들어, 프라이머의 3' 말단에서 5-탄소 당질의 3' 또는 2' 위치에서 차단 기를 가진 화학적 변형체에 의해 달성될 수 있다. 다르게는, 또는 게다가, 포스포다이에스터 결합 형성을 배제 또는 방지하는 화학적 변형체는 또한 뉴클레오티드의 질소성 염기로 만들어질 수 있다. 차단 기의 각각의 이들 유형을 포함하는 가역적 종결자 뉴클레오티드 유사체는 당해 분야에서 기술의 통상적인 수준을 가진 것에 익숙할 것이다. 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 말단에서 이들 유사체의 혼입은 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 초래한다. 차단된 프라이밍된 주형 핵산은, 그것의 3'-말단에서 연장으로부터 차단된, 상보적 프라이머, 및 결합되는 것에 주형 핵산을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소성 염기, 5-탄소 당질(리보오스 또는 데옥시리보스), 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함하는 분자이다. 상기 용어는, 비제한적으로, 외인성 표지 또는 가역적 종결자, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함하기 위해 변형된 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드를 포용한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "원상태" 뉴클레오티드는 외인성 표지(예를 들어, 형광성 염료, 또는 다른 표지)를 포함하지 않는 자연 발생 뉴클레오티드를 지칭하거나 화학적 변형체는, 예컨대 뉴클레오티드 유사체를 특성규명할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 결합에-의한-서열결정 절차 수행에 유용한 원상태 뉴클레오티드의 예는 하기를 포함한다: dATP(2'-데옥시아데노신-5'-트라이포스페이트); dGTP(2'-데옥시구아노신-5'-트라이포스페이트); dCTP(2'-데옥시시티딘-5'-트라이포스페이트); dTTP(2'-데옥시티미딘-5'-트라이포스페이트); 및 dUTP(2'-데옥시우리딘-5'-트라이포스페이트).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드 유사체"는, 원상태 뉴클레오티드의 임의의 성분(예를 들어, 질소성 염기, 5-탄소 당질, 또는 포스페이트 기(들))을 대체, 제거 및/또는 변형시키는, 하나 이상의 변형체, 예컨대 화학적 모이어티를 갖는다. 뉴클레오티드 유사체는 핵산 중합 반응에서 폴리머라제에 의해 혼입가능 또는 비-혼입가능일 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체의 3'-OH 기는 모이어티로 변형된다. 모이어티는 폴리머라제 연장의 3' 가역적 또는 비가역적 종결자일 수 있다. 뉴클레오티드의 염기는 임의의 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실, 또는 이의 유사체일 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드는 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌, 니트로피롤(3-니트로피롤 포함) 또는 니트로인돌(5-니트로인돌 포함) 염기를 갖는다. 뉴클레오티드는, 비제한적으로, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP, 및 dGMP를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 또한, ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddUTP 및 ddCTP)로서 약칭되는, DNA 폴리머라제의 종결 억제제, 다이데옥시뉴클레오티드 또는 2',3' 다이데옥시뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "다음 주형 뉴클레오티드"(또는 "다음 주형 염기")는 하이브리드화된 프라이머의 3'-말단의 바로 하류에 위치하는 주형 핵산에서 다음 뉴클레오티드(또는 염기)를 지칭한다. 환언하면, 다음 주형 뉴클레오티드는 프라이머의 3' 말단에 하이브리드화되는 주형에서 염기의 바로 5'에 위치한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "차단 모이어티"는, 뉴클레오티드 유사체와 관련하여 사용된 경우, 핵산 중합 반응의 혼입 단계 동안 (예를 들어, 프라이머 뉴클레오티드의 3'-OH를 통해) 제2 뉴클레오티드에 대한 공유결합 형성으로부터 뉴클레오티드를 억제 또는 방지시키는 뉴클레오티드의 일부이다. "가역적 종결자" 뉴클레오티드의 차단 모이어티는 뉴클레오티드 혼입을 허용하기 위해 뉴클레오티드 유사체로부터 제거될 수 있다. 그와 같은 차단 모이어티는 본 명세서에서 "가역적 종결자 모이어티"로서 지칭된다. 예시적인 가역적 종결자 모이어티는, 이들 각각이 참고로 혼입되는, 미국 특허 제7,427,673호; 제7,414,116호; 및 제7,057,026호 및 PCT 공개 WO 91/06678 및 WO 07/123744에서 제시된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "시험 뉴클레오티드"는 프라이밍된 주형 핵산 및 폴리머라제를 추가로 포함하는 3원 복합체의 형성에 참가하는 그것의 능력에 대하여 조사되는 뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "폴리머라제"는, 비제한적으로, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소, 프리마제 및 전달효소를 포함하는, 핵산 합성화 효소에 대한 일반 용어이다. 전형적으로, 폴리머라제는 뉴클레오티드 결합 및/또는 뉴클레오티드 중합의 촉매작용이 발생할 수 있는 하나 이상의 활성 부위를 포함한다. 폴리머라제는 그것의 상보적 핵산 가닥에 결합된 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오티드의 중합을 촉매화시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제는 포스포다이에스터 결합을 통해 프라이머의 3' 산소에 다음 정확한 뉴클레오티드의 첨가를 촉매화시킬 수 있고, 그렇게 함으로써 프라이머로 뉴클레오티드를 화학적으로 혼입한다. 임의로, 제공된 방법에서 사용된 폴리머라제는 점진적 폴리머라제이다. 임의로, 제공된 방법에서 사용된 폴리머라제는 분배적 폴리머라제이다. 임의로, 폴리머라제는 본 명세서에서 제시된 방법에서 사용된 하나 이상의 조건 하에 뉴클레오티드 혼입을 할 필요가 없다. 예를 들어, 돌연변이체 폴리머라제는 3원 복합체를 형성할 수 있지만 뉴클레오티드 혼입을 촉매화시킬 수 없다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "1가 양이온을 제공하는 염"은 단일 양전하를 갖는 양이온을 생산하기 위해 수용액에서 해리하는 이온성 화합물이다. 예를 들어, 양이온은 산화 상태가 +1인 금속 양이온일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "글루타메이트 염"은 글루타메이트 음이온을 생산하기 위해 수용액에서 해리하는 이온성 화합물이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "2상성"은 프라이밍된 주형 핵산이 폴리머라제 및 시험 뉴클레오티드와 접촉되는 2단계 공정을 지칭한다. 공정의 제1 상은 뉴클레오티드(들)의 하위-포화 수준의 존재 하에, 또는 심지어 뉴클레오티드의 부재 하에 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산의 접촉을 포함한다. 용어 "하위-포화"는, 수용체에 결합하는 리간드(예를 들어, 폴리머라제에 결합하는 뉴클레오티드)에 관련하여 사용된 경우, 평형에서 리간드에 결합되고 있는 수용체의 적어도 90%를 초래하도록 요구된 것 미만인 리간드의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 하위-포화 양은 뉴클레오티드에 결합되고 있는 적어도 90%, 95%, 99% 또는 초과의 폴리머라제를 산출할 수 있다. 공정의 제2 상은 제1 상에서 사용된 것보다 뉴클레오티드(들)의 더 높은 농도의 존재 하에 폴리머라제와 제1 상으로부터 프라이밍된 주형 핵산의 접촉을 포함하고, 여기에서 더 높은 농도는 반응에서 뉴클레오티드가 다음 정확한 뉴클레오티드인 경우 최대 3원 복합체 형성을 산출하는데 충분하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 주형, 프라이머, 프라이밍된 주형 핵산, 또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산을 "제공하는"은, 예를 들어 반응 혼합물 또는 반응 챔버에 하나 이상의 핵산 중합체의 제조 및 전달을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "모니터링"(또는 때때로 "측정")은 2 분자 종 사이 측정가능한 상호작용 또는 결합의 검출 공정을 지칭한다. 예를 들어, 모니터링은, 전형적으로 절차 전반에 걸쳐 다양한 지점에서, 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 사이 측정가능한 상호작용 검출을 포함할 수 있다. 모니터링은 간헐적(예를 들어, 주기적) 또는 연속적(예를 들어, 중단 없음)일 수 있고, 정량적 결과의 취득을 포함할 수 있다. 모니터링은 결합 사건 동안 일정 기간에 걸쳐 다중 신호 검출에 의해 또는, 다르게는, 결합 사건 이후 또는 동안 단일 시점에서 신호(들) 검출에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "접촉"은 물리적 결합 반응 또는 화학적 반응이 발생할 수 있도록 시약을 함께 혼합하는 것(예를 들어, 폴리머라제를 포함하는 완충된 용액, 또는 폴리머라제 및 시험 뉴클레오티드의 조합, 및 고정된 주형 핵산을 혼합하는 것)을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "혼입하는" 또는 "화학적으로 혼입하는"은, 프라이밍된 주형 및 뉴클레오티드에 관련하여 사용된 경우, 포스포다이에스터 결합의 형성에 의해 프라이머로의 동족 뉴클레오티드 연결의 공정을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "연장"은 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형 핵산이 서로 어닐링된 후의 공정을 지칭하고, 여기에서 폴리머라제 효소는 프라이머의 3'-말단에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가를 촉매화시킨다. 연장에 의해 핵산에 첨가되는 뉴클레오티드는 핵산에 "혼입된"다고 언급된다. 따라서, 용어 "혼입하는"은 포스포다이에스터 결합의 형성에 의해 프라이머의 3'-말단으로의 뉴클레오티드 연결의 공정을 지칭하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "2원 복합체"는 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산) 사이의 분자간 회합이고, 여기에서 복합체는 뉴클레오티드 분자, 예컨대 다음 정확한 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "3원 복합체"는 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산), 및 프라이머의 바로 하류에 배치되고, 프라이밍된 주형 핵산 또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산의 주형 가닥에 상보적인 다음 정확한 뉴클레오티드 사이의 분자간 회합이다. 프라이밍된 주형 핵산은, 예를 들어, 자유 3'-OH를 가진 프라이머 또는 차단된 프라이머(예를 들어, 3' 말단 뉴클레오티드의 당 모이어티 또는 염기의 화학적 변형체를 가진 프라이머, 여기에서 변형체는 효소 포스포다이에스터 결합 형성을 배제한다)를 포함할 수 있다. 용어 "안정화된 3원 복합체"는 촉진된 또는 장기적인 실재를 가진 3원 복합체 또는 파괴가 억제된 3원 복합체를 의미한다. 일반적으로, 3원 복합체의 안정화는 3원 복합체의 프라이밍된 핵산 성분 속에 3원 복합체의 뉴클레오티드 성분의 공유 혼입을 방지한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "촉매적 금속 이온"은 핵산(예를 들어, 프라이머)의 3'-OH와 폴리머라제에 의해 들어오는 뉴클레오티드의 포스페이트 사이의 포스포다이에스터 결합 형성을 용이하게 하는 금속 이온을 지칭한다. "2가 촉매적 금속 양이온"은 2의 원자가를 갖는 촉매적 금속 이온이다. 촉매적 금속 이온은, 금속 이온의 비-촉매적 농도로서 지칭된, 폴리머라제, 뉴클레오티드, 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 복합체의 형성을 안정화시키는데 필요한 농도에서 존재할 수 있다. 금속 이온의 촉매적 농도는 핵산(예를 들어, 프라이머)의 3'-OH 기와 들어오는 뉴클레오티드의 포스페이트 기 사이 반응을 촉매화시키기 위해 폴리머라제에 충분한 금속 이온의 양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비-촉매적 금속 이온"은, 폴리머라제 효소의 존재 하인 경우, 프라이머로의 뉴클레오티드의 화학적 혼입에 필요한 포스포다이에스터 결합 형성을 용이하게 하지 않는 금속 이온을 지칭한다. 전형적으로, 비-촉매적 금속 이온은 양이온이다. 비-촉매적 금속 이온은 폴리머라제에 의해 포스포다이에스터 결합 형성을 억제시킬 수 있고, 따라서 뉴클레오티드 혼입 방지에 의해 3원 복합체를 안정화시킬 수 있다. 비-촉매적 금속 이온은, 예를 들어, 촉매적 금속 이온과 비교되는 경쟁적 결합을 통해 폴리머라제와 상호작용할 수 있다. "2가 비-촉매적 금속 이온"은 2의 원자가를 갖는 비-촉매적 금속 이온이다. 2가 비-촉매적 금속 이온의 예는, 비제한적으로, Ca2 +, Zn2 +, Co2 +, Ni2 +, 및 Sr2 +를 포함한다. 3가 Eu3 + 및 Tb3 + 이온은 3의 원자가를 갖는 비-촉매적 금속 이온이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "외인성 표지"는 서열결정 시약, 예컨대 뉴클레오티드 또는 폴리머라제(예를 들어, DNA 폴리머라제)에 첨가된 검출가능한 화학적 모이어티를 지칭한다. 원상태 dNTP가 특징적인 제한된 형광 프로파일을 가질 수 있는 반면, 원상태 dNTP는 임의의 첨가된 비색계 또는 형광성 모이어티를 포함하지 않는다. 반대로, 감마 포스페이트에 부착된 형광성 모이어티 및 화학적 링커를 포함하도록 변형된 dATP(2'-데옥시아데노신-5'-트라이포스페이트) 분자는 부착된 화학적 성분이 통상적으로 뉴클레오티드의 일부가 아니기 때문에 외인성 표지를 포함한다고 언급될 것이다. 물론, 뉴클레오티드 염기에 검출가능한 표지를 첨가하기 위한 화학적 변형체는 또한 외인성 표지로서 간주될 것이다. 마찬가지로, 뉴클레오티드 결합시 그것의 특성을 변화시키는 형태적으로 감수성 형광성 염료를 포함하도록 변형된 DNA 폴리머라제는 또한 표지가 통상적으로 폴리머라제의 일부가 아니기 때문에 외인성 표지를 포함한다고 언급될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "미표지된"은 첨가된 또는 외인성 표지(들) 또는 태그(들)가 없는 분자 종을 지칭한다. 물론, 미표지된 뉴클레오티드는 외인성 형광성 표지 또는 외인성 라만 산란 태그를 포함하지 않을 것이다. 원상태 뉴클레오티드는 미표지된 분자 종의 또 다른 예이다. 미표지된 분자 종은 본 명세서에서 제시된 또는 달리 핵산 서열결정 또는 분석적 생화학에 관련된 당해 분야에서 공지된 표지의 하나 이상을 배제할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "고체 지지체"는 수성 액체에서 불용성인 강성 기재를 지칭한다. 기재는 비-다공성 또는 다공성일 수 있다. 기재는 임의로 (예를 들어, 다공성으로 인해) 액체를 받아들일 수 있지만 전형적으로 기재가 액체를 받아들이는 경우 실질적으로 팽윤하지 않는 그리고 액체가 건조에 의해 제거되는 경우 실질적으로 수축하지 않는 충분히 강성일 것이다. 비다공성 고체 지지체는 일반적으로 액체 또는 기체에 불투과성이다. 예시적인 고체 지지체는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 유리 및 변형된 또는 작용화된 유리, 플라스틱(아크릴, 스티렌 및 다른 물질의 폴리스티렌 및 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, TeflonTM, 환형 올레핀, 폴리이미드 등 포함), 나일론, 세라믹, 수지, Zeonor, 실리콘 및 변형된 실리콘을 포함하는 실리카 또는 실리카계 물질, 탄소, 금속, 무기 유리, 광섬유 다발, 및 중합체.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "원상태 DNA 폴리머라제"는 비-동족 뉴클레오티드와 동족 뉴클레오티드를 식별하는 능력, 그리고 촉매적 2가 금속 이온(예를 들어, Mg2 + 또는 Mn2 +)으로 또한 제공된 경우 2 종을 연결시키는 포스포다이에스터 결합 형성에 의해, 성장하는 프라이머 가닥 속에 동족 뉴클레오티드를 혼입하는 능력을 소유하는 변형된 또는 비변형된 DNA 폴리머라제 효소이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "손상된 DNA 폴리머라제"는 DNA 중합화 효소의 돌연변이된 버전이고, 여기에서 돌연변이체는 (예를 들어, 프라이밍된 주형 핵산 및 동족 뉴클레오티드와 주형-의존적 복합체를 형성할 수 있는) 부정확한 뉴클레오티드로부터 다음 정확한 뉴클레오티드를 식별할 수 있지만, 프라이머와 동족 뉴클레오티드 사이의 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시킬 수 없다. 예를 들어, 원상태 DNA 폴리머라제의 하나 이상의 아미노산 위치는 손상된 DNA 폴리머라제를 창출하기 위해 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 부위의 화학적 변형체에 의해 및/또는 동일한 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부위 지향적 돌연변이유발에 의해) 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "키트"는, 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 손상된 DNA 폴리머라제를 사용하여 검출 및/또는 서열결정 반응 수행에 사용될 수 있는 하나 이상의 성분을 함유하는 포장된 유닛이다. 전형적인 키트는, 하나 이상의 용기 또는 바이알에서, 절차에서 사용되는 시약의 포장된 조합을 포함할 수 있다.
결합에-의한-서열결정
폴리머라제-기반, 결합에-의한-서열결정(SBB) 반응이 본 명세서에서 기재되고, 여기서 손상된 DNA 폴리머라제는 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 다음 정확한 뉴클레오티드 직면시 형태적 전이를 거친다. 손상된 DNA 폴리머라제는 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시킬 수 없고, 따라서 본 명세서에서 "3원" 복합체로서 지칭된 복합체에서 지속된다. 임의의 접근법에 의한 3원 복합체의 검출은 동족 뉴클레오티드 검출용 대용이다.
개시된 접근법은, 일반적인 용어에서 아래 기재될, (US 14/805,381에 의해 확인된 통상적으로 소유된 미국 특허출원에서 개시된) 종래의 SBB 기술과 공동으로 많은 특징을 공유한다. 물론, 검사 단계에 사용된 동일한 효소에 의한 마그네슘-기반 촉매작용에 대한 임의의 참조는 손상된 DNA 폴리머라제에 적용하지 않는다.
일 단계에서, 폴리머라제는 프라이밍된 주형 핵산에 결합하여, 사전-삽입 형태로서 본 명세서에서 또한 지칭된, 2원 복합체를 형성한다. 후속 단계에서, 들어오는 뉴클레오티드는 결합되고 폴리머라제는 가까이 손대어, 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산 및 뉴클레오티드를 포함하는 사전-화학 형태를 형성하고; 여기서 결합된 뉴클레오티드는 혼입되지 않았다. 본 명세서에서 "검사" 단계로서 또한 지칭된, 이 단계는 포스포다이에스터 결합이 뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 혼입)로부터 수반되는 파이로포스페이트 절단으로 형성되는 화학적 단계로 이어질 수 있다. 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산 및 새로 혼입된 뉴클레오티드는 사후-화학, 사전-번역 형태를 생산한다. 폴리머라제가 폐쇄된 상태에 있는, 양쪽 사전-화학 형태 및 사전-전좌 형태가 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산 및 뉴클레오티드를 포함함에 따라, 어느 한쪽 형태는 본 명세서에서 폐쇄된-복합체 또는 폐쇄된 3원 복합체로서 지칭될 수 있다. 폐쇄된 사전-삽입 상태에서, 2가 촉매적 금속 이온, 예컨대 Mg2+는 프라이머의 3' 하이드록실에 의해 파이로포스페이트(PPi)의 친핵성 대체를 포함하는 신속 화학적 반응을 매개한다. 폴리머라제는 PPi의 방출시 개방 상태로 돌아오고, 사후-전좌 단계, 및 전좌는 반응의 다음 라운드를 개시한다. 폐쇄된-복합체가 2가 촉매적 금속 이온(예를 들어, Mg2 +)의 부재 하에 형성할 수 있는 반면, 폐쇄된 복합체의 폴리머라제는 이용가능한 3' 하이드록실 기를 갖는 적절한 기재로 제공된 경우 2가 금속 이온의 존재 하에 뉴클레오티드의 화학적 첨가에 숙련된다. 촉매적 금속 이온, 예컨대 Mg2 +의 낮은 또는 결핍된 수준은 폐쇄된-복합체에서 다음 정확한 뉴클레오티드의 비-공유(예를 들어, 물리적) 격리로 이어진다. 이러한 폐쇄된-복합체는 안정화된 또는 포획된 폐쇄된-복합체로서 지칭될 수 있다. 상기 기재된 임의의 반응 단계에서, 폴리머라제 배치형태 및/또는 핵산과 상호작용은 주형 핵산 서열에서 다음 정확한 염기를 확인하기 위해 검사 단계 동안 모니터링될 수 있다. 혼입 전 또는 후, 반응 조건은 프라이밍된 주형 핵산으로부터 폴리머라제를 해방시키도록 변화될 수 있고, 폴리머라제 결합을 억제하는 임의의 시약을 국부 환경으로부터 제거하도록 재차 변화될 수 있다.
일반적으로, SBB 절차는 다음 주형 염기를 확인하는 "검사" 단계, 및 임의로 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 성분의 3'-말단에 하나 이상의 상보적 뉴클레오티드를 첨가하는 "혼입" 단계를 포함한다. 첨가되는 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성은 공유결합을 통해 프라이머의 3'-말단에 그 뉴클레오티드의 화학적 연결 없이, 또는 그 이전으로 결정된다. 검사 단계는 절차에서 사용되는 프라이밍된 주형 핵산의 제공, 및 가능한 다음 정확한 뉴클레오티드로서 조사되고 있는 하나 이상의 시험 뉴클레오티드 및 폴리머라제 효소(예를 들어, DNA 폴리머라제)와 프라이밍된 주형 핵산의 접촉을 포함할 수 있다. 또한, 시험 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호작용의 모니터링 또는 측정을 포함하는 단계가 있다. 임의로, 상호작용은 안정화제의 존재 하에 발생할 수 있고, 그것에 의하여 폴리머라제-핵산 상호작용은 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 안정화된다. 재차, 검사 단계는 뉴클레오티드의 혼입 요구 없이 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성을 확인 또는 결정한다. 달리 말하면, 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성은 검사의 하나 이상의 사이클이 표지된 또는 미표지된 뉴클레오티드를 사용하여 수행되는 경우 프라이머로의 뉴클레오티드의 화학적 혼입 없이 확립될 수 있다.
단일 주형 핵산 분자를 포함하는 방법은 편의상 기재될 수 있는 반면에, 이들 방법은 예시적이다. 본 명세서에서 쉽게 제공된 서열결정 방법은 다수의 주형 핵산을 포괄하고, 여기서 다수의 핵산은, 조합, 예컨대 클론으로 증폭되는 이종 핵산의 모집단을 포함하는, 단일 핵산, 또는 이종 핵산의 클론으로 증폭된 카피일 수 있다. 따라서, 그와 같은 서열결정 방법은 본 명세서에서 완전하게 개시된다.
검사 단계
본 명세서에서 기재된 기술에 따른 검사 단계는 전형적으로 하기 하위단계를 포함한다: (1) 프라이밍된 주형 핵산(즉, 그것의 3'-말단에서 연장으로부터 임의로 차단될 수 있는 프라이머로 하이브리드화된 주형 핵산 분자) 제공; (2) 손상된 DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 프라이밍된 주형 핵산 접촉; (3) 뉴클레오티드(들)의 존재 하에 그리고 프라이밍된 주형 핵산으로의 임의의 뉴클레오티드의 화학적 혼입 없이 프라이밍된 주형 핵산 분자와 손상된 DNA 폴리머라제의 상호작용 모니터링; 및 (4) 모니터링된 상호작용을 사용하여 주형 핵산(즉, 다음 정확한 뉴클레오티드)에서 다음 염기 확인. 임의로, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 임의의 뉴클레오티드 접촉 전 뉴클레오티드(들)의 부재 하에 손상된 DNA 폴리머라제와 초기에 접촉될 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머는 연장가능한 프라이머일 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산, 손상된 DNA 폴리머라제 및 시험 뉴클레오티드는 시험 뉴클레오티드의 염기가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음 염기에 상보적인 경우 3원 복합체를 형성할 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산 및 손상된 DNA 폴리머라제는 시험 뉴클레오티드의 염기가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음 염기에 상보적이지 않은 경우 2원 복합체를 형성할 수 있다. 임의로, 접촉은 2원 복합체의 형성보다 3원 복합체의 형성을 선호하는 조건 하에 발생한다. 확인 단계는 프라이밍된 주형 핵산의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오티드의 염기 확인을 포함할 수 있다. 임의로, 이것은 3원 복합체를 선택적으로 유지 또는 해리하도록 하는 상이한 뉴클레오티드 조성물을 갖는 하나 이상의 세정액과 3원 복합체 접촉을 포함한다.
이들 단계의 모두는 광범위한 서열 정보를 수득하기 위해 1회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어, 3원 복합체는 (외인성 표지로 임의로 표지된) 손상된 DNA 폴리머라제 및 (하나 이상의 외인성 표지를 임의로 포함하는) 하나 이상의 뉴클레오티드와 (차단된 3'-말단을 임의로 포함하는) 프라이밍된 주형 핵산 접촉에 의해 초기에 형성될 수 있다. 완충제 조건은 3원 복합체가 3원 복합체 형성에 사용된 뉴클레오티드의 하위집합만을 포함하는 세정 용액과 접촉되도록 변화될 수 있다. 임의로, 이 완충제는 3원 복합체를 형성하는데 사용된 동일한 손상된 DNA 폴리머라제를 포함한다. 3원 복합체에서 손상된 DNA 폴리머라제 및/또는 뉴클레오티드의 상호작용 모니터링은 3원 복합체가 안정하게 남아있는지를 결정하기 위해 수행될 수 있거나(그렇게 함으로써 세정 완충제에서 뉴클레오티드 중 하나가 동족 뉴클레오티드에 상응한다는 것을 나타냄), 불안정화된다(그렇게 함으로써 완충제가 동족 뉴클레오티드를 더 이상 함유하지 않는다는 것을 나타냄). 세정 단계는 3원 복합체가 이전의 세정 사이클 동안 존재하였던 하나의 뉴클레오티드를 점진적으로 생략시킴으로써 불안정화될 때까지 반복될 수 있다. 임의로, 동족 뉴클레오티드는 하나 이상의 시약 교환 이후 제2 DNA 폴리머라제에 의해 혼입될 수 있다.
이들 단계의 모두는 광범위한 서열 정보를 수득하기 위해 1회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어, 접촉 및 모니터링 단계는 1회 이상 반복될 수 있다. 임의로, 접촉 및 모니터링 단계는 손상된 DNA 폴리머라제 및 제1 시험 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 임의로, 접촉 및 모니터링 단계는 손상된 DNA 폴리머라제 및 제2 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 반복된다. 임의로, 접촉 및 모니터링 단계는 손상된 DNA 폴리머라제 및 제3 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 반복된다. 임의로, 접촉 및 모니터링 단계는 손상된 DNA 폴리머라제 및 제4 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 반복된다.
본 명세서에서 제공된 서열결정 방법에서, 손상된 DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 시험 뉴클레오티드를 포함하는, 3원 복합체 형성에 사용된 반응 혼합물은 적어도 1, 2, 3, 또는 4개 유형의 뉴클레오티드 분자(예를 들어, 지된 또는 미표지된 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 반응 혼합물은 최대 4, 3, 2 또는 1개 유형의 뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드는 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP로부터 선택된 원상태 뉴클레오티드이다. 임의로, 반응 혼합물은 하나 이상의 트라이포스페이트 뉴클레오티드 및 하나 이상의 다이포스페이트 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 프라이밍된 주형 핵산, 손상된 DNA 폴리머라제, 및 반응 혼합물에서 포함된 4개의 뉴클레오티드 분자 중 하나 사이에 형성된다.
제공된 방법의 특정 예에서, (그것의 3'-말단에서 임의로 차단된) 프라이밍된 주형 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드와 폴리머라제를 포함하는 반응 혼합물과 접촉된다. 3원 복합체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 문의되고 있는 위치용 동족 뉴클레오티드이면 형성할 것이다.
제공된 방법의 또 다른 특정 예에서, (그것의 3'-말단에서 임의로 차단된) 프라이밍된 주형 핵산은 첨가된 시험 뉴클레오티드 없이 손상된 DNA 폴리머라제를 포함하는 반응 혼합물과 초기에 접촉된다. 그 후에, 프라이밍된 주형 핵산은 3원 복합체 형성에 참여할 수 있는 손상된 DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 시험 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉된다. 그 후에, 임의로 차단된 프라이밍된 주형 핵산은 이전의 반응 혼합물보다 하나 더 적은 뉴클레오티드 및 폴리머라제를 포함하는 반응 혼합물과 접촉된다. 임의의 3원 복합체의 유지 또는 불안정화 모니터링은 계속해서, 또는 각각의 반응 혼합물 변화 이후 발생할 수 있다.
뉴클레오티드 혼입이 검사 단계 동안 발생하지 않기 때문에, 별개의 혼입 단계는 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성 결정, 또는 적어도 결정하는데 필요한 결과 획득 후 수행될 수 있다. 동족 뉴클레오티드가 검사 단계 동안 이미 확인되었음에 따라, 별개의 혼입 단계는 모니터링에 대한 필요 없이 달성될 수 있다. 가역적으로 종결된 뉴클레오티드는 후속 뉴클레오티드의 첨가를 방지하기 위해 또한 사용될 수 있다. 손상된 DNA 폴리머라제와 주형 핵산 사이의 상호작용이 뉴클레오티드에서 표지와 함께 또는 표지 없이 모니터링될 수 있음에 따라, SBB 방법은 표지된 뉴클레오티드의 사용과 함께 또는 사용 없이 주형 핵산 염기의 제어된 결정을 허용한다. 그러나, 분명히 하기 위해, 표지된 뉴클레오티드(예를 들어, 형광성 뉴클레오티드)의 용도는 결합된 뉴클레오티드의 형광성 검출을 허용하기 위해 현재 개시된 절차를 수행하는 경우 선택적이다.
