KR20180089499A - 변형된 나노세공, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 용도 - Google Patents

변형된 나노세공, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 용도 Download PDF

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로렌초 프란체스키니
티네 브로운스
앤드류 존 헤론
라크말 니샨타 자야싱헤
엘리자베스 제인 월리스
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카트호리이케 유니버시타이트 로이펜
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Abstract

본원에 제공된 것은 변형된 또는 돌연변이체 형태의 세포용해소 A (ClyA) 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 상기 변형된 또는 돌연변이체 형태의 ClyA는 낮은 또는 생리학적 이온 강도에서 변형된 또는 돌연변이체 ClyA 나노세공을 통하여 음으로 하전된 표적 분자 또는 중합체의 효율적인 포획 및/또는 전위를 허용해 준다. 따라서, 예를 들어, 음으로 하전된 표적 분석물, 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위하여, 상기 변형된 또는 돌연변이체 형태의 ClyA 및 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

변형된 나노세공, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에, 2015년 12월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/264,709를 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에는 변형된 또는 돌연변이체 형태의 세포용해소 A (ClyA) 및 그를 포함하는 조성물이 제공된다. 예를 들어, 표적 분석물, 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위하여, 상기 변형된 또는 돌연변이체 형태의 ClyA 및 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.
막횡단 세공 (예를 들어, 나노세공)은 작은 분자 또는 폴딩된 단백질을 확인하고 단일 분자 수준에서 화학적 또는 효소적 반응을 모니터링하기 위하여 사용되어 왔다. 인공 막으로 재구성된 나노세공을 가로지르는 DNA의 전기영동 전위는 DNA 서열분석 및 바이오마커 인식과 같은 실제 적용 분야에 큰 가능성을 제공한다. 그러나, 음으로 하전된 아미노산과 맞댄 내부 표면을 갖는 나노세공을 통한 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA의 전위는 효율적이지 못하다. 특히, 용액의 데바이(Debye) 길이와 거의 동등한 수준인 반경 및 음의 내부 표면 전하를 갖는 나노세공에서는, 내부 나노세공 벽 상의 전기-이중층 (EDL)에 의해 생성된 표면 전위는 중첩되어, DNA가 나노세공 내로 진입하기 위한 큰 정전기 장벽이 초래된다. 그 결과로서, 이러한 나노세공을 가로지르는 DNA의 전위는 높은 이온 강도 용액 또는 비대칭적 염 농도 하에 작은 나노세공 (예를 들어, ~3.5 nm)을 사용하거나 또는 큰 나노세공 (예를 들어, 10 nm)을 사용해서만 관찰되었다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 특정의 단백질 나노세공, 예를 들어, 세포용해소 A (ClyA) 나노세공이 음으로 하전된 좁은 협착부 (또는 전위의 효율을 억제 또는 저하시키는 영역)를 갖고 있긴 하지만, 낮은 이온 강도 용액에서 음으로 하전된 좁은 협착부를 갖는 상기 단백질 나노세공을 통하여 음으로 하전된 분자 또는 중합체 (예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA)를 성공적으로 포획하고 전위시키는 것은, 양전하, 예를 들어, 양으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 아르기닌)을 단백질 나노세공 (예를 들어, ClyA 나노세공)의 루멘내 표면 내에 도입하여, 음으로 하전된 분자 또는 중합체 (예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA)를 그러한 나노세공 내에 포획하고 배향시킴으로써 달성될 수 있다는 예상치 못한 발견에 근거한다. 예를 들어, 양전하, 예를 들어, 양으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 아르기닌)은 그의 개구부 (예를 들어, 음으로 하전된 분자 또는 중합체의 진입을 위한 개구부) 근처 및 그의 중간-섹션 내에 음으로 하전된 좁은 협착부를 갖는 단백질 나노세공 (예를 들어, ClyA 나노세공)의 루멘내 표면 내에 도입될 수 있다.
특정의 예에서는, 평면 지질 이중층에서 그의 유리한 특성을 위해 선별된 조작된 ClyA 버전인 ClyA-AS를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공을 창출시켰다. ClyA-AS의 내부 전하는 생리학적 이온 강도에서 상기 나노세공에 의한 DNA의 포획을 유도하도록 재배열되었다. 예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공은 시스 개구부, 중간-섹션, 및 트랜스 개구부를 포함하며, 여기서 시스 개구부의 내부 표면은 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하고; 중간-섹션의 내부 표면은 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하고; 트랜스 개구부는 전기음성 협착부를 포함한다. 일부 경우에, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환 (예를 들어, 아르기닌으로의 치환)은 시스 개구부 내에 위치설정되어, 변형된 ClyA 나노세공 내로의 DNA의 포획을 허용하도록 하고/거나 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환 (예를 들어, 아르기닌으로의 치환)은 중간-섹션 내에 위치설정되어, 변형된 ClyA 나노세공을 통한 DNA의 전위를 허용하도록 할 수 있다. 예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환은 ClyA-AS의 아미노산 서열 내의 S110R 돌연변이에 상응할 수 있고/거나 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환은 ClyA-AS의 아미노산 서열 내의 D64R 돌연변이에 상응할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은, 예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공 내로의 음으로 하전된 중합체의 포획을 허용해 주고/거나 변형된 ClyA 나노세공을 통한 음으로 하전된 중합체의 전위를 허용해 주는 변형된 ClyA 나노세공을 특징으로 한다. 이러한 변형된 ClyA 나노세공은 제1 개구부, 중간-섹션, 제2 개구부, 및 중간-섹션을 통하여 제1 개구부로부터 제2 개구부까지 연장되는 루멘을 포함하며, 여기서 제1 개구부의 루멘내 표면은 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)을 포함하고, 중간-섹션의 루멘내 표면은 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)을 포함한다. 제2 개구부의 루멘내 표면이 전기음성 협착부를 규정한다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 임의의 것에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)으로부터 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)까지의 루멘 내의 거리는 약 0.5 nm 내지 약 10 nm의 범위 내에서 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)으로부터 제1 개구부 표면까지의 루멘 내의 거리는 약 3 nm 내지 약 7 nm의 범위 내에서 다양할 수 있다.
임의의 형태의 ClyA를 사용하여 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 야생형 ClyA (ClyA-WT) 및 ClyA-AS의 아미노산 서열, 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 야생형 ClyA에 상응하는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함) 동일한 아미노산 서열을 갖는 서브유닛 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 변형된 ClyA 나노세공은 ClyA-AS에 상응하는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함) 동일한 아미노산 서열을 갖는 서브유닛 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하여, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 15개 이하의 치환을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 임의의 것에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 제1 개구부 내에 위치설정되어, 제1 개구부에 노출된 용액 내에 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 데옥시리보핵산 (DNA), 예컨대 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 DNA이지만, 이에 제한되지 않음)의 포획을 허용하도록 할 수 있다. 예를 들어, 양전하 (예를 들어, 양으로 하전된 아미노산)로의 치환은 다음 위치 중 하나 이상에서 일어날 수 있다: 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 E106, D114, D121, D122, E129, E85, E78, D268, D267, D265, E258.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 임의의 것에서, 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 중간-섹션 내에 위치설정되어, 상기 세공의 루멘을 통한 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 데옥시리보핵산 (DNA), 예컨대 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 DNA이지만, 이에 제한되지 않음)의 전위를 허용하도록 할 수 있다. 예를 들어, 양전하 (예를 들어, 양으로 하전된 아미노산)로의 치환은 다음 위치 중 하나 이상에서 일어날 수 있다: 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 D74, D71, D64, E53, E161, D158, E46, E42, D41.
제1의 양전하 변형과 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 치환과 제2의 양으로 하전된 치환) 간의 거리는 바람직하게 약 0.5 nm 내지 약 10 nm이다. 그 거리는 약 3 nm 내지 약 7 nm일 수 있다.
변형된 ClyA 나노세공은 동종-다량체성 (예를 들어, 나노세공 내의 모든 서브유닛이 동일함) 또는 이종-다량체성 (예를 들어, 적어도 하나의 서브유닛이 나노세공 내의 다른 것과 상이함)일 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공은 표적 중합체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 관통을 허용하기에 충분히 큰 루멘을 형성하기에 충분한 임의의 수의 서브유닛 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 12개 이상의 서브유닛 폴리펩티드 (예를 들어, 13개 서브유닛 폴리펩티드, 및 14개 서브유닛 폴리펩티드 포함)를 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 서브유닛 폴리펩티드 중 적어도 하나 이상은 본원에 기재된 바와 같은 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함한다.
제1 및 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 나노세공의 서브유닛 모두에서 일어날 수 있다.
따라서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드, 및 이러한 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함) 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 이러한 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 106-78의 범위 내의 위치에서의 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환) 및 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 41-74의 범위 내의 위치에서의 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)을 포함한다. 한 예에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 위치 110에 위치될 수 있고/거나 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 위치 64에 위치될 수 있다. 제1 및/또는 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환의 예는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신 중 하나로의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 개시내용의 범위 내에는, 예를 들어, 표적 중합체, 예를 들어, 음으로 하전된 표적 중합체, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는데 사용하기 위한 조성물이 있다. 이러한 조성물은 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 임의의 것을 포함한다. 조성물은 변형된 ClyA 나노세공이 있는 막 (예를 들어, 인공 막)을 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 낮은 이온 강도 용액, 예를 들어, 약 100 mM 내지 약 300 mM 또는 약 150 mM 내지 약 300 mM의 이온 강도를 갖는 염 용액을 추가로 포함할 수 있다. 보다 일반적으로 이러한 염 용액은 약 50 mM 내지 약 1 M의 이온 강도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 변형된 ClyA 나노세공에 임의로 커플링될 수 있는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공 및 조성물은 폴리뉴클레오티드 서열분석에 제한되지 않는, 다양한 바이오센서 또는 분석물 검출 적용을 위해 사용될 수 있다. 분석물은 단백질일 수 있다. 한 측면에서, 낮은 이온 강도에서 DNA를 전위시키는 방법이 본원에 기재된다. 이러한 방법은 (a) 낮은 이온 강도 용액에, 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나 및 막 (예를 들어, 인공 막)을 제공하는 단계이며, 여기서 변형된 ClyA 나노세공은 상기 막에 존재하여, 변형된 ClyA 나노세공의 시스 개구부가 낮은 이온 강도 용액의 시스 측에 존재하고 변형된 ClyA 나노세공의 트랜스 개구부가 낮은 이온 강도 용액의 트랜스 측에 존재하도록 하는 것인 단계; (b) 낮은 이온 강도 용액의 시스 측에 DNA를 제공하는 단계; 및 (c) 변형된 ClyA 나노세공을 가로질러 전기 전위를 인가하여, 상기 DNA를 변형된 ClyA 나노세공을 통하여 시스 측에서부터 트랜스 측으로 전위시키는 단계를 포함한다. 한 예에서, 낮은 이온 강도 용액은 약 150 mM 내지 약 300 mM의 이온 강도를 갖는 염 용액 (예를 들어, 염화나트륨 용액)일 수 있다. 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA)를 특징규명하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 방법이 또한, 본원에 제공된다. 이러한 방법은 (a) 낮은 이온 강도 용액 (예를 들어, 약 150 mM 내지 약 300 mM의 이온 강도 용액)에, 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나 및 막을 제공하는 단계이며, 여기서 변형된 ClyA 나노세공은 상기 막에 존재하는 것인 단계; (b) 단계 (a)의 낮은 이온 강도 용액에 표적 폴리뉴클레오티드를 부가하는 단계; 및 (c) 나노세공을 가로질러 전위를 인가하는 동안, 변형된 ClyA 나노세공을 통한 이온 흐름을 측정하며, 여기서 이온 흐름 측정은 표적 폴리뉴클레오티드의 1종 이상의 특징을 지시하는 것인 단계를 포함한다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 결정될 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드의 특징의 비제한적 예는 (i) 표적 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 실체, (iii) 표적 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 표적 폴리뉴클레오티드의 2차 구조, (v) 표적 폴리뉴클레오티드가 변형되는지의 여부, 및 이로써 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 것, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 측면 중 임의의 것에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다.