본 명세서에서 제공된 서열결정 방법에서, 시험 뉴클레오티드(예를 들어, 하나 이상의 시험 뉴클레오티드)는 3' 하이드록실 기, 또는 프라이머의 3'-말단에서 포스포다이에스터 결합 형성을 방지하는 차단 모이어티를 포함할 수 있다. 3' 종결자 모이어티 또는 2' 종결자 모이어티는 가역적 종결자 또는 비가역적 종결자일 수 있다. 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드 분자의 가역적 종결자는 가역적 종결자를 포함하였던 시험 뉴클레오티드를 이용하였던 검사 단계 후 일부 지점에서 대체 또는 제거된다.
접촉 단계
손상된 DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 시험 뉴클레오티드 분자를 포함하는 반응 혼합물과 프라이밍된 주형 핵산 분자의 접촉은 3원 복합체의 형성을 안정화하고/거나 2원 복합체의 형성을 불안정화시키는 조건 하에 발생할 수 있다. 임의로, 반응 혼합물은 글루탐산칼륨을 포함한다. 임의로, 3원 복합체의 형성을 안정화시키는 조건은 안정화제와 프라이밍된 주형 핵산 접촉을 포함한다. 임의로, 반응 혼합물은 안정화제를 포함한다. 안정화제는 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 하나 이상의 비-촉매적 금속 이온일 수 있다. 이러한 목적에 유용한 예시적인 비-촉매적 금속 이온은 스트론튬 이온, 주석 이온, 니켈 이온, 및 유로퓸 이온을 포함한다. 예를 들어, 프라이밍된 주형 핵산, 폴리머라제, 및 시험 뉴클레오티드를 포함하는 검사 단계의 반응 혼합물은 또한 안정화제로서 0.01 mM 내지 30 mM 염화스트론튬을 포함할 수 있다.
다르게는, 및 특히 검사 단계에서 3원 복합체를 형성하기 위해 차단된 프라이밍된 주형 핵산을 사용하는 경우, 검사 및 모니터링 단계 실행에 사용된 반응 혼합물은 임의로 촉매적 금속 이온(예를 들어, Mg2+ 또는 Mn2+)를 포함할 수 있다. 비변형된(즉, 3' 차단되지 않은) 프라이머를 사용하는 경우 중합 활성을 지지하는데 필요한 촉매적 금속 이온의 농도는 당해 분야에서 기술의 통상적인 수준을 가진 자들에 익숙할 것이다.
특정 구현예에서, 프라이밍된 주형 핵산은 고체 지지체의 표면에 고정화된다. 고정화는 프라이밍된 주형 핵산의 하나 또는 다른, 또는 심지어 양쪽 가닥과 고체 지지체 사이에 공유 또는 비공유결합을 이용할 수 있다. 예를 들어, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 가닥 및 주형이 상이한 분자인 경우, 주형 가닥은, 예를 들어 그것의 5'-말단을 통해, 고정화될 수 있다. 그러나, 필요한 것은, 프라이머의 3' 말단이 폴리머라제와 상호작용에 이용가능하다는 것이다.
프라이밍된 주형 핵산이 고체 지지체에 고정화되는 경우, 접촉 단계가 수행되는 방법용 대안이 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 상이한 시약 용액을 함유하는 상이한 용기(예를 들어, 다중웰 플레이트의 개별 웰) 사이에 물리적으로 전달될 수 있다. 이것은 자동화 또는 로보트 기기를 사용하여 편리하게 달성된다. 또 다른 예에서, 프라이밍된 주형 핵산은 유동 세포 또는 챔버 내부 고체 지지체에 고정화된다. 이 사례에서, 상이한 접촉 단계는 챔버를 통해, 또는 고정된 프라이밍된 주형 핵산을 거쳐 상이한 액체 시약의 제어된 유동에 의해 실행될 수 있다.
모니터링 단계
뉴클레오티드 분자의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 손상된 DNA 폴리머라제의 상호작용 모니터링 또는 측정은 많은 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 모니터링은 프라이밍된 주형 핵산, 손상된 DNA 폴리머라제, 및 뉴클레오티드 사이의 상호작용에 대하여 회합 동력학 측정을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 분자의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 손상된 DNA 폴리머라제의 상호작용 모니터링은 손상된 DNA 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이의 평형 결합 상수(즉, 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산에 대한 폴리머라제의 평형 결합 상수) 측정을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모니터링은 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 손상된 DNA 폴리머라제의 평형 결합 상수 측정을 포함한다. 뉴클레오티드 분자의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 손상된 DNA 폴리머라제의 상호작용 모니터링은 4개의 뉴클레오티드 중 어느 하나의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산으로부터 폴리머라제의 해리 동력학 측정을 포함한다. 임의로, 뉴클레오티드 분자의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 손상된 DNA 폴리머라제의 상호작용 모니터링은 폐쇄된-복합체의 해리(즉, 프라이밍된 주형 핵산, 폴리머라제, 및 뉴클레오티드의 해리)의 동력학 측정을 포함한다. 임의로, 측정된 회합 동력학은 뉴클레오티드 분자의 동일성에 의존하여 상이하다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 이용된 각각의 유형의 뉴클레오티드에 대하여 상이한 친화도를 갖는다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 각각의 유형의 폐쇄된-복합체에서 각각의 유형의 뉴클레오티드에 대하여 상이한 해리 상수를 갖는다. 회합, 평형 및 해리 동력학은 공지되고 당해 분야에서의 것에 의해 쉽게 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Markiewicz et al., Nucleic Acids Research 40(16):7975-84 (2012); Xia et al., J. Am. Chem . Soc . 135(1):193-202 (2013); Brown et al., J. Nucleic Acids, Article ID 871939, 11 pages (2010); Washington, et al., Mol . Cell. Biol . 24(2):936-43 (2004); Walsh and Beuning, J. Nucleic Acids, Article ID 530963, 17 pages (2012); 및 Roettger, et al., Biochemistry 47(37):9718-9727 (2008)] 참고, 이들의 전체내용이 본원에 참고로 혼입됨).
모니터링 단계는, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머로의 제1 뉴클레오티드의 화학적 혼입 없이, 제1 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산과 폴리머라제의 정상 상태 상호작용 모니터링을 포함할 수 있다. 임의로, 모니터링은, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머로의 제1 뉴클레오티드의 화학적 혼입 없이, 제1 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산으로부터 폴리머라제의 해리 모니터링을 포함한다. 임의로, 모니터링은, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머로의 제1 뉴클레오티드의 화학적 혼입 없이, 제1 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산과 폴리머라제의 회합 모니터링을 포함한다. 재차, 이들 절차에서 시험 뉴클레오티드는 원상태 뉴클레오티드(즉, 미표지된), 표지된 뉴클레오티드(예를 들어, 형광적으로 표지된 뉴클레오티드), 또는 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 가역적 또는 비가역적 종결자 모이어티를 포함하도록 변형된 뉴클레오티드)일 수 있다.
손상된 DNA 폴리머라제가 실질적으로 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시킬 수 없기 때문에, 검사 반응 혼합물에서 촉매적 금속 이온을 포함하는 것은 선택적이다. 물론, 반응 혼합물에서 촉매적 금속 이온의 부재, 또는 폴리머라제의 활성 부위에서 촉매적 금속 이온의 부재는 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머로의 뉴클레오티드의 화학적 혼입을 방지한다.
검사 단계는 손상된 DNA 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호작용의 모니터링을 허용하면서 뉴클레오티드의 화학적 혼입을 방지하기 위한 반응 조건 제공에 의해, 부분적으로, 제어될 수 있고, 그렇게 함으로써 핵산 주형 가닥의 다음 염기의 동일성의 결정을 허용한다. 그와 같은 반응 조건은 "검사 반응 조건"으로서 지칭될 수 있다. 임의로, 3원 복합체 또는 폐쇄된-복합체는 검사 조건 하에 형성된다. 임의로, 안정화된 3원 복합체 또는 폐쇄된-복합체는 검사 조건 하에 또는 사전-화학 형태로 형성된다. 임의로, 안정화된 폐쇄된-복합체는 사전-전좌 형태이고, 여기서 봉입된 뉴클레오티드는 혼입되었지만, 폐쇄된-복합체는 후속 뉴클레오티드의 혼입을 허용하지 않는다. 임의로, 검사 조건은 상이한 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 폴리머라제에 대한 친화도에서 차이를 강조한다. 임의로, 검사 조건은 상이한 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대하여 손상된 DNA 폴리머라제의 차별적인 친화도를 야기한다. 예를 들어, 상이한 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대하여 손상된 DNA 폴리머라제의 차별적인 친화도를 야기하는 검사 조건은, 비제한적으로, 글루탐산칼륨의 고 염 및 봉입체를 포함한다. 프라이밍된 주형 핵산에 대하여 폴리머라제 친화도를 변경시키는데 사용될 수 있는 글루탐산칼륨의 농도는 글루탐산칼륨의 10 mM 내지 1.6 M, 또는 10 mM 내지 1.6 M의 임의의 양을 포함한다. 임의로, 고 염은 염 50 mM 내지 1,500 mM 염의 농도를 지칭한다.
검사는 전형적으로, 모니터링 단계에서, 주형 핵산과, 또는 조합으로 주형 핵산 및 뉴클레오티드와 손상된 DNA 폴리머라제의 상호작용 검출을 포함한다. 검출은 광학, 전기, 열, 청각, 화학 및 기계 수단을 포함할 수 있다. 임의로, 모니터링은 완충제 변화 또는 세정 단계 후 수행되고, 여기서 세정 단계는 관찰의 영역으로부터 임의의 비-결합된 시약(예를 들어, 미결합된 폴리머라제 및/또는 뉴클레오티드)을 제거한다. 임의로, 모니터링은 완충제 변화 또는 세정 단계 동안 수행되어, 이로써 폴리머라제-핵산 또는 폴리머라제-핵산-뉴클레오티드 복합체의 해리 동력학은 다음 염기의 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 임의로, 모니터링은 검사 반응 혼합물 또는 제1 반응 혼합물의 첨가의 과정 동안 수행되어, 이로써 핵산에 대한 폴리머라제의 회합 동력학은 핵산에서 다음 염기의 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 임의로, 모니터링은 폴리머라제 및 프라이밍된 주형 핵산의 2원 복합체와 폐쇄된-복합체의 식별을 포함한다. 임의로, 모니터링은 측정된 친화도가 평형 친화도인 평형 조건 하에 수행된다. 상이한 또는 유사한 검사 시약을 포함하는 다중 검사 단계는 다음 주형 염기의 동일성을 확인하기 위해 순차적으로 수행될 수 있다. 다중 검사 단계는 다중 주형 핵산이 하나의 서열결정 반응에서 동시에 서열결정되고 있는 사례에서 이용될 수 있고, 여기서 상이한 핵산은 상이한 검사 시약에 상이하게 반응한다. 임의로, 다중 검사 단계는 다음 염기 결정의 정확도를 개선할 수 있다.
예시적인 서열결정 반응에서, 검사 단계는 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 다음 정확한 뉴클레오티드를 포함하는 폐쇄된-복합체의 형성 및/또는 안정화를 포함한다. 폐쇄된-복합체의 형성 및/또는 방출의 특징은 봉입된 뉴클레오티드 및 이에 따라 주형 핵산에서 다음 염기를 확인하기 위해 모니터링된다. 폐쇄된-복합체 특징은 서열결정 반응 성분(예를 들어, 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오티드) 및/또는 반응 혼합물 성분 및/또는 조건에 의존적일 수 있다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 사전-화학 형태이다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 사전-전좌 형태이다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 사후-전좌 형태이다.
검사 단계는 시험 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산과 손상된 DNA 폴리머라제의 상호작용 모니터링을 포함한다. 폐쇄된-복합체의 형성은 모니터링될 수 있다. 임의로, 폐쇄된-복합체의 형성의 부재는 모니터링된다. 임의로, 폐쇄된-복합체의 해리는 모니터링된다. 임의로, 혼입 단계는 뉴클레오티드의 혼입 모니터링을 포함한다. 임의로, 혼입 단계는 뉴클레오티드 혼입의 부재 모니터링을 포함한다.
검사 및/또는 혼입 단계의 임의의 공정은 모니터링될 수 있다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 외인성 표지 또는 "태그"를 갖는다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제에서 검출가능한 태그 또는 표지는 제거가능하다. 임의로, 뉴클레오티드 또는 손상된 DNA 폴리머라제는 검출가능한 표지를 갖지만, 표지는 서열결정 동안 검출되지 않는다. 임의로, 서열결정 반응의 성분은 외인성 표지로 검출가능하게 표지되지 않는다.
뉴클레오티드의 혼입을 허용하지 않는 조건 하에, 정확한 및 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산에 대하여 손상된 DNA 폴리머라제의 친화도에서 변화 모니터링은 핵산의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 변형된 또는 표지된 뉴클레오티드를 포함하는, 상이한 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산에 대하여 손상된 DNA 폴리머라제의 친화도는 다양한 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제-핵산 상호작용의 오프-레이트로서 모니터링될 수 있다. 다양한 매칭된/정확한, 불일치된/부정확한 및 변형된 뉴클레오티드에 대한 많은 표준 폴리머라제의 친화도 및 오프-레이트는 당해 기술에 공지되어 있다. Klenow 폴리머라제의 단일 분자 이미지형성은, 뉴클레오티드 유형이 혼입에서 방지되는 경우, 상이한 뉴클레오티드 유형에 대하여 주형 핵산에 대한 오프-레이트가 뚜렷하게 및 측정가능하게 상이하다는 것을 드러낸다.
임의로, 특정 유형의 뉴클레오티드는 프라이밍된 주형 핵산의 존재 하에 손상된 DNA 폴리머라제에 이용가능하게 만들어진다. 뉴클레오티드가 다음 정확한 뉴클레오티드이면, 폴리머라제가 폐쇄된-복합체를 형성하기 위해 안정화될 수 있는, 반응은 모니터링된다. 뉴클레오티드가 부정확한 뉴클레오티드이면, 폐쇄된-복합체는 여전히 형성될 수 있지만; 안정화제 또는 반응 조건(예를 들어, 촉매적 이온, 폴리머라제 억제제, 염의 부재)의 추가의 지원 없이, 폐쇄된-복합체는 해리될 수 있다. 해리율은 폴리머라제, 주형 핵산, 및 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 반응 조건의 특정한 조합의 친화도에 의존적이다. 임의로, 친화도는 오프-레이트로서 측정된다. 임의로, 친화도는 폐쇄된-복합체에 대해 상이한 뉴클레오티드 사이에서 상이하다. 예를 들어, 프라이머의 3'-말단의 주형 핵산 하류에서 다음 염기가 G이면, 오프-레이트로서 측정된, 폴리머라제-핵산 친화도는 dATP, dCTP, dGTP 또는 dTTP가 첨가되는지 여부에 기반하여 상이한 것으로 기대된다. 이 경우에, dCTP는, 상호작용에 상이한 오프-레이트를 제공하는 다른 뉴클레오티드로, 가장 느린 오프-레이트를 가질 것이다. 임의로, 오프-레이트는 반응 조건, 예를 들어, 안정화제(예를 들어, 억제성 화합물)의 존재 또는 반응 조건(예를 들어, 뉴클레오티드 변형체 또는 변형된 폴리머라제)에 의존하여 상이할 수 있다. 일단 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성이 결정되면, 1, 2, 3, 4개 또는 초과의 뉴클레오티드 유형은 폐쇄된-복합체의 형성을 구체적으로 표적하는 조건 하에 반응 혼합물에 동시에 도입될 수 있다. 과잉의 뉴클레오티드는 폐쇄된-복합체의 다음 정확한 뉴클레오티드를 혼입시키기 위해 (예를 들어, 가역적 종결자 뉴클레오티드의 사용에 의해) 조절된 반응 조건 및 반응 혼합물로부터 제거될 수 있다. 이러한 서열결정 반응은 단 하나의 뉴클레오티드가 서열결정 사이클당 혼입된다는 것을 확보한다.
뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산에 대하여 손상된 DNA 폴리머라제의 친화도는 당해 분야의 숙련가에 공지된 다수의 방법에서 측정될 수 있다. 임의로, 친화도는 오프-레이트로서 측정되고, 여기에서 오프-레이트는 반응이 세정 완충제로 세정됨에 따라 주형 핵산으로부터 손상된 DNA 폴리머라제의 방출 모니터링에 의해 측정된다. 폴리머라제 결합 속도는 손상된 DNA 폴리머라제의 충분히 낮은 농도에서 확산 제한될 수 있고, 여기서 손상된 DNA 폴리머라제가 DNA-폴리머라제 복합체로부터 떨어지면, 즉시 역으로 장입하지 않아, 폴리머라제가 복합체로부터 방출된 것을 검출하기에 충분한 시간을 허용한다. 더 높은 친화도 상호작용을 위하여, 손상된 DNA 폴리머라제는 핵산으로부터 느리게 방출되고, 반면에 저 친화도 상호작용은 더욱 빠르게 방출되는 폴리머라제를 초래한다. 친화도의 스펙트럼은, 이 경우에, 동적 세정 조건 하에 또는 평형에서 측정된 오프-레이트로, 상이한 오프-레이트로 번역한다. 최소 오프-레이트는 첨가된 뉴클레오티드에 상보적인 염기에 상응하고, 반면 다른 오프-레이트는, 공지된 방식으로, 선택된 손상된 DNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 조합에 의존하여, 다양하다.
임의로, 오프-레이트는 손상된 DNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드가 반응 혼합물에서 제공된 후 평형 신호 강도로서 측정되고, 여기서 최저 오프-레이트(최고 친화도) 뉴클레오티드와의 상호작용은 가장 강한 신호를 생산하고, 반면 다른 다양한 오프-레이트 뉴클레오티드와의 상호작용은 측정가능하게 상이한 강도의 신호를 생산한다. 비-제한적인 예로서, 바람직하게는, 총 내부 반사(TIRF) 조건 하에 측정된, 형광적으로 표지된 폴리머라제는 적합하게 선택된 시간의 윈도우에서 표면-고정화된 핵산 분자에 결합된 폴리머라제 분자의 수에 의존하여 상이한 측정된 형광 강도를 생산한다. 폴리머라제의 고유 형광, 예를 들어, 트립토판 형광은 또한 이용될 수 있다. 선택된 시간 윈도우에서, 결합된 손상된 DNA 폴리머라제 분자의 수가 매우 작음에 따라, 높은 오프-레이트 상호작용이 낮은 측정된 강도를 생산하고, 여기서 높은 오프-레이트는 대부분의 폴리머라제가 핵산으로부터 미결합되는 것을 나타낸다. 임의의 표면 국소화된 측정 계획은, 비제한적으로, 표지된 또는 형광 계획을 포함하여 이용될 수 있다. 평형 조건 하에 친화도를 측정하는 적합한 측정 계획은, 비제한적으로, 결합된 질량, 굴절률, 표면 전하, 유전 상수, 및 당해 분야에서 공지된 다른 계획을 포함한다. 임의로, 온-레이트 및 오프-레이트 공학기술의 조합은 제안된 계획에서 더 높은 충실도 검출을 산출한다. 비-제한적인 예로서, 균일하게 낮은 온-레이트, 염기-의존적, 다양한 오프-레이트는, 오프-레이트 및 측정된 강도에서 변화의 향상된 식별력을 허용하는, 장기적인 기간 동안 미결합된 잔존하는 미결합된 폴리머라제를 초래한다. 온-레이트는 첨가된 손상된 DNA 폴리머라제, 뉴클레오티드, 또는 양쪽 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 농도 저하에 의해 조작될 수 있다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제와 핵산 사이의 상호작용은 폴리머라제에 부착된 검출가능한 태그를 통해 모니터링된다. 태그는, 비제한적으로, 광학, 전기, 열, 질량, 크기, 전하, 진동, 및 압력을 포함하는 검출 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 표지는 자기성, 형광성 또는 충전될 수 있다. 외부 및 내부 표지 계획을 위하여, 형광 이방성은 폐쇄된-복합체에서 핵산으로의 손상된 DNA 폴리머라제의 안정한 결합을 결정하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 손상된 DNA 폴리머라제는 형광단으로 태깅되고, 여기서 폐쇄된-복합체 형성은 안정한 형광성 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산과 손상된 DNA 폴리머라제의 안정한 상호작용은 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 형성된 폐쇄된-복합체와 비교된 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다. 그러나, 특정 바람직한 구현예에서, 결합에-의한-서열결정 절차는 손상된 DNA 폴리머라제에 연결된 임의의 외인성 표지(예를 들어, 형광성 표지)의 검출에 의존하지 않는다.
임의로, (그것의 3'-말단에서 임의로 차단된) 프라이밍된 주형 핵산 분자는 검사 단계 동안 손상된 DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 외인성으로 표지된 뉴클레오티드와 접촉된다. 표지된 뉴클레오티드의 존재의 결과로서 생성된 신호의 모니터링은 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 3원 복합체의 안정화/불안정화 및 형성에 관한 정보를 제공한다. 예를 들어, 외인성 표지가 형광성 표지이면, 그리고 프라이밍된 주형 핵산이 특정 유전자좌에서 고체 지지체에 고정화되면, 그 유전자좌와 관련된 형광성 신호 모니터링은 상이한 반응 혼합물 조건 하에 3원 복합체 형성 및 안정성 모니터링에 사용될 수 있다.
확인 단계
다음 정확한 염기 또는 뉴클레오티드의 동일성은 3원 복합체 또는 폐쇄된-복합체의 존재, 형성 및/또는 해리 모니터링에 의해 결정될 수 있다. 다음 염기의 동일성은 프라이머의 3'-말단으로의 다음 정확한 뉴클레오티드의 화학적으로 혼입 없이 결정될 수 있다. 임의로, 다음 염기의 동일성은 첨가된 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대하여 손상된 DNA 폴리머라제의 친화도 모니터링에 의해 결정된다. 임의로, 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대하여 폴리머라제의 친화도는 주형 핵산에서 다음 정확한 염기를 결정하는데 사용될 수 있다. 임의로, 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대하여 손상된 DNA 폴리머라제의 친화도는 주형 핵산에서 다음 정확한 염기를 결정하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산)을 포함하는 3원 복합체는 손상된 DNA 폴리머라제 및 다수의 뉴클레오티드의 존재 하에 형성된다. 3원 복합체에 참여하는 동족 뉴클레오티드는 임의로 동족 뉴클레오티드가, 예를 들어 하나의 반응 혼합물을 또 다른 것으로 교환함으로써 반응 혼합물로부터 제거되는 경우 발생하는 복합체의 손실 관찰에 의해 확인된다. 여기에서, 복합체의 불안정화는 동족 뉴클레오티드 동일성의 지표이다. 결합 신호(예를 들어, 고체 지지체에서 특정 유전자좌와 관련된 형광성 결합 신호)의 손실은 프라이밍된 주형 핵산이 동족 뉴클레오티드를 포함하지 않는 반응 혼합물에 노출되는 경우 발생할 수 있다. 임의로, 반응 혼합물에서 단일 뉴클레오티드의 존재 하에 3원 복합체의 유지는 또한 동족 뉴클레오티드의 동일성을 나타낼 수 있다.
혼입 단계
임의로, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 혼입 단계를 포함한다. 예를 들어, 혼입 단계는 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머로의 주형 핵산의 다음 염기에 상보적인 단일 뉴클레오티드(예를 들어, 미표지된 뉴클레오티드, 가역적 종결자 뉴클레오티드, 또는 검출가능하게 표지된 뉴클레오티드 유사체)의 혼입을 포함한다. 임의로, 혼입 단계는 혼입 반응 혼합물과 프라이밍된 주형 핵산 분자, (검사 단계에서 사용된 손상된 DNA 폴리머라제 이외) 폴리머라제 및 뉴클레오티드 접촉을 포함한다. 반응 혼합물 혼입은 전형적으로 촉매적 금속 이온을 포함한다.
제공된 방법은 추가로 혼입 단계 이후 다음 검사 단계를 위하여 프라이밍된 주형 핵산 분자 제조를 포함할 수 있다. 임의로, 제조는 프라이밍된 주형 핵산 또는 핵산/폴리머라제 복합체를 하나 이상의 세정 단계; 온도 변화; 기계적 진동; pH 변화; 염 또는 완충제 조성물 변화, 광학 자극 또는 이들의 조합에 적용함을 포함한다. 임의로, 세정 단계는 하나 이상의 완충제, 세제, 단백질 변성제, 프로테아제, 산화제, 환원제, 또는 폴리머라제 내에 내부 가교제 또는 폴리머라제와 핵산 사이에 가교제를 방출시킬 수 있는 다른 제제와 프라이밍된 주형 핵산 또는 프라이밍된 주형 핵산/폴리머라제 복합체의 접촉을 포함한다.
임의로, 상기 방법은 추가로 주형 핵산 분자를 서열화하기 위해 검사 단계 및 혼입 단계의 반복을 포함한다. 검사 단계는 혼입 단계 수행에 앞서 1회 이상 반복될 수 있다. 임의로, 2개의 연속적인 검사 단계는 상이한 뉴클레오티드 분자(예를 들어, 표지된 또는 미표지된 상이한 뉴클레오티드)를 가진 반응 혼합물을 포함한다. 임의로, 프라이밍된 주형 핵산 분자로의 단일 뉴클레오티드의 혼입에 앞서, 제1 반응 혼합물은 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 있는 폴리머라제 및 1, 2, 3, 또는 4개 유형의 뉴클레오티드 분자(예를 들어, 상이한 미표지된 뉴클레오티드)를 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체된다. 임의로, 뉴클레오티드 분자는 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP로부터 선택된 원상태 뉴클레오티드이다.
혼입 반응은 혼입 반응 혼합물에 의해 가능해질 수 있다. 임의로, 혼입 반응 혼합물은 검사 반응과 상이한 조성의 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 검사 반응은 1개 유형의 뉴클레오티드를 포함하고 혼입 반응은 또 다른 유형의 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 예로서, 검사 반응은 1개 유형의 뉴클레오티드를 포함하고 혼입 반응은 4개 유형의 뉴클레오티드를 포함하거나, 그 반대이다. 임의로, 검사 반응 혼합물은 혼입 반응 혼합물에 의해 변경 또는 대체된다. 임의로, 혼입 반응 혼합물은 촉매적 금속 이온, 칼륨 염화물, 또는 이들의 조합을 포함한다.
임의로, 혼입 단계는 검사 단계로부터 뉴클레오티드 대체 및 주형 핵산 프라이머의 3'-말단으로의 또 다른 뉴클레오티드 혼입을 포함한다. 혼입 단계는 추가로 폐쇄된-복합체 이내로부터 뉴클레오티드 방출(예를 들어, 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체이다) 및 주형 핵산 프라이머의 3'-말단으로의 상이한 종류의 뉴클레오티드 혼입을 포함할 수 있다. 임의로, 방출된 뉴클레오티드는 제거되거나 다음 정확한 뉴클레오티드를 포함하는 혼입 반응 혼합물로 대체된다.
혼입에 적합한 반응 조건은 혼입 반응 혼합물로의 검사 반응 혼합물 대체를 포함할 수 있다. 임의로, 검사 반응 혼합물에서 존재하는 뉴클레오티드는 혼입 반응 혼합물에서 하나 이상의 뉴클레오티드로 대체된다. 임의로, 검사 단계 동안 존재하는 폴리머라제는 혼입 단계 동안 대체된다. 임의로, 검사 단계 동안 존재하는 폴리머라제는 혼입 단계 동안 변형된다. 임의로, 검사 단계 동안 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드는 혼입 단계 동안 변형된다. 검사 단계 동안 존재하는 반응 혼합물 및/또는 반응 조건은 혼입 단계 동안 임의의 수단에 의해 변경될 수 있다. 이들 수단은, 비제한적으로, 제거 시약, 킬레이트 시약, 희석 시약, 첨가 시약, 변경 반응 조건, 예컨대 전도도 또는 pH, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함하는 반응 혼합물에서 시약은 검사 단계 및/또는 혼입 단계 동안 변형될 수 있다.
임의로, 혼입 단계의 반응 혼합물은 경쟁적 억제제를 포함하고, 여기서 경쟁적 억제제는 다중 혼입의 발생을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 경쟁적 억제제는 비-혼입가능 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 경쟁적 억제제는 아미노글리코시드이다. 경쟁적 억제제는 활성 부위에서 어느 한쪽 뉴클레오티드 또는 촉매적 금속 이온을 대체할 수 있어서, 이로써 제1 혼입 후 경쟁적 억제제는 제2 혼입을 방지하는 활성 부위를 차지한다. 일부 구현예에서, 양쪽 혼입가능 뉴클레오티드 및 경쟁적 억제제는 혼입 단계에서 도입되어서, 이로써 혼입가능 뉴클레오티드 및 억제제의 비는 프라이머의 3'-말단에서 단일 뉴클레오티드의 혼입을 확보하도록 조정될 수 있다.