본원에 기재된 측면 중 임의의 것에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 낮은 이온 강도 용액에 부가하여, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 하고 변형된 ClyA 나노세공을 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태의 세부사항이 아래 설명에 제시된다. 본 개시내용의 다른 특징 또는 이점이 하기 도면 및 여러 실시양태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정의 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1. DNA 전위를 위하여 ClyA 나노세공을 조작함. 패널 A) 이. 콜라이(E. coli) ClyA 구조로부터의 상동성 모델링에 의해 구축된 지질 이중층 내로 매몰된 ClyA-AS 및 ClyA-RR 나노세공에 대한 횡단면 (PDB: 2WCD, 90% 서열 동일성). 내부 세공 루멘은 표면 표현으로서 제시되고, "진공 상태" 정전기학에 따라서 음영 처리된다 (음성 영역에 대해서는 더 어두운 음영이고, 양성 영역에 대해서는 더 밝은 음영이다; Pymol). 시험되었던 아미노산 치환이 ClyA-AS에 지시된다 (좌측). ClyA-RR 세공은 위치 110 및 64에서 프로테오머당 2개의 부가 아르기닌 잔기를 함유한다 (우측). 패널 B) ClyA-AS 및 ClyA-RR에 대한 전류 대 전압 관계. +70 mV에서 생리학적 이온 강도 하에 ClyA-RR 나노세공을 통한 패널 C) ssDNA (1a, 1 μM) 및 (패널 D) dsDNA (1, 170 nM) 전위. 하단의 전류 트레이스는 DNA 전위 이벤트의 확대를 보여준다. 전류 시그널은 2-kHz 저역 통과 베셀(Bessel) 필터를 적용하여 10 kHz에서 수집하였다. 완충제는 150 mM NaCl, 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5이고, 온도는 22℃였다.
도 2. 150 mM NaCl 용액 중에서의 DNA 로탁산 형성. 패널 A) 시스 구획에 뉴트라비딘 (1.2 μM, 단량체)과 복합체를 형성한 하이브리드 dsDNA/ssDNA 스레드 1a/1c (1.0 μM)를 부가함으로써 +50 mV에서 dsDNA 로탁산이 형성되었다. 1a/1c는 1a/1c의 ssDNA 오버행에 대해 상보적인 비오티닐화 ssDNA 분자인 1d (1.0 μM)와 혼성화하기 위해 사용되었던 5'에서의 31개 염기 단일 가닥 오버행을 함유하였다. 따라서, 나노세공/DNA 로탁산은 1a/1c가 나노세공을 통해 전위되는 경우에만 형성된다. DNA가 ClyA의 루멘을 점유한 경우, 개방 세공 전류는 양성 인가된 전위에서 감소되었고 (IRES+50 = 84±7, 평균 ± S.D., N=3), 음성 인가된 전위에서 증강되었다 (IRES-50 = 1.11±0.06, 평균 ± S.D., N=3). 패널 B) ClyA-RR 나노세공의 시스 구획에 뉴트라비딘 (1.2 μM, 단량체)과 복합체를 형성한 5' 비오티닐화 ssDNA 스레드 2a (1.0 μM, 흑색 라인)를 부가함으로써 +50 mV에서 ssDNA/dsDNA 하이브리드 로탁산이 형성되었다. 2a의 3' 말단에 대해 상보적이고 뉴트라비딘 (1.2 μM, 단량체)과 복합체를 형성한 제2의 5' 비오티닐화 ssDNA 분자 2b (1.0 μM)를 트랜스 구획에 부가하였다. 로탁산 형성시, -50 mV로 인가된 전위의 역전은 전류 증강을 유도하였으며 (IRES-50 = 1.16 ± 0.03, 평균 ± S.D., N=3), 이는 하이브리드 ssDNA/dsDNA가 어셈블리된다는 것을 지시한다. 전류 트레이스의 우측은 유리 ClyA-RR 및 로탁산 입체배치의 ClyA-RR에 대한 전압 관계 (IV 곡선)을 보여준다. 도 2, 패널 A 및 B에서의 흑색 및 회색 라인은 두 로탁산의 DNA 입체배치를 지시한다. 사용된 완충제는 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5였고, 온도는 22℃이다. 그러한 DNA 서열이 표 3에 제시된다.
도 3. DNA 전위 및 스레딩의 이온 강도 의존성. 패널 A) dsDNA (원형) 및 ssDNA (삼각형)에 대한 전위의 빈도의 데바이 강도 의존성. dsDNA 전위 이벤트의 빈도는 선형 회귀에 잘 맞은 반면 (R2=0.98), ssDNA의 빈도는 선행 회귀 (R2=0.78)보다는 단일 지수 (R2=0.99)에 더 잘 맞았다. 패널 B) 용액 데바이 길이에 대한 dsDNA (삼각형) 및 뉴트라비딘:dsDNA 복합체 (원형) 차단의 잔류 전류의 의존성. 라인은 선형 회귀를 나타낸다. 패널 C) 패널 B에서와 동일하지만, ssDNA에 대한 것이다. 패널 D) DNA 스레딩의 이온 강도 의존성. +70 mV 인가된 전위 하에, ClyA-RR의 시스 측에 대한 ssDNA (1a, 1 μM)의 초기 부가는 ClyA-RR 개방 세공 전류로의 신속한 전류 차단을 유도시켰다. 뉴트라비딘 (1.2 μM, 시스)의 후속 부가는 150 및 300 mM NaCl 용액에서 장기간 지속되는 전류 차단을 유도시켰으며, 이는 ssDNA의 스레딩 때문일 가능성이 가장 크다. 이는 1 M NaCl 용액 (또는 그 초과)에서 관찰되지 않았으며, 여기서는 상기 차단이 일시적으로 유지되었다. 상보적 ssDNA (1a, 1 μM, 시스)를 추가로 부가하면, dsDNA의 스레딩으로 인해 모든 이온 강도에서 영구적인 차단이 유도되었다. 각각의 영구적인 DNA 포획 이벤트 후에, 전위를 -70 mV로 수동으로 역전시킴으로써 개방 세공을 재생시켰다. 개방 세공 전류 수준 위아래의 스파이크는 전위 역전 후의 용량성 과도 상태를 나타낸다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 10-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 20 μs (50 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였고, 이는 표 7에 열거된다. 150 mM NaCl에서, 부가 디지털 2-kHz 저역 통과 베셀 필터를 전류 트레이스에 적용하였다.
도 4. ClyA-RR 나노세공을 통한 단방향 DNA 전위. 패널 A) 150 mM NaCl 용액에서, 3 μM의 dsDNA 1을 ClyA-RR 나노세공의 시스 측과 트랜스 측 둘 다에 부가하면, 양성 인가된 전위 하에서만 일시적인 전류 차단 (회색 수직 라인)이 유도되었다. 패널 B) 1.0 M NaCl 용액에서는, 인가된 전위 둘 다 하에서 DNA 차단이 관찰된다. DNA 유도된 차단은 회색 수직 라인으로서 제시된다. 인가된 전위는 21초 이내에 +70에서 -70 mV로 (패널 A) 또는 +100에서 -100 mV로 (패널 B) 자동적으로 변화되었다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 2-kHz (패널 A) 및 10-kHz (패널 B) 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 100 μs (10 kHz, 패널 A) 및 50 kHz (패널 B) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다.
도 5. ClyA 나노세공을 통한 dsDNA 및 ssDNA 전위의 메카니즘. 패널 A) dsDNA 전위. (1) dsDNA는 초기에, 상기 나노세공의 시스 입구에서의 전하와 상호작용한다. (2) dsDNA는 나노세공 내부로 침투하여, 제2의 조작된 전하와 상호작용한다. 둘 다의 전하는 음으로 하전된 트랜스 협착부를 통해 생산적인 전위를 위하여 DNA를 정렬시키는데 중요하다. (3) 이어서, dsDNA는 전위될 수 있고, 그 다음 (4) 상기 세공을 빠져나간다. 패널 B) (1) 시스 입구에서의 부가 전하는 나노세공 내부에서의 DNA의 효율적인 포획을 매개한다. (2) ssDNA는 가장 가능하게는 코일 구조로서 시스 루멘에 진입된다. (3) 트랜스 협착부를 전위시키기 위해서는, ssDNA가 나노세공 외부에서 언코일된 다음 리코일될 필요가 있다. (4) DNA가 나노세공을 빠져나간다. DNA 분자 및 나노세공은 일정 규모로 도시된다. Rg는 ssDNA의 회전 반경을 지시한다. 실험 조건 하에서, dsDNA는 단단한 막대이고, ssDNA는 ~6 nm의 회전 반경을 수반한 코일 구조이다.
도 6. 0.15 M NaCl 용액 중에서 ClyA 나노세공의 시스 측으로부터의 DNA 전위. 각각의 지시된 돌연변이체에 대하여 (패널 A-G), 다음과 같이 보고된다: IV 관계 (21 s 및 10 mV 전압 단계에서 +100으로부터 -100 mV까지의 전압 램프) 및 시스 구획에 1 μM의 비오티닐화 ssDNA (1a, 표 3)를 부가하기 전 및 후에 양성 VG 인가된 전위 하의 대표적인 전류 트레이스 (표 5). 시스 용액에 1.2 μM 뉴트라비딘 (단량체) 및 1 μM의 상보적 ssDNA (1b, 표 1)를 후속 부가한 후의 각종 전류 트레이스가 또한 제시된다. 전기 기록은 22℃ 하에 0.15 M NaCl, 15 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 2-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 100 μs (10 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다.
도 7. ssDNA 전위의 이온 강도 의존성. 패널 A-F는 상이한 염 농도 또는 이온 강도에 대한 데이터를 보여준다. (좌측) 상이한 NaCl 농도에서 + 70 mV 하에 상기 세공의 시스 측에 1 μM의 비오티닐화 ssDNA (1a, 표 3)를 부가하기 전 및 후에 ClyA-RR 나노세공의 개방 세공 전류를 보여주는 대표적인 전류 트레이스. 우측 상의 히스토그램은 개별 ssDNA 전위 이벤트의 체류 시간 (tOFF, 좌측 히스토그램) 및 이벤트 사이 시간 (tON, 우측 히스토그램)을 나타낸다. 개별 toff 및 이벤트 사이 시간 ton 이벤트는 0.05 ms의 데이터 수집 한계치를 사용하여 클램프피트(Clampfit) 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스(Molecular devices))에서 "단일 채널 검색" 기능을 사용함으로써 개별적으로 수집되었다. 평균 DNA 전위 체류 시간 tOFF는 누적 히스토그램으로부터의 단일 지수 적합도로부터 계산되었다. 이벤트 사이 시간 tON는 대수 빈(bin) (기수 10)을 사용하여 히스토그램으로부터 피팅되는 지수 대수 확률로부터 계산되었다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 10-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 20 μs (50 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다. 0.15 M NaCl 용액에서 수집된 데이터에 대해서는 부가 2-kHz 저역 통과 베셀 필터가 사용되었다.
도 8. dsDNA 전위의 이온 강도 의존성. 패널 A-E는 상이한 염 농도 또는 이온 강도에 대한 데이터를 보여준다. 전류 트레이스는 지시된 NaCl 농도에서 + 70 mV 하에 상기 세공의 시스 측에 170 nM dsDNA (1, 표 3)를 부가하기 전 (좌측) 및 후 (우측)의 ClyA-RR 나노세공의 개방 세공 전류를 보여준다. 우측 상의 히스토그램은 개별 ssDNA 전위 이벤트의 체류 시간 (tOFF, 좌측 히스토그램) 및 이벤트 사이 시간 (tON, 우측 히스토그램)을 나타낸다. 개별 tOFF 및 이벤트 사이 시간 tON 이벤트는 0.05 ms의 데이터 수집 한계치를 사용하여 클램프피트 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스)에서 "단일 채널 검색" 기능을 사용함으로써 개별적으로 수집되었다. 평균 DNA 전위 체류 시간 τoff는 누적 히스토그램으로부터의 단일 지수 적합도로부터 계산되었다. 이벤트 사이 시간 τon는 대수 빈 (기수 10)을 사용하여 히스토그램으로부터 피팅되는 지수 대수 확률로부터 계산되었다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 10-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 20 μs (50 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다. 0.15 M NaCl 용액에서 수집된 데이터에 대해서는 부가 2-kHz 저역 통과 베셀 필터가 사용되었다.
도 9. 1 M NaCl에서 트랜스 측으로부터의 DNA 로탁산의 형성. 패널 A) 트랜스 나노세공 구획에 뉴트라비딘 (1.2 uM, 단량체)과 복합체를 형성한 하이브리드 dsDNA/ssDNA 스레드 T1d (1a 및 1c, 1.0 μM, 표 3; 전류 트레이스 위의 흑색 라인으로서 제시됨)를 부가함으로써 -70 mV 인가된 전위 하에 dsDNA 로탁산이 형성되었다. T1d의 오버행에 대해 상보적인 3' 비오티닐화 ssDNA 분자인 1d (1.0 μM, 표 3; 전류 트레이스 위의 회색 라인에 상응함)를 시스 구획에 부가하였다. T1d가 1과 혼성화하기 위하여 나노세공을 통하여 전위되는 경우에만 나노세공/DNA 로탁산이 형성될 수 있기 때문에, 이러한 실험은 ClyA를 통한 시스에서 트랜스로의 DNA의 전위를 입증시켜 준다. -70 mV에서는, 스레드된 DNA의 차단된 세공 전류가 64±2.0 (평균 ± S.D., N=3)였다. 로탁산 형성 후, 인가된 전위가 +70 mV로 역전되는 것은 차단된 세공 전류를 보여주었으며 (IRES+70 = 73±0.5, 평균 ± S.D., N=3), 이는 dsDNA가 나노세공을 점유하였다는 것을 지시한다. 패널 B) ClyA-RR 및 로탁산 입체배치의 ClyA-RR에 대한 IV 관계.
도 10. 0.15 M NaCl 용액 중에서 트랜스 측으로부터의 DNA의 전위를 관찰하기 위한 세공 조작. 패널 A-I에 지시된 각각의 돌연변이체에 대하여, 다음과 같이 보고된다: IV 관계 (21 s 및 10 mV 전압 단계에서 +100으로부터 -100 mV까지의 전압 램프) 및 트랜스 구획에 1 μM의 비오티닐화 ssDNA (1a, 표 3)를 부가하기 전 및 후에 양성 VG 인가된 전위 하의 대표적인 전류 트레이스. 트랜스 용액에 1.2 μM 뉴트라비딘 (단량체) 및 1 μM의 상보적 ssDNA (1b, 표 1)를 후속 부가한 후의 각종 전류 트레이스가 또한 제시된다. DNA를 트랜스 챔버에 부가한 후에 ClyA-3R-E7S는 전류 차단을 나타냈지만, 로탁산은 형성될 수 없었으며, 이는 이러한 차단이 DNA의 전위에 기인한 것이 아니라는 것을 암시한다. 전기 기록은 22℃ 하에 0.15 M NaCl, 15 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 2-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 100 μs (10 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다.
도 11. DNA 전위를 위하여 ClyA 나노세공을 조작함. 패널 A) VMD 및 NAMD를 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) ClyA 구조로부터의 상동성 모델링에 의해 구축된 지질 이중층 내로 매몰된 ClyA-AS (좌측) 및 ClyA-RR (우측) 나노세공의 횡단면 (PDB: 2WCD, 90% 서열 동일성). 내부 세공 루멘은 PyMOL (버전 1.8 슈뢰딩거, 엘엘씨(Schroedinger, LLC))에 의해 계산된 바와 같은 용제 접근가능한 표면 면적을 이용하여 제시되고, 적응형 포아송-볼츠만 해법 (APBS)에 의해 계산된 바와 같이 150 mM NaCl 용액 중에서의 정전기 전위에 따라서 음영 처리된다. 음영 처리된 영역은 음성 및 양성 전위에 상응한다 (범위 -2 내지 +2 kBT/e 또는 -51.4 내지 +51.4 mV). 패널 B) 150 mM NaCl 농도 하에 ClyA-AS 및 ClyA-RR 나노세공의 중앙에서의 정전기 전위.
도 12. +50 mV 하에 150 mM NaCl 용액 중에서의 DNA 로탁산 형성. 패널 A) 시스 및 트랜스 구획 각각에 1a/1c (1.0 μM, 흑색 라인) 및 1d (1.0 μM, 회색 라인)를 부가함으로써 dsDNA 로탁산이 형성되었다. 뉴트라비딘 (NA, 0.3 μM, 사량체)이 또한, 양쪽 용액에 부가되었다. 패널 B) 시스 구획에 5'-비오티닐화 ssDNA 스레드 2a (1.0 μM, 흑색 라인)를 부가하고, 트랜스 구획에 2a의 3' 말단에 대해 상보적인 5'-비오티닐화 ssDNA 분자 (2b, 1.0 μM, 회색 라인)를 부가함으로써 ssDNA/dsDNA 하이브리드 로탁산이 형성되었다. NA (0.3 μM, 사량체)가 양측에 존재하였다. 전류 트레이스의 우측 상의 그래프는 ClyA-RR 및 로탁산 입체배치의 ClyA-RR에 대한 전압 관계 (I-V 곡선)를 보여준다. 실험은 22℃ 하에 150 mM NaCl 및 15 mM 트리스-HCl (pH 7.5)을 함유하는 완충제에서 수행되었다. 그 DNA 서열이 표 3에 제시된다.
도 13. +70 mV 하에 DNA 전위 및 스레딩의 이온 강도 의존성. 패널 A-B) 1 μM DNA당 dsDNA (패널 A) 및 ssDNA (패널 B) 전위의 빈도의 데바이 길이 의존성. (패널 A) 내의 점선은 확산 제한적 프로세스에 대한 전위 빈도의 이론적 예측을 묘사한 것이다. (패널 B) 내의 라인은 장벽 제한적 프로세스를 지시하는 지수 회귀이다.
도 14. ClyA-RR 나노세공을 통한 dsDNA 및 ssDNA 전위의 메카니즘. 패널 A) dsDNA 전위는 확산 제한적이다. (i) 실험 조건 하에 단단한 막대인 dsDNA는 전기장 라인에 의해 정렬되고, 규정된 배향을 수반한 나노세공 내로 진입된다. (ii) dsDNA는 나노세공 내부로 침투하여, 조작된 전하의 제2 층과 상호작용한다. (iii) 이어서, dsDNA는 협착부를 전위시킬 수 있고, (iv) 상기 세공을 빠져나간다. 나노세공의 시스 진입부에서의 전하는 초기 포획에 도움을 준다. 패널 B) ssDNA 전위는 반응 제한적이다. (i) ssDNA는 나노세공의 반경의 약 2배인 회전 반경 (Rg
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6 nm)을 수반한 코일 구조를 갖는다. (ii) ssDNA는 세공 내에 아직 있지 않고, 진입부를 검색한다. (iii) ssDNA의 한 말단은 시스 루멘의 진입부를 발견하고 언코일하기 시작한다. 나노세공에 들어가기 위한 엔트로피 에너지 장벽이 있기 때문에, 성공적인 전위 이벤트가 일어나기 전에 여러 시도를 할 수 있다. (iv) 협착부를 전위시키기 위해서는, ssDNA를 완전히 언코일할 필요가 있다. (v) DNA는 나노세공을 빠져나간 다음 리코일된다. 시스 진입부에서의 부가 전하는 나노세공 내부에서 DNA의 효율적인 포획을 매개할 가능성이 가장 크다. DNA 분자 및 나노세공은 일정 규모로 도시된다.