임의로, 혼입 반응 혼합물을 포함하는, 제공된 반응 혼합물은 비-혼입가능 뉴클레오티드인 하나 이상의 미표지된 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 환언하면, 제공된 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머로 혼입할 수 없는 하나 이상의 미표지된 뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있다. 혼입할 수 없는 뉴클레오티드는, 예를 들어, 다이포스페이트 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드를 비-혼입가능하게 만드는 트라이포스페이트 기에 변형체를 함유시킬 수 있다. 비-혼입가능 뉴클레오티드의 예는 아래에 발견될 수 있다: 미국 특허 제7,482,120호(이의 전체내용은 본원에 참고로 혼입됨). 임의로, 프라이머는 그것의 3'-말단에서 자유 하이드록실 기를 함유할 수 없어서, 그렇게 함으로써 프라이머가 임의의 뉴클레오티드를 혼입할 수 없도록 만들고, 따라서 임의의 뉴클레오티드를 비-혼입가능하게 만든다.
폴리머라제 억제제는 임의로 다음 정확한 뉴클레오티드 결합시 핵산에서 폴리머라제를 포획하기 위한 검사 단계에서 시험 뉴클레오티드를 함유하는 반응 혼합물과 함께 포함될 수 있다. 임의로, 폴리머라제 억제제는 파이로포스페이트 유사체이다. 임의로, 폴리머라제 억제제는 알로스테릭 억제제이다. 임의로, 폴리머라제 억제제는 DNA 또는 RNA 압타머이다. 임의로, 폴리머라제 억제제는 폴리머라제에서 촉매적-이온 결합 부위와 경쟁한다. 임의로, 폴리머라제 억제제는 역전사효소 억제제이다. 폴리머라제 억제제는 HIV-1 역전사효소 억제제 또는 HIV-2 역전사효소 억제제일 수 있다. HIV-1 역전사효소 억제제는 (4/6-할로겐/MeO/EtO-치환된 벤조[d]티아졸-2-일)티오졸리딘-4-온일 수 있다.
제공된 서열결정 방법에서, 다음 정확한 뉴클레오티드는 혼입 단계 전 확인되어, 혼입 단계가 표지된 시약 및/또는 모니터링을 요구하지 않도록 한다. 따라서, 제공된 방법에서, 뉴클레오티드는, 임의로, 부착된 검출가능한 태그 또는 표지를 함유하지 않는다. 임의로, 뉴클레오티드는 검출가능한 표지를 함유하지만, 표지는 방법에서 검출되지 않는다. 임의로, 정확한 뉴클레오티드는 검출가능한 표지를 함유하지 않지만; 다음 염기에 부정확한 또는 비-상보적 뉴클레오티드는 검출가능한 표지를 함유한다.
서열결정 반응의 검사 단계는 혼입 단계에 앞서 1, 2, 3, 4회 또는 초과 반복될 수 있다. 검사 및 혼입 단계는 주형 핵산의 원하는 서열이 수득될 때까지 반복될 수 있다.
반응 혼합물
핵산 서열결정 반응 혼합물, 또는 단순히 "반응 혼합물"은, 전형적으로 폴리머라제-기반 핵산 합성 반응에서 통상적으로 존재하는 시약을 포함한다. 반응 혼합물 시약은, 비제한적으로, 효소(예를 들어, 손상된 DNA 폴리머라제, 또는 혼입 단계에서 사용된 폴리머라제), dNTP, 주형 핵산, 프라이머 핵산, 염, 완충제, 작은 분자, 보조인자, 금속, 및 이온을 포함한다. 이온은 촉매적 이온, 2가 촉매적 이온, 비-촉매적 이온, 비-공유 금속 이온, 또는 이들의 조합일 수 있다. 반응 혼합물은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄, 글루탐산칼륨, NH4Cl, 또는 NH4HSO4를 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 이온, 예컨대 Mg2 + 또는 Mn2 + Mg-아세테이트, Co2 + 또는 Ba2 +의 공급원을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 주석 이온, Ca2 +, Zn2+, Cu2 +, Co2 +, Fe2 +, Ni2 +, 또는 Eu+3을 포함할 수 있다. 완충제는 Tris, 트리신, HEPES, MOPS, ACES, MES, 포스페이트-기반 완충제, 및 아세테이트-기반 완충제를 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 킬레이트제, 예컨대 EDTA, EGTA, 및 기타 등등을 포함할 수 있다. 임의로, 반응 혼합물은 가교결합 시약을 포함한다. 임의로, 검사 단계 동안 사용된, 반응 혼합물, 뿐만 아니라 하나 이상의 상기 언급된 제제를 포함할 수 있는 뉴클레오티드 혼입 동안 사용된 혼입 반응 혼합물이 본 명세서에서 제공된다. 반응 혼합물은, 검사 동안 사용된 경우, 본 명세서에서 검사 반응 혼합물로서 지칭될 수 있다. 임의로, 검사 반응 혼합물은 고 농도의 염; 고 pH; 1, 2, 3, 4개 또는 초과 유형의 미표지된 뉴클레오티드; 글루탐산칼륨; 킬레이트제; 폴리머라제 억제제; 촉매적 금속 이온; 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 비-촉매적 금속 이온; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 검사 반응 혼합물은 10 mM 내지 1.6 M의 글루탐산칼륨 또는 10 mM 내지 1.6 M의 임의의 양을 포함할 수 있다. 임의로, 혼입 반응 혼합물은 촉매적 금속 이온; 1, 2, 3, 4개 또는 초과 유형의 뉴클레오티드(예를 들어, 미표지된 뉴클레오티드); 염화칼륨; 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 비-촉매적 금속 이온; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
임의로, 개시된 기술에 따른 반응 혼합물은 검사 단계 동안 폐쇄된-복합체의 형성 및 안정화를 조절한다. 예를 들어, 검사 단계의 반응 조건은 임의로 뉴클레오티드를 캡슐화하는 폐쇄된-복합체의 형성 및/또는 안정화, 및 2원 복합체의 형성 및/또는 안정화를 선호할 수 있다. 폴리머라제와 주형 핵산 사이의 2원 상호작용은 서열결정 반응 파라미터, 예컨대 이온성 강도, pH, 온도, 또는 이들의 임의의 조합 조절에 의해, 또는 반응에 2원 복합체 불안정화제의 첨가에 의해 조작될 수 있다. 임의로, 고 염(예를 들어, 50 mM 내지 1,500 mM) 및/또는 pH 변화는 2원 복합체를 불안정화시키는데 이용된다. 임의로, 2원 복합체는, 뉴클레오티드의 존재와 무관하게, 서열결정 반응의 검사 또는 혼입 단계 동안 폴리머라제와 주형 핵산 사이에 형성될 수 있다. 임의로, 반응 조건은 폐쇄된 3원 복합체의 안정화 및 2원 복합체의 불안정화를 선호한다. 예를 들어, 검사 반응 혼합물의 pH는 폐쇄된 3원 복합체의 안정화 및 2원 복합체의 불안정화를 선호하기 위해 pH 4.0 내지 pH 10.0으로 조정될 수 있다. 임의로, 검사 반응 혼합물의 pH는 pH 4.0 내지 pH 6.0이다. 임의로, 검사 반응 혼합물의 pH는 pH 6.0 내지 pH 10.0이다.
본 명세서에서 제공된 반응 혼합물 및 개시된 서열결정 방법은 뉴클레오티드의 화학적 첨가를 제어하면서 다음 염기의 동일성을 드러내는 방식으로 뉴클레오티드 및 주형 핵산과 폴리머라제의 상호작용을 조장한다. 임의로, 상기 방법은 표지가 검출되지 않는 표지된 뉴클레오티드의 존재 하에 또는 검출가능하게 표지된 뉴클레오티드의 부재 하에 수행된다. 임의로, 반응 혼합물은 외인성 검출가능한 표지(예를 들어, 형광성 표지)를 제공하는 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 반응 혼합물에서 다수의 뉴클레오티드는 동일한 외인성 검출가능한 표지를 제공한다. 임의로, 반응 혼합물에서 다수의 뉴클레오티드는 상이한 외인성 검출가능한 표지를 제공한다. 임의로, 반응 혼합물은 하나 이상의 외인성으로 표지된 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다.
검사 반응 혼합물 조건 하에, 폴리머라제-주형 핵산 복합체 내에 봉입된 뉴클레오티드 및 프라이밍된 주형 핵산에 결합된 폴리머라제를 포함하는 폐쇄된-복합체의 형성 및/또는 안정화를 용이하게 하는 반응 혼합물 및 방법이 본 명세서에서 제공된다. 검사 반응 조건은 뉴클레오티드 혼입을 억제 또는 약화시킬 수 있다. 임의로, 봉입된 뉴클레오티드의 혼입은 억제되고 복합체는 사전-화학 형태 또는 3원 복합체에서 안정화 또는 포획된다. 임의로, 봉입된 뉴클레오티드는 혼입되고 후속 뉴클레오티드 혼입은 억제된다. 이 사례에서, 복합체는 사전-전좌 형태에서 안정화 또는 포획된다. 본 명세서에서 제공된 서열결정 반응을 위하여, 폐쇄된-복합체는 검사 단계 동안 안정화되어서, 제어된 뉴클레오티드 혼입을 허용한다. 임의로, 안정화된 폐쇄된-복합체는 봉입된 뉴클레오티드의 혼입이 검사 단계 동안 일시적으로(예를 들어, 복합체의 검사, 및 이어서 뉴클레오티드의 혼입을 위해) 또는 영구적으로(예를 들어, 검사 단독을 위하여) 약화되는 복합체이다. 임의로, 안정화된 폐쇄된-복합체는 봉입된 뉴클레오티드의 혼입을 허용하지만, 후속 뉴클레오티드의 혼입을 허용하지 않는다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 주형 핵산에서 다음 염기의 확인을 위하여 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산과 임의의 폴리머라제 상호작용을 모니터링하기 위해 안정화된다.
임의로, 봉입된 뉴클레오티드는 폐쇄된-복합체에서 주형 핵산에 심하게 감소된 또는 고장난 결합을 갖는다. 임의로, 봉입된 뉴클레오티드는 다음 염기에서 주형 핵산에 대한 염기쌍이 된다. 임의로, 폴리머라제, 뉴클레오티드, 프라이머, 주형 핵산, 또는 이들의 임의의 조합의 동일성은 폐쇄된-복합체에서 봉입된 뉴클레오티드와 주형 핵산 사이의 상호작용에 영향을 준다.
임의로, 봉입된 뉴클레오티드는 폐쇄된-복합체의 폴리머라제에 결합된다. 임의로, 봉입된 뉴클레오티드는 폐쇄된-복합체의 폴리머라제와 약하게 회합된다. 임의로, 폴리머라제, 뉴클레오티드, 프라이머, 주형 핵산, 또는 이들의 임의의 조합의 동일성은 폐쇄된-복합체에서 봉입된 뉴클레오티드와 폴리머라제 사이의 상호작용에 영향을 준다. 주어진 폴리머라제에 대하여, 각각의 뉴클레오티드는 폴리머라제에 대하여 또 다른 뉴클레오티드와 상이한 친화도를 갖는다. 임의로, 이러한 친화도는, 부분적으로, 주형 핵산 및/또는 프라이머에 의존적이다.
폐쇄된-복합체는 일시적으로 형성될 수 있다. 임의로, 봉입된 뉴클레오티드는 다음 정확한 뉴클레오티드이다. 일부 방법에서, 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재는, 부분적으로, 폐쇄된-복합체의 안정화에 기여한다. 임의로, 봉입된 뉴클레오티드는 다음 정확한 뉴클레오티드가 아니다.
임의로, 검사 반응 조건은 다수의 프라이밍된 주형 핵산, 폴리머라제, 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 임의로, 다수의 뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4개 또는 초과 유형의 상이한 뉴클레오티드, 예를 들어 dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP를 포함한다. 임의로, 다수의 주형 핵산은 주형 핵산의 클론 모집단이다.
폐쇄된-복합체의 안정성을 조정할 수 있는 반응 조건은, 비제한적으로, 촉매적 금속 이온의 이용가능성, 차선적 또는 억제성 금속 이온, 이온성 강도, pH, 온도, 폴리머라제 억제제, 가교결합 시약, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 폐쇄된-복합체의 안정성을 조정할 수 있는 반응 시약은, 비제한적으로, 비-혼입가능 뉴클레오티드, 부정확한 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 폴리머라제, 비-연장가능 중합 시작 부위를 가진 주형 핵산, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
검사 반응 혼합물은, 비제한적으로, 효소를 포함하는 다른 분자를 포함할 수 있다. 임의로, 검사 반응 혼합물은 핵산 중합 반응에서 일반적으로 존재하는 생체분자 또는 임의의 시약을 포함한다. 반응 성분은, 비제한적으로, 염, 완충제, 작은 분자, 금속, 및 이온을 포함할 수 있다. 임의로, 반응 혼합물의 특성은, 예를 들어, 전기적으로, 자석으로, 및/또는 진동으로 조작될 수 있다.
뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체
본 명세서에서 기재된 결합에-의한-서열결정 절차 실시에 유용한 뉴클레오티드는 원상태 뉴클레오티드, 표지된 뉴클레오티드(예를 들어, 원상태 뉴클레오티드에서 발견되지 않은 다른 표지 또는 외인성 형광성 염료를 포함하는 뉴클레오티드), 및 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오티드)를 포함한다.
현재 기재된 기술에 관하여 이용될 수 있는 뉴클레오티드의 성질에서 가요성이 있다. 뉴클레오티드는 임의의 하기 염기를 그것의 질소성 염기로서 포함할 수 있다: 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실. 임의로, 뉴클레오티드는 이노신, 크산타닌, 하이포크산타닌, 이소시토신, 이소구아닌, 니트로피롤(3-니트로피롤 포함) 또는 니트로인돌(5-니트로인돌 포함) 염기를 포함한다. 유용한 뉴클레오티드는, 비제한적으로, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dUDP, dAMP, dTMP, dCMP, dGMP, 및 dUMP를 포함한다. 임의로, 포스페이트 기는 모이어티로 변형된다. 모이어티는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드의 3' OH 기는, 모이어티가 3' 가역적 또는 비가역적 종결자 모이어티일 수 있는, 모이어티로 변형된다. 임의로, 뉴클레오티드의 2' 위치는, 모이어티가 2' 가역적 또는 비가역적 종결자 모이어티일 수 있는, 모이어티로 변형된다. 임의로, 뉴클레오티드의 염기는 가역적 종결자 모이어티를 포함하도록 변형된다. 뉴클레오티드는 또한, ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP, 및 ddUTP)로 약칭되는, DNA 폴리머라제, 다이데옥시뉴클레오티드 또는 2',3' 다이데옥시뉴클레오티드의 종결 억제제를 함유할 수 있다.
임의로, 검사 단계의 폐쇄된-복합체는 폐쇄된-복합체의 안정화를 용이하게 하기 위해 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 질소성 염기, 5-탄소 당질, 및 포스페이트 기를 포함하고 뉴클레오티드의 임의의 성분은 변형 및/또는 대체될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 비-혼입가능 뉴클레오티드일 수 있다. 비-혼입가능 뉴클레오티드는 서열결정 방법 동안 임의의 지점에서 혼입가능해지도록 변형될 수 있다.
뉴클레오티드 유사체는, 비제한적으로, 알파-포스페이트 변형된 뉴클레오티드, 알파-베타 뉴클레오티드 유사체, 베타-포스페이트 변형된 뉴클레오티드, 베타-감마 뉴클레오티드 유사체, 감마-포스페이트 변형된 뉴클레오티드, 케이징된 뉴클레오티드, 또는 ddNTP를 포함한다. 뉴클레오티드 유사체의 예는, 전체내용이 본원에 참고로 혼입된 미국 특허 제8,071,755호에 기재된다.
뉴클레오티드 유사체는 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오티드 혼입을 가역적으로 방지시키는 종결자를 포함할 수 있다. 1개 유형의 가역적 종결자는 3'-O-차단된 가역적 종결자이다. 종결자는 뉴클레오티드의 5-탄소 당질의 3' OH 말단의 산소 원자에 연결된다. 또 다른 유형의 가역적 종결자는 3'-미차단된 가역적 종결자이다. 종결자는 뉴클레오티드의 질소성 염기에 연결된다. 종결자를 갖는 뉴클레오티드 유사체의 검토를 위하여, 예를 들어, 문헌[Mu, R., et al., "The History and Advances of Reversible Terminators Used in New Generations of Sequencing Technology," Genomics, Proteomics & Bioinformatics 11(1):34-40 (2013)](이의 전체내용은 본원에 참고로 혼입됨)을 참고한다.
임의로, 뉴클레오티드는 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오티드 혼입을 비가역적으로 방지하는 종결자를 갖는 변형된 뉴클레오티드 유사체에 대하여 치환된다. 비가역적 뉴클레오티드 유사체는 다이데옥시뉴클레오티드, ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP)를 포함한다. 다이데옥시뉴클레오티드는 폴리머라제-매개된 합성에 필수적인 dNTP의 3'-OH 기가 부족하다.
임의로, 비-혼입가능 뉴클레오티드는 핵산 중합 반응의 혼입 단계 동안 제2 뉴클레오티드에 대한 공유결합 형성으로부터 뉴클레오티드를 억제 또는 방지하는 차단 모이어티(프라이머의 3' OH)를 포함한다. 차단 모이어티는 뉴클레오티드로부터 제거될 수 있어서, 뉴클레오티드 혼입을 허용한다.
임의로, 폐쇄된-복합체에서 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 폐쇄된-복합체를 안정하게 만든다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 비-혼입가능하다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 방출되고 원상태 뉴클레오티드는 혼입된다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 방출되고, 뉴클레오티드 유사체는 변형되고, 변형된 뉴클레오티드 유사체는 혼입된다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 폐쇄된-복합체에서 뉴클레오티드 유사체를 변형 및/또는 불안정화시키는 반응 조건 하에 방출된다.
임의로, 폐쇄된-복합체에서 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 혼입되고 폐쇄된-복합체는 안정화된다. 폐쇄된-복합체는 뉴클레오티드 유사체에 의해, 또는 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 임의의 안정화 방법에 의해 안정화될 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 후속 뉴클레오티드의 혼입을 허용하지 않는다. 폐쇄된-복합체는, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 임의의 방법에 의해 방출될 수 있고, 뉴클레오티드 유사체는 변형된다. 변형된 뉴클레오티드 유사체는 그것의 3'-말단에 뉴클레오티드의 후속 혼입을 허용할 수 있다.
임의로, 뉴클레오티드 유사체는 검사 단계 동안 반응 혼합물에서 존재한다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4개 또는 초과의 뉴클레오티드 유사체는 검사 단계 동안 반응 혼합물에서 존재한다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 혼입 단계 동안 대체, 희석, 또는 격리된다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 원상태 뉴클레오티드로 대체된다. 원상태 뉴클레오티드는 다음 정확한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 혼입 단계 동안 변형된다. 변형된 뉴클레오티드 유사체는 원상태 뉴클레오티드에 유사하거나 상기와 동일할 수 있다.
임의로, 뉴클레오티드 유사체는 손상된 DNA 폴리머라제에 대하여 원상태 뉴클레오티드와 상이한 결합 친화도를 갖는다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 원상태 뉴클레오티드보다 다음 염기와 상이한 상호작용을 갖는다. 뉴클레오티드 유사체 및/또는 비-혼입가능 뉴클레오티드는 주형 핵산의 상보적 염기와 염기쌍이 될 수 있다.
임의로, 뉴클레오티드 유사체는, 폴리머라제에 융합된, 변형된 또는 원상태, 뉴클레오티드이다. 임의로, 다수의 뉴클레오티드 유사체는 다수의 폴리머라제에 대한 융합을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오티드 유사체는 상이한 폴리머라제를 포함한다.
뉴클레오티드는 2원 복합체의 형성보다 폐쇄된-복합체의 형성을 선호하도록 변형될 수 있다. 뉴클레오티드는 손상된 DNA 폴리머라제에 대하여 고 친화도를 갖도록 선택 또는 변형될 수 있고, 여기서 폴리머라제는 주형 핵산에 대한 결합에 앞서 뉴클레오티드에 결합한다.
폐쇄된-복합체에서 손상된 DNA 폴리머라제를 포획하는 임의의 뉴클레오티드 변형체는 본 명세서에서 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 뉴클레오티드는 영구적으로 또는 일시적으로 포획될 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체는 폐쇄된-복합체가 안정화되는 수단이 아니다. 임의의 폐쇄된-복합체 안정화 방법은 뉴클레오티드 유사체를 이용하는 반응에서 조합될 수 있다.
임의로, 폐쇄된-복합체의 안정화를 허용하는 뉴클레오티드 유사체는 폐쇄된-복합체를 일반적으로 방출시키는 반응 조건과 조합된다. 상기 조건은, 비제한적으로, 방출 시약(예를 들어, 촉매적 금속 이온, 예컨대 마그네슘 또는 망간)의 존재를 포함한다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 촉매적 금속 이온의 존재 하에 안정화된다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 심지어 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에 방출된다. 임의로, 폐쇄된-복합체의 안정화는, 부분적으로, 안정화 시약 및/또는 방출 시약의 농도 및/또는 동일성, 및 이들의 임의의 조합에 의존적이다. 임의로, 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 폐쇄된-복합체의 안정화는, 비제한적으로, 촉매적 금속 이온의 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화를 포함하는, 폐쇄된-복합체를 안정화시키는 기능을 하는 추가의 반응 조건; 폴리머라제 억제제, 가교결합제의 존재; 및 이들의 임의의 조합과 조합된다.
임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 식별가능한 및/또는 검출가능한 태그 또는 표지로 표지될 수 있지만; 그와 같은 태그 또는 표지는 검사, 염기의 확인 또는 염기의 혼입 동안 검출되지 않고, 본 명세서에서 개시된 서열결정 방법 동안 검출되지 않는다. 태그는 형광, 라만 스펙트럼, 전하, 질량, 굴절률, 발광, 길이, 또는 임의의 다른 측정가능한 특성에서 그것의 차이에 의해 식별가능할 수 있다. 태그는, 폴리머라제-핵산 복합체에 결합의 충실도가 정확하게 주형 핵산에서 상보적 염기의 확인을 할 수 있도록 충분히 유지되는 한, 뉴클레오티드에서 하나 이상의 상이한 위치에 부착될 수 있다. 임의로, 태그는 뉴클레오티드의 핵염기 위치에 부착된다. 적합한 반응 조건 하에, 태깅된 뉴클레오티드는 폴리머라제 및 프라이밍된 주형 핵산과 폐쇄된-복합체에서 봉입될 수 있다. 다르게는, 태그는 뉴클레오티드의 감마 포스페이트 위치에 부착된다.
폴리머라제
개시된 결합에-의한-서열결정 기술 실시에 유용한 손상된 DNA 폴리머라제는, 비제한적으로, 돌연변이체, 재조합, 융합, 유전적 변형, 화학적 변형, 합성, 및 유사체를 포함하는, 자연 발생 폴리머라제의 변형된 변이체를 포함한다. 임의로, 변형된 변이체는, 핵산에 향상된 결합 친화도, 핵산에 감소된 결합 친화도, 향상된 촉매작용 속도, 감소된 촉매작용 속도 등을 포함하는, 서열 DNA에 그것의 능력을 향상시키는 특별한 특성을 갖는다. 돌연변이체 폴리머라제는 하나 이상의 아미노산이 (자연 또는 비-자연 발생) 다른 아미노산으로 대체되고/거나, 하나 이상의 아미노산이 화학적으로 변형되고/거나 하나 이상의 아미노산이 삽입 또는 결실되는 폴리머라제를 포함한다. 변형된 폴리머라제는, 폴리머라제의 존재 및 상호작용을 모니터링하는데 사용될 수 있는, 외부 태그를 함유하는 폴리머라제를 포함한다. 임의로, 폴리머라제로부터의 고유 신호는 그것의 존재 및 상호작용을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 폴리머라제로부터의 고유 신호의 검출을 통해 폴리머라제, 뉴클레오티드 및 주형 핵산의 상호작용 모니터링을 포함할 수 있다. 임의로, 고유 신호는 광 산란 신호이다. 예를 들어, 고유 신호는 특정 아미노산, 예컨대 트립토판의 원상태 형광을 포함하고, 여기서 폴리머라제로부터 고유 신호에서의 변화는 폐쇄된-복합체의 형성을 나타낼 수 있다. 따라서, 제공된 방법에서, 폴리머라제는 미표지된 폴리머라제일 수 있고, 모니터링은 폴리머라제와 관련된 검출가능한 표지의 부재 하에 수행될 수 있다.
용어 폴리머라제 및 그것의 변이체는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, 핵산 가닥 속에 뉴클레오티드의 중합을 촉매화시킬 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 하나의 부분이 제2 모이어티, 예컨대, 리포터 효소 또는 진행성-변형 도메인을 포함하는 또 다른 부분에 연결되는, 서로에 대해서 연결된 적어도 2개의 부분을 포함하는 융합 단백질을 또한 지칭한다. 예를 들어, T7 DNA 폴리머라제는, 티오레독신 결합이 폴리머라제의 진행성을 향상시키는, 티오레독신 결합 도메인 및 핵산 중합화 도메인을 포함한다. 티오레독신 결합 부재인 경우, T7 DNA 폴리머라제는 몇몇 염기에 단 하나의 진행성을 가진 분배적 폴리머라제이다. DNA 폴리머라제가 상세히 상이하여도, 이들은 손가락, 손바닥, 및 엄지손가락으로서 지칭된 특이적 영역으로 손의 유사한 전반적인 형상; 그리고 핵산의 합성 동안, 엄지손가락 및/또는 손가락 도메인의 운동을 포함하는, 유사한 전반적인 구조적 전이를 갖는다.
손상된 DNA 폴리머라제를 산출하기 위해 변형될 수 있는 DNA 폴리머라제는, 비제한적으로, 박테리아 DNA 폴리머라제, 진핵 DNA 폴리머라제, 고세균 DNA 폴리머라제, 바이러스성 DNA 폴리머라제 및 파아지 DNA 폴리머라제를 포함한다. 박테리아 DNA 폴리머라제는 대장균 DNA 폴리머라제 I, II 및 III, IV 및 V, 대장균 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편, 클로스트리듐 스테르코라리움(Cst) DNA 폴리머라제, 클로스트리듐 써모셀룸(Cth) DNA 폴리머라제 및 설포로버스 솔파타리쿠스(Sso) DNA 폴리머라제를 포함한다. 진핵 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 α, β, γ, δ, €, η, ξ, λ, σ, μ 및 κ, 뿐만 아니라 Revl 폴리머라제(말단 데옥시시티딜 전달효소) 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소(TdT)를 포함한다. 바이러스성 DNA 폴리머라제는 T4 DNA 폴리머라제, 파이-29 DNA 폴리머라제, GA-1, 파이-29-유사 DNA 폴리머라제, PZA DNA 폴리머라제, 파이-15 DNA 폴리머라제, Cpl DNA 폴리머라제, Cp7 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, 및 T4 폴리머라제를 포함한다. 다른 DNA 폴리머라제는 열안정성 및/또는 호열성 DNA 폴리머라제, 예컨대 하기로부터 단리된 DNA 폴리머라제를 포함한다: 테르무스 아쿠아티쿠스(Taq) DNA 폴리머라제, 테르무스 필리포르미스(Tfi) DNA 폴리머라제, 써모코쿠스 지일리지(Tzi) DNA 폴리머라제, 테르무스 써모필루스(Tth) DNA 폴리머라제, 테르무스 플라부수(Tfl) DNA 폴리머라제, 파이로코쿠스 우에세이(Pwo) DNA 폴리머라제, 파이로코쿠스 푸리오서스(Pfu) DNA 폴리머라제 및 터보 Pfu DNA 폴리머라제, 써모코쿠스 리토랄리스(Tli) DNA 폴리머라제, 파이로코쿠스 sp. GB-D 폴리머라제, 써모토가 마리티마(Tma) DNA 폴리머라제, 바실러스 스테아로써모필루스(Bst) DNA 폴리머라제, 파이로코쿠스 코다카라엔시스(KOD) DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, 써모코쿠스 sp. JDF-3(JDF-3) DNA 폴리머라제, 써모코쿠스 고르고나리우스(Tgo) DNA 폴리머라제, 써모코쿠스 아시도필륨 DNA 폴리머라제; 설포로버스 악시도칼다리우스 DNA 폴리머라제; 써모코쿠스 sp. go N-7 DNA 폴리머라제; 파이로딕티움 옥쿨툼 DNA 폴리머라제; 메타노코커스 볼타에 DNA 폴리머라제; 메타노코커스 써모아우토트로피쿰 DNA 폴리머라제; 메타노코커스 얀나쉬이 DNA 폴리머라제; 데술푸로콕쿠스 균주 TOK DNA 폴리머라제(D. Tok Pol); 파이로코쿠스 아비시이 DNA 폴리머라제; 파이로코쿠스 호리코쉬이 DNA 폴리머라제; 파이로코쿠스 이슬란디쿰 DNA 폴리머라제; 써모코쿠스 푸미코란스 DNA 폴리머라제; 아에로피룸 페르닉스 DNA 폴리머라제; 및 헤테로이량체성 DNA 폴리머라제 DP1/DP2. 조작된 및 변형된 폴리머라제는 또한 개시된 기술에 관하여 유용하다. 예를 들어, 극도로 호열성 해양 고세균 써모코쿠스 종 9°N의 변형된 버전(예를 들어, New England BioLabs Inc.(Ipswich, MA)의 종결자 DNA 폴리머라제; )이 사용될 수 있다. 3PDX 폴리머라제를 포함하는, 또 다른 유용한 DNA 폴리머라제는, 이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입되는 US 8,703,461에서 개시된다.