도 15. DNA 스레딩의 이온 강도 의존성. ssDNA (1a, 1.0 μM)를 먼저, ClyA-RR의 시스 측에 부가한 다음, 뉴트라비딘 (NA, 0.3 μM, 시스), 및 최종적으로 상보적 ssDNA (1b, 1 μM, 시스)를 부가하였다. 150 및 500 mM NaCl 용액에서는, ssDNA:NA 복합체가 장기간 지속되는 전류 차단을 유도시켰으며, 이는 ssDNA의 스레딩에 기인할 가능성이 가장 크다. 1.0 M NaCl 용액 (또는 그 초과)에서는, ssDNA:NA 차단이 일시적이었으며, 이는 ssDNA가 상기 세공을 완전히 스레드할 수 없었다는 것을 암시한다. dsDNA:NA 복합체는 모든 이온 강도에서 영구적인 차단을 유도시켰다. 개방 세공 전류 수준 위 아래의 스파이크는 DNA로부터 나노세공을 유리시키기 위해 사용된 수동 전위 역전 후의 용량성 과도 상태를 나타낸다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 수행되었다.
도 16. ClyA-RR 나노세공을 통한 ssDNA 전위의 이온 강도 의존성. 패널 A-F는 상이한 염 농도 또는 이온 강도에 대한 데이터를 나타낸다. 전류 트레이스는 상이한 NaCl 농도에서 +70 mV 하에 상기 세공의 시스 측에 1.0 μM의 비오티닐화 ssDNA (1a, 표 3)를 부가하기 전 및 후의 ClyA-RR의 개방 세공 전류를 보여준다. 트레이스의 우측 상의 히스토그램은 dsDNA 전위 이벤트의 체류 시간 (좌측 히스토그램, 통상적인 비닝 단일 지수 적합도) 및 이벤트 사이 시간 (우측 히스토그램, 대수 기수 10, 지수 대수 확률 적합도)을 나타낸다. 분산된 플롯은 전류 대 체류 시간을 나타낸다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 10-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 20 μs (50 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다. 0.15 M NaCl 용액에서 수집된 데이터에 대해서는 부가 2-kHz 저역 통과 베셀 필터가 사용되었다.
도 17. ClyA-RR 나노세공을 통한 dsDNA 전위의 이온 강도 의존성. 패널 A-E는 상이한 염 농도 또는 이온 강도에 대한 데이터를 나타낸다. 전류 트레이스는 상이한 NaCl 농도에서 +70 mV 하에 상기 세공의 시스 측에 140 내지 170 nM의 비오티닐화 dsDNA (1, 표 3)를 부가하기 전 및 후의 ClyA-RR의 개방 세공 전류를 보여준다. 트레이스의 우측 상의 히스토그램은 dsDNA 전위 이벤트의 체류 시간 (좌측 히스토그램, 통상적인 비닝 단일 지수 적합도) 및 이벤트 사이 시간 (우측 히스토그램, 대수 기수 10, 지수 대수 확률 적합도)을 나타낸다. 분산된 플롯은 전류 대 체류 시간을 나타낸다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스-HCl pH 7.5에서 수행되었다. 10-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 50 kHz 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다. 0.15 M NaCl 용액에서 수집된 데이터에 대해서는 부가 2-kHz 저역 통과 베셀 필터가 사용되었다.
도 18. 1 kHz에서 필터링된 DNA 전위 빈도의 이온 강도 의존성. 1 kHz 디지털 가우시안 필터 (클램프피트, 몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 필터링된 전류 트레이스로부터 결정된 바와 같은 (패널 A) dsDNA 및 (패널 B) ssDNA에 대한 이벤트 빈도의 염 의존성. 라인은 선형 (패널 A) 및 지수 (패널 B) 회귀 적합도를 보여준다.
도 19. 나노세공 근처의 ssDNA에 작용하는 엔트로피 및 전기영동 힘. ssDNA는 코일 모양을 갖고 있고, 장벽 크로싱을 통하여 상기 세공에 의해 포획되는 것으로 예상된다 (반응 제한적 프로세스). 이러한 장벽은 견인적 전기영동 힘의 상부에서 작용하는 세공 근방의 엔트로피 기원의 반발력으로부터 유래된다. 이들 두 가지 기여에 대한 자유 에너지는 가는 선으로 지시되고 두꺼운 선은 이 둘의 합이다 (방정식 (15)). 본 도면의 상단 부분은 반응 좌표 r a 및 r b 각각으로써 특징지을 수 있는 ssDNA의 2종의 특징적인 입체배치를 보여준다. 입체배치 (b)는 더 낮은 엔트로피를 가지며, 장벽의 상단에 근접한 상태에 상응한다.
도 20은 ClyA의 구조 및 A로서 나타낸 시스 섹션, B로서 나타낸 중간-섹션 및 C로서 나타낸 트랜스 섹션을 도시한 것이다. 음으로 하전된 아미노산 D 및 E는 (극성의 전하를 띠지 않은 S 및 Q와 함께) 본 도면의 좌측에 제시된다. 극성의 전하를 띠지 않은 아미노산 또는 음으로 하전된 아미노산 중 하나 이상의 치환은 A에서 일어날 수 있고, 음으로 하전된 아미노산 중 하나 이상의 치환은 B에서 일어날 수 있다. 수많은 음으로 하전된 아미노산을 함유하는 영역 C는 중성 또는 양으로 하전된 아미노산으로의 치환을 수반하지 않고 그 자체로 유지될 수 있다.
막횡단 세공 (예를 들어, 단백질 나노세공 또는 고체 상태 나노세공)이 생체 고분자를 검출하거나 또는 특징규명하기 위한 센서로서 유용하긴 하지만, 낮은 이온 강도 (예를 들어, 약 150 mM 내지 약 300 mM)에서 특정의 나노세공을 통하여 생체 고분자, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 전위시키는 것은 문제가 될 수 있었다. 특히, 음의 내부 표면 전하를 수반한 특정 부분과, 음으로 하전된 생체 고분자의 크기와 거의 동등한 수준의 반경 (예를 들어, dsDNA의 B-형태의 경우에는 ~2.2 nm이고, ssDNA의 경우에는 ~1 nm임)을 갖는 나노세공은 낮은 이온 강도에서 음으로 하전된 생체 고분자를 나노세공 내로 진입시키기 위해 큰 정전기 장벽을 창출시킬 수 있다. 따라서, 나노세공을 가로질러 음으로 하전된 생체 고분자, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 보다 효율적인 포획 및/또는 전위를 허용해 주는 막횡단 나노세공을 조작할 필요가 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드 맵핑 또는 서열분석과 같은 실제적인 적용에 유용할 수 있다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 양전하를 특정 위치에서 막횡단 나노세공, 예를 들어, 세포용해소 A (ClyA)의 루멘내 표면 내로 도입하여, 음으로 하전된 좁은 협착부 (예를 들어, 약 3.3 nm의 치수를 수반함)를 통한 DNA 전위에 대한 엔트로피 및 정전기 장벽을 극복할 수 있다는 예상치 못한 발견에 근거한다. 예를 들어, ClyA 나노세공의 더 넓은 진입부 (시스 측) 및 중간-섹션에서의 양성 변화 (예를 들어, 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌)의 도입이, 음으로 하전된 트랜스 협착부 그 자체에 대한 어떠한 변형의 부재하에서 조차도, 좁고 음으로 하전된 트랜스 협착부를 통한 유효한 전기영동-구동된 슬라이딩을 위하여 DNA (예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥)를 "그래빙하고" 배향시키기에 충분하다는 사실이 밝혀졌다. 추가로, 이러한 변형이 낮은 이온 강도, 예를 들어, 50 mM 정도로 낮은 이온 강도에서 DNA 전위를 허용한다는 사실이 밝혀졌다. 원칙적으로, 상기 변형은 본원에 기재된 임의의 측면의 방법이 50 mM보다 훨씬 더 낮은 이온 강도에서 수행되도록 허용해 준다. 그러나 더 낮은 이온 강도는 이에 상응하게 더 낮은 이온 전류를 유발시킬 수 있으므로, 일부 상황 하에서는 바람직하지 않을 수 있다. 이러한 변형을 수반하지 않는 경우, 나노세공을 통한 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 전위는 2.0 M 이온 강도 위에서만 관찰되었다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드 (예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공을 형성하기 위함) 및 그를 포함하는 나노세공을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공은 다양한 실제적 적용, 예컨대 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것은 또한, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 이중 가닥 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위한 방법 및 조성물이다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 생리학적 이온 강도 (예를 들어, 50 mM 내지 300 mM) 또는 낮은 이온 강도 (예를 들어, 2 M 미만 또는 1 M 미만)에서 이중 가닥 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 효율적인 전위를 제공한다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 및 방법은 폴리뉴클레오티드의 단방향 전위를 허용하며, 즉 폴리뉴클레오티드는 트랜스 방향에서 시스 방향으로 나노세공에 진입하여 통과될 수 없다. 이는, 예를 들어 시스 방향에서 트랜스 방향으로의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)의 필터링을 가능하게 한다.
ClyA 나노세공의 구조와 유사한 나노세공 구조를 갖는 다른 나노 구조 (예를 들어, 시스 개구부에 더 큰 직경 (예를 들어, 5-7 nm)을 갖고 트랜스 개구부에 음으로 하전된 더 좁은 협착부 (예를 들어, 직경 3-4 nm)를 수반한 실린더형 루멘)가 낮은 이온 강도 용액 중에서 DNA 전위를 허용해 주는 유사한 변형 전략을 채택할 수 있다는 것이 또한 고려된다.
변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드
본 개시내용의 한 측면은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 제공한다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 그의 서열이 참조 ClyA 아미노산 서열에서 벗어나는 폴리펩티드이다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 아미노산 서열은 (i) 시스 개구부-형성 아미노산 서열, (ii) 중간-섹션-형성 아미노산 서열, 및 (iii) 트랜스 개구부-형성 아미노산 서열을 포함한다. 시스 개구부-형성 아미노산 서열은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드가 다른 서브유닛 폴리펩티드와 상호작용하여 막 내에 나노세공을 형성하는 경우에 이러한 나노세공의 시스 개구부의 일부를 형성하는 아미노산 서열의 특정 부분이다. 중간-섹션-형성 아미노산 서열은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드가 다른 서브유닛 폴리펩티드와 상호작용하여 막 내에 나노세공을 형성하는 경우에 이러한 나노세공의 중간부의 일부를 형성하는 아미노산 서열의 특정 부분이다. 트랜스 개구부-형성 아미노산 서열은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드가 다른 서브유닛 폴리펩티드와 상호작용하여 막 내에 나노세공을 형성하는 경우에 이러한 나노세공의 트랜스 개구부의 일부를 형성하는 아미노산 서열의 특정 부분이다. ClyA 나노세공의 시스 부분, 중간-섹션, 및 트랜스 부분에 상응하는 ClyA 아미노산 서열의 부분을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 또한 본 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어, 그의 특정 부분이 막 내로 매립되는 나노세공은, 예를 들어, 문헌 [Humphrey et al., "VMD: Visual Molecular Dynamics" J. Mol. Graphics (1996) 14: 33-38]에 기재된 바와 같은 VMD; 및, 예를 들어, 문헌 [Phillips et al., "Scalable Molecular Dynamics with NAMD" J. Comput. Chem. (2005) 26: 1781-1802]에 기재된 바와 같은 NAMD를 사용하여 공지된 ClyA 구조로부터 상동성 모델링에 의해 구축될 수 있다. 예를 들어, 도 1A 참조.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "참조 ClyA 아미노산 서열"은 ClyA 나노세공 서브유닛의 공지된 아미노산 서열을 지칭한다. 다양한 형태의 ClyA 나노세공 서브유닛이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, ClyA 야생형 (ClyA-WT), ClyA-SS, ClyA-CS, 및 ClyA-AS를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, ClyA-WT와 비교하여 ClyA-SS, ClyA-CS, 및 ClyA-AS에서의 상이한 돌연변이, 및 이의 제조 방법이 기재되어 있는 문헌 [Soskine et al. "Tuning the size and properties of ClyA nanopores assisted by directed evolution" J Am Chem Soc. (2013) 135: 13456-13463]을 참조할 수 있다. WO 2016/166232 및 WO 2014/153625에 기재된 임의의 ClyA 아미노산 서열이 또한, 참조 ClyA 아미노산 서열로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 참조 ClyA 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 ClyA-WT의 아미노산 서열이다. 한 실시양태에서, 참조 아미노산은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 ClyA-WT의 아미노산 서열과 비교하여, 다음 돌연변이: C87A, L99Q, E103G, F166Y, I203V, C285S, K294R을 함유하는, 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 ClyA-AS의 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, ClyA-AS의 아미노산 서열은 ClyA-WT의 아미노산 서열과 비교하여 H307Y를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 참조 ClyA 아미노산 서열과 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 그 초과 포함) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 관련 기술분야에서의 표준 방법을 사용하여 상동성을 결정할 수 있다. 예를 들어 UWGCG 패키지는, 예를 들어 그의 디폴트 환경 상에서 사용된, 상동성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 사용하여, 예를 들어 문헌 [Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S.F et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기재된 바와 같이, 상동성을 계산하거나 또는 서열을 정렬시킬 수 있다 (예컨대 등가의 잔기 또는 상응하는 서열 (전형적으로 그의 디폴트 환경 상에서)을 확인함). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터를 통하여 공개적으로 입수가능하다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 아미노산 서열은 (i) 시스 개구부-형성 아미노산 서열 내의 특정 위치에서의 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환); 및 (ii) 중간-섹션-형성 아미노산 서열 내의 특정 위치에서의 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)을 포함한다. 이러한 제1 및 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제1 및 제2의 양으로 하전된 치환)은 참조 ClyA 아미노산 서열과 비교하여, 나노세공을 통한 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA)의 포획 및/또는 전위의 더 높은 빈도를 제공하도록 선택된다.
한 실시양태에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 위치 110에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 양전하 (예를 들어, 양으로 하전된 아미노산)로의 치환은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 다음 위치 중 하나 이상에서 일어날 수 있다: E106, D114, D121, D122, E129, E85, E78, D268, D267, D265, E258. 일부 실시양태에서, ClyA 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호 1 또는 2에 제시된 바와 같음)은 그의 N-말단에 부가 아미노산 "MI"를 포함하도록 변형되거나 또는 조작될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 위치 64에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 양전하 (예를 들어, 양으로 하전된 아미노산)로의 치환은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 다음 위치 중 하나 이상에서 일어날 수 있다: D74, D71, D64, E53, E161, D158, E46, E42, D41.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "양으로 하전된 아미노산 치환"은, 예를 들어, pH 7.0-8.0 (예를 들어, pH 8.0) 및 실온, 예를 들어, 20 내지 25℃에서 검출된 바와 같이, 참조 아미노산의 순 양전하를 증가시키거나 또는 순 음전하를 감소시키는 참조 아미노산에 대한 변형을 지칭한다. 예를 들어, 양으로 하전된 아미노산 치환은 (i) 음으로 하전된 아미노산을 덜 음으로 하전된 아미노산, 중성 아미노산, 또는 양으로 하전된 아미노산으로 대체시키는 것, (ii) 중성 아미노산을 양으로 하전된 아미노산으로 대체시키는 것, 또는 (iii) 양으로 하전된 아미노산을 더 양으로 하전된 아미노산으로 대체시키는 것을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 양으로 하전된 아미노산 치환은 음으로 하전된 아미노산의 결실 또는 양으로 하전된 아미노산의 부가를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양으로 하전된 아미노산 치환은 그의 음전하를 중화시키는 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산의 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산은 카르보디이미드와 반응될 수 있다.
양으로 하전된 아미노산은 특정 용액 중의 아미노산이 순 양전하를 수반하도록 이러한 용액의 pH보다 더 높은 등전점 (pI)을 갖는 아미노산이다. 예를 들어, pH 7.0-8.0 (예를 들어, pH 8.0) 및 실온, 예를 들어, 20 내지 25℃에서 검출된 바와 같이 양으로 하전된 아미노산의 예는 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 및 리신 (K)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 음으로 하전된 아미노산은 특정 용액 중의 아미노산이 순 음전하를 수반하도록 이러한 용액의 pH보다 더 낮은 pI를 갖는 아미노산이다. pH 7.0-8.0 (예를 들어, pH 8.0) 및 실온, 예를 들어, 20 내지 25℃에서 검출된 바와 같이 음으로 하전된 아미노산의 예는 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 세린 (S), 글루타민 (Q)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 중성 아미노산은 특정 용액 중의 아미노산이 순 전하를 수반하지 않도록 이러한 용액의 pH와 동일한 등전점 (pI)을 갖는 아미노산이다. 아미노산의 pI 값은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 관심 아미노산의 pI 값을 특정 용액의 pH와 비교함으로써, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용액에 존재하는 아미노산이 양으로 하전된 아미노산, 중성 아미노산, 또는 음으로 하전된 아미노산인지의 여부를 용이하게 결정할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 합성 아미노산일 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, pH 7.0-8.0 (예를 들어, pH 8.0) 및 실온, 예를 들어, 20 내지 25℃에서 검출된 바와 같이 제1 및/또는 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환은 참조 아미노산을 아르기닌, 히스티딘, 및 리신 중 하나로 치환하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환은 S110R인데, 여기서 위치 110은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 110에 상응한다.
일부 실시양태에서, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환은 D64R인데, 여기서 위치 64는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 64에 상응한다.
본원에 기재된 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환 이외에, 아미노산 치환은 참조 ClyA 아미노산 서열에 대하여, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 치환으로 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 특정 아미노산을 유사한 화학적 구조, 유사한 화학적 특성 또는 유사한 측쇄 용적의 다른 아미노산으로 대체시키는 것이다. 도입된 아미노산은 이들이 대체한 아미노산과 유사한 극성, 친수성, 소수성, 염기도, 산도, 중성도 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 기존의 방향족 또는 지방족 아미노산 대신 또 다른 방향족 또는 지방족 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아래 표 A에 정의된 바와 같은 20개 주요 아미노산의 특성에 따라서 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우, 이는 또한, 표 A에서의 아미노산 측쇄에 대한 소수친수성 척도를 참조로 하여 결정될 수 있다.
표 A - 아미노산의 화학적 특성
Figure pct00002
표 B - 소수친수성 척도
Figure pct00003
서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열의 1개 이상의 아미노산 잔기는 부가적으로, 상기 기재된 폴리펩티드로부터 결실될 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30개 이하의 잔기 또는 그 초과가 결실될 수 있다.
1개 이상의 아미노산이 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 기재된 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열 또는 그의 폴리펩티드 변이체 또는 단편의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 연장이 제공될 수 있다. 이러한 연장을 다소 짧을 수 있으며, 예를 들어 길이가 1 내지 10개 아미노산일 수 있다. 대안적으로, 연장이 더 길 수 있으며, 예를 들어 50개 또는 100개 이하의 아미노산일 수 있다. 캐리어 단백질이 아미노산 서열, 예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 아미노산 서열과 융합될 수 있다. 다른 융합 단백질이 다음에 보다 상세히 논의된다.
(예를 들어, 치환, 부가, 또는 결실에 의해) 아미노산을 변형시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 참조 아미노산에 대한 코돈을, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내의 관련 위치에서 표적 아미노산에 대한 코돈으로 대체함으로써 참조 아미노산이 표적 아미노산으로 치환될 수 있다. 이어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 다음에 논의되는 바와 같이 발현될 수 있다. 아미노산이 비-자연적으로 발생하는 아미노산인 경우, 이는 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용된 IVTT 시스템에 합성 아미노아실-tRNA를 포함시킴으로써 도입될 수 있다. 대안적으로, 이는 특이적 아미노산의 합성 (즉, 비-자연적으로 발생하는) 유사체의 존재하에 특이적 아미노산에 대해 영양요구성인 이. 콜라이에서 상기 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 발현시킴으로써 도입될 수 있다. 이는 또한, 부분 펩티드 합성을 이용하여 상기 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 생성하는 경우에 있는 그대로의 라이게이션에 의해 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 트랜스 개구부-형성 아미노산 서열은, 예를 들어, pH 7.0-8.0 (예를 들어, pH 8.0) 및 실온 (예를 들어, 20 내지 25℃)에서 검출된 바와 같이, 순 음전하를 수반할 수 있으며, 이는 참조 ClyA 아미노산 서열의 상응하는 트랜스 개구부-형성 부분의 순 음전하와 거의 동등한 수준이다 (예를 들어, 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내, 또는 더 낮음). 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 트랜스 개구부 형성 아미노산 서열은, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 참조 ClyA 아미노산 서열의 상응하는 트랜스 개구부-형성 부분과 적어도 약 95% 이상 (예를 들어, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 이하 포함) 동일할 수 있다. 한 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 트랜스 개구부-형성 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 상응하는 트랜스 개구부-형성 부분과 100% 동일하다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 동종-다량체성 나노세공 또는 이종-다량체성 나노세공을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 다른 서브유닛 폴리펩티드와 나노세공을 형성할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 나노세공을 형성할 수 있는 변형된 단량체의 능력을 평가하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 다른 적절한 서브유닛과 함께 양친매성 층 내로 삽입될 수 있고, 세공을 형성하기 위해 올리고머화할 수 있는 그의 능력이 결정될 수 있다. 서브유닛을 막, 예컨대 양친매성 층 내로 삽입하기 위한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 서브유닛은 트리블록 공중합체 막을 함유하는 용액 중에 정제된 형태로 현탁되어, 이것이 막으로 확산되고 막에 결합하며 기능적 상태로 어셈블리됨으로써 삽입되도록 할 수 있다. 대안적으로, 서브유닛은 문헌 [M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503] 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (WO 2006/100484로서 공개됨)에 기재된 "선택 및 배치" 방법을 사용하여 막 내로 직접적으로 삽입될 수 있다.