RNA 폴리머라제는, 비제한적으로, 바이러스성 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제, T3 폴리머라제, SP6 폴리머라제, 및 K11 폴리머라제; 진핵 RNA 폴리머라제, 예컨대 RNA 폴리머라제 I, RNA 폴리머라제 II, RNA 폴리머라제 III, RNA 폴리머라제 IV, 및 RNA 폴리머라제 V; 및 고세균 RNA 폴리머라제를 포함한다.
역전사효소는, 비제한적으로, 인간 면역결핍 바이러스 유형 1로부터의 HIV-1 역전사효소(PDB 1HMV), 인간 면역결핍 바이러스 유형 2로부터의 HIV-2 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스로부터의 M-MLV 역전사효소, 조류 골수아세포증 바이러스로부터의 AMV 역전사효소, 및 진핵 염색체의 말단소체를 유지시키는 텔로머라제 역전사효소를 포함한다.
촉매적으로 불활성인 폴리머라제 돌연변이체의 모델링
돌연변이체가 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 적절하게 형성하지만, Mg2 + 이온의 존재 하에 그들 뉴클레오티드를 혼입시킬 수 없는, 바실러스 스테아로써모필루스(Bst-f)의 열안정성 계열 균주로부터 DNA 폴리머라제 I(pol I) 큰 단편 돌연변이체의 제조가 아래 기재된다. Bst-f 효소는, 대장균 DNA pol I(KF), 테르무스 아쿠아티쿠스 DNA pol I(Taq), 및 바실러스 서브틸리스 DNA pol I(Bsu-f)를 포함하는, 다른 널리-특성규명된, 고 충실도 폴리머라제에 대한 상동성을 갖는 계열 A 폴리머라제이다. 이들 폴리머라제는, 뉴클레오티드 결합 및 중합을 포함하는, 구별되는 기능을 이행하는데 필요한 보존된 단백질 서열 모티프를 공유한다.
또한, 계열 A 폴리머라제는 손가락, 엄지손가락 및 손바닥 서브도메인으로서 공지된 공통 구조적 구조를 공유한다. 손바닥 서브도메인은, 당해 분야에서 기술의 통상적인 수준을 갖는 이들에 익숙할 촉매적 코어를 포함함에 따라, DNA 폴리머라제 중에 고도로 보존된다. 손바닥은 또한 모티프 A 및 C로부터 촉매적 카복실레이트를 함유한다. 모티프 A 및 C에서, 보존된 산성 아미노산 잔기, 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)은 폴리머라제에 의해 촉매접촉된 포스포릴 전이 반응 동안 2가 양이온에 대하여 금속 리간드로서 제공된다고 생각된다. 모티프 A는 베타-가닥 및 알파-나선의 접합에서 엄격히-보존된 아스파르테이트를 함유하고, 모티프 C는, 베타-회전-베타 2차 구조에서 위치한, 음전하의 이중항을 갖는다.
돌연변이체 제조에 사용된 모체 효소("CBT")는 시스테인 함량에 대하여 최적화된 Bst 폴리머라제의 조작된 버전, 및 단백질 정제 및 가공을 용이하게 하였던 N-말단 서열이었다. 더 구체적으로, 서열번호 1로서 확인된 폴리펩티드 서열은 하기를 갖는 변형된 N-말단을 포함하였다: (1) 위치 5-10에서 조작된 "His-태그" 모티프; (2) 위치 17과 18 사이의 트롬빈 절단 부위; 및 (3) 위치 23의 시스테인 잔기. 자연 발생 Bst 폴리머라제 서열은 위치 27부터 (자연 발생 시스테인 잔기의 제거를 거친) C-말단까지 연장되었다. 본 개시내용에 따라 조작된 폴리머라제가 임의로 상기 기재된 N-말단 변형체를 포함 또는 생락하는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 유용한 폴리머라제는 서열번호 2(트롬빈 절단 부위의 서열 상류 생략) 또는 서열번호 3(원상태 Bst 폴리머라제의 제1 아미노산의 서열 상류 생략)의 모체 스캐폴드에서 작제될 수 있다. 따라서, 포스포다이에스터 결합 형성에 대한 수용력에 영향을 주는 유용한 변형체는 이들 단백질 서열 스캐폴드와 관련하여 이해될 수 있다.
종래의 A 및 C 모티프의 배열은 아래 제시된다. 양쪽 정렬은 표준 폴리펩티드 서열 정렬 소프트웨어 툴을 사용하여 제조되었다. 모티프 A에서 밑줄친 및 진한 아스파르트산(D) 잔기는 Bst 폴리머라제의 결정 구조에서 아미노산 위치 653(UniProt 번호 P52026, 단백질 데이터 은행 번호 3EZ5)에 상응한다. 모티프 C에서 밑줄친 및 진한 아스파르트산 및 글루탐산(DE) 잔기는 Bst 폴리머라제의 결정 구조에서 아미노산 위치 830 및 831(UniProt 번호 P52026, 단백질 데이터 은행 번호 3EZ5)에 상응한다.
모티프 A
Klenow 단편: DYVIVSA D YSQIELRIMAHLSRDKGL (서열번호 4)
Taq: GWLLVAL D YSQIELRVLAHLSGDENL (서열번호 5)
Bst-f: DWLIFAA D YSQIELRVLAHIAEDDNL (서열번호 6)
Bsu-f: DWLIFAA D YSQIELRVLAHISKDENL (서열번호 7)
모티프 C
Klenow 단편: MIMQVH DE LVFEVHKDDVD (서열번호 8)
Taq: MLLQVH DE LVLEAPKERAE (서열번호 9)
Bst-f: LLLQVH DE LILEAPKEEIE (서열번호 10)
Bsu-f: LLLQVH DE LIFEAPKEEIE (서열번호 11)
진한 및 밑줄친 모티프 A 아스파르테이트(D) 잔기에 대하여 Bst-f 넘버링은 서열번호 1에서 잔기 381(또는 서열번호 2의 잔기 364; 또는 서열번호 3의 잔기 355)이다. 모티프 C 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E) 잔기는 서열번호 1에서 넘버링된 558 및 559(또는 서열번호 2의 잔기 541 및 542; 또는 서열번호 3의 잔기 532 및 533) 각각이다. 대부분의 DNA 폴리머라제가 모티프 A 및 C에서 3개의 카복실레이트 측쇄를 제공하는 아미노산을 포함하는 것으로 공지되는 반면, 일부는 촉매작용 동안 단지 2개의 카복실레이트 측쇄를 요구한다. 서열번호 1의 잔기 381 및 558은 폴리머라제 활성에서 그것의 효과를 조사하기 위해 돌연변이유발에 대하여 뽑혔다. 이들 잔기는, 폴리머라제 단백질을 인코딩하는 부위 지향적 돌연변이유발 및 발현 벡터를 사용하여, 글루타메이트(E) 또는 아스파라긴(N)으로 치환되었다. 재차, 객체는 중합 화학 단계를 억제시키면서 DNA 및 dNTP 결합 특성의 유지를 허용하는 것이었다. 핵심 돌연변이의 요약은 표 1에서 제시된다.
Figure 112018118828832-pct00001
아래 간단히 기재된 바와 같이, TDE 및 BDE 돌연변이체 폴리머라제는 실질적으로 유사하게 거동하였다. 더 구체적으로, 양쪽 돌연변이체는 혼입 없이 검사 반응 동안 동족 뉴클레오티드 결합 및 확인에 대하여 유용하였다. 또한, 어느 돌연변이체도 Mg2 + 이온의 존재 하에 촉매적 혼입 활성을 소유하지 않았다. 그에 반해서, TDN 돌연변이체는 불활성이었다(즉, 검사 단계에서 동족 뉴클레오티드를 확인할 수 없었다).
손상된 DNA 폴리머라제 리포터
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 발광성 태그로 태깅되고, 여기서 폐쇄된-복합체 형성은 적절한 발광 유발제(예를 들어, 방사선 유발제 또는, 화학발광 태그의 경우에서, 화학적 유발제)의 존재 하에 안정한 발광 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산과 손상된 DNA 폴리머라제의 불안정한 상호작용은 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 형성된 폐쇄된-복합체에 비교하여 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다. 추가로, 발광 유발에 앞서 세정 단계는 안정한 폐쇄된-복합체에서 결합되지 않는 모든 폴리머라제 분자를 제거할 수 있다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 광학 산란 태그로 태깅되고, 여기서 폐쇄된-복합체 형성은 안정한 광학 산란 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 핵산과 손상된 DNA 폴리머라제의 불안정한 상호작용은 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 형성된 폐쇄된-복합체에 비교하여 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 플라즈몬성 나노입자 태그로 태깅되고, 여기서 폐쇄된-복합체 형성은 폐쇄된-복합체의 부재 하에 또는 부정확한 뉴클레오티드를 포함하는 폐쇄된-복합체의 존재 하에 플라즈몬성 공명과 상이한 플라즈몬성 공명에서 시프트로서 모니터링된다. 플라즈몬 공명에서 변화는 폐쇄된-복합체에서 국부 유전체 환경내 변화에 기인될 수 있거나, 폐쇄된-복합체 배치형태에서 상이하게 플라즈몬에 영향을 주는 또 다른 수단 또는 클론으로 증폭된 핵산 분자의 클러스터에서 플라즈몬성 나노입자의 동시 응집에 기인될 수 있다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 라만 산란 태그로 태깅되고, 여기서 폐쇄된-복합체 형성은 안정한 라만 산란 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 핵산과 손상된 DNA 폴리머라제의 불안정한 상호작용은 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 형성된 폐쇄된-복합체와 비교하여 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다.
임의로, 다음 정확한 뉴클레오티드는 뉴클레오티드에 대하여 고 친화도를 갖기 위해 선택된 또는 변형된 손상된 DNA 폴리머라제에서 태그에 의해 확인되고, 여기서 폴리머라제는 주형 핵산에 대한 결합에 앞서 뉴클레오티드에 결합한다. 예를 들어, 아프리카 돼지 콜레라바이러스로부터의 DNA 폴리머라제 X는 기재 결합의 변경된 차례를 갖고, 여기에서 폴리머라제는 뉴클레오티드에 먼저 결합하고, 그 다음 주형 핵산에 결합한다. 임의로, 폴리머라제는 별개의 구획에서 각각의 유형의 뉴클레오티드로 인큐베이션되고, 여기에서 각각의 구획은 상이한 유형의 뉴클레오티드를 함유하고 폴리머라제는 인큐베이션되는 뉴클레오티드에 의존하여 태그로 상이하게 표지된다. 이들 조건에서, 미표지된 뉴클레오티드는 상이하게 표지된 폴리머라제에 결합된다. 폴리머라제는 각각의 뉴클레오티드 유형에 결합된 동일한 종류의 폴리머라제 또는 각각의 뉴클레오티드 유형에 결합된 상이한 폴리머라제일 수 있다. 차별적으로 태깅된 폴리머라제-뉴클레오티드 복합체는 서열결정 반응의 임의의 단계에 동시에 첨가될 수 있다. 각각의 폴리머라제-뉴클레오티드 복합체는 다음 염기가 폴리머라제-뉴클레오티드 복합체에서 뉴클레오티드에 상보적인 주형 핵산에 결합한다. 다음 정확한 뉴클레오티드는 뉴클레오티드를 운반하는 폴리머라제에서 태그에 의해 확인된다. 표지된 폴리머라제-뉴클레오티드 복합체에 의한 다음 주형 염기의 문의은 비-혼입 및/또는 검사 조건 하에 수행될 수 있고, 여기에서 일단 다음 주형 염기가 결정되면, 복합체는 불안정화 및 제거, 격리, 및/또는 희석되고 별개의 혼입 단계는 단 하나의 뉴클레오티드가 혼입되는 방식으로 수행된다.
폴리머라제에서 검출가능한 태그 도입의 흔한 방법은 임의로 폴리머라제의 비-활성 영역에서 존재하는 아민 또는 시스테인에 화학적 콘주게이션을 포함한다. 그와 같은 콘주게이션 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 비-제한적인 예로서, n-하이드록시석신이미드 에스터(NHS 에스터)는 효소에서 발견될 수 있는 아민 기를 표지하는데 통상적으로 이용된다. 시스테인은 티올 또는 말레이미드 기와 쉽게 반응하고, 반면 카복실 기는 EDC(1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드 하이드로클로라이드)로 이들을 활성화시킴으로써 아민과 반응할 수 있다. 임의로, N-하이드록시석신이미드(NHS) 화학은 단지 N-말단 아민이 반응성(예를 들어, pH 7)인 pH 범위에서 이용되어서, 이로써 단지 단일 태그는 폴리머라제마다 첨가된다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제에 부착된 태그는 전하 태그이어서, 이로써 안정한 폐쇄된-복합체의 형성은 주형 핵산 주위 국부 전하 밀도에서 변화를 측정함으로써 전기 수단에 의해 검출될 수 있다. 전하 검출 방법은, 그 중에서도, 전계효과 트랜지스터, 유전체 분광법, 임피던스 측정, 및 pH 측정과 같은 방법을 포함하여, 당해 분야에서 잘 알려진다. 전계효과 트랜지스터는, 비제한적으로, 반도체의 단일 벽 탄소 나노튜브를 사용하여 제작된 이온-감수성 전계효과 트랜지스터(ISFET), 전하-조절된 전계효과 트랜지스터, 절연된-게이트 전계효과 트랜지스터, 산화금속 반도체 전계효과 트랜지스터 및 전계효과 트랜지스터를 포함한다.
임의로, 전하 태그는 약 4 미만 또는 약 10 초과의 등전점을 갖는 펩티드 태그이다. 임의로, 펩티드 태그를 포함하는 손상된 DNA 폴리머라제는 약 5 미만 또는 약 9 초과의 총 등전점을 갖는다. 전하 태그는 양으로 또는 음으로 하전되는 임의의 모이어티일 수 있다. 전하 태그는 질량 및/또는 표지, 예컨대 염료를 포함하는 추가의 모이어티를 포함할 수 있다. 임의로, 전하 태그는 단지 특정 반응 조건, 예컨대 pH의 변화 하에서 양전하 또는 음전하를 소유할 것이다.
손상된 DNA 폴리머라제는 형광단 및/또는 켄쳐로 표지될 수 있다. 임의로, 핵산은 형광단 및/또는 켄쳐로 표지된다. 임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 형광단 및/또는 켄쳐로 표지된다. 예시적인 형광단은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 형광성 나노결정; 양자점; 다이클로로[R110], 다이클로로[R6G], 다이클로로[TAMRA], 다이클로로[ROX] 또는 기타 동종을 포함하는 d-로다민 수용체 염료; 플루오레신, 6-FAM, 또는 기타 동종을 포함하는 플루오레신 공여체 염료; 시아닌 염료, 예컨대 Cy3B; Alexa 염료, SETA 염료, Atto 염료, 예컨대 Cy3B와 FRET 쌍을 형성하는 atto 647N 및 기타 동종. 형광단은, 비제한적으로, MDCC(7-다이에틸아미노-3-[([(2-말레이미딜)에틸]아미노)카보닐]쿠마린), TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas Red, Cy5, LC red 705 및 LC red 640을 포함한다. 폴리머라제 및 다른 분자로의 부착을 포함하는 이의 용도에 대한 형광단 및 방법은, 이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입되는, 문헌[The Molecular Probes® Handbook (Life Technologies; Carlsbad Calif.) 및 Fluorophores Guide (Promega; Madison, WI)]에서 기재된다. 예시적인 켄치는, 비제한적으로, ZEN, IBFQ, BHQ-1, BHQ-2, DDQ-I, DDQ-11, Dabcyl, Qxl 켄쳐, Iowa Black RQ, 및 IRDye QC-1을 포함한다.
임의로, 형태적인 감수성 염료는 폴리머라제의 중합 능력 또는 충실도에 영향 없이 손상된 DNA 폴리머라제의 활성 부위에 밀접하게 부착될 수 있고; 여기서 형태에서의 변화, 또는 폐쇄된-복합체의 형성으로 인한 극성 환경에서의 변화는 염료의 형광 또는 흡광도 특성에서의 변화로서 반영된다. 흔한 형광단, 예컨대 Cy3 및 플루오레신은, 폐쇄된-복합체의 형성이 2원 폴리머라제-핵산 복합체와 명확히 식별될 수 있는 정도로, 폴리머라제 결합 및 폐쇄된-복합체 형성에 대해 강한 용매화발색 반응을 갖는 것으로 공지된다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 형태적인 감수성 염료로부터 형광 또는 흡광도 신호에서의 차이에 기반하여 2원 복합체와 식별될 수 있다. 임의로, 용매화발색 염료는 형태적 전이를 모니터링하는데 이용될 수 있고; 여기서 형태적 변화에 의해 유도된 국부 극성 환경에서의 변화는 리포터 신호로서 사용될 수 있다. 용매화발색 염료는, 비제한적으로, 레이차트 염료, IR44, 메로시아닌 염료(예를 들어, 메로시아닌 540), 4-[2-N-치환된-1,4-하이드로피리딘-4-일리딘)에틸리덴]사이클로헥사-2,5-다이엔-1-온, 레드 피라졸론 염료, 아조메틴 염료, 인도아닐린 염료, 다이아자메로시아닌 염료, 인디고에 의해 예시된 바와 같이, 인디고이드 염료, 및 기타 뿐만 아니라 이의 혼합물을 포함한다. 폴리머라제의 특이적 부위에 염료 또는 형광단을 도입하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 비-제한적인 예로서, 염료로 T7 DNA 폴리머라제의 부위 특이적 표지화용 절차는 하기에서 제공된다: 문헌["Site-Specific Labeling of T7 DNA Polymerase with a Conformationally Sensitive Fluorophore and Its Use in Detecting Single-Nucleotide Polymorphisms," Analytical Biochemistry 384: 136-144 (2009)], 이의 전체내용은 본원에 참고로 혼입됨.
임의로, 폴리머라제는 반응에 의한 방해 없이 폐쇄된-복합체 형성을 감지할 수 있는 위치에서 형광단으로 태깅된다. 폴리머라제는 원상태 또는 변형된 폴리머라제일 수 있다. 변형된 폴리머라제는 하나 이상의 아미노산 화학적 변형체, 돌연변이, 첨가, 및/또는 결실을 가진 것이다. 임의로, 하나 이상의, 전부가 아닌, 시스테인 아미노산은 또 다른 아미노산, 예컨대 알라닌으로 돌연변이된다. 이 경우에, 잔존하는 하나 이상의 시스테인은 형광단에 부위-특이적 콘주게이션으로 사용된다. 다르게는, 하나 이상의 아미노산은 형광단 콘주게이션에 적합한 반응성 아미노산, 예컨대 시스테인 또는 일차 아민을 포함하는 아미노산으로 돌연변이된다.
임의로, 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 손상된 DNA 폴리머라제와 주형 핵산 사이의 결합은 형광에서 감소를 유도할 수 있고, 반면에 부정확한 뉴클레오티드와의 결합은 형광에서 증가를 야기한다. 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제와 주형 핵산 사이의 결합은 형광에서 증가를 유도할 수 있고, 반면에 부정확한 뉴클레오티드와 결합은 형광에서 감소를 야기한다. 형광성 신호는 뉴클레오티드-유도된 형태적 변화의 동력학을 모니터링하는데 그리고 주형 핵산 서열에서 다음 염기를 확인하는데 사용될 수 있다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제/핵산 상호작용은 폴리머라제 또는 폴리머라제에 부착된 태그, 예를 들어, 나노입자 태그로부터 기원하는 산란 신호에 의해 모니터링될 수 있다.
폐쇄된-복합체 형성 및 조작용 조건
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폐쇄된-복합체는 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드를 포함하는 3원 복합체일 수 있다. 폐쇄된-복합체는, 뉴클레오티드는 격리되지만 혼입되지 않는, 사전-화학 형태일 수 있다. 폐쇄된-복합체는, 다르게는, 뉴클레오티드가 프라이밍된 주형 핵산에서 프라이머의 3'-말단과 포스포다이에스터 결합의 형성에 의해 혼입되는, 사전-전좌 형태일 수 있다. 폐쇄된-복합체는 촉매적 금속 이온 또는 촉매적 금속 이온의 결핍된 수준의 부재 하에 형성될 수 있고, 그렇게 함으로써 화학적 혼입 없이 폴리머라제 활성 부위 내에 다음 정확한 뉴클레오티드를 물리적으로 격리시킨다. 임의로, 격리된 뉴클레오티드는 비-혼입가능 뉴클레오티드일 수 있다. 폐쇄된-복합체는, 폐쇄된-복합체가 혼입되는 뉴클레오티드 유사체를 포함하지만, PPi가 방출될 수 없는, 촉매적 금속 이온의 존재 하에 형성될 수 있다. 이 사례에서, 폐쇄된-복합체는 사전-전좌 형태에서 안정화된다. 임의로, 사전-전좌 형태는 폴리머라제의 화학적인 가교결합에 의해 안정화된다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 외부 수단에 의해 안정화될 수 있다. 일부 사례에서, 폐쇄된-복합체는 작은 분자, 또는 거대분자, 예컨대 항체 또는 압타머의 알로스테릭 결합에 의해 안정화될 수 있다. 임의로, 폐쇄된-복합체는, 폴리머라제의 전좌를 방지하는, 고 친화도로 활성 부위에 밀접하게 결합하는 파이로포스페이트 유사체에 의해 안정화될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 안정화된 폐쇄된-복합체 또는 안정화된 3원 복합체는, 비제한적으로, 폐쇄된 형태에서 엄지손가락 및 손가락 도메인의 가교결합, 개방 형태로의 폴리머라제의 복귀를 방지하는 알로스테릭 억제제의 결합, 사전-전좌 단계에서 폴리머라제를 포획하는 파이로포스페이트 유사체의 결합, 폴리머라제의 활성 부위에서 촉매적 금속 이온의 부재, 및 촉매적 금속 이온에 대한 대체물로서 금속 이온, 예컨대 니켈, 주석 및 Sr2 +의 첨가를 포함하는, 수단의 하나 또는 조합에 의해 프라이밍된 주형 핵산의 중합 시작 부위(프라이머의 3'-말단)에서 포획된 폴리머라제를 지칭한다. 이와 같이, 폴리머라제는 심지어 뉴클레오티드의 혼입 후 중합 시작 부위에서 포획될 수 있다. 따라서, 폴리머라제는 사전-화학 형태, 사전-전좌 단계, 사후-전좌 단계 또는 이의 임의의 중간 단계에서 포획될 수 있다. 따라서, 다음 정확한 뉴클레오티드 또는 염기의 충분한 검사 및 확인을 허용한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 폴리머라제-기반된, 결합에-의한-서열결정 반응은 일반적으로, 뉴클레오티드가 프라이밍된 주형 핵산의 다음 염기에 상보적일 수 있거나 아닐 수 있는, 폴리머라제 및 하나 이상의 유형의 뉴클레오티드에 프라이밍된 주형 핵산 제공, 및 프라이밍된 주형 핵산으로의 뉴클레오티드의 화학적 혼입이 사전-화학 형태에서 고장나거나 심하게 억제되거나, 하나 이상의 상보적 뉴클레오티드 혼입이 프라이머의 3'-말단에서 발생하는 어느 한쪽 조건 하에 프라이밍된 주형 핵산과 폴리머라제의 상호작용 검사를 포함한다. 임의로, 사전-화학 형태가, 뉴클레오티드 혼입에 앞서, 바람직하게는 안정화제를 사용하여, 안정화되는 경우, 별개의 혼입 단계는 프라이머의 3'-말단에 단일 뉴클레오티드를 혼입하는 검사 단계가 뒤따르게 할 수 있다. 임의로, 단일 뉴클레오티드 혼입이 발생하는 경우, 사전-전좌 형태는 검사를 용이하게 하기 위해 및/또는 후속 뉴클레오티드 혼입을 방지하기 위해 안정화될 수 있다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 현재 기재된 핵산 서열결정 방법은 검사 단계를 포함한다. 검사 단계는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물에서 프라이밍된 주형 핵산의 중합 시작 부위에 폴리머라제 결합, 및 상호작용 모니터링을 포함한다. 임의로, 뉴클레오티드는, 폴리머라제에 의해 봉입된 뉴클레오티드의 혼입이 약화 또는 억제되는 조건 하에, 폐쇄된-복합체를 형성하기 위해 폴리머라제-프라이밍된 주형 핵산 복합체 내에 격리된다. 임의로 안정화제는 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 3원 복합체를 안정화시키기 위해 첨가된다. 이러한 폐쇄된-복합체는 안정화된 또는 폴리머라제-포획된 사전-화학 형태이다. 폐쇄된-복합체는 봉입된 뉴클레오티드의 혼입을 허용하지만 후속 뉴클레오티드의 혼입을 허용하지 않는다. 이러한 폐쇄된-복합체는 안정화된 또는 포획된 사전-전좌 형태이다. 임의로, 폴리머라제는, 비제한적으로, 폴리머라제 도메인의 가교결합, 핵산에 대한 폴리머라제의 가교결합, 작은 분자에 의한 알로스테릭 억제, 미경쟁적 억제제, 경쟁적 억제제, 비-경쟁적 억제제, 및 변성을 포함하는 수단의 하나 또는 조합에 의해 그것의 폐쇄된-복합체내 중합 부위에서 포획되고; 여기서 포획된 폐쇄된-복합체의 형성은 핵산 주형에서 다음 염기의 동일성에 대하여 정보를 제공한다.
임의로, 폐쇄된-복합체는, 주형 핵산 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오티드 혼입을 허용할 수 있는, 그것의 포획된 또는 안정화된 형태로부터 방출된다. 폐쇄된-복합체는 반응 조건의 조성물 조정에 의해 불안정화되고/거나 방출될 수 있다. 게다가, 폐쇄된-복합체는 전기적, 자기적, 및/또는 기계적 수단에 의해 불안정화될 수 있다. 기계적 수단은, 예를 들어, 초음파 진탕 이용에 의한 기계적 진탕을 포함한다. 기계적 진동은 폐쇄된-복합체를 불안정화시키고 DNA에 대한 폴리머라제의 결합을 억압시킨다. 따라서, 검사 반응 혼합물이 혼입 혼합물로 대체되는 세정 단계 보다는, 기계적 진탕이 주형 핵산으로부터 폴리머라제를 제거하는데 사용될 수 있어서, 단계마다 단일 뉴클레오티드 첨가에 의한 연속적인 혼입 단계를 통해 사이클링을 가능하게 한다.
폐쇄된-복합체 안정화 또는 폐쇄된-복합체 방출 반응 조건 및/또는 방법의 임의의 조합은 조합될 수 있다. 예를 들어, 폐쇄된-복합체를 안정화시키는 폴리머라제 억제제는, 폐쇄된-복합체를 방출시키는 기능을 하는, 촉매적 이온으로 검사 반응에서 존재할 수 있다. 상기 언급된 예에서, 폐쇄된-복합체는, 폴리머라제 억제제 특성 및 농도, 촉매적 금속 이온의 농도, 반응 혼합물의 다른 시약 및/또는 조건, 및 이들의 임의의 조합에 의존하여, 안정화 또는 방출될 수 있다.
폐쇄된-복합체는 프라이밍된 주형 핵산에서 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오티드의 공유결합이 약화되는 반응 조건 하에 안정화될 수 있다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 사전-화학 형태 또는 3원 복합체이다. 임의로, 폐쇄된-복합체는 사전-전좌 형태이다. 이러한 폐쇄된-복합체의 형성은 반응 혼합물에서 프라이머로의 뉴클레오티드의 화학적 혼입 및/또는 폐쇄된-복합체 방출을 허용하는 촉매적 금속 이온의 이용가능성 조정에 의해 개시 및/또는 안정화될 수 있다. 예시적인 금속 이온은, 비제한적으로, 마그네슘, 망간, 코발트, 및 바륨을 포함한다. 촉매적 이온은 임의의 제형, 예를 들어, 염, 예컨대 MgCl2, Mg(CH3CO2)2, 및 MnCl2일 수 있다.
촉매적 금속 이온의 선택 및/또는 농도는 서열결정 반응에서 폴리머라제 및/또는 뉴클레오티드에 기반할 수 있다. 예를 들어, HIV 역전사효소는 뉴클레오티드 혼입을 위하여 마그네슘을 이용한다(문헌[N Kaushik, Biochemistry 35:11536-11546 (1996), 및 H P Patel, Biochemistry 34:5351-5363 (1995)], 이의 전체내용은 본원에 참고로 혼입됨). 마그네슘 대 망간을 이용하는 폐쇄된-복합체 형성의 속도는 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 동일성에 의존하여 상이할 수 있다. 따라서, 폐쇄된-복합체의 안정성은 촉매적 금속 이온, 폴리머라제, 및/또는 뉴클레오티드 동일성에 의존하여 상이할 수 있다. 또한, 폐쇄된-복합체 안정화에 필요한 촉매적 이온의 농도는 촉매적 금속 이온, 폴리머라제, 및/또는 뉴클레오티드 동일성에 의존하여 다양할 수 있고 본 명세서에서 제공된 안내를 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 혼입은 하나의 금속 이온의 높은 촉매적 이온 농도에서 발생할 수 있지만 동일한 금속 이온의 낮은 농도에서 발생하지 않거나, 그 반대이다. 따라서, 금속 이온 동일성, 금속 이온 농도, 폴리머라제 동일성, 및/또는 뉴클레오티드 동일성 변형은 제어된 검사 반응 조건을 허용한다.
폐쇄된-복합체는 폐쇄된-복합체 방출 및/또는 화학적 혼입이 발생하지 않도록 서열결정 반응의 검사 단계 동안 촉매적 금속 이온의 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화에 의해 형성 및/또는 안정화될 수 있다. 킬레이트화는, EDTA 및/또는 EGTA 사용을 포함하는, 촉매적 금속 이온을 뉴클레오티드 혼입에 이용할 수 없도록 만드는 임의의 절차를 포함한다. 감소는 반응 혼합물에서 촉매적 금속 이온의 농도 희석을 포함한다. 반응 혼합물은, 폐쇄된-복합체 형성을 허용하지만, 뉴클레오티드 혼입을 억제하는, 비-촉매적 이온을 포함하는 용액으로 희석 또는 대체될 수 있다. 비-촉매적 이온은, 비제한적으로, 칼슘, 스트론튬, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크로뮴, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 게르마늄, 비소, 셀레늄, 로듐, 및 스트론튬을 포함한다. 임의로, Ni2 +는 폐쇄된-복합체 형성을 용이하게 하기 위해 검사 반응에서 제공된다. 임의로, Sr2 +는 폐쇄된-복합체 형성을 용이하게 하기 위해 검사 반응에서 제공된다. 임의로, 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 비-촉매적 금속 이온 및 촉매적 금속 이온 둘 다는 반응 혼합물에서 존재하고, 여기서 하나의 이온은 다른 것보다 더 높은 유효 농도로 존재한다. 제공된 방법에서, 비-촉매적 이온, 예컨대 코발트는 고 농도에서 촉매적이 될 수 있다(즉, 뉴클레오티드 혼입을 용이하게 할 수 있다). 따라서, 임의로, 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 비-촉매적 금속 이온의 저 농도는 3원 복합체 형성을 용이하게 하는데 사용되고, 비-촉매적 금속 이온의 더 높은 농도는 혼입을 용이하게 하는데 사용된다.
비-촉매적 이온은 검사 조건 하에 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 반응은 이미 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 임의로, 비-촉매적 이온은 하나 이상의 뉴클레오티드에 복합체화되고 복합체화된 뉴클레오티드는 반응 혼합물에 첨가된다. 비-촉매적 이온은 고온(약 80℃)에서 비-촉매적 이온과 뉴클레오티드 혼합에 의해 뉴클레오티드에 복합체화할 수 있다. 예를 들어, 크로뮴 뉴클레오티드 복합체는 폐쇄된-복합체 형성 및 안정화를 용이하게 하기 위해 혼합물에 첨가될 수 있다. 임의로, 크로뮴 뉴클레오티드 복합체는 크로뮴 한자리, 두자리, 또는 세자리 복합체이다. 임의로, 크로뮴 뉴클레오티드 복합체는 α-한자리, 또는 β-γ-두자리 뉴클레오티드이다.
임의로, 폐쇄된-복합체는, Sr2 +가 폐쇄된-복합체의 형성을 촉진시키는, Sr2 +를 포함하는 반응 조건에서 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드 사이에 형성된다. Sr2 +의 존재는 부정확한 뉴클레오티드를 포함하는 복합체 형성보다 다음 정확한 뉴클레오티드를 포함하는 폐쇄된-복합체의 양호한 형성을 허용할 수 있다. Sr2 + 이온은 농도 약 0.01 mM 내지 약 30 mM에서 존재할 수 있다. 임의로, Sr2 +는 10 mM SrCl2로서 존재한다. 폐쇄된-복합체의 형성은 폐쇄된-복합체의 주형 핵산에서 다음 염기를 확인하기 위한 검사 조건 하에 모니터링된다. Sr2 +의 존재 하에 각각의 dNTP(예를 들어, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)에 대하여 폴리머라제(예를 들어, 대장균 DNA 폴리머라제 I, Bst의 Klenow 단편)의 친화도는 상이할 수 있다. 따라서, 검사는 dNTP에 대한 폴리머라제-주형 핵산의 결합 친화도 측정을 포함할 수 있고; 여기서 결합 친화도는 주형 핵산에서 다음 염기를 나타낸다. 임의로, 결합 상호작용은 손상된 DNA 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 2원 상호작용을 불안정화시키는 조건 하에 수행될 수 있다. 임의로, 결합 상호작용은 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 다음 정확한 뉴클레오티드 사이의 3원 상호작용을 안정화시키는 조건 하에 수행될 수 있다. 검사 후, 세정 단계는 미결합된 뉴클레오티드를 제거하고, Mg2 +는 파이로포스페이트(PPi) 절단 및 뉴클레오티드 혼입을 유도시키기 위해 반응에 첨가된다. 임의로, 세정 단계는 3원 복합체의 안정성을 유지시키기 위해 Sr2 +를 포함하여, 3원 복합체의 해리를 방지한다. 반응은 원하는 서열 판독 길이가 수득될 때까지 반복될 수 있다.
임의로, 폐쇄된-복합체는, Ni2 +가 폐쇄된-복합체의 형성을 촉진시키는, Ni2 +를 포함하는 반응 조건에서 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드 사이에 형성된다. Ni2 +의 존재는 부정확한 뉴클레오티드를 포함하는 복합체 형성보다 다음 정확한 뉴클레오티드를 포함하는 폐쇄된-복합체의 양호한 형성을 허용할 수 있다. Ni2 + 이온은 농도 약 0.01 mM 내지 약 30 mM에서 존재할 수 있다. 임의로, Ni2 +는 10 mM NiCl2로서 존재한다. 폐쇄된-복합체의 형성은 폐쇄된-복합체의 주형 핵산에서 다음 염기를 확인하기 위한 검사 조건 하에 모니터링된다. Sr2 +의 존재 하에 각각의 dNTP(예를 들어, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)에 대하여 폴리머라제(예를 들어, 대장균 DNA 폴리머라제 I, Bst의 Klenow 단편)의 친화도는 상이할 수 있다. 따라서, 검사는 dNTP에 대한 폴리머라제-주형 핵산의 결합 친화도 측정을 포함할 수 있고; 여기서 결합 친화도는 주형 핵산에서 다음 염기를 나타낸다. 임의로, 결합 상호작용은 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 2원 상호작용을 불안정화시키는 조건 하에 수행될 수 있다. 임의로, 결합 상호작용은 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 다음 정확한 뉴클레오티드 사이의 3원 상호작용을 안정화시키는 조건 하에 수행될 수 있다. 검사 후, 세정은 미결합된 뉴클레오티드 및 폴리머라제를 제거하고, Mg2 +는 파이로포스페이트(PPi) 절단 및 뉴클레오티드 혼입을 유도시키기 위해 반응에 첨가된다. 임의로, 세정 완충제는 3원 복합체의 안정성을 유지시키기 위해 Ni2 +를 포함하여, 3원 복합체의 해리를 방지한다. 반응은 원하는 서열 판독 길이가 수득될 때까지 반복될 수 있다.
임의로, 폐쇄된-복합체는, Co2 +가 폐쇄된-복합체의 형성을 촉진시키는, Co2 +의 비-촉매적 농도를 포함하는 반응 조건에서 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드 사이에 형성된다. Co2 +의 비-촉매적 농도의 존재는 부정확한 뉴클레오티드를 포함하는 복합체 형성보다 다음 정확한 뉴클레오티드를 포함하는 폐쇄된-복합체의 양호한 형성을 허용할 수 있다. Co2 + 이온은 농도 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM에서 존재할 수 있다. 임의로, Co2 +는 0.5 mM CoCl2로서 존재한다. 폐쇄된-복합체의 형성은 폐쇄된-복합체의 주형 핵산에서 다음 염기를 확인하기 위한 검사 조건 하에 모니터링된다. Co2 +의 존재 하에 각각의 dNTP(예를 들어, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)에 대하여 폴리머라제(예를 들어, 대장균 DNA 폴리머라제 I, Bst의 Klenow 단편)의 친화도는 상이할 수 있다. 따라서, 검사는 dNTP에 대한 폴리머라제-주형 핵산의 결합 친화도 측정을 포함할 수 있고; 여기서 결합 친화도는 주형 핵산에서 다음 염기를 나타낸다. 임의로, 결합 상호작용은 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 2원 상호작용을 불안정화시키는 조건 하에 수행될 수 있다. 임의로, 결합 상호작용은 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 다음 정확한 뉴클레오티드 사이의 3원 상호작용을 안정화시키는 조건 하에 수행될 수 있다. 검사 후, 세정은 미결합된 뉴클레오티드 및 폴리머라제를 제거하고, 촉매적 농도에서 Co2+는 파이로포스페이트(PPi) 절단 및 뉴클레오티드 혼입을 유도시키기 위해 반응에 첨가된다. 임의로, 세정 완충제는 3원 복합체의 안정성을 유지시키기 위해 Co2 +의 비-촉매적 양을 포함하여, 3원 복합체의 해리를 방지한다. 반응은 원하는 서열 판독 길이가 수득될 때까지 반복될 수 있다.
임의로, 촉매적 금속 이온은 후속 뉴클레오티드 혼입 및 폐쇄된-복합체 방출 없이 폐쇄된-복합체의 형성을 용이하게 할 수 있다. 임의로, 반응 혼합물에서 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μM Mg2 +의 농도는 후속 뉴클레오티드 혼입, PPi 및 폐쇄된-복합체 방출 없이 폐쇄된-복합체를 형성하기 위해 폴리머라제의 형태적 변화를 유도할 수 있다. 임의로, Mg2 +의 농도는 약 0.5 μm 내지 약 10 μM, 약 0.5 μm 내지 약 5 μM, 약 0.5 μm 내지 약 4 μM, 약 0.5 μm 내지 약 3 μM, 약 1 μm 내지 약 5 μM, 약 1 μm 내지 약 4 μM, 및 약 1 μm 내지 약 3 μM이다.
임의로, 뉴클레오티드 혼입을 허용하는데 필요한 서열결정 반응에서 이용가능한 촉매적 금속 이온의 농도는 약 0.001 mM 내지 약 10 mM, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 3 mM, 약 0.01 mM 내지 약 2 mM, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.05 mM 내지 약 10 mM, 약 0.05 mM 내지 약 5 mM, 약 0.05 mM 내지 약 3 mM, 약 0.05 내지 약 2 mM, 또는 약 0.05 mM 내지 약 1 mM이다. 임의로, 촉매적 금속 이온의 농도는 5 mM 내지 50 mM이다. 임의로, 촉매적 금속 이온의 농도는 5 mM 내지 15 mM, 또는 약 10 mM이다.
비-촉매적 이온은 임의의 하기 반응 단계 전, 동안, 또는 후 임의의 단계에서 반응 혼합물에 첨가될 수 있다: 프라이밍된 주형 핵산 제공, 폴리머라제 제공, 2원 복합체의 형성, 뉴클레오티드 제공, 사전-화학 폐쇄된-복합체의 형성, 뉴클레오티드 혼입, 사전-전좌 폐쇄된-복합체의 형성, 및 사후-전좌 형태의 형성. 비-촉매적 이온은 세정 단계 동안 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 비-촉매적 이온은 반응 혼합물에서 반응을 통해 존재할 수 있다. 예를 들어, 촉매적 이온은, 뉴클레오티드 혼입을 허용하는, 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 비-촉매적 금속 이온을 희석시키는 농도에서 반응 혼합물에 첨가된다.
뉴클레오티드 혼입을 조정하기 위한 촉매적 및 비-촉매적 이온의 능력은, 비제한적으로, pH, 이온성 강도, 킬레이트제, 화학적 가교결합, 변형된 폴리머라제, 비-혼입가능 뉴클레오티드, 기계적 또는 진동 에너지, 및 전기장을 포함하는 반응 혼합물에서의 조건에 의존할 수 있다.
임의로, 뉴클레오티드 혼입 없이 폐쇄된-복합체 형성을 허용하는데 필요한 서열결정 반응에서 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 비-촉매적 금속 이온의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.1 mM 내지 약 40 mM, 약 0.1 mM 내지 약 30 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 내지 약 1 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 2 mM 내지 약 30 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 이들 범위 이내 임의의 농도이다.
폐쇄된-복합체는 검사 반응 혼합물로의 폴리머라제 억제제의 첨가에 의해 형성 및/또는 안정화될 수 있다. 억제제 분자 포스포노아세테이트(포스포노아세트산) 및 포스포노포르메이트(포스포노포름산, 일반 명칭 포스카르네트), 수라민, 아미노글리코시드, INDOPY-1 및 타게티톡신은 폴리머라제 활성의 미경쟁적 또는 비경쟁적 억제제의 비-제한적인 예이다. 효소의 활성 부위 주변, 억제제 분자의 결합은 뉴클레오티드 혼입 사이클의 사전-전좌 또는 사후-전좌 단계에서 폴리머라제를 포획하여, 뉴클레오티드의 혼입 전 또는 후 그것의 폐쇄된-복합체 형태로 폴리머라제를 안정화시키고, 억제제 분자가 제거, 희석 또는 킬레이트화에 의해 반응 혼합물에서 이용불가능할 때까지 주형 핵산에 폴리머라제를 강제로 결합시킨다.
따라서, 하기를 포함하는 검사 단계를 포함하는 주형 핵산 분자의 서열결정 방법이 제공된다: 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자의 제공; 폴리머라제, 폴리머라제 억제제 및 하나 이상의 미표지된 뉴클레오티드 분자를 포함하는 제1 반응 혼합물과 프라이밍된 주형 핵산 분자의 접촉; 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머로의 뉴클레오티드의 혼입 없이 미표지된 뉴클레오티드 분자의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 폴리머라제의 상호작용의 모니터링; 및 모니터링된 상호작용에 의해 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오티드의 확인. 폴리머라제 억제제는 프라이머 주형 핵산의 프라이머로의 미표지된 뉴클레오티드 분자의 혼입을 방지한다. 임의로, 억제제는 비-경쟁적 억제제, 알로스테릭 억제제, 또는 미경쟁적 알로스테릭 억제제이다. 임의로, 폴리머라제 억제제는 폴리머라제에서 촉매적 이온 결합 부위와 경쟁한다.
검출 플랫폼: 폐쇄된-복합체 검출용 계기 장비
뉴클레오티드의 존재 하에 손상된 DNA 폴리머라제와 주형 핵산 사이의 상호작용은 외인성 표지의 사용 없이 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 서열결정 반응은 주형 핵산과 폐쇄된-복합체에서 폴리머라제 결합으로 인한 첨가된 질량 또는 굴절률을 검출하는 굴절률, 형광 방출, 전하 검출, 라만 산란 검출, 타원계측법 검출, pH 검출, 크기 검출, 질량 검출, 표면 플라즈몬 공명, 유도된 방식 공명, 나노기공 광학 간섭법, 속삭임 회랑 방식 공명, 나노입자 산란, 광자 결정, 석영 결정 미량천칭, 생물-층 간섭법, 진동 검출, 압력 검출 및 다른 무표지 검출 계획에서 변화 검출에 의해 모니터링될 수 있다.
임의로, 굴절률에서 변화 검출은, 비제한적으로, 표면 플라즈몬 공명 감지, 국소화된 플라즈몬 공명 감지, 플라즈몬-광자 커플링 감지, 하위-파장 나노홀을 통한 전송 감지(향상된 광 투과), 광자 결정 감지, 간섭법 감지, 굴절 감지, 유도된 방식 공명 감지, 고리 공진기 감지, 또는 타원계측법 감지를 포함하는 수단의 하나 또는 조합에 의해 달성된다. 임의로, 핵산 분자는 표면에 국소화될 수 있고, 여기서 다양한 뉴클레오티드의 존재 하에 핵산과 폴리머라제의 상호작용은 국부 굴절률에서 변화로서 측정될 수 있다.
임의로, 주형 핵산은 표면에서 또는 그 근처에서 적절하게 국소화되거나 상기에 결박되어, 이로써 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제 및 주형 핵산의 상호작용은 표면으로부터 반사된 또는 표면을 거쳐 투과된 광을 변화시킨다. 표면은 나노구조를 함유할 수 있다. 임의로, 표면은 플라즈몬 또는 플라즈몬 공명을 지속시킬 수 있다. 임의로, 표면은, 공명 공동, 공명 고리 또는 광자 결정 슬래브에 제한되지 않는, 광자 기재이다. 임의로, 표면은 유도된 방식 공명 센서이다. 임의로, 핵산은 나노홀 어레이, 나노입자 또는 극미립자에서 또는 그 근처에서 적절하게 국소화되거나, 상기에 결박되어, 이로써 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제 및 주형 핵산의 상호작용은 극미립자 또는 나노입자와 상호작용하는 광의 흡광도, 산란, 반사 또는 공명을 변화시킨다.
임의로, 금 표면에서 나노홀 어레이는 굴절률 센서로서 사용된다. 주형 핵산은, DNA를 증폭시키기 위한 PCR 반응에서 사용된 프라이머의 하나에서 티올 기를 혼입하는, 표준 티올 화학에 의해 금속 표면에 부착될 수 있다. 나노홀 어레이의 치수가 입사광으로 적절하게 튜닝되는 경우, 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산에 대한 폴리머라제의 결합은 나노홀을 거쳐 투과된 광에서 변화로서 모니터링될 수 있다. 양쪽 표지된 및 무표지 계획에 대하여, 평형 신호 강도의 단순 및 간단한 측정은 안정한 폐쇄된-복합체의 형성을 드러낼 수 있다.
임의로, 핵산 분자는 표면 플라즈몬을 지속시킬 수 있는 표면에 국소화되고, 여기서 국소화된 핵산과 폴리머라제 상호작용에 의해 야기된 굴절률에서의 변화는 표면 플라즈몬의 특성에서 변화를 통해 모니터링될 수 있고, 여기서 추가로, 표면 플라즈몬의 상기 특성은 표면 플라즈몬 공명을 포함할 수 있다. 표면 플라즈몬, 국소화된 표면 플라즈몬(LSP), 또는 표면 플라즈몬 폴라리톤(SPP)은 표면 전하의 플라즈마 진동에 전자기파의 커플링에서 발생한다. LSP는 나노입자 표면에 국한되고, 반면에 SPP는, 높은 전자 이동도 표면과 유전 매질 사이 계면에서, 높은 전자 밀도 표면에 국한된다. 표면 플라즈몬은 계면의 방향을 따라 전파할 수 있고, 반면에 이들은 감쇠 방식으로만 유전 매질에 침투한다. 입사 전자기 방사선의 빈도가 표면 전자의 진동의 천연 빈도를 매칭시키는 경우 표면 플라즈몬 공명 조건은 확립된다. 예를 들어, 결합 또는 분자 크라우딩으로 인해, 계면에서 유전체 특성에서의 변화는 표면 전자의 진동에 영향을 주어서, 그렇게 함으로써 표면 플라즈몬 공명 파장을 변경시킨다. 표면 플라즈몬 공명을 할 수 있는 표면은, 비-제한 방식으로, 나노입자, 나노입자의 클러스터 및 응집물, 연속 평면 표면, 나노구조화된 표면, 및 미세구조화된 표면을 포함한다. 물질 예컨대 금, 은, 알루미늄, 고전도도 산화금속(예를 들어, 인듐 주석 옥사이드, 산화아연, 산화텅스텐)은 그것의 표면에서 표면 플라즈몬 공명을 지지할 수 있다.
임의로, 단일 핵산 분자, 또는 핵산의 다중 클론 카피는 나노입자에 부착되어, 이로써 핵산에 대한 폴리머라제의 결합은 국소화된 표면 플라즈몬 공명(LSPR)에서 시프트를 야기한다. 나노입자에서 광 입사는 그들 내 전도 전자를 유도시켜 나노입자 크기, 형상 및 조성물에 의존하는 공명 빈도로 집합적으로 진동시킨다. 관심의 나노입자는, 구형 나노입자, 나노막대, 나노피라미드, 나노다이아몬드, 및 나노디스크를 포함하는, 상이한 형상을 추정할 수 있다. 이들 LSPR 방식의 결과로서, 나노입자는 단일 나노입자가 암시야(광학 산란) 현미경검사를 사용하여 눈으로 쉽게 관측되도록 강렬하게 광을 흡수 및 산란시킨다. 예를 들어, 단일 80-nm 은 나노구형체는, 플루오레신 분자의 형광 단면보다 백만-배 더 큰, 그리고 자가-캔칭 한계에 플루오레신으로 채워진 유사한 크기의 나노구형체의 단면보다 천배 더 큰, 3 x 10-2 m2의 산란 단면으로 445-nm 청색 광을 산란시킨다. 임의로, 나노입자는 가시 스펙트럼에서 어디서든 산란 피크를 가진 초고-밝기, 나노크기의 광학 산란기로서 구성된 플라즈몬-공명 입자이다. 플라즈몬-공명 입자는 이들이 표백하지 않음에 따라 유리하다. 임의로, 플라즈몬-공명 입자는 제조되고, 주형 핵산으로 코팅되고, 폴리머라제 및 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물에서 제공되고, 여기서 폴리머라제-주형 핵산-입자 상호작용이 검출된다. 하나 이상의 상기 언급된 단계는, 이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입되는 문헌[Schultz et al., PNAS 97:996-1001 (2000)]에 개시된 하나 이상의 방법에 기반될 수 있거나 상기에서 유래될 수 있다.
공명 파장에서 매우 큰 소광 계수는 귀-금속 나노입자를 표면하 상호작용에 대하여 극도로 강렬한 표지로서 작용하도록 할 수 있다. 임의로, 나노입자-국소화된 DNA와 폴리머라제 상호작용은 공명 파장에서 시프트를 초래한다. 결합 또는 결합 상호작용으로 인한 공명 파장에서 변화는 많은 방식 중 하나에서 측정될 수 있다. 임의로, 조명은 최대 산란이 이미지형성 디바이스에서 관측되는 파장을 확인하기 위해 파장의 범위를 거쳐 스캐닝된다. 임의로, 광대역 조명은 이미지형성 디바이스 근처 분산 소자와 함께 이용되어서, 이로써 공명 피크는 분광적으로 확인된다. 임의로, 나노입자 시스템은 그것의 공명 파장에서, 또는 그것의 공명 파장 근처에서 조명될 수 있고, 임의의 결합 상호작용은 신규한 공명 파장이 조명 파장에서 벗어남에 따라 산란된 광의 강도에서 하락으로서 관측될 수 있다. 조명 파장의 위치결정에 의존하여, 상호작용은 공명 피크가 조명 파장을 향하여 이동함에 따라 나노입자 산란에서 증가로서 심지어 나타날 수 있다. 임의로, DNA-부착된-나노입자는 표면에 국소화될 수 있거나, 다르게는, DNA-부착된-나노입자는 용액에 현탁될 수 있다. 나노입자를 이용하는 생물감지의 포괄적인 검토는, 이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입되는 문헌[Anker et al., Nature Materials 7: 442-453 (2008)]에 기재된다.
임의로, LSPR을 할 수 있는 나노-특징은 평면 기재에서 리쏘그래프로 패턴화된다. 나노-특징의 2차원 패턴화는 다수의 상이한 핵산 분자의 다중화 및 고-처리량 분석에서 이점을 갖는다. 임의로, 금 나노포스트는, 핵산이 나노포스트에 부착되는, 폴리머라제-주형 핵산 상호작용의 표면 플라즈몬 공명 이미지형성 검출용 기재이다. 나노구조 크기 및 기간은, 임의로, 대조군 필름에 비교된 경우 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8-배 또는 더 높은 신호 증폭을 제공하는, 표면 플라즈몬 공명 신호 향상에 영향을 미칠 수 있다.
임의로, 표면 플라즈몬 공명은 평면 표면에서 지속될 수 있다. 크레츠만 배치형태(예를 들어, Biacore, Uppsala, Sweden) 및 표면 플라즈몬 공명 이미지형성(예를 들어, GWC Technologies; Madison, WI; 또는 Horiba; Kyoto, Japan)에 기반된 수많은 상업적 기기가 이용가능하고, 단일 스팟으로서 그리고 다중화된 어레이 패턴에서, 그것의 표면에 DNA 부착을 위하여 잘 확립된 프로토콜을 갖는다. 크레츠만 배치형태에서, 금속 필름, 전형적으로 금은 프리즘의 양상에서 증발되고 입사 방사선은 표면 플라즈몬을 여기시키기 위한 각에서 개시된다. 감쇠파는, 금 필름 근처 표면하 및 표면 상호작용을 모니터링하는데 사용될 수 있는, 다른 양상에서 플라즈몬을 여기시키는 금속 필름을 통해 투과한다. 공명 각에서, 프리즘-금 계면으로부터 반사된 광은 심하게 약화된다. 고정된 파장 조명을 추정하여, 결합 상호작용은 공명 각에 가까운 고정된 각에서 반사광의 양쪽 강도 모니터링에 의해, 뿐만 아니라 표면 플라즈몬 공명 조건(최소 반사율)을 확립시키기 위해 요구된 입사각에서 변화 모니터링에 의해 검사될 수 있다. 2D 이미지형성 디바이스, 예컨대 CCD 또는 CMOS 카메라가 반사광을 모니터링하는데 이용되는 경우, 전체 조명 영역은 고해상도로 이미지화될 수 있다. 이 방법은 표면 플라즈몬 공명 이미지형성(SPRi)으로 명명된다. 동시에 표면에서 독립적인 영역의 고처리량 분석을 허용한다. 광대역 조명은 또한, 고정된 각 배치형태에서 사용될 수 있고, 여기서 표면 플라즈몬 공명에 커플링되는 파장은 반사된 스펙트럼에서 감소를 찾음으로써 분광적으로 확인된다. 표면 상호작용은 공명 파장에서 시프트를 통해 모니터링된다.
표면 플라즈몬 공명은 모니터링 단백질-핵산 상호작용에 대하여 널리-확립된 방법이고, 핵산 부착에 대하여 뿐만 아니라 데이터 분석에 대하여 많은 표준 프로토콜이 실재한다. 문헌으로부터 실례가 되는 참조는 하기를 포함한다: 문헌[Cho et al., "Binding Kinetics of DNA-Protein Interaction Using Surface Plasmon Resonance," Protocol Exchange, May 22, 2013; 및 Brockman et al., "A Multistep Chemical Modification Procedure To Create DNA Arrays on Gold Surfaces for the Study of Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance Imaging," Journal of the American Chemical Society 121: 8044-51 (1999)], 둘 다 이들의 전체내용은 본원에 참고로 혼입됨).
폴리머라제/핵산 상호작용은 국소화된 표면 플라즈몬을 지속할 수 있는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다. 임의로, 폴리머라제/핵산 상호작용은 표면 플라즈몬 폴라리톤을 지속할 수 있는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다.
임의로, 폴리머라제/핵산 상호작용은 국소화된 표면 플라즈몬을 지속할 수 있는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다. 임의로, 폴리머라제/핵산 상호작용은 표면 플라즈몬 폴라리톤을 지속할 수 있는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다.
임의로, 나노홀 어레이를 통한 특이 광 투과(EOT)는 핵산/폴리머라제 상호작용을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 플라즈몬성 금속 필름에서 하위파장 나노홀을 거쳐 투과된 광은 고전적 전자기 이론으로부터 기대된 것보다 더 높다. 이 향상된 광 투과는 입사 방사선에 플라즈몬성 공명 커플링을 고려함으로써 설명될 수 있고, 그것에 의하여 공명 파장에서, 광의 기대된 분획보다 더 큰 것이 금속 나노홀을 거쳐 투과된다. 향상된 광 투과는 나노홀의 치수 및 피치, 금속의 특성, 뿐만 아니라 나노홀을 보유하는 금속 필름의 어느 한쪽에서 매체의 유전체 특성에 의존적이다. 바이오센서의 문맥에서, 금속 나노홀 어레이의 투과성은 금속 필름을 접촉하는 매체의 굴절률에 의존하고, 그것에 의하여, 예를 들어, 금속 표면에 부착된 핵산과 폴리머라제의 상호작용은 나노홀 어레이를 거쳐 투과된 광의 강도에서의 변화로서 모니터링될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명의 EOT/플라즈몬성 나노홀 어레이 접근법을 이용하는 경우 계기 장비 및 정렬 요건은 고 압축 광학 및 이미지형성 요소를 사용하여 이용될 수 있다. 저전력 LED 조명 및 CMOS 또는 CCD 카메라는 강력한 EOT 플라즈몬성 센서를 이행하기 위해 충분할 수 있다. 예시적인 나노홀 어레이-기반 표면 플라즈몬 공명 감지 디바이스는 문헌[Escobedo et al., "Integrated Nanohole Array Surface Plasmon Resonance Sensing Device Using a Dual­Wavelength Source," Journal of Micromechanics and Microengineering 21: 115001 (2011)](이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입됨)에 기재된다.