변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 비-특이적 변형을 함유할 수 있으며, 단 이는 나노세공 형성을 방해하지 않아야 한다. 수많은 비-특이적 측쇄 변형이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 아미노산의 측쇄에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 알데히드와 반응시킨 다음 NaBH4로 환원시키는 것에 의한 아미노산의 환원적 알킬화, 메틸아세트이미데이트로의 아미딘화 또는 아세트산 무수물로의 아실화를 포함한다.
변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 합성적으로 또는 재조합 수단에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 시험관내 번역 및 전사 (IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 세공 및 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 생성하는데 적합한 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (WO 2010/004273으로서 공개됨), PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로서 공개됨) 또는 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로서 공개됨)에 논의된다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 D-아미노산을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 이러한 단백질 또는 펩티드를 생성하기 위하여 관련 기술분야에서 통상적인 일이다.
일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 임의의 방식 및 임의의 부위에서 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 염료 또는 형광단의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 특정 분자를 하나 이상의 시스테인에 부착시키거나 (시스테인 연결), 분자를 하나 이상의 리신에 부착시키거나, 분자를 하나 이상의 비-자연 아미노산에 부착시키거나, 에피토프의 효소 변형 또는 특정 말단의 변형에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형을 수행하는데 적합한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 이러한 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는 나노세공과 표적 뉴클레오티드 또는 표적 폴리뉴클레오티드 서열 간의 상호작용을 촉진시켜 주는 분자 어댑터를 이용하여 화학적으로 변형될 수 있다. 어댑터의 존재는 나노세공과 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 호스트-게스트 화학을 개선시키고 이로써 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드로부터 형성된 세공의 서열분석 능력을 개선시킨다. 호스트-게스트 화학의 원리는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 어댑터는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과의 상호작용을 개선시켜 주는 나노세공의 물리적 또는 화학적 특성에 대한 효과를 갖는다. 어댑터는 세공의 배럴 또는 채널의 전하를 변경시킬 수 있거나 또는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 특이적으로 상호작용하거나 또는 그에 결합하고 이로써 그와 세공과의 상호작용을 촉진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자 어댑터는 시클릭 분자, 시클로덱스트린, 혼성화할 수 있는 종, DNA 결합제 또는 인터킬레이터, 펩티드 또는 펩티드 유사체, 합성 중합체, 방향족 평면 분자, 양으로 하전된 작은 분자 또는 수소 결합할 수 있는 작은 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자 어댑터는 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 어댑터는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 나노세공에 공유적으로 부착될 수 있다. 어댑터는 전형적으로, 화학적 연결을 통하여 부착된다. 분자 어댑터가 시스테인 연결을 통하여 부착되는 경우, 하나 이상의 시스테인이 치환에 의해 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드에 도입될 수 있다.
다른 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 예를 들어, 헬리카제, 엑소뉴클레아제, 및 폴리머라제에 부착되거나 또는 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 헬리카제, 예를 들어, DNA 헬리카제에 부착되거나 또는 커플링될 수 있다. 나노세공 서열분석에 사용하기 적합한 헬리카제, 엑소뉴클레아제, 및 폴리머라제의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 헬리카제, 예를 들어, DNA 헬리카제, Hel308 헬리카제 (예를 들어, WO 2013/057495에 기재된 바와 같음), RecD 헬리카제 (예를 들어, WO2013/098562에 기재된 바와 같음), XPD 헬리카제 (예를 들어, WO201/098561에 기재된 바와 같음), 또는 Dda 헬리카제 (예를 들어, WO2015/055981에 기재된 바와 같음)에 부착되거나 또는 커플링될 수 있다. 이는 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 방법에 사용될 수 있는 모듈러 서열분석 시스템을 형성한다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 아래에 논의된다. 전위 속도 제어는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질의 유형 및/또는 상기 시스템에 부가된 연료 (ATP)의 양에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 DNA 분석물의 전위 속도는 이중 가닥 DNA 트랜스로카제, 예컨대 FtsK에 의해 제어될 수 있다. 시스템에 부가된 연료 (ATP)에 따라서, 표적 폴리뉴클레오티드의 전위 속도는 약 30 B/s 내지 1000 B/s일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 화학적으로 융합되거나 또는 유전적으로 융합될 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 전체 구조물이 단일 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 경우에는 유전적으로 융합된다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드가 폴리뉴클레오티드 결합 단백질과 유전적으로 융합하는 것은 국제 출원 번호 PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로서 공개됨)에 논의되어 있다.
변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드는 분자 어댑터 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 이용하여 화학적으로 변형될 수 있다.
본원에 기재된 단백질 중 임의의 것, 예컨대 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드 및 나노세공은, 예를 들어 히스티딘 잔기 (his 태그), 아스파르트산 잔기 (asp 태그), 스트렙타비딘 태그, 플래그 태그, SUMO 태그, GST 태그 또는 MBP 태그를 부가함으로써, 또는 폴리펩티드가 시그널 서열을 자연적으로 함유하지 않는 세포로부터의 그의 분비를 증진시키도록 상기 시그널 서열을 부가함으로써, 그의 확인 또는 정제에 도움을 주기 위해 변형될 수 있다. 유전적 태그를 도입하기 위한 대안은 단백질 상의 천연 또는 조작된 위치 상으로 태그를 화학적으로 반응시키는 것이다. 이의 한 예는 단백질의 외부에서 조작된 시스테인과 겔-시프트 시약을 반응시키는 것일 것이다. 이는 용혈소 이종-올리고머를 분리시키는 방법으로서 입증되었다 (Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505).
본원에 기재된 단백질 중 임의의 것, 예컨대 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드 및 나노세공은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 검출가능한 표지는 단백질이 검출되도록 허용해 주는 임의의 적합한 표지일 수 있다. 적합한 표지는 형광성 분자, 방사성 동위원소, 예를 들어, 125I, 35S, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오티드 및 리간드, 예컨대 비오틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함한, 본원에 기재된 단백질 중 임의의 것은 관련 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에서의 표준 방법을 사용하여 유래 및 복제될 수 있다. 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에서의 표준 기술을 사용하여 박테리아 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 상기 단백질은 재조합 발현 벡터로부터 폴리펩티드의 계내 발현에 의해 특정 세포에서 생성될 수 있다. 발현 벡터는 임의로, 폴리펩티드의 발현을 제어하기 위한 유도성 프로모터를 수반한다. 이들 방법은 문헌 [Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재되어 있다.
단백질은 단백질 생산 유기체로부터 임의의 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 정제 후에 또는 재조합 발현 후에 대규모로 생성될 수 있다. 전형적인 단백질 액체 크로마토그래피 시스템은 FPLC, AKTA 시스템, 바이오-캐드(Bio-Cad) 시스템, 바이오-래드(Bio-Rad) 바이오로직 시스템 및 길슨(Gilson) HPLC 시스템을 포함한다.
변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본원에는 또한, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다.
폴리뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에서의 표준 방법을 사용하여 유래 및 복제될 수 있다. 야생형 ClyA를 코딩하는 염색체 DNA는 세공 생산 유기체, 예컨대 살모넬라 티피(Salmonella typhi)로부터 추출될 수 있다. 세공 서브유닛을 코딩하는 유전자는 특이적 프라이머를 포함하는 PCR을 사용하여 증폭될 수 있다. 이어서, 이와 같이 증폭된 서열은 부위 지정 돌연변이 유발을 진행할 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발의 적합한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 조합 연쇄 반응을 포함한다. 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 널리 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 기술을 사용하여 만들 수 있다.
이어서, 이로써 생성되는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 복제가능한 벡터, 예컨대 클로닝 벡터 내로 혼입될 수 있다. 상기 벡터를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 화합성 숙주 세포에서 복제시킬 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터 내로 도입하고, 이러한 벡터를 화합성 숙주 세포 내로 도입하며, 상기 벡터의 복제를 유발시키는 조건 하에 상기 숙주 세포를 성장시킴으로써 만들어질 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는데 적합한 숙주 세포는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드 또는 구조물의 생성 방법을 포함한다. 이러한 방법은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 임의의 실시양태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 벡터의 일부이고, 바람직하게는 프로모터와 작동적으로 연결된다.
변형된 ClyA 나노세공
본 개시내용의 한 측면은, 예를 들어, 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA)의 변형된 ClyA 나노세공 내로의 포획을 허용해 주고/거나 변형된 ClyA 나노세공을 통한 음으로 하전된 중합체의 전위를 허용해 주는 변형된 ClyA 나노세공을 특징으로 한다. 이러한 변형된 ClyA 나노세공은 제1 개구부, 중간-섹션, 제2 개구부, 및 중간-섹션을 통하여 제1 개구부로부터 제2 개구부로 연장되는 루멘을 포함하며, 여기서 제1 개구부의 루멘내 표면은 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하고, 중간-섹션의 루멘내 표면은 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함한다. 제2 개구부의 루멘내 표면은 전기음성 협착부를 규정한다. 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환은 상기 섹션 "변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드"에 상세히 기재되어 있다.
단지 예시 목적을 위하여, 도 1 (패널 A)은 본원에 기재된 한 실시양태에 따르는 변형된 ClyA 나노세공을 보여준다. 이러한 변형된 ClyA 나노세공은 제1 개구부 (102), 중간-섹션 (104), 및 제2 개구부 (106)를 포함한다. 루멘 (108)은 중간-섹션 (104)를 통하여 제1 개구부 (102)에서 제2 개구부 (106)로 연장되고, 약 13 nm 내지 약 15 nm의 총 길이를 갖는다. 제1 개구부 (102) 및 중간-섹션 (104)는 약 5 nm 내지 약 7 nm의 직경을 갖는다. 제2 개구부 (106)의 루멘내 표면은 전기음성 협착부 (112)를 규정하며, 여기서 가장 좁은 횡단면은 약 3 nm 내지 약 4 nm의 직경을 갖는다. 변형된 ClyA 나노세공의 제2 개구부 (106) (약 3 nm 내지 약 5 nm의 길이를 수반함)는 막 (예를 들어, 이중층) (110) 내로 삽입되어, 변형된 ClyA 나노세공이 존재하는 용액이 2개 측으로 분리되도록 하며, 제1 개구부 (102)는 용액의 한 측에 존재하는 반면, 전기음성 협착부 (112)는 용액의 또 다른 측에 존재한다. 표적 중합체 (예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드)가 제1 개구부 (102)와 동일한 측 위에 부가되는 경우, 제1 개구부 (102)는 시스 개구부이고, 제2 개구부 (106)는 트랜스 개구부이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "루멘내 표면"은 용액에 노출되는 루멘의 내부 표면을 지칭한다.