플라즈몬성 나노홀 어레이는 유리 표면에서 침착된(50 nm 초과 두께) 금의 임의로 불투명한 층에서 패턴화될 수 있다. 임의로, 플라즈몬성 나노홀 어레이는 알루미늄의 임의로 두꺼운 필름으로 패턴화될 수 있거나 유리상에 침착될 수 있다. 임의로, 나노홀 어레이는 저 굴절률 플라스틱에서 침착된 임의로 두꺼운 금속 층에서 패턴화된다. 저 굴절률 플라스틱에서 플라즈몬성 나노홀 어레이 패턴화는 금속 층의 2개의 양상에서 굴절률의 더 나은 매칭에 의해 굴절률 변화에 대한 디바이스의 감수성을 향상시킨다. 임의로, 나노홀 어레이의 굴절률 감수성은 홀 사이 거리 증가에 의해 증가된다. 임의로, 나노홀 어레이는 복제에 의해, 예를 들어, 엠보싱, 주조, 임프린트-리쏘그래피, 또는 주형-스트립핑에 의해 제작된다. 임의로, 나노홀 어레이는 콜로이드를 사용하여 자가-조립에 의해 제작된다. 임의로, 나노홀 어레이는 투사 직접 패턴화, 예컨대 레이저 간섭 리쏘그래피에 의해 제작된다.
나노-버킷 배치형태는 나노홀 배치형태보다 바람직할 수 있다. 나노홀 배치형태에서, 나노-특징의 최하부는 유리 또는 플라스틱 또는 다른 적절한 유전체이고, 반면에 나노-버킷 배치형태에서, 나노-특징의 최하부는 플라즈몬성 금속을 포함한다. 나노-버킷 어레이는 유익하게는 국부 굴절률에 투과 감수성을 유지하면서 제작하기에 상대적으로 단순하다.
임의로, 나노홀 어레이 플라즈몬성 감지는 값싼 방식으로 큰 면적 이미지형성의 무렌즈 홀로그램 이미지형성과 조합된다. 임의로, 플라즈몬성 생물감지 플랫폼은, 표면에서 분자 결합 사건에 의해 조절되는, 나노홀 어레이를 가진 플라즈몬성 칩, 칩을 조명하도록 구성된 광-방출 다이오드 공급원, 및 나노홀의 회절 패턴을 기록하기 위한 CMOS 이미저 칩을 포함한다. 결합 사건은 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제와 주형 핵산 사이 폐쇄된-복합체의 형성일 수 있다.
표면 플라즈몬 공명 감지를 위하여 (핵산 부착용) 표면을 기능화하는 방법은 양쪽 감지 계획이 핵산이 부착될 필요가 있는 유사한 금속 표면을 사용함에 따라 EOT 나노홀 어레이에 직접적으로 적용될 수 있다.
임의로, 폴리머라제/핵산 상호작용과 관련된 굴절률 변화는 플라즈몬을 지지하지 않는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다. 임의로, 유도된 방식 공명은 폴리머라제/핵산 상호작용을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 유도된-방식 공명 또는 도파관-방식 공명은 광학 도파관의 유도된 방식이 위상-매칭 요소, 예컨대 회절 격자 또는 프리즘의 도입에 의해 여기 및 동시에 추출될 수 있는 현상이다. 그와 같이 유도된 방식은 또한, 이들이 1차원 및 2차원 광자 결정 슬래브에서 관측되지 않았고 유도된 채 남아있지 않기 때문에 "누설 방식"으로 명명된다. 유도된 방식 공명은 서로의 최상부에서 또는 이에 인접하여 배치된 2개의 광학 구조화된 것의 도파관 방식에 회절된 방식의 커플링으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 광학 도파관의 최상부에서 배치된 회절 격자를 위하여, 회절된 방식의 하나는 광학 도파관의 유도된 방식에 정확히 커플링할 수 있어서, 도파관을 따라 그 방식의 전파를 초래한다. 오프-공명 조건을 위하여, 광은 도파관 속에 커플링되지 않고, 따라서 그 구조는 (유전체 도파관이 사용되면) 완전히 투명하게 나타날 수 있다. 공명에서, 공명 파장은 도파관 속에 강하게 커플링되고 격자-도파관 계면으로부터 하류 요소에 의존하여 구조 밖으로 커플링될 수 있다. 격자 커플러가 도파관의 전체 표면에 대해 연장되는 사례에서, 내부 커플링된 임의의 광이 다음 격자 요소에서 외부 커플링됨에 따라, 광은 유도될 수 없다. 따라서, 격자 도파관 구조에서, 공명은 강한 반사 피크로서 관측되고, 반면에 구조는 오프-공명 조건에 투명하다. 공명 조건은 각, 격자 특성, 분극화 및 입사광의 파장에 의존적이다. 유도된 방식 전파가, 예를 들어 도파관의 전체 표면에 격자 커플로 인해 존재하지 않는 사례를 위하여, 공명 방식은 또한, 도파관 층으로부터 횡방향으로 방사선의 감쇠 전파 및 강한 광 밀폐의 면에서, 누설-방식 공명으로 명명될 수 있다. 예를 들어 생물분자의 결합으로 인해, 격자 근처 유전체 특성에서 변화가 도파관 속에 커플링에 영향을 주고, 그렇게 함으로써 공명 조건을 변경시킨다. 임의로, 핵산 분자가 격자 도파관 구조의 표면에 부착되는 경우, 폴리머라제/핵산 상호작용은 누설 방식 공명의 파장에서 변화로서 모니터링될 수 있다.
회절 요소는 도파관 요소에 대하여 명백한 필요 없이 투명 기재에서 직접적으로 사용될 수 있다. 격자 나노구조 근처에서 상호작용으로 인한 공명 조건에서 변화는 반사된 또는 투과된 방사선에서 공명 파장 시프트로서 모니터링될 수 있다.
핵산 부착된 유도된 방식 공명 센서로부터 반사광은 폴리머라제/핵산 상호작용을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 광대역 조명 공급원은 조명을 위하여 이용될 수 있고, 반사광의 분광 검사는 폴리머라제 결합으로 인한 국부 굴절률에서 변화를 드러낼 수 있다.
임의로, 광대역 조명이 사용될 수 있고 투과된 광은 폴리머라제 상호작용으로 인해 공명 시프트를 확인하기 위해 검사될 수 있다. 선형으로 극성화된 협대역 조명이 사용될 수 있고, 투과된 광은 교차-편광자를 통해 여과될 수 있고; 여기서 투과된 광은 분극화가 변형되는 누설 방식 반응을 제외하고 교차된 편광자로 인해 완전히 약화된다. 이 실행은 굴절률 모니터링을 값싼 이미지형성 시스템에서 모니터링될 수 있는 단순 투과 검정으로 전환시킨다. 공개된 자료는 광학 성분의 어셈블리를 기재한다(문헌[Nazirizadeh et al., "Low-Cost Label-Free Biosensors Using Photonic Crystals Embedded between Crossed Polarizers," Optics Express 18: 19120-19128 (2010)](이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입됨) 참고).
나노구조화된 표면에 더하여, 평평한, 미구조화된 표면은 또한 유익하게는 굴절률 조절 모니터링을 위하여 사용될 수 있다. 임의로, 간섭법은 미-구조화된, 임의로 투명 기재에 결합된 핵산과 폴리머라제의 상호작용을 모니터링하는데 이용될 수 있다. 핵산 분자는 당해 분야에서 공지된 임의의 수단에 의해 유리 슬라이드의 최상부 표면, 및 유리 슬라이드의 최하부 표면으로부터 조명된 시스템에 부착될 수 있다. 이 배치형태에서 2개의 반사 표면, 유리 슬라이드의 최하부 표면으로부터 하나의 반사, 및 그것에 부착된 핵산 분자를 갖는 최상부 표면으로부터 다른 것이 있다. 2개의 반사파는, 결합된 핵산 분자로 인해 유전 상수에서 변화에 의해(그리고 후속적으로 결합된 핵산 분자와 폴리머라제의 상호작용에 의해) 조절된 최상부 표면으로부터 반사된 파로, 경로 길이 차이에 기반된 보강 또는 상쇄 간섭을 야기하는 서로를 방해할 수 있다. 변함없는 최하부 표면으로부터 반사로, 핵산 분자에 임의의 결합은, 관측되는 간섭 패턴에 차례로 영향을 주는, 최상부 및 최하부 표면으로부터 반사되는 빔 사이의 위상차에서 반사될 수 있다. 임의로, 생물-층 간섭법은 핵산/폴리머라제 상호작용을 모니터링하는데 사용된다. 생물-층 간섭법은 상업적 디바이스, 예컨대 Pall Forte Bio corporation(Menlo Park, CA)에 의해 판매된 것에서 수행될 수 있다.
임의로, 최상부 표면으로부터의 반사광은 초점조정 광학 사용에 의해 선택적으로 선택된다. 최하부 표면으로부터 반사광은 초점면에 없기 때문에 무시된다. 핵산-부착된 최상부 표면에서만의 초점조정으로, 초점조정 렌즈에 의해 수집된 광은, 부분적으로 반사된 입사 방사선에 상응하는, 평면파 및, 초점면에서 분자에 의해 수집 방향에서 산란된 방사선에 상응하는, 산란파를 포함한다. 이들 2개의 성분은 입사 방사선이 간섭성이면 방해하도록 될 수 있다. 이 산란 기반 간섭계 검출은 극도로 감수성이고 단일 단백질 분자를 검출하는데 사용될 수 있다.
임의로, 전계효과 트랜지스터(FET)는 폐쇄된-복합체의 검출용 바이오센서로서 구성된다. FET의 게이트 말단은 주형 핵산의 첨가에 의해 변형된다. 충전된 태그를 포함하는 폴리머라제의 결합은 전기화학적 신호에서 변화를 초래한다. 주형 핵산에 다음 정확한 뉴클레오티드와 폴리머라제의 결합은 다른 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산에 대한 폴리머라제 결합과 상이한 신호를 제공하고, 여기에서 각각의 부정확한 뉴클레오티드는 또한 상이한 신호를 제공할 수 있다. 임의로, 주형 핵산과 폴리머라제 상호작용은 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 또는 뉴클레오티드에서 외인성 표지의 사용 없이 FET를 사용하여 모니터링된다. 임의로, 혼입 반응 동안 H+ 이온의 방출로 인해 발생하는 pH 변화는 FET를 사용하여 검출된다. 임의로, 폴리머라제는 FET에 의해 검출되는 연속 H+ 이온을 생성하는 태그를 포함한다. 임의로, 연속 H+ 이온 생성 태그는 ATP 합성효소이다. 임의로, 연속 H+ 이온 생성 태그는 팔라듐, 구리 또는 또 다른 촉매이다. 임의로, 뉴클레오티드 혼입후 PPi의 방출은 FET를 사용하여 검출된다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 하나의 유형은 한번에 반응에 제공될 수 있다. 일단 다음 정확한 뉴클레오티드가 첨가되고 조건이 혼입을 허용하면, PPi는 FET를 사용하여 절단, 방출, 및 검출되고, 따라서 다음 정확한 뉴클레오티드 및 다음 염기를 확인한다. 임의로, 주형 핵산은 나노튜브의 벽에 결합된다. 임의로, 폴리머라제는 나노튜브의 벽에 결합된다. FET는 그것의 작은 크기 및 낮은 중량으로 인해 서열결정 센서로서 사용에 유리하여, 휴대용 서열결정 모니터링 성분으로서 사용에 적절하게 만든다. 분자 상호작용의 FET 검출의 세부사항은, 이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입되는, 문헌[Kim et al., "An FET-Type Charge Sensor for Highly Sensitive Detection of DNA Sequence", Biosensors and Bioelectronics, Microsensors and Microsystems 20: 69-74 (2004), doi:10.1016/j.bios.2004.01.025]; 및 문헌[Star et al., "Electronic Detection of Specific Protein Binding Using Nanotube FET Devices", Nano Letters 3: 459-63 (2003), doi:10.1021/nl0340172]에 기재된다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 형광성 태그를 포함한다. 높은 신호-대-잡음과 폴리머라제-핵산 상호작용을 모니터링하기 위해, 감쇠 조명 또는 공초점 이미지형성이 이용될 수 있다. 국소화된 주형 핵산에서 폐쇄된-복합체의 형성은, 예를 들어, 배경과 비교된 증가된 형광으로서 관측될 수 있고, 반면에 일부 사례에서 또한 국부 극성 환경에서 켄칭 또는 변화로 인해 감소된 형광으로서 관측될 수 있다. 임의로, 폴리머라제 분자의 분획은 형광단으로 태깅될 수 있는 한편 또 다른 분획은 동일한 반응 혼합물에서 켄쳐와 태깅될 수 있고; 여기서, 핵산의 국소화된, 클론 모집단에서 폐쇄된-복합체의 형성은 배경과 비교하여 형광에서의 감소로서 드러난다. 핵산의 클론 모집단은 지지체 표면, 예컨대 평면 기재, 극미립자, 또는 나노입자에 부착될 수 있다. 임의로, 폴리머라제는 형광단, 발광단, 화학발광단, 발색단, 또는 생물발광단으로 태깅된다. 프라이밍된 주형 핵산 분자, 동족 뉴클레오티드, 및 형광적으로 태깅된 또는 표지된 폴리머라제를 포함하는 3원 복합체는 폴리머라제에 부착된 형광성 표지 모이어티 검출에 의해 검출 또는 모니터링될 수 있다.
임의로, 다수의 주형 핵산은 표면에 결박되고 하나(또는 초과)의 dNTP는 순차적으로 유동된다. 친화도의 스펙트럼은 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성, 및 이에 따라 주형 핵산에서 다음 염기를 드러낸다. 임의로, 친화도는 반응 혼합물 조건(즉, 세정 단계)의 제거 및 대체에 대한 필요 없이 측정된다. 결합 상호작용의 측정된 강도의 자가상관관계는, 예를 들어, 핵산 서열의 동력학을 쉽게 드러낼 수 있다. 임의로, 검사는 뉴클레오티드의 존재 하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 폴리머라제의 친화도 모니터링을 포함한다. 임의로, 폴리머라제는 일시적으로 핵산과 결합하고 결합 동력학 및 친화도는 주형 핵산에서 다음 염기의 동일성에 대하여 정보를 제공한다. 임의로, 폐쇄된-복합체가 형성되고, 여기서 폐쇄된-복합체의 형성에 관여된 반응 조건이 핵산에서 다음 염기에 대하여 정보를 제공한다. 임의로, 폴리머라제는 그것의 상호작용에서 중합 부위에 포획되고, 따라서 오프-레이트를 측정하는 세정 단계 요구 없이 친화도를 드러낸다.
손상된 DNA 폴리머라제와 핵산 사이 동적 상호작용을 측정할 수 있는 임의의 기술은 본 명세서에서 개시된 서열결정 반응 방법을 가능하게 하는데 그리고 친화도를 측정하는데 사용될 수 있다.
뉴클레오티드-특이적 3원 복합체 형성 검출용 시스템
제공된 방법은 플랫폼을 이용하여 수행될 수 있고, 여기에서 핵산 중합 반응의 임의의 성분은 표면에 국소화된다. 임의로, 주형 핵산은 평면 기재, 나노홀 어레이, 극미립자, 또는 나노입자에 부착된다. 임의로, 모든 반응 성분은 반응 혼합물에 자유롭게 현탁되고, 고체 지지체 기재에 고정되지 않는다.
임의로, 주형 핵산은 표면에 고정된다. 표면은 평면 기재, 하이드로겔, 나노홀 어레이, 극미립자, 또는 나노입자일 수 있다. 임의로, 반응 혼합물은 다수의 클론으로 증폭된 주형 핵산 분자를 함유한다. 임의로, 반응 혼합물은 다수의 구별할 수 있는 주형 핵산을 함유한다.
특히, 비제한적으로, 폴리머라제 도메인의 가교결합, 핵산에 대한 폴리머라제의 가교결합, 작은 분자에 의한 알로스테릭 억제, 미경쟁적 억제제, 경쟁적 억제제, 비-경쟁적 억제제, 및 변성을 포함하는 수단의 하나 또는 조합에 의해 주형 폐쇄된-복합체에서 다음 염기를 확인하기 위해 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호작용의 검사를 포함하는 서열결정 반응 수행용 시스템이 본 명세서에서 제공되고; 여기서 포획된 폴리머라제 복합체의 형성은 핵산 주형에서 다음 염기의 동일성에 대하여 정보를 제공한다.
본 명세서에서 개시된 임의의 서열결정 방법의 하나 이상의 단계 수행용 시스템이 또한 제공된다. 임의로, 시스템은 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제 및 주형 핵산 결합 검정을 수행하는데 필요한 성분 및 시약을 포함하고, 여기서 주형 핵산은 나노구조에서 제공된다. 임의로, 시스템은 나노구조 상에 주형 DNA 분자를 결합시키는데 필요한 지침 및 하나 이상의 시약을 포함한다. 예를 들어, 시스템은, 결합 동력학을 결정하기 위해 표면 플라즈몬 공명으로 사용을 위하여 구성된, 나노구조, 예컨대 칩을 제공한다. 그와 같은 칩의 예는 CM5 센서 S 칩(GE Healthcare; Piscatawany, N.J)이다. 시스템은 계기 장비, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기기를 제공할 수 있다. 시스템은 스트렙타비딘 및/또는 바이오틴을 제공할 수 있다. 임의로, 시스템은 바이오틴화된 주형 DNA의 제조를 위하여 바이오틴-DNA, DNA 리가제, 완충제, 및/또는 DNA 폴리머라제를 제공한다. 임의로, 시스템은 바이오틴화된 DNA 정제용 겔 또는 시약(예를 들어, 페놀:클로로포름)을 제공한다. 다르게는, 시스템은 바이오틴화된 주형 DNA 특성규명, 예를 들어, 질량 분광분석법 또는 HPLC용 시약을 제공한다. 임의로, 시스템은 스트렙타비딘, 칩, 시약, 계기 장비, 및/또는 칩에서 스트렙타비딘의 고정용 지침을 포함한다. 임의로, 칩은 주형 DNA 코팅을 위하여 이미 구성된 시스템에서 제공되고, 여기서 칩은 주형 핵산 또는 변형된 주형 핵산(예를 들어, 바이오틴화된 주형 DNA)을 결합시킬 수 있는 시약으로 고정된다. 임의로, 시스템은 칩 재생용 시약을 제공한다.
본 명세서에서 개시된 임의의 서열결정 방법의 하나 이상의 단계 수행용 시스템이 또한 제공된다. 임의로, 시스템은 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제 및 주형 핵산 결합 검정을 수행하는데 필요한 성분 및 시약을 포함하고, 여기서 주형 핵산은 나노입자에서 제공된다. 임의로, 시스템은 나노입자상에 주형 DNA 분자를 결합시키는데 필요한 지침 및 하나 이상의 시약을 포함한다. 나노입자는, 예를 들어, 금 나노입자를 사용함으로써, 핵산-폴리머라제 상호작용의 전기화학적 검출을 위하여 구성될 수 있다. 임의로, DNA-나노입자 콘주게이트는, 예를 들어, 그것의 단부에서 유리 티올 또는 다이설파이드 기를 포함하는 주형 DNA 분자와 수성 금 콜로이드 용액 사이 형성된다. 콘주게이트는 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 임의로, 나노입자 콘주게이트는 고온(예를 들어, 60℃ 초과) 및 높은 이온성 강도(예를 들어, 1M Na+)에서 응집 및 침전에 대해 안정화된다. 임의로, 시스템은, 다이설파이드 또는 티올과 주형 DNA 분자 생성을 포함하는, 나노입자 부착을 위하여 주형 DNA 분자 제조용 시약을 제공한다. 다이설파이드-함유 주형 핵산은, 예를 들어, 3'-티올 개질제 제어된-기공 유리(CPG)를 사용하여 또는 보편적인 지지체 CPG로 시작 및 서열에서 제1 모노머로서 다이설파이드 개질제 포스포르아미다이트 첨가에 의해 합성될 수 있다. 시스템은 다이설파이드-변형된 주형 핵산 수득용 지침 및/또는 핵산 합성 시약을 제공할 수 있다. 티올-함유 주형 핵산은 또한 5'-트리틸티올 개질제 포스포르아미다이트와 핵산 합성 동안 생성될 수 있다. 시스템은, 예를 들어, 전기영동 또는 원심분리를 사용하여 나노입자 콘주게이트 정제용 시약 및/또는 지침을 제공할 수 있다. 임의로, 나노입자 콘주게이트는 폴리머라제-주형 핵산 상호작용을 비색계로 모니터링하는데 사용된다. 이 사례에서, 나노입자 콘주게이트의 용융 온도는 강한 폴리머라제 결합의 존재 하에 증가한다. 따라서, DNA 결합의 강도는, 색상 변화에 의해 관측가능한, 이 용융 전이에서 변화에 의해 결정될 수 있다. 시스템은 임의로 용융 전이의 검출용 시약 및 설비를 포함한다.
본 명세서에서 개시된 임의의 서열결정 방법의 하나 이상의 단계 수행용 시스템이 또한 제공된다. 임의로, 시스템은, 검출가능한 폴리머라제를 이용하여, 뉴클레오티드의 존재 하에 폴리머라제 및 주형 핵산 결합 검정 수행에 필요한 성분 및 시약을 포함한다. 임의로, 폴리머라제는 검출가능하게 표지된다. 임의로, 폴리머라제는 폴리머라제, 예를 들어, 방향족 아미노산의 고유 특성을 사용하여 검출된다. 임의로, 시스템에서 존재하는 폴리머라제 및 주형 핵산은, 지지체에 콘주게이션 없이, 용액에서 사용하기 위하여 구성된다. 폴리머라제에서 검출가능한 표지는 형광단일 수 있고, 여기서 형광은 폴리머라제-주형 핵산 결합 사건을 모니터링하는데 사용된다. 임의로, 검출가능한 폴리머라제는 용액내 주형 핵산, 또는 지지체 구조에 콘주게이션된 주형 핵산과 조합으로 사용될 수 있다. 임의로, 폴리머라제의 하나 이상의 시스테인 잔기는 Cy3-말레이미드로 표지된다. 임의로, 시스템은 형광적으로 표지된 폴리머라제 분자를 제조하는데 필요한 시약 및/또는 지침을 포함한다. 시스템은 형광적으로 표지된 폴리머라제의 정제용 시약 및/또는 지침을 포함할 수 있다.
방법의 절차적 특징
검사 단계 이후, 다음 염기의 동일성이 폐쇄된-복합체의 형성을 통해 확인된 경우, 반응 조건은, 선택적인 혼입 단계 또는 추가의 검사 단계의 제조에서, 적절한 경우 재설정, 재충전, 또는 변형될 수 있다. 임의로, 다음 염기의 동일성은 뉴클레오티드의 화학적으로 혼입 없이 확인되었다. 임의로, 다음 염기의 동일성은 뉴클레오티드의 화학적 혼입으로 확인되고, 여기서 후속 뉴클레오티드 혼입은 억제되었다. 임의로, 서열결정되는 주형 핵산을 배제하는, 검사 단계의 모든 성분은 제거되거나 세정되어서, 사전-검사 조건으로 시스템을 되돌린다. 임의로, 검사 단계의 부분적인 성분은 제거된다. 임의로, 추가의 성분은 검사 단계에 첨가된다.
임의로, 가역적 종결자 뉴클레오티드는 하나를 확인하기 위해 혼입 단계에서 사용되고, 단 하나의 뉴클레오티드는 사이클마다 혼입된다. 표지는 염기 동일성이 검사 단계로부터 공지됨에 따라 가역적 종결자 뉴클레오티드에서 요구되지 않는다. 비-형광적으로 표지된 가역적 종결자는 상업적 공급자로부터 쉽게 이용가능하다. 비-표지된 가역적 종결자 뉴클레오티드는 그것의 더 작은 입체 밑넓이로 인해 표지된 가역적 종결자와 비교하여 훨씬 더 빠른 혼입 동력학, 및 천연 뉴클레오티드와 유사한 크기를 갖는 것으로 기대된다.
서열결정 방법을 사이클링하는 시약이, 부분적으로, 본 명세서에서 개시되고, 여기서 서열결정 시약은, 검사 및/또는 혼입의 모든 사이클에 대하여, 차례로, 도입된다. 임의로, 서열결정 반응 혼합물은 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 하나 이상의 유형의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 뉴클레오티드 및/또는 폴리머라제는 서열결정 반응 혼합물에 주기적으로 도입된다. 임의로, 서열결정 반응 혼합물은 다수의 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 다수의 뉴클레오티드 및/또는 다수의 폴리머라제는 서열결정 반응 혼합물에 주기적으로 도입된다. 임의로, 서열결정 반응의 검사 단계는 서열결정 반응의 혼입 단계와 상이한 조성물을 갖는다.
임의로, 하나 이상의 뉴클레오티드는 서열결정 반응에 순차적으로 첨가되고 상기로부터 제거된다. 임의로, 1, 2, 3, 4개 또는 초과 유형의 뉴클레오티드가 반응 혼합물에 첨가되고 상기로부터 제거된다. 예를 들어, 1개 유형의 뉴클레오티드가 서열결정 반응에 첨가되고, 제거되고, 또 다른 유형의 뉴클레오티드에 의해 대체된다. 임의로, 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오티드 유형은 혼입 단계 동안 존재하는 뉴클레오티드 유형과 상이하다. 임의로, 하나의 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오티드 유형은 순차적인 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오티드 유형과 상이하다(즉, 순차적인 검사 단계는 혼입 단계에 앞서 수행된다). 임의로, 1, 2, 3, 4개 또는 초과 유형의 뉴클레오티드가 검사 반응 혼합물에서 존재하고 1, 2, 3, 4개 또는 초과 유형의 뉴클레오티드는 혼입 반응 혼합물에서 존재한다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 서열결정 반응에 주기적으로 첨가되고 상기로부터 제거된다. 하나 이상의 상이한 유형의 폴리머라제는 서열결정 반응에 주기적으로 첨가될 수 있고 상기로부터 제거될 수 있다. 임의로, 검사 단계 동안 존재하는 폴리머라제 유형은 혼입 단계 동안 존재하는 폴리머라제 유형과 상이하다. 하나의 검사 단계 동안 존재하는 폴리머라제 유형은 순차적인 검사 단계 동안 존재하는 폴리머라제 유형과 상이할 수 있다(즉, 순차적인 검사 단계는 혼입 단계에 앞서 수행된다).
임의로, 조건, 예컨대 시약의 존재, pH, 온도, 및 이온성 강도는 서열결정 반응을 통해 가변된다. 임의로, 금속은 서열결정 반응에 주기적으로 첨가되고 상기로부터 제거된다. 예를 들어, 촉매적 금속 이온은 검사 단계 동안 부재일 수 있고 혼입 단계 동안 존재할 수 있다. 다르게는, 폴리머라제 억제제는 검사 단계 동안 존재할 수 있고 혼입 단계 동안 부재할 수 있다. 임의로, 서열결정 반응 동안 소비되는 반응 성분은 서열결정 반응 동안 임의의 지점에서 신규한 성분의 첨가로 보충된다.
뉴클레오티드는, 폐쇄된-복합체 형성을 선호하는 반응 조건에, 손상된 DNA 폴리머라제와 함께, 한번에 하나의 유형으로 첨가될 수 있다. 폴리머라제는 다음 정확한 뉴클레오티드가 존재하면 주형 핵산에만 결합한다. 모든 뉴클레오티드 첨가후 세정 단계는 폐쇄된-복합체에서 관여되지 않은 모든 과잉의 폴리머라제 및 뉴클레오티드가 반응 혼합물로부터 제거되는 것을 확보한다. 뉴클레오티드가, 공지된 순서로, 한번에 하나 첨가되면, 주형 핵산에서 다음 염기는 첨가된 뉴클레오티드가 다음 정확한 뉴클레오티드인 경우 폐쇄된-복합체의 형성에 의해 결정된다. 폐쇄된-복합체는 폴리머라제-주형 핵산-뉴클레오티드 상호작용의 증가된 안정성과 형태적 변화 양쪽에 의해 확인될 수 있다. 임의로, 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 형성된 폐쇄된-복합체의 안정성은 부정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 주형 핵산과 폴리머라제의 불안정한 상호작용보다 적어도 큰 크기의 정도이다. 세정 단계의 용도는 미결합된 뉴클레오티드 및 폴리머라제가 없다는 것 및 반응에서 존재하는 뉴클레오티드만이 폴리머라제 및 주형 핵산을 가진 폐쇄된-복합체에서 격리된 것임을 확보한다. 일단 주형 핵산에서 다음 염기가 결정되면, 폐쇄된-복합체에서 격리된 다음 정확한 뉴클레오티드는 폐쇄된-복합체의 해리 또는 불안정화를 선호하는 반응 조건에서의 유동 및 하나의 염기(혼입)에 의한 주형 핵산 프라이머 가닥 연장에 의해 혼입될 수 있다. 따라서, 세정 단계는 혼입된 뉴클레오티드만이 폐쇄된-복합체로부터 다음 정확한 뉴클레오티드인 것을 확보한다. 이 시약 사이클링 방법은 반복될 수 있고 핵산 서열은 결정될 수 있다. 이 시약 사이클링 방법은 단일 주형 핵산 분자에, 또는 클론 모집단, 예컨대 PCR 생성물 또는 회전환 증폭된 DNA의 수집물에 적용될 수 있다. 많은 상이한 주형은 이들이, 예를 들어, 고체 지지체상에 배열되면 병렬적으로 서열결정될 수 있다. 임의로, 세정 단계는 2원 복합체 형성을 불안정화시킨다. 임의로, 세정은 2원 복합체가 제거되어, 반응 혼합물에서 안정화된 폐쇄된-복합체를 남겨두는 것을 확보하는 지속기간 동안 수행된다. 임의로, 세정 단계는 고 이온성 강도 또는 고 pH 용액으로 반응 세정을 포함한다.