본원에 상호교환적으로 사용된 바와 같은 용어 "전기음성 협착부" 또는 "음으로 하전된 협착부"는 순 음성 표면 전하를 갖는 협착부를 지칭한다. 예를 들어, 전기음성 협착부를 규정하는 제2 개구부의 루멘내 표면은 도 1 (패널 A)에 나타낸 바와 같은 순 음성 표면 전하를 갖는다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 임의의 것에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)에서부터 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환) 까지의 루멘 내의 거리는 약 0.5 nm 내지 약 10 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 7 nm의 범위 내에서 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)에서부터 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환) 까지의 루멘 내의 거리는 약 1 nm, 약 2 nm, 약 3 nm, 약 4 nm, 약 5 nm, 약 6 nm, 약 7 nm, 약 8 nm, 또는 약 9 nm일 수 있다.
임의의 형태의 ClyA를 사용하여 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 예를 들어, 야생형 ClyA (ClyA-WT) 및 ClyA-AS를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 ClyA의 아미노산 서열, 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 본원에 기재된 바와 같은 참조 ClyA 아미노산 서열과 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함) 동일한 아미노산 서열을 갖는 서브유닛 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 야생형 ClyA에 상응하는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함) 동일한 아미노산 서열을 갖는 서브유닛 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 변형된 ClyA 나노세공은 ClyA-AS의 아미노산 서열에 상응하는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함) 동일한 아미노산 서열을 갖는 서브유닛 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 제1 및 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)을 포함하여, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 15개 이하의 치환 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 치환)을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 임의의 것에서, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 제1 개구부에 노출된 용액 내에서의 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 데옥시리보핵산 (DNA), 예컨대 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 DNA이지만, 이에 제한되지 않음)의 포획을 허용하도록 제1 개구부 내에 위치설정될 수 있다. 예를 들어, 제1의 양전하 변형 (예를 들어, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 내의 위치 E106, S110, D114, D121, D122, E129, E85, E78, D268, D267, D265, E258, 또는 그의 조합에 위치될 수 있다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 임의의 것에서, 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 상기 세공의 루멘을 통한 음으로 하전된 중합체 (예를 들어, 데옥시리보핵산 (DNA), 예컨대 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 DNA이지만, 이에 제한되지 않음)의 전위를 허용하도록 중간-섹션 내에 위치설정될 수 있다. 예를 들어, 제2의 양전하 변형 (예를 들어, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환)은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 내의 위치 D74, D71, D64, E53, E161, D158, E46, E42, D41, 또는 그의 조합에 위치될 수 있다.
변형된 ClyA 나노세공은 동종-다량체성 (예를 들어, 나노세공 내의 모든 서브유닛이 동일함) 또는 이종-다량체성 (예를 들어, 적어도 하나의 서브유닛이 나노세공 내의 다른 것과 상이함)일 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공은 표적 중합체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 관통을 허용하기에 충분히 큰 루멘을 형성하기에 충분한 임의의 수의 서브유닛 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 12개 이상의 서브유닛 폴리펩티드 (예를 들어, 13개 서브유닛 폴리펩티드, 및 14개 서브유닛 폴리펩티드 포함)를 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 서브유닛 폴리펩티드 중 적어도 하나 이상은 본원에 기재된 바와 같은 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함한다.
변형된 ClyA 나노세공은, 예를 들어, 나노세공 내에서의 체류 시간 및 이러한 세공을 통하여 흐르는 전류에 근거하여, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단일 가닥 폴리뉴클레오티드와 구별하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 변형된 ClyA 나노세공은 폴리뉴클레오티드 서열을 특징규명하기 위하여, 예컨대 서열분석하기 위하여 사용될 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공은 또한, 예를 들어, 메틸화된 뉴클레오티드와 메틸화되지 않은 뉴클레오티드 간의 변형된 염기를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공은 본원에 기재된 제1 및 제2의 양으로 하전된 치환을 수반하지 않은 ClyA 나노세공과 비교하여, 낮은 이온 강도 용액에서 나노세공을 통한 폴리뉴클레오티드의 더 높은 빈도의 포획 및/또는 전위를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "낮은 이온 강도 용액"은, 예를 들어, 1 M 미만, 900 mM 미만, 800 mM 미만, 700 mM 미만, 600 mM 미만, 500 mM 미만, 400 mM 미만, 300 mM 미만, 200 mM 미만, 150 mM 미만 또는 그 이하를 포함한, 2 M 미만의 이온 강도를 수반한 용액을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 더 낮은 이온 강도 용액은 적어도 약 50 mM, 적어도 약 100 mM, 적어도 약 150 mM, 적어도 약 200 mM, 적어도 약 300 mM, 적어도 약 400 mM, 적어도 약 500 mM, 적어도 약 600 mM, 적어도 약 700 mM, 적어도 약 800 mM, 적어도 약 900 mM, 적어도 약 1 M, 또는 그 초과의 이온 강도를 갖는다. 상기 참조 범위의 조합이 또한 포괄된다. 예를 들어, 낮은 이온 강도 용액은 약 100 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 300 mM의 이온 강도를 가질 수 있다. 적절한 이온 강도를 수반한 용액을 산출하기 위해 어떠한 염도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 알칼리성 염 (예를 들어, 염화칼륨 또는 염화나트륨이지만, 이에 제한되지 않음)이 낮은 이온 강도 용액에 사용될 수 있다.
변형된 ClyA 나노세공은 일정 범위의 조건 하에 상이한 뉴클레오티드 간을 식별할 수 있다. 특히, 상기 세공은 핵산을 특징규명하는데, 예컨대 서열분석하는데 유리한 조건 하에 뉴클레오티드 간을 식별할 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공이 상이한 뉴클레오티드 간을 식별할 수 있는 정도는 인가된 전위, 염 농도, 완충제, 온도 및 첨가제, 예컨대 우레아, 베타인 및 DTT의 존재를 변경시킴으로써 제어될 수 있다. 이는, 특히 서열분석될 때, 상기 세공의 기능을 미세 조정하도록 허용해 준다. 이것은 아래에 보다 상세히 논의된다. 변형된 ClyA 나노세공은 또한, 뉴클레오티드 단위에 근거하는 것이 아니라 하나 이상의 단량체와의 상호작용으로부터 폴리뉴클레오티드 중합체를 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 ClyA 나노세공은 핵산-단백질 상호작용을 특징규명하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 나노세공은, 예를 들어, 핵산을 따라 결합 부위의 위치를 스캐닝 및 맵핑하고/거나 단백질과 핵산 간의 상호작용의 강도를 프로빙하는 것과 같은 상이한 감지 모드를 사용하여 단백질-핵산을 조사하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산의 천연 전하는 전기영동 힘을 핵산-단백질 복합체에 적용하기 위해 레버리지될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, DNA-단백질 상호작용은 단백질 나노세공을 통한 단일 DNA 분자의 전압 구동된 스레딩을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 개별 DNA 단백질 복합체 (예를 들어, DNA-엑소뉴클레아제 I 복합체, DNA-헬리카제 복합체, DNA-클램프 복합체)에 인가된 전기력은 두 분자를 이격시킬 수 있는데, 이와 동시에 이온 전류 변화가 복합체의 해리 속도를 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 ClyA 나노세공은 핵산과 다른 핵산 결합 단백질, 예컨대 전사 인자, 효소, DNA 패키징 단백질 등과 관련된 핵산-단백질 상호작용의 검출 및 특징규명을 위해 사용될 수 있다.
변형된 ClyA 나노세공은 단리되거나, 실질적으로 단리되거나, 정제되거나 또는 실질적으로 정제될 수 있다. 변형된 ClyA 나노세공은 그것에 임의의 다른 성분, 예컨대 지질 또는 다른 세공이 완전히 없는 경우에 단리되거나 또는 정제될 수 있다. 특정 세공이 그의 사용 목적을 방해하지 않을 담체 또는 희석제와 혼합되는 경우에, 이러한 세공은 실질적으로 단리된다. 예를 들어, 특정 세공이 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 다른 성분, 예컨대 트리블록 공중합체, 지질 또는 다른 세공을 포함하는 형태로 존재하는 경우에, 이러한 세공은 실질적으로 단리되거나 또는 실질적으로 정제된다. 대안적으로, 하나 이상의 변형된 ClyA 나노세공은 막에 존재할 수 있다. 적합한 막이 아래에 논의된다.
변형된 ClyA 나노세공은 개별 또는 단일 세공으로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 변형된 ClyA 나노세공은 2개 이상의 세공의 상동 또는 이종 집단으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공은 마이크로웰의 어레이로 배열될 수 있으며, 여기서 각각의 마이크로웰은 특정 막 내에 적어도 하나의 나노세공을 함유한다.
동종- 다량체성 ClyA 나노세공
동일한 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는 동종-다량체성 나노세공이 또한 본원에 제공된다. 이러한 동종-다량체성 나노세공은 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 임의의 실시양태를 포함할 수 있다. 동종-다량체성 나노세공은 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위하여, 예컨대 서열분석하기 위하여 사용될 수 있고/거나 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 대 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 동종-다량체성 나노세공은 상기 논의된 이점 중 임의의 것을 가질 수 있다.
동종-다량체성 세공은 임의의 수의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 이러한 세공은 전형적으로, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 또는 적어도 14개의 동일한 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드, 예컨대 12, 13, 또는 14개의 동일한 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함한다.
세공의 제조 방법이 아래에 보다 상세히 논의된다.
이종- 다량체성 ClyA 나노세공
적어도 하나의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는 이종-다량체성 나노세공이 또한 본원에 제공된다. 이러한 이종-다량체성 나노세공은 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위하여, 예컨대 서열분석하기 위하여 사용될 수 있고/거나 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 대 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이종-다량체성 나노세공은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Protein Sci. 2002 Jul; 11(7):1813-24] 참조).