임의로, 혼입 단계는 3 단계 공정이다. 제1 단계에서, 모두 4개의 뉴클레오티드 유형은, 폐쇄된-복합체의 형성을 선호하는 반응 조건 하에, 손상된 DNA 폴리머라제와, 프라이밍된 주형 핵산을 포함하는 반응 속에 도입되고, 다음 정확한 뉴클레오티드는 주형 핵산과 안정한 폐쇄된-복합체를 형성하게 된다. 제2 단계에서, 존재해 왔을 수 있는 손상된 DNA 폴리머라제 및 임의의 동족 뉴클레오티드는 제거되고, 제거된 성분은 그 다음 제2 폴리머라제 및 하나 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 가역적 종결자 뉴클레오티드)로 대체된다. 제3 단계에서, 동족 뉴클레오티드는 주형 핵산 프라이머의 3'-말단 속에 혼입된다. 혼입 단계에서 조밀한 폴리머라제-핵산 복합체의 형성은 표준 기술, 예컨대 폴리머라제(예를 들어, Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)으로부터 이용가능한 Phusion 폴리머라제)에 비-특이적 DNA 결합 도메인 융합, 및 정확한 뉴클레오티드가 항상 폐쇄된-복합체에서 존재한다는 것을 확보하기 위해 뉴클레오티드의 고 농도 이용에 의해 가능해질 수 있다.
폴리머라제 분자는 폴리머라제 합성 반응에 전형적으로 요구되는 2가 금속 이온의 부재 하에조차 다음 정확한 뉴클레오티드의 존재 하에 손가락-폐쇄된 형태에서 프라이밍된 주형 핵산 분자에 결합한다. 형태적 변화는 폴리머라제의 활성 부위 내에서 다음 주형 염기에 상보적인 뉴클레오티드를 포획한다. 임의로, 폐쇄된-복합체의 형성은 주형 핵산에서 다음 염기의 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 임의로, 프라이밍된 주형 핵산은 폴리머라제의 존재 하에, 촉매적 2가 금속 이온의 부재 하에 상이한 뉴클레오티드에 의해 연속으로 접촉될 수 있고; 여기서 폐쇄된-복합체의 형성은 주형 핵산과 현재 접촉하는 뉴클레오티드가 핵산에서 다음 염기에 상보적 뉴클레오티드인 것을 나타낸다. (폴리머라제의 존재 및 촉매적 금속 이온의 부재 하에) 주형 핵산과 접촉되는 뉴클레오티드의 공지된 순서는 폐쇄된-복합체 형성을 유도시키는 순서로 특정한 위치에 기반하여 상보적 뉴클레오티드의 손쉬운 확인을 확보한다. 임의로, 적절한 세정 단계는 모든 과잉의 효소 및 뉴클레오티드의 제거를 확보하기 위해 모든 뉴클레오티드 첨가후 수행될 수 있어, 활성 부위에서 다음 정확한 뉴클레오티드를 가진 폐쇄된-복합체에서 핵산에 결합되는 단지 폴리머라제 뒤에 남겨둔다. 폐쇄된-복합체는 2원 폴리머라제-핵산 복합체와 비교된 또는 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산 및 부정확한 뉴클레오티드 사이의 불안정한 상호작용과 비교된 폴리머라제/핵산/다음-정확한-뉴클레오티드 복합체의 증가된 안정성을 드러내는 수단에 의해 또는 폐쇄된 형태에서 폴리머라제의 형태적 변화를 드러내는 수단에 의해 확인될 수 있다.
임의로, 다음 상보적 뉴클레오티드의 확인 공정(검사 단계)은 뉴클레오티드의 화학적 혼입을 억제하는 조건 하에 하나의 종류의 뉴클레오티드 및 폴리머라제를 포함하는 검사 혼합물과 고정된 프라이밍된 주형 핵산의 접촉의 단계, 세정 단계에 의한 미결합된 시약의 제거의 단계, 고정된 핵산에서 폴리머라제 폐쇄된-복합체의 존재 또는 부재 검출의 단계, 및 폐쇄된-복합체 형성이 검출될 때까지 상이한 종류의 뉴클레오티드로, 연속적으로 이들 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 폐쇄된-복합체는 폴리머라제/핵산/다음-정확한-뉴클레오티드 복합체의 증가된 안정성 및 형태적 변화 양쪽에 의해 확인될 수 있다. 연속적인 뉴클레오티드 첨가 사이 세정 단계는 고 충실도로 폐쇄된-복합체의 형성을 검출할 수 있는 검출 기전의 사용, 예를 들어, 감쇠파 감지 방법 또는 폐쇄된-복합체로부터 신호를 선택적으로 모니터링하는 방법에 의해 제거될 수 있다. 상기 언급된 검사 단계는 이어서, 프라이머의 3'-말단에 폐쇄된-복합체에서 격리된 뉴클레오티드를 공유적으로 첨가시키기 위해 촉매적 금속 이온(예를 들어, Mn2 +)과 폐쇄된-복합체의 접촉을 포함하는 혼입 단계일 수 있다. 임의로, 혼입 단계는 뉴클레오티드의 화학적 혼입을 억제하는 조건 하에 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 다중 유형의 조합을 포함하는 사전-혼입 혼합물과 고정된 핵산의 접촉을 포함할 수 있고; 여기서 사전-혼입 혼합물은 고도로 효율적인 폐쇄된-복합체 형성(예를 들어, 저-염 조건)을 확보하기 위한 용액 조건 및 첨가제를 함유할 수 있다. 방법은 또한, 폴리머라제의 활성 부위 내에 격리된 뉴클레오티드를 화학적으로 혼입시키기 위해, 촉매적 금속 이온을 포함하는, 혼입 혼합물에 고정된 복합체의 제공 및 미결합된 시약을 제거하기 위한 세정 단계의 수행을 포함할 수 있다. 사전-혼입 혼합물은 고도로 효율적인 폐쇄된-복합체 형성을 확보하고, 반면에 세정 단계 및 혼입 혼합물은 프라이머의 3'-말단에 단일 뉴클레오티드의 첨가를 확보한다. 임의로, 혼입 단계는 하나의 유형의 뉴클레오티드의 첨가 검사후 직접적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 서열결정에 사용된 반복된 패턴은 하기 유동 패턴을 포함할 수 있다: (i) dATP+/폴리머라제, (ii) 세정, (iii) Mn+2, (iv) 세정, (v) dTTP+/폴리머라제, (vi) 세정, (vii) Mn+2, (viii) 세정, (ix) dCTP+/폴리머라제, (x) 세정, (xi) Mn+2, (xii) 세정, (xiii) dGTP+/폴리머라제, (xiv) 세정, (xv) Mn+2, (xvi) 세정. 임의로, 서열결정에 사용된 반복된 패턴은 하기를 포함할 수 있다: (i) dATP+/폴리머라제, (ii) 세정, (iii) dTTP+/폴리머라제, (iv) 세정, (v) dGTP+/폴리머라제, (vi) 세정, (vii) dCTP+/폴리머라제, (viii) 세정, (ix) 사전-혼입 혼합물, (x) 세정, (xi) Mn2 +, (xii) 세정. 세정 단계는 임의로 검사 단계 동안 우연한 혼입을 방지하기 위해 금속 이온 킬레이터 및 다른 작은 분자를 함유한다. 혼입 단계후, 프라이머 가닥은 전형적으로 하나의 염기에 의해 연장된다. 이 과정을 반복하여, 핵산의 순차적인 핵염기는 확인될 수 있어서, 핵산 서열을 효과적으로 결정한다. 임의로, 검사 단계는, 예를 들어, 50 mM 내지 1,500 mM 염의 조건 하에 고 염 조건에서 수행된다.
서열결정 적용을 위하여, 유체공학 및 시약 교환을 최소화 또는 일소하는 것이 유리할 수 있다. 펌프, 밸브 및 시약 컨테이너 제거는 더 작은 디바이스의 간소화한 제조를 허용할 수 있다. "올-인" 서열결정 방법이, 부분적으로, 본 명세서에서 개시되고, 여기서 차례로 시약을 도입하기 위한 필요성은, 검사 및/또는 혼입의 모든 사이클에 대하여, 제거된다. 시약은 반응에 1회만 첨가되고, 합성에-의한-서열결정은 서열결정 반응 내에 이미 봉입된 시약 조작에 의해 수행된다. 이와 같은 계획은 상이한 뉴클레오티드를 식별하기 위한 방법, 핵산의 클론 모집단을 거쳐 및/또는 상이한 핵산 분자를 거쳐 뉴클레오티드의 혼입을 동기시키기 위한 방법, 및 단 하나의 뉴클레오티드가 사이클마다 첨가되는 것을 확보하기 위한 방법을 요구한다.
임의로, 서열결정 반응 혼합물은 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 하나 이상의 유형의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 서열결정 반응 혼합물은 다수의 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 폴리머라제는 단일 폴리머라제 또는 다수의 폴리머라제를 지칭한다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 프라이밍된 주형 핵산 또는 주형 핵산은 단일 프라이밍된 주형 핵산 또는 단일 주형 핵산, 또는 다수의 프라이밍된 주형 핵산 또는 다수의 주형 핵산을 지칭한다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 뉴클레오티드는 하나의 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드를 지칭한다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 단일 뉴클레오티드는 하나의 뉴클레오티드이다. 임의로, 서열결정 반응 뉴클레오티드는, 비제한적으로, 하기 뉴클레오티드 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 및 dUTP.
임의로, 1, 2, 3, 4개 또는 초과 유형의 뉴클레오티드(예를 들어, dATP, dGTP, dCTP, dTTP)는 동시에 함께 반응 혼합물에서 존재하고, 여기서 하나의 유형의 뉴클레오티드는 다음 정확한 뉴클레오티드이다. 반응 혼합물은 추가로 하나 이상의 손상된 DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 프라이밍된 주형 핵산을 포함한다. 임의로, 주형 핵산은 주형 핵산의 클론 모집단이다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오티드는 검사 반응 조건 하에 폐쇄된-복합체를 형성한다.
제공된 방법에서, 4개 유형의 뉴클레오티드는, 이들이 4개의 뉴클레오티드의 상이한 농도로 인해 다음 정확한 뉴클레오티드이면, 주형 핵산에 폴리머라제의 확산 및 결합 시간이 각각의 4개의 뉴클레오티드에 대하여 상이한, 구별되는 상이한 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 최고 농도에서 뉴클레오티드는 빠른 시간에 주형 핵산에서 그것의 상보적 염기에 결합할 것이고, 최저 농도에서 뉴클레오티드는 더 느린 시간에 주형 핵산에서 그것의 상보적 염기에 결합할 것이고; 여기서 주형 핵산에서 상보적 염기에 결합은 폐쇄된 폐쇄된-복합체에서 다음 정확한 뉴클레오티드와 주형 핵산에 대한 폴리머라제 결합을 지칭한다. 따라서, 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성은 폐쇄된-복합체에서 주형 핵산에 대한 폴리머라제의 결합의 속도 또는 시간 모니터링에 의해 결정된다. 임의로, 4개 유형의 뉴클레오티드는 그것의 농도에 의해 식별될 수 있고, 여기서 뉴클레오티드의 상이한 농도는 핵산에 폴리머라제 결합에 대하여 측정가능하게 상이한 온-레이트를 초래한다. 임의로, 4개 유형의 뉴클레오티드는 그것의 농도에 의해 식별될 수 있고, 여기서 상이한 농도의 뉴클레오티드는 안정화된 폐쇄된-복합체의 형성을 위하여 측정가능하게 상이한 온-레이트를 초래한다.
임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 표지된다. 일부 사례에서, 폴리머라제는 표지되지 않고(즉, 외인성 표지, 예컨대 형광성 표지를 갖지 않고), 본 명세서에서 개시된 또는 당해 분야에서 공지된 임의의 무표지 검출 방법이 이용된다. 임의로, 핵산에 대한 폴리머라제의 결합은 손상된 DNA 폴리머라제의 검출가능한 특징을 통해 모니터링된다. 임의로, 안정화된 폐쇄된-복합체의 형성은 폴리머라제의 검출가능한 특징을 통해 모니터링된다. 폴리머라제의 검출가능한 특징은, 비제한적으로, 광학, 전기, 열, 비색계, 질량, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
임의로, 1, 2, 3, 4개 또는 초과의 뉴클레오티드 유형(예를 들어, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)은 1, 2, 3, 4개 또는 초과의 상이한 손상된 DNA 폴리머라제에 결박되고; 여기서 각각의 뉴클레오티드 유형은 상이한 폴리머라제에 결박되고 각각의 폴리머라제는 그것의 확인을 가능하게 하기 위해 다른 폴리머라제로부터 검출가능한 특징 또는 상이한 외인성 표지를 갖는다. 모든 결박된 뉴클레오티드 유형은 결박된 뉴클레오티드-폴리머라제를 포함하는 폐쇄된-복합체를 형성하는 서열결정 반응 혼합물과 함께 첨가될 수 있고; 폐쇄된-복합체는 폴리머라제를 확인하기 위해 모니터링되고, 그렇게 함으로써 폴리머라제가 결박되는 다음 정확한 뉴클레오티드를 확인한다. 결박은 다중-포스페이트 기 및 링커 분자를 통해 뉴클레오티드의 감마 포스페이트에서 발생할 수 있다. 그와 같은 감마-포스페이트 연결 방법은 당해 분야에서 표준이고, 여기에서 형광단은 감마 포스페이트 링커에 부착된다. 임의로, 상이한 뉴클레오티드 유형은 구별할 수 있는 외인성 표지에 의해 확인된다. 임의로, 구별할 수 있는 외인성 표지는 각각의 뉴클레오티드의 감마 포스페이트 위치에 부착된다.
임의로, 서열결정 반응 혼합물은 촉매적 금속 이온을 포함한다. 임의로, 촉매적 금속 이온은 Mn2 + 이온이다. 임의로, 촉매적 금속 이온은 일시적 방식으로 서열결정 반응에서 임의의 지점에 손상된 DNA 폴리머라제와 반응하기 위해 이용가능하다. 강력한 서열결정을 확보하기 위해, 촉매적 금속 이온은 짧은 기간 동안 이용가능하여, 혼입 단계 동안 프라이머의 3'-말단 속에 혼입되도록 주형 핵산에서 다음 염기에 상보적인 단일 뉴클레오티드를 허용한다. 이 사례에서, 다른 뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 핵산에서 다음 염기의 염기 하류에 상보적인 뉴클레오티드는 혼입되지 않는다. 임의로, 촉매적 금속 이온 마그네슘은 국소화된 UV 조명이 마그네슘을 방출시켜, 뉴클레오티드 혼입용 폴리머라제에 이용가능하게 만들도록 서열결정 반응 혼합물에서 광케이징된 복합체(예를 들어, DM-Nitrophen)로서 존재한다. 게다가, 서열결정 반응 혼합물은 EDTA를 함유할 수 있고, 여기서 마그네슘은 촉매적 뉴클레오티드 혼입후 폴리머라제 활성 부위로부터 방출되고 서열결정 반응 혼합물에서 EDTA에 의해 포착되어, 그렇게 함으로써 마그네슘이 후속 뉴클레오티드 혼입을 촉매화시킬 수 없도록 만든다.
따라서, 제공된 방법에서, 촉매적 금속 이온은 유발제에 의해 방출될 수 있는 킬레이트화된 또는 케이징된 형태로 서열결정 반응에서 존재할 수 있다. 예를 들어, 촉매적 금속 이온은 폐쇄된-복합체 다음 정확한 뉴클레오티드의 혼입을 촉매화시키고, 촉매적 금속 이온이 활성 부위로부터 방출됨에 따라, 제2 킬레이트제 또는 케이징 제제에 의해 격리되어, 금속 이온을 후속 혼입의 촉매화로부터 불가능하게 한다. 그것의 킬레이팅 또는 케이징된 복합체로부터 촉매적 금속 이온의 국소화된 방출은 국소화된 해방된 또는 비-킬레이팅 계획, 예컨대 감쇠파 조명 또는 구조화된 조명 사용에 의해 확보된다. 촉매적 금속 이온의 조절 방출은, 예를 들어, 열적 수단에 의해 발생할 수 있다. 그것의 광케이징된 복합체로부터의 촉매적 금속 이온의 조절 방출은 국한된 광학 분야에 의해, 예를 들어 감쇠 조명, 예컨대 도파관 또는 총 내부 반사 현미경검사에 의해 주형 핵산 근처에서 국소적으로 방출될 수 있다. 촉매적 금속 이온의 조절 방출은, 예를 들어, 주형 핵산의 부근 근처의 용액의 pH 변경에 의해 발생할 수 있다. 킬레이트제, 예컨대 EDTA 및 EGTA는 pH 의존적이다. 5 미만 pH에서, 2가 양이온 Mg2 + 및 Mn2 +는 EDTA에 의해 효과적으로 킬레이트화되지 않는다. 주형 핵산 근처 pH를 제어가능하게 조작하기 위한 방법은 킬레이트제로부터 촉매적 금속 이온의 조절 방출을 허용한다. 임의로, 국소 pH 변화는 핵산이 부착되는 표면에 전압을 인가함으로써 유도된다. pH 방법은 pH가 킬레이팅 범위로 역으로 되돌아가는 경우, 그것의 킬레이트화된 형태로 금속이 돌아간다는 점에서 장점을 제공한다.
핵산 서열의 확인을 위하여 폴리머라제-핵산 결합 반응이 상기 기재된다. 그러나, 핵산 서열 확인은, 메틸화 및 하이드록시메틸화를 포함하는, 핵산 변형체에 관한 정보를 포함할 수 있다. 메틸화는 주형 핵산의 시토신 염기에서 발생할 수 있다. DNA 메틸화는 유전자의 발현을 안정적으로 변경시킬 수 있다. DNA 메틸화는 또한 다양한 유형의 암, 죽상경화증, 및 노화의 발생으로 나타난다. 따라서, DNA 메틸화는 인간 질환에 대하여 후성유전적 바이오마커로서 제공할 수 있다.
임의로, 주형 핵산에서 하나 이상의 시토신 메틸화는 본 명세서에서 제공된 결합 방법에 의해 서열결정 동안 확인된다. 주형 핵산은 서열결정에 앞서 클론으로 증폭될 수 있고, 여기서 앰플리콘은 그것의 주형 핵산과 동일한 메틸화를 포함한다. 주형 핵산의 증폭은 앰플리콘 메틸화를 달성하기 위해 DNA 메틸전달효소의 사용을 포함할 수 있다. 주형 핵산 또는 증폭된 주형 핵산은 폴리머라제 및 하나 이상의 뉴클레오티드 유형을 포함하는 반응 혼합물에 제공되고, 여기서 폴리머라제와 핵산 사이의 상호작용이 모니터링된다. 임의로, 메틸화된 시토신의 존재 하에 폴리머라제와 주형 핵산 사이의 상호작용은 비변형된 시토신의 존재 하에 상호작용과 상이하다. 따라서, 폴리머라제-핵산 상호작용의 검사에 기반하여, 변형된 뉴클레오티드의 동일성은 결정된다.
임의로, 하나 이상의 검사 및/또는 혼입 단계 이후, 뉴클레오티드의 하위집합은 페이싱을 감소 또는 재설정하기 위해 첨가된다. 따라서, 방법은 핵산 분자의 주형 가닥 반대편 가닥 속에 뉴클레오티드 혼입용 효소 및 뉴클레오티드의 하위집합을 포함하는 조성물과 서열결정되는 주형 핵산 분자의 접촉의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 접촉은 핵산 분자에서 페이싱을 감소시키기 위한 조건 하에 발생할 수 있다. 임의로, 주형 핵산 분자 접촉의 단계는 혼입 단계 후 및/또는 검사 단계 후 발생한다. 임의로, 접촉은 서열결정의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 라운드 또는 초과(즉, 검사 및 혼입의 라운드) 후 발생한다. 임의로, 접촉은 서열결정의 30 내지 60 라운드 후 발생한다. 임의로, 접촉은 서열결정의 모든 라운드 후(즉, 한 세트의 검사 및 혼입 단계 후) 발생한다. 임의로, 다중 접촉 단계는 서열결정의 모든 라운드 후 발생하고, 여기서 각각의 접촉 단계는 상이한 하위집합의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 임의로, 방법은 추가로 접촉 후 하나 이상의 세정 단계를 포함한다. 임의로, 하위집합은 2 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 하위집합은 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 뉴클레오티드의 하위집합은 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는 이의 유도체 중 3개로부터 선택된다. 임의로, 3개의 뉴클레오티드는 아데노신, 시토신, 및 구아닌을 포함한다. 임의로, 3개의 뉴클레오티드는 아데노신, 시토신, 및 티민을 포함한다. 임의로, 3개의 뉴클레오티드는 시토신, 구아닌 및 티민을 포함한다. 임의로, 3개의 뉴클레오티드는 아데노신, 구아닌 및 티민을 포함한다. 임의로, 접촉의 각각의 라운드는 뉴클레오티드의 동일한 하위집합 또는 상이한 하위집합을 포함한다. 임의로, 핵산 주형의 서열결정은 모니터링되고 뉴클레오티드의 하위집합과의 접촉은 페이싱의 검출시 발생한다(또한, 예를 들어, 미국 특허 제8,236,532호(이의 전체내용이 본원에 참고로 혼입됨) 참고).
임의로, 서열결정 반응은 다수의 주형 핵산, 폴리머라제 및/또는 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 다수의 폐쇄된-복합체는 모니터링된다. 클론으로 증폭된 주형 핵산은 클론이 서열결정 동안 향상된 모니터링을 허용하기 위해 가까이 근접하여 국소화된다. 임의로, 폐쇄된-복합체의 형성은 다수의 클론으로 증폭된 주형 핵산을 거쳐 염기 연장의 동기성을 확보한다. 염기 연장의 동기성은 서열결정 사이클마다 단 하나의 염기의 첨가를 허용한다.
유전형분석 적용
개시된 손상된 DNA 폴리머라제에 대하여 예시적인 용도는, 광범위한 서열결정 필요 없이, SNP 검출 및 유전형분석 적용에 관한 것이다. 여기에서 손상된 DNA 폴리머라제는, 혼입 없이, 검사를 거치는 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대하여 다음 정확한 뉴클레오티드의 동일성 결정에 사용될 수 있다. 임의로, 절차는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 초래하기 위해 표적 핵산에 프라이머의 하이브리드화를 포함한다. 프라이밍된 주형 핵산은 그 다음 손상된 DNA 폴리머라제 및 더 많은 뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 조성물과 접촉될 수 있다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 검출가능한 표지, 예컨대 형광성 검출가능한 표지를 포함한다. 임의로, 1개 초과의 손상된 DNA 폴리머라제는, 손상된 DNA 폴리머라제의 적어도 2개가 식별가능하게 표지되는, 조성물에서 포함된다. 임의로, 조성물은 검출가능한 표지, 예컨대 검출가능한 형광성 표지를 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 조성물에서 1개 초과의 뉴클레오티드는 검출가능한 표지를 포함한다. 임의로, 조성물에서 2개의 상이한 뉴클레오티드는 각각 서로 식별될 수 있는 상이한 검출가능한 표지를 갖는다. 이의 개시내용이 본원에 참고로 혼입되는, (2017년 1월 20일 출원된) US 62/448,630에 의해 확인된 통상적으로 소유된 미국 특허출원은 본 손상된 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있는 수많은 유전형분석 절차를 제시한다.
손상된 DNA 폴리머라제를 사용하는 실례가 되는 서열결정 방법
개시된 기술에 따른 검사 반응은 임의로 Mg+2 이온의 존재 하에 수행될 수 있다. 손상된 DNA 폴리머라제가 이 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시킬 수 없다는 사실은 타협적인 일시적 결합 없이 검사 단계(즉, 혼입 없는 결합) 동안 포함될 수 있다는 것을 의미한다. 촉매적 금속 이온의 존재는 DNA 중합 반응 동안 통상적으로 중요한 차별적인 활성을 향상시킬 수 있다. 비-촉매적 이온이 또한 포함될 수 있거나 촉매적 이온 대신에 치환될 수 있는 한편, 폴리머라제-매개된 혼입을 억제하는 비-촉매적 금속 이온의 봉입체는 선택적이다.
개시된 기술을 사용하는 검사 반응은 임의로 원상태 뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 손상된 DNA 폴리머라제를 포함하는 3원 복합체의 임의의 검출 방법은 뉴클레오티드 서열결정 프로토콜에서 유용할 것이다. 굴절률에서 변화를 검출하는 광학 기술(예를 들어, 간섭법 또는 표면 플라즈몬 공명 감지)은 무표지 검출할 수 있을 것이고, 따라서 검사 단계에서 미표지된 원상태 뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제가 외인성 표지(예를 들어, 형광성 표지)를 가지면, 고체 지지체 또는 표면에서 정의된 위치(예를 들어, 평면 어레이, 또는 비드 어레이에서 유전자좌)에 국소화된 3원 복합체의 형성은 종래의 형광성 모니터링 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
손상된 폴리머라제를 사용하여 수행된 검사 반응은 임의로 외인성 표지(예를 들어, 형광성 표지)를 갖는 뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 형광성 검출 플랫폼으로 사용된 경우, 프라이밍된 주형 핵산 및 손상된 폴리머라제로 공-국재화하는 형광성 화학적 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체는 3원 복합체 형성을 나타낼 수 있다.
검사는 프라이밍된 주형 핵산을 사용하여 수행될 수 있고, 여기에서 듀플렉스의 프라이머 가닥은 포스포다이에스터 결합을 형성할 능력을 갖는 원상태 DNA 폴리머라제 및 동족 뉴클레오티드의 존재 하에 포스포다이에스터 결합의 형성에 참여하기 위해 이용가능한 자유 3' 하이드록실 모이어티를 갖는다.
서열결정 기술에 대하여 예시적인 작업 흐름은 하나 이상의 시험 뉴클레오티드(즉, 동족 뉴클레오티드 후보로서 시험될 뉴클레오티드), 및 손상된 폴리머라제와 프라이밍된 주형 핵산의 제1 접촉을 포함할 것이다. 시험 뉴클레오티드가 다음 정확한 뉴클레오티드인 사건에서, 모두 3개의 성분을 포함하는 3원 복합체가 형성될 것이다. 3원 복합체의 긍정적인 검출은 시험 뉴클레오티드가 주형 가닥을 따라 그 위치에 상보적인 염기를 갖는 동족 뉴클레오티드이다. 손상된 DNA 폴리머라제가 포스포다이에스터 결합을 촉매화시킬 수 없을 것이기 때문에, 다음 정확한 뉴클레오티드의 확인은 반드시 프라이머로의 동족 뉴클레오티드의 혼입 없이 발생할 것이다. 동족 뉴클레오티드의 혼입에 의한 프라이머의 연장은 상이한 접근법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일단 다음 정확한 뉴클레오티드를 확인하기 위해 필요한 정보가 수집되었다면, 반응 혼합물의 교환은 손상된 폴리머라제가 포스포다이에스터 결합 형성을 촉진시킬 수 있는 제2 폴리머라제로 교환되도록 영향받을 수 있다. 동족 뉴클레오티드 및 2가 양이온으로 또한 제공되면, 제2 폴리머라제는 프라이머로의 동족 뉴클레오티드의 혼입을 유효화시킬 수 있을 것이다.
개시된 기술이 성장하는 프라이머로의 동족 뉴클레오티드 혼입을 위하여 활성 DNA 중합화 효소를 요구할 것임이 이해되어야 한다.
개시된 기술의 특정 구현예에서, 동족 뉴클레오티드에 상응하는 가역적 종결자 뉴클레오티드는 일단 동족 뉴클레오티드의 동일성을 확립시키는데 필요한 정보가 수집되었다면 성장하는 프라이머로 혼입될 수 있다.
하나의 양상에서, 개시된 기술은 손상된 DNA 폴리머라제의 사용에 의존하는 절차에 의한 뉴클레오티드 확인을 특징으로 삼는다. 임의로, Mg2 + 이온은 프라이밍된 주형 핵산, 손상된 DNA 폴리머라제, 및 시험 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 검사 반응 혼합물에서 포함될 수 있다. 임의로, 프라이밍된 주형 핵산은 평면 표면 또는 비드에서 고정된 위치에 고정될 수 있다. 임의로, 검사 단계에서 사용된 시험 뉴클레오티드는 원상태 뉴클레오티드이다. 임의로, 시험 뉴클레오티드는 외인성 표지, 예컨대 형광성 표지를 포함한다. 임의로, 상이한 시험 뉴클레오티드는 서로 구별할 수 있는 상이한 외인성 표지로 표지된다. 임의로, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머는 자유 3' 하이드록실 기를 포함한다. 임의로, 손상된 DNA 폴리머라제는 외인성 표지, 예컨대 형광성 표지를 갖는다. 임의로, 일단 충분한 정보가 프라이밍된 주형 핵산, 손상된 DNA 폴리머라제, 및 뉴클레오티드를 포함하는 3원 복합체에서 존재하는 동족 뉴클레오티드를 확인하기 위해 수집되었다면, 손상된 DNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드는 (예를 들어, EDTA 및 고 이온성 강도 조건의 사용에 의해) 프라이밍된 주형 핵산으로부터 제거될 수 있고 제2 폴리머라제 및 하나 또는 또 다른 유형의 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 제2 DNA 폴리머라제는 임의로 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시킬 수 있을 것이다. 제2 DNA 폴리머라제와 함께 사용된 뉴클레오티드는 원상태 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 가역적 종결자 뉴클레오티드)일 수 있다. 임의로, 사이클링 프로토콜에서 손상된 DNA 폴리머라제 및 제2 DNA 폴리머라제 사용은 하나 이상의 뉴클레오티드의 혼입에 의한 프라이머의 연장을 허용한다. 임의로, 가역적 종결자 뉴클레오티드와 조합되는 제2 DNA 폴리머라제의 사용은 단일 뉴클레오티드로의 혼입을 제한한다. 임의로, 가역적 종결자 모이어티는 제거되어 또 다른 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 후속 혼입을 허용할 수 있다.
실시예 1은 손상된 폴리머라제가 형광적으로 표지된 뉴클레오티드로 DNA 서열결정 방법에서 사용될 수 있는 방법을 설명한다.
실시예 1
손상된 DNA 폴리머라제 및 형광성 뉴클레오티드를 사용하는 DNA 서열결정
포스포다이에스터 결합을 먼저 형성하기 위한 능력이 아닌, 동족 뉴클레오티드 결합 및 식별력 활성을 소유하는 손상된 DNA 폴리머라제가 먼저 수득된다. 유동 세포의 어레이 포멧으로 고체 지지체에서 정의된 위치에 고정된 프라이밍된 주형 핵산은 감마 포스페이트에서 형광성 모이어티로 표지된 dATP, 및 손상된 폴리머라제를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉된다. 형광 모니터링은 배경 위에서 형광 신호를 나타내지 않는다. 이것은 dATP가 다음 정확한 뉴클레오티드가 아닌 것을 나타낸다. 유동 세포 내에 제1 반응 혼합물은 감마 포스페이트에서 형광성 모이어티로 표지된 dGTP, 및 손상된 폴리머라제를 포함하는 제2 반응 혼합물에 의해 대체된다. 형광 모니터링은 배경 위 실질적인 형광을 나타낸다. 이것은 dGTP가 다음 정확한 뉴클레오티드인 것을 나타낸다. 제2 반응 혼합물은 유동 세포로부터 플러싱되고, 3'-ONH2 차단 기를 갖는 종결자 DNA 폴리머라제(New England BioLabs) 및 4개의 가역적 종결자 뉴클레오티드, 각각을 포함하는 혼입 반응 혼합물에 의해 대체된다. 그것의 염기로서 구아닌을 갖는 가역적 종결자 뉴클레오티드는 혼입된다. 임의로, 수득한 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자는 더욱 광범위한 서열 정보를 수득하기 위해 손상된 DNA 폴리머라제와 함께 뉴클레오티드 검사의 후속 라운드에서 직접적으로 사용된다. 임의로, 가역적 종결자 모이어티는 원상태 프라이머를 드러내기 위해 표준 절차에 의해 화학적으로 절단되고, 수득한 프라이밍된 주형 핵산 분자는 더욱 광범위한 서열 정보를 수득하기 위해 손상된 DNA 폴리머라제와 함께 뉴클레오티드 검사의 후속 라운드에서 사용된다.
실시예 2는 손상된 폴리머라제가 형광적으로 표지되는 경우 손상된 폴리머라제가 DNA 서열결정 방법에서 사용될 수 있는 방법을 설명한다.
실시예 2
형광적으로 표지된 손상된 DNA 폴리머라제를 사용하는 DNA 서열결정
포스포다이에스터 결합을 형성하기 위한 능력이 아닌, 동족 뉴클레오티드 결합 및 식별력 활성을 소유하는 손상된 DNA 폴리머라제가 먼저 수득된다. 손상된 DNA 폴리머라제는 표면-접근가능한 시스테인 아미노산의 작용기에서 형광성 모이어티로 표지된다. 유동 세포의 어레이 포멧으로 고체 지지체에서 정의된 위치에 고정된 프라이밍된 주형 핵산은 형광성 손상된 DNA 폴리머라제, 및 원상태 dATP를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉된다. 형광 모니터링은 배경 위 형광 신호를 나타내지 않는다. 이것은 dATP가 다음 정확한 뉴클레오티드가 아닌 것을 나타낸다. 유동 세포 내에 제1 반응 혼합물은 형광성 손상된 폴리머라제, 및 원상태 dGTP를 포함하는 제2 반응 혼합물에 의해 대체된다. 형광 모니터링은 배경 위 실질적인 형광을 나타낸다. 이것은 dGTP가 다음 정확한 뉴클레오티드인 것을 나타낸다. 제2 반응 혼합물은 유동 세포로부터 플러싱되고, 3'-ONH2 차단 기를 갖는, 종결자 DNA 폴리머라제(New England BioLabs) 및 4개의 가역적 종결자 뉴클레오티드, 각각을 포함하는 혼입 반응 혼합물에 의해 대체된다. 그것의 염기로서 구아닌을 갖는 가역적 종결자 뉴클레오티드는 혼입된다.
상기 기재된 TDE 돌연변이체 폴리머라제는 당해 분야에서 통상적인 수준의 기술을 가진 자에 익숙할 표준 기술을 사용하여 제조 및 정제되었다. 절차에서 사용된 Bst-f 단백질 골격(즉, 서열번호 1)은 위치 23에서 최적화된 시스테인(cys) 잔기, 단백질 정제를 돕기 위해 N-말단(즉, 위치 5 내지 10)에서 히스티딘-태그 서열, 및 위치 16과 17 사이의 트롬빈 절단 부위를 포함하도록 변형되었다. 원상태 Bst DNA 폴리머라제의 제1 메티오닌의 단백질 서열 변형체 상류(즉, 서열번호 1의 위치 27)의 어느 것도 Mg2 +-촉매접촉된 혼입 없이 정확한 뉴클레오티드 확인의 원하는 조합에 필수적인 것으로서 간주되지 않았다. 따라서, 이들 변형체의 봉입체는 작업 생성물에서 선택적이고, 따라서 표 1에서 제시된(즉, 임의의 서열번호 1 내지 3의 모 스캐폴드를 사용하는) 3개의 TDE 돌연변이체는 임의로 검출 또는 서열결정 절차 실시를 위하여 사용될 수 있다.
실시예 3은 동족 뉴클레오티드를 확인하기 위해 검사의 사이클을 포함하는 결합에-의한-서열결정 프로토콜에서 손상된 DNA 폴리머라제의 용도를 기재하고, 돌연변이체가 달리 촉매적 Mg2 + 금속 이온의 존재 하에 동족 뉴클레오티드를 혼입시키지 않는다는 것을 입증한다. 상기 기재된 바와 같이, TDE 돌연변이체는 Bst-f 효소의 위치 381(서열번호 1)에서 단일 아미노산 변화를 포함한다. 따라서, TDE 돌연변이체는 모티프 A 내에 D YSQIELR(서열번호 13) 대신에 서열 E YSQIELR(서열번호 12)을 포함하였다. BDE 돌연변이체는 모티프 C 내에 QVH D EL(서열번호 15) 대신에 서열 QVH E EL(서열번호 14)을 포함하였다. 외인성 시스테인 잔기 및 N-말단 His-태그를 포함하였지만, 임의의 중합-불구 돌연변이를 포함하지 않았던 모 효소는 이 절차에서 대조군으로서 제공하였다. 대안에서, 변형된 모티프 A를 포함하는 조작된 폴리머라제는 절차에서 치환될 수 있다. 예를 들어, 조작된 폴리머라제는 글루타메이트에 의해 치환된 위치 355를 갖는 서열번호 3의 서열 내에 함유된 서열번호 12의 서열을 포함할 수 있다. 글루타메이트에 의해 치환된 위치 364를 갖는 서열번호 2의 서열은 하나의 예이고, 한편 글루타메이트에 의해 치환된 위치 381을 갖는 서열번호 1의 서열은 또 다른 예이다. 마찬가지로, 변형된 모티프 C를 포함하는 조작된 폴리머라제는 절차에서 치환될 수 있다. 예를 들어, 조작된 폴리머라제는 글루타메이트에 의해 치환된 위치 532를 갖는 서열번호 3의 서열 내에 함유된 서열번호 14의 서열을 포함할 수 있다. 글루타메이트에 의해 치환된 위치 541을 갖는 서열번호 2의 서열은 하나의 예이고, 한편 글루타메이트에 의해 치환된 위치 558을 갖는 서열번호 1의 서열은 또 다른 예이다.
실시예 3
손상된 DNA 폴리머라제를 사용하여 혼입 없이 동족 뉴클레오티드 확인의 시범
섬유 광학 팁의 표면에서 결합 반응을 측정하기 위해 생물층 간섭법을 이용하는 FORTEBIO®(Menlo Park, CA) Octet 기기는 서열결정 기술을 설명하기 위해 다중웰 플레이트 포멧으로 사용되었다. 주형 가닥의 5'-말단에서 바이오틴화된 프라이밍된 주형 핵산 분자는 표준 절차를 사용하여 스트렙타비딘(SA)으로 작용화된 섬유 광학 팁상에 고정되었다. 이 절차에서 프라이밍된 주형 핵산 분자는 프라이머의 다음 정확한 뉴클레오티드 하류로서 CG를 가졌다.
사이클링 절차는 하기 단계를 포함하였다: (1) 센서 팁 세정/재생; (2) 폴리머라제 및 동족 뉴클레오티드를 포함하였던 3원 복합체 형성; 및 (3) 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 복합체를 박리시키기 위해 EDTA 용액으로 세정. 혼입 단계는 한번에 하나, 4개의 dNTP를 사용하여 결합 및 검사의 완전한 라운드를 뒤따랐다. 센서 팁은 사이클링 프로토콜로 개시 전 KCl, 글루탐산칼륨, 및 0.01% Tween-20을 포함하였던 트리스-완충된 용액(pH 8.0)에서 세정/재생되었다. 먼저 들어오는 뉴클레오티드는 검사 완충제(30 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 420 mM KCl, 160 mM 글루탐산칼륨, 2 mM SrCl2, 0.01% Tween-20, 0.1 mg/mL 아세틸화된 BSA, 및 1 mM β-메르캅토에탄올)의 존재 하에 500 nM의 TDE 또는 500 nM의 CBT로 문의되었다. 원상태 뉴클레오티드는 이 절차에서 사용되었고, 하기 순서로 센서 팁에 접촉되었다: dATP, dCTP, dTTP, 및 dGTP. 각각의 dNTP는, 200 μM의 농도에서 사용되었던, dTTP를 제외하고, 100 μM의 농도에서 존재하였다. 뉴클레오티드 결합 단계는 30℃에서 약 30 초의 기간 동안이었다. 각각의 뉴클레오티드 결합 및 검사 단계의 마지막에, 임의의 형성된 복합체는 2가 양이온을 킬레이팅하기 위해 KCl을 함유하는 EDTA 용액을 사용하여 45 초 동안 센서 팁으로부터 세정되었다. 그 후에, 바이오센서는 다음 dNTP 검사로 이동 전 30 초 동안 재생되었다.
3원 복합체가 형성되었는지를 결정하기 위해 모두 4개의 dNTP의 검사 이후, 혼입 반응은 TDE 돌연변이체의 가능한 잔존 폴리머라제 활성을 조사하기 위해 수행되었다. 여기에서 모 CBT 효소는 뉴클레오티드 결합 및 혼입 활성에 대한 양성 대조군으로서 작용하였다. 먼저, 3원 복합체는 30 초 동안 100 μM의 농도에서 동족 뉴클레오티드(즉, dCTP)와 센서 팁 접촉에 의해 제조되었다. 이어서, 바이오센서 팁은 30 초 동안 혼입 완충제(30 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 50 mM Mg2 +)에 전달되었다. 마지막으로, 복합체는 2가 양이온을 킬레이팅하기 위해 KCl을 함유하는 EDTA 용액을 이용하여 45 초 동안 센서 팁으로부터 세정되었다. 재차, 바이오센서는 한번에 하나, 모두 4개의 dNTP를 사용하여 검사 반응의 다음 시리즈로 이동 전 30 초 동안 재생되었다. 검사 반응의 이러한 후자의 세트로부터 결과는 돌연변이체 효소의 결합 및 혼입 활성에 관하여 정보성이었다.
도 1에서 보여진, 상기 절차로부터의 결과는 손상된 폴리머라제가 동족 뉴클레오티드를 정확하게 확인하였지만, 촉매적 Mg2 + 금속 이온의 존재 하에조차 그 뉴클레오티드를 혼입시킬 수 없었다는 것을 확인하였다. 도면은 TDE 및 CBT 폴리머라제를 사용하여 수행된 모두 4개의 뉴클레오티드에 대한 검사 기록을 보여준다. 뉴클레오티드의 첨가 전 2원 복합체의 형성은 비교용 기준선 값을 확립시켰다. dNTP의 존재 하에 생성된 3원 복합체는 양쪽 폴리머라제가 동족 뉴클레오티드로서 dCTP를 정확하게 확인하였다는 것을 나타냈다. 모든 경우에, 비-동족 뉴클레오티드는 실질적으로 기준선 결합 신호와 관련되었다. 혼입을 허용하기 위한 단계 이후, 단지 모 CBT 효소는 촉매적 활성을 소유하는 것으로 나타났다. 더 구체적으로, 돌연변이체 TDE 효소는 재차 프라이밍된 주형 핵산 분자용 동족 뉴클레오티드로서 dCTP를 확인하였다. 이것은 뉴클레오티드가 혼입 조건 하에 돌연변이체 효소에 의해 혼입되지 않았다는 것을 나타냈다. 반대로, 모 CBT 효소는 혼입 이후 다음 정확한 뉴클레오티드로서 dGTP를 확인하였다. 따라서, 손상된 폴리머라제는 동족 뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 능력 없이 검사 단계를 정확하게 수행하였다. 물론, 광범위한 서열결정을 실행하기 위한 반복적인 사이클링 절차는 혼입 단계를 위하여 상이한 효소를 사용할 수 있다. 가역적 종결자 뉴클레오티드(예를 들어, 미표지된 가역적 종결자 뉴클레오티드)는 혼입 절차에서 사용될 수 있다.
촉매적 금속 이온의 더 낮은 농도에서 수행된 추가의 시험은 포스포다이에스터 결합 형성에 의해 동족 뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 손상된 TDE 폴리머라제의 능력을 조사하기 위해 수행되었다. 여기에서 MgCl2 또는 MnCl2의 10 mM 농도는 혼입 단계에서 시험되었다. 재차, 손상된 TDE 돌연변이체는 촉매적 Mg2 + 금속 이온의 존재 하에 동족 뉴클레오티드를 혼입하는데 실패하였다. 그러나, TDE 돌연변이체는 촉매적 Mn2 + 금속 이온의 존재 하에 동족 뉴클레오티드를 혼입시켰다. 상당히, 평행한 시험은 BDE 돌연변이체가 검사 단계 동안 동족 뉴클레오티드를 정확하게 확인하였지만, TDE 돌연변이체처럼 또한 Mg2 + 이온의 존재 하에 촉매적으로 불활성이었다는 것을 보여주었다. TDN 돌연변이체는 양쪽 동족 뉴클레오티드를 확인하고 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시킬 수 없었다.
개시된 방법 및 조성물의 생성물이거나, 상기의 제조에서 사용될 수 있거나, 상기와 함께 사용될 수 있거나, 상기에 사용될 수 있는 물질, 조성물, 및 성분이 상기 개시된다. 이들 물질의 조합, 하위집합, 상호작용, 그룹 등이 개시된 경우, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적인 및 집단적인 조합 및 순열의 특정 참조가 명백하게 개시되지 않을 수 있는 반면, 각각이 본 명세서에서 구체적으로 고려되고 기재된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되며 방법을 포함하는 수많은 분자에 실시될 수 있는 수많은 변형이 논의되면, 그 방법의 각각의 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형은, 반대로 구체적으로 나타내지 않는 한, 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위집합 또는 조합은 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 이 개념은, 개시된 조성물을 사용하는 방법에서 단계를 포함하는, 본 개시내용의 모든 양상에 적용한다. 따라서, 수행될 수 있는 여러가지의 추가의 단계가 있다면, 각각의 이들 추가의 단계가 개시된 방법의 임의의 특이적 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있다는 것, 및 각각의 그와 같은 조합 또는 조합의 하위집합이 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 인용된 공보, 및 이들이 인용되는 자료는 이들의 전체내용이 본원에 구체적으로 참고로 혼입된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허출원이 참고로 혼입되도록 구체적으로 및 개별적으로 나타나는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 혼입된다.
본 명세서에서 사용된 제목이 단지 조직상의 목적이고 설명 또는 청구항을 제한하는 의미는 아님이 이해되어야 한다.
수많은 구현예가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 다른 구현예는 청구범위의 범주에 속한다.
<110> Omniome, Inc. <120> METHOD OF NUCLEIC ACID SEQUENCE DETERMINATION <130> OMNI-008 <140> PCT/US2017/030135 <141> 2017-04-28 <150> US 62/329,489 <151> 2016-04-29 <150> US 62/444,733 <151> 2017-01-10 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 604 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered DNA polymerase <400> 1 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ser Cys Gly Ala Ala Met Ala Phe Thr Leu Ala 20 25 30 Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val 35 40 45 Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala 50 55 60 Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu 65 70 75 80 Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys 85 90 95 Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly 100 105 110 Ile Glu Leu Ala Gly Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu 115 120 125 Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met 130 135 140 Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly 145 150 155 160 Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val 165 170 175 Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Glu Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu 180 185 190 Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val Asp 210 215 220 Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Gly 225 230 235 240 Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile 245 250 255 Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu 260 265 270 Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val 275 280 285 Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu Asn Ile Leu His 290 295 300 Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu 305 310 315 320 Lys Val Val Arg Pro Ala Thr Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln 325 330 335 Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln 340 345 350 Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe 355 360 365 Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln 370 375 380 Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met 385 390 395 400 Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp 405 410 415 Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg Gln 420 425 430 Ala Lys Ala Val Asn Tyr Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly 435 440 445 Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile 450 455 460 Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr Met Glu Asn 465 470 475 480 Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu His 485 490 495 Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val Arg 500 505 510 Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala 515 520 525 Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys 530 535 540 Glu Glu Arg Leu Gln Ala His Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu 545 550 555 560 Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu Arg Leu Ala Arg Leu Val 565 570 575 Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val 580 585 590 Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 595 600 <210> 2 <211> 587 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered DNA polymerase <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(587) <223> Engineered DNA polymerase <400> 2 Gly Ser His Met Ser Cys Gly Ala Ala Met Ala Phe Thr Leu Ala Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val Glu 20 25 30 Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala Val 35 40 45 Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala 50 55 60 Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser 65 70 75 80 Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile 85 90 95 Glu Leu Ala Gly Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu 100 105 110 Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys 115 120 125 Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala 130 135 140 Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg 145 150 155 160 Lys Ala Ala Ala Ile Trp Glu Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu 165 170 175 Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro Leu 180 185 190 Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val Asp Thr 195 200 205 Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Gly Thr 210 215 220 Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn 225 230 235 240 Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu Pro 245 250 255 Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val Leu 260 265 270 Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu Asn Ile Leu His Tyr 275 280 285 Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys 290 295 300 Val Val Arg Pro Ala Thr Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala 305 310 315 320 Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn 325 330 335 Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val 340 345 350 Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile 355 360 365 Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu 370 375 380 Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile 385 390 395 400 Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg Gln Ala 405 410 415 Lys Ala Val Asn Tyr Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu 420 425 430 Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile Glu 435 440 445 Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr Met Glu Asn Ile 450 455 460 Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu His Arg 465 470 475 480 Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val Arg Ser 485 490 495 Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala 500 505 510 Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu 515 520 525 Glu Arg Leu Gln Ala His Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile 530 535 540 Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro 545 550 555 560 Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp 565 570 575 Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 580 585 <210> 3 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered DNA polymerase <400> 3 Met Ala Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp 1 5 10 15 Lys Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala 20 25 30 Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu 35 40 45 Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly 50 55 60 Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val 65 70 75 80 Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Ala Gly Val Ser Phe Asp Leu 85 90 95 Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu 115 120 125 Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val 130 135 140 Leu Ala Glu His Leu Val Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Glu Leu Glu 145 150 155 160 Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu 165 170 175 Val Glu Leu Glu Gln Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe 180 185 190 Ala Gly Val Lys Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Lys Glu 195 200 205 Leu Ala Glu Gln Leu Gly Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala 210 215 220 Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu 225 230 235 240 Phe Glu Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr 245 250 255 Ser Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile 260 265 270 Val Glu Asn Ile Leu His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr 275 280 285 Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Ala Thr Lys Lys Val 290 295 300 His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser 305 310 315 320 Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg 325 330 335 Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe 340 345 350 Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala 355 360 365 Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His 370 375 380 Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr 385 390 395 400 Pro Asn Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Tyr Gly Ile Val Tyr 405 410 415 Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys 420 425 430 Glu Ala Ala Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val 435 440 445 Lys Arg Tyr Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr 450 455 460 Val Thr Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser 465 470 475 480 Arg Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr 485 490 495 Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp 500 505 510 Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala His Leu Leu Leu 515 520 525 Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu 530 535 540 Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu 545 550 555 560 Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp 565 570 575 Ala Lys <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Asp Tyr Val Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile 1 5 10 15 Met Ala His Leu Ser Arg Asp Lys Gly Leu 20 25 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 5 Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val 1 5 10 15 Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu 20 25 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 6 Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val 1 5 10 15 Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu 20 25 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 7 Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val 1 5 10 15 Leu Ala His Ile Ser Lys Asp Glu Asn Leu 20 25 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Met Ile Met Gln Val His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val His Lys Asp 1 5 10 15 Asp Val Asp <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 9 Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu 1 5 10 15 Arg Ala Glu <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 10 Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu 1 5 10 15 Glu Ile Glu <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 11 Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Phe Glu Ala Pro Lys Glu 1 5 10 15 Glu Ile Glu <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of DNA polymerase motif A <400> 12 Glu Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 13 Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of DNA polymerase motif C <400> 14 Gln Val His Glu Glu Leu 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 15 Gln Val His Asp Glu Leu 1 5

Claims (39)

  1. 시험 뉴클레오티드가 프라이밍(priming)된 주형 핵산에서 프라이머의 바로 하류의 주형 가닥에서 다음 염기(next base)에 상보적인 염기를 포함하는 정확한 뉴클레오티드(correct nucleotide)인지를 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 프라이밍된 주형 핵산을, 손상된 계열 A DNA 폴리머라제 및 상기 시험 뉴클레오티드를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시킴으로써, 상기 시험 뉴클레오티드가 상기 정확한 뉴클레오티드일 때, 상기 프라이밍된 주형 핵산, 상기 손상된 계열 A DNA 폴리머라제 및 상기 시험 뉴클레오티드를 포함하는 복합체가 형성되는 단계로서, 상기 손상된 계열 A DNA 폴리머라제가 모티프 A에서 서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열, 또는 모티프 C에서 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 상기 손상된 계열 A DNA 폴리머라제가 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는, 단계;
    (b) 상기 프라이밍된 주형 핵산의 상기 프라이머와 상기 시험 뉴클레오티드의 포스포다이에스터 결합 형성 없이, 상기 시험 뉴클레오티드의 존재 하에 상기 손상된 계열 A DNA 폴리머라제로의 상기 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 시험 뉴클레오티드가 상기 정확한 뉴클레오티드인지를 단계 (b)의 결과로부터 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제가 2가 망간 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합의 형성을 촉매화시키고, 제1 반응 혼합물은 2가 망간 이온이 포스포다이에스터 결합의 형성을 촉진시키는 것으로 2가 망간 이온을 함유하지 않는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    시험 뉴클레오티드가 외인성 표지를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    시험 뉴클레오티드의 외인성 표지가 형광성 모이어티를 포함하고, 단계 (b)가 상기 시험 뉴클레오티드의 상기 형광성 모이어티에 의해 생산된 형광성 신호의 측정을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제가 외인성 표지를 포함하고, 단계 (b)가 상기 손상된 계열 A DNA 폴리머라제의 상기 외인성 표지의 검출을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제의 외인성 표지가 형광성 모이어티를 포함하고, 단계 (b)가 상기 손상된 계열 A DNA 폴리머라제의 상기 형광성 모이어티에 의해 생산된 형광성 신호의 측정을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    프라이머가 자유 3' 하이드록실 모이어티를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 (b) 후, 상기 손상된 계열 A DNA 폴리머라제가 아닌 제2 폴리머라제, 및 상기 시험 뉴클레오티드가 아닌 제2 유형의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 반응 혼합물로 제1 반응 혼합물을 대체하고, 이어서 상기 제2 유형의 뉴클레오티드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머에 혼입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    제2 유형의 뉴클레오티드가 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 가역적 종결자 뉴클레오티드이고, 상기 가역적 종결자 뉴클레오티드의 혼입이 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생산하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    가역적 종결자 모이어티를 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 제거하여 프라이밍된 주형 핵산 분자를 재생하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    프라이밍된 주형 핵산 대신에 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 사용하여 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 381을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1이거나, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 558을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1인, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 364를 갖는 것을 제외하고 서열번호 2이거나, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 541을 갖는 것을 제외하고 서열번호 2인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 355를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3이거나, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 532를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3인, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    제1 반응 혼합물이 2가 마그네슘 이온을 포함하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    제1 반응 혼합물이 Mg2+ 이온을 포함하고, 프라이머가 3' 하이드록실 모이어티를 포함하는, 방법.
  18. 프라이밍된 주형 핵산 분자에 혼입되는 정확한 뉴클레오티드를 확인하기 위한 키트로서,
    (a) 상기 프라이밍된 주형 핵산 및 상기 정확한 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하지만, 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는 손상된 계열 A DNA 폴리머라제로서, 모티프 A에서 서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열, 또는 모티프 C에서 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 손상된 계열 A DNA 폴리머라제;
    (b) 4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자; 및
    (c) 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드
    를 하나 이상의 용기의 포장된 조합으로 포함하는 키트.
  19. 제18항에 있어서,
    4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드가 4개의 비-형광성 가역적 종결자 뉴클레오티드인, 키트.
  20. 제18항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제가 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
  21. 제18항에 있어서,
    4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자 중 하나 이상이 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
  22. 제18항에 있어서,
    손상된 계열 A DNA 폴리머라제가 망간 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매화시키는, 키트.
  23. 제18항에 있어서,
    가역적 종결자 모이어티를 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드로부터 제거하는 화학 시약을 추가로 포함하는 키트.
  24. 제18항에 있어서,
    각각의 상이한 4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자가 마그네슘-의존적 폴리머라제 활성을 포함하는 DNA 폴리머라제에 의해 혼입가능한, 키트.
  25. 제18항에 있어서,
    정확한 뉴클레오티드를 프라이밍된 주형 핵산 분자에 혼입하는 제2 DNA 폴리머라제를 추가로 포함하는 키트.
  26. 제25항에 있어서,
    제2 DNA 폴리머라제가 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드 중 하나를 정확한 뉴클레오티드로서 혼입하는, 키트.
  27. 제18항에 있어서,
    유동 세포를 추가로 포함하는 키트.
  28. 제18항에 있어서,
    4개 유형의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 분자가 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP 또는 dUTP를 포함하고; 4개 유형의 가역적 종결자 뉴클레오티드가 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP 또는 dUTP의 유사체를 포함하고, 각각의 상기 유사체가 3'-ONH2 가역적 종결자 모이어티를 포함하는, 키트.
  29. 제18항에 있어서,
    서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 355를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3을 포함하는, 키트.
  30. 제18항에 있어서,
    서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 532를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3을 포함하는, 키트.
  31. 모티프 A에서 서열번호 12를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제로서,
    프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하지만, 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제.
  32. 제31항에 있어서,
    돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제가 2가 망간 이온의 존재 하에 포스포다이에스터 결합의 형성을 촉매화시키는, 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제.
  33. 제31항에 있어서,
    돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 381을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 364를 갖는 것을 제외하고 서열번호 2, 및 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 355를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제.
  34. 제33항에 있어서,
    돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제에 부착된 리포터 모이어티를 추가로 포함하는 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제.
  35. 모티프 C에서 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제로서,
    프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오티드와 3원 복합체를 형성하지만, 마그네슘-촉매화된 포스포다이에스터 결합 형성을 할 수 없는 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제.
  36. 제35항에 있어서,
    돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제의 폴리펩티드 서열이, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 558을 갖는 것을 제외하고 서열번호 1, 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 541을 갖는 것을 제외하고 서열번호 2, 및 글루타메이트에 의해 치환된 아미노산 위치 532를 갖는 것을 제외하고 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제.
  37. 제36항에 있어서,
    돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제에 부착된 리포터 모이어티를 추가로 포함하는 단리된 돌연변이체 계열 A DNA 폴리머라제.
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