이종-다량체성 세공은 이러한 세공을 형성하기에 충분한 서브유닛 폴리펩티드를 함유한다. 서브유닛 폴리펩티드는 임의의 형태일 수 있다. 상기 세공은 전형적으로, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 또는 적어도 14개의 서브유닛 폴리펩티드, 예컨대 12, 13, 또는 14개의 서브유닛 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 서브유닛 폴리펩티드 모두 (예컨대 12, 13, 또는 14개의 서브유닛 폴리펩티드)는 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드이고, 이들 중 적어도 하나는 다른 것과 상이하다. 일부 실시양태에서, 상기 세공은 12 또는 13개의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 다른 것과 상이하다. 이들은 모두 서로 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 서브유닛 폴리펩티드 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드가 아니다. 이러한 실시양태에서, 나머지 단량체는 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드 중 어느 하나일 수 있다. 따라서, 상기 세공은 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드(들)를 포함할 수 있다. 나노세공을 형성하는 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드(들)는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
세공의 제조 방법이 아래에 보다 상세히 논의된다.
폴리뉴클레오티드 특징규명
본 개시내용의 또 다른 측면은 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 약 50 mM 내지 약 1 M의 낮은 이온 강도 용액에, 본원에 기재된 임의의 실시양태에 따르는 변형된 ClyA 나노세공 및 막을 제공하는 단계이며, 여기서 변형된 ClyA 나노세공은 막에 존재하는 것인 단계; (b) 단계 (a)의 낮은 이온 강도 용액에 표적 폴리뉴클레오티드를 부가하는 단계; 및 (c) 나노세공을 가로질러 전위를 인가하는 동안, 변형된 ClyA 나노세공을 통한 이온 흐름을 측정하며, 여기서 이온 흐름 측정은 표적 폴리뉴클레오티드의 1종 이상의 특징을 지시하는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 낮은 이온 강도 용액의 시스 측에 부가된다.
일부 실시양태에서, 낮은 이온 강도 용액은 약 50 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 300 mM의 이온 강도를 가질 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 또한, 주형 폴리뉴클레오티드 또는 관심 폴리뉴클레오티드로 지칭될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드, 예컨대 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대분자이다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 자연적으로 발생하거나 또는 인공적일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 산화되거나 또는 메틸화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 피리미딘 이량체를 포함할 수 있다. 이러한 이량체는 전형적으로, 자외선에 의한 손상과 연관되고, 피부 흑색종의 주요 원인이다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는, 예를 들어 표지 또는 태그로 변형될 수 있다. 적합한 표지가 아래에 기재된다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드는 전형적으로, 핵염기, 당 및 적어도 1개의 포스페이트 기를 함유한다. 핵염기와 당이 뉴클레오시드를 형성한다.
핵염기는 전형적으로 헤테로시클릭이다. 핵염기는 푸린 및 피리미딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 보다 구체적으로는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U) 및 시토신 (C)이다.
당은 전형적으로 펜토스 당이다. 뉴클레오티드 당은 리보스 및 데옥시리보스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당은 바람직하게 데옥시리보스이다.
폴리뉴클레오티드는 바람직하게 다음 뉴클레오시드를 포함한다: 데옥시아데노신 (dA), 데옥시우리딘 (dU) 및/또는 티미딘 (dT), 데옥시구아노신 (dG) 및 데옥시시티딘 (dC).
뉴클레오티드는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 전형적으로, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 함유한다. 뉴클레오티드는 3개 초과의 포스페이트, 예컨대 4 또는 5개의 포스페이트를 포함할 수 있다. 포스페이트는 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측 상에 부착될 수 있다. 뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 5-메틸시티딘 모노포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘 모노포스페이트, 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP) 및 데옥시메틸시티딘 모노포스페이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드는 바람직하게, AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP, dCMP 및 dUMP로부터 선택된다.
뉴클레오티드는 탈염기 (즉, 핵염기가 결여됨)일 수 있다. 뉴클레오티드는 핵염기와 당이 결여될 수도 있다.
폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드는 임의의 방식으로 서로 부착될 수 있다. 뉴클레오티드는 전형적으로, 핵산에서와 같이 그의 당 및 포스페이트 기에 의해 부착된다. 뉴클레오티드는 피리미딘 이량체에서와 같이 그의 핵염기를 통하여 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 적어도 특정 부분은 바람직하게 이중 가닥이다.
폴리뉴클레오티드는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA의 하나의 가닥과 혼성화된 RNA의 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 고정 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄를 수반한 다른 합성 중합체일 수 있다. PNA 주쇄는 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성된다. GNA 주쇄는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복되는 글리콜 단위로 구성된다. TNA 주쇄는 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 반복되는 트레오스 당으로 구성된다. LNA는 리보스 모이어티에서 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 여분의 브릿지를 갖는 상기 논의된 바와 같은 리보뉴클레오티드로부터 형성된다.
폴리뉴클레오티드는 가장 바람직하게, 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)이다.
폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 1000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 5000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 또는 100000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
임의의 수의 폴리뉴클레오티드를 연구할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 100개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 것에 관한 것일 수 있다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 경우, 이들은 상이한 폴리뉴클레오티드일 수 있거나 또는 동일한 폴리뉴클레오티드의 2가지 경우일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하거나 또는 인공적일 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 제작된 올리고뉴클레오티드의 서열을 검증하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로, 시험관 내에서 수행된다.
폴리뉴클레오티드는 부착된 종, 예컨대 단백질 또는 분석물을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 혼성화된 프로브를 포함할 수 있다.
샘플
각각의 분석물은 전형적으로, 임의의 적합한 샘플에 존재한다. 상기 방법은 이러한 분석물을 함유하는 것으로 공지되어 있거나 또는 이러한 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 2개 이상의 샘플 상에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 샘플 내에서의 그의 존재가 공지되거나 또는 예측되는 2개 이상의 분석물의 실체를 확증하기 위하여 2개 이상의 샘플 상에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단일 가닥 폴리뉴클레오티드과 구별하기 위하여 샘플 상에서 수행될 수 있다.
제1 샘플 및/또는 제2 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 본원에 기재된 방법은 임의의 유기체 또는 미생물로부터 수득되거나 또는 이로부터 추출된 적어도 하나의 샘플을 사용하여 시험관 내에서 수행될 수 있다. 제1 샘플 및/또는 제2 샘플은 비-생물학적 샘플일 수 있다. 이러한 비-생물학적 샘플은 유체 샘플일 수 있다. 비-생물학적 샘플의 예는 외과적 유체, 물, 예컨대 음료수, 해수 또는 강물, 및 실험실 시험용 시약을 포함한다.
제1 샘플 및/또는 제2 샘플은 전형적으로, 본원에 기재된 방법에 사용되기 이전에, 예를 들어 원심분리에 의해 또는 원치 않는 분자 또는 세포, 예컨대 적혈구를 걸러 내는 막을 관통시킴으로써 프로세싱된다. 제1 샘플 및/또는 제2 샘플은 채취한 즉시 측정될 수 있다. 제1 샘플 및/또는 제2 샘플은 또한 전형적으로, 검정하기 이전에, 바람직하게 -70℃ 아래로 저장될 수 있다.
특징규명
상기 방법은 폴리뉴클레오티드의 2, 3지, 4 또는 5종 또는 그 초과의 특징을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 1종 이상의 특징은 바람직하게, (i) 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 폴리뉴클레오티드의 실체, (iii) 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 폴리뉴클레오티드의 2차 구조 및 (v) 폴리뉴클레오티드가 변형되는지의 여부로부터 선택된다. 본원에 기재된 방법에 따라서, (i) 내지 (v)의 임의의 조합, 예컨대 {i}, {ii}, {iii}, {iv}, {v}, {i,ii}, {i,iii}, {i,iv}, {i,v}, {ii,iii}, {ii,iv}, {ii,v}, {iii,iv}, {iii,v}, {iv,v}, {i,ii,iii}, {i,ii,iv}, {i,ii,v}, {i,iii,iv}, {i,iii,v}, {i,iv,v}, {ii,iii,iv}, {ii,iii,v}, {ii,iv,v}, {iii,iv,v}, {i,ii,iii,iv}, {i,ii,iii,v}, {i,ii,iv,v}, {i,iii,iv,v}, {ii,iii,iv,v} 또는 {i,ii,iii,iv,v}이 측정될 수 있다. 제2 폴리뉴클레오티드와 비교하여 제1 폴리뉴클레오티드에 대하여 (i) 내지 (v)의 상이한 조합 (상기 열거된 조합 중 임의의 것 포함)이 측정될 수 있다.
(i)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 길이는, 예를 들어 폴리뉴클레오티드와 세공 간의 상호작용의 수 또는 폴리뉴클레오티드와 세공 간의 상호작용의 지속 기간을 결정함으로써 측정될 수 있다.
(ii)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 실체는 수많은 방식으로 측정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 실체는 폴리뉴클레오티드의 서열의 측정과 연계되거나 또는 폴리뉴클레오티드의 서열의 측정과 연계되지 않으면서 측정될 수 있다. 전자는 간단하며; 폴리뉴클레오티드는 서열분석되고 이로써 확인된다. 후자는 여러 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 내의 특별한 모티프의 존재는 측정될 수 있다 (폴리뉴클레오티드의 나머지 서열을 측정하지 않음). 대안적으로, 상기 방법에서의 특별한 전기적 및/또는 광학적 시그널의 측정은 폴리뉴클레오티드를 특별한 공급원으로부터 유래되는 것으로 확인할 수 있다.
(iii)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 서열은 이전에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 적합한 서열분석 방법, 특히 전기적 측정을 이용하는 방법은 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO 2000/28312에 기재되어 있다.
(iv)의 경우, 2차 구조는 각종 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법이 전기적 측정을 포함하는 경우, 2차 구조는 체류 시간 상의 변화 또는 세공을 통하여 흐르는 전류 상의 변화를 이용하여 측정될 수 있다. 이는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 영역과 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 영역을 구별할 수 있게 한다.
(v)의 경우, 임의의 변형의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게, 폴리뉴클레오티드가 메틸화에 의해, 산화에 의해, 손상에 의해, 하나 이상의 단백질로, 또는 하나 이상의 표지, 태그 또는 스페이서로 변형되는 지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 특이적 변형은 세공과의 특이적 상호작용을 초래할 것인데, 이는 아래 기재된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 메틸시토신은 그와 각각의 뉴클레오티드 간의 상호작용 동안 세공을 통하여 흐르는 전류를 기준으로 하여 시토신과 구별될 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나와 접촉된다. 상기 세공은 전형적으로, 막에 존재한다. 적합한 막이 아래에 논의된다. 상기 방법은 막/세공 시스템 (여기서 세공이 막에 존재함)을 연구하기에 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 막횡단 세공 감지에 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 장치는 수성 용액을 포함하는 챔버; 및 이러한 챔버를 두 섹션으로 분리시키는 장벽을 포함한다. 상기 장벽은 전형적으로, 세공을 함유하는 막이 형성되는 애퍼처를 갖는다. 대안적으로 상기 장벽은 세공이 존재하는 막을 형성한다.
상기 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB08/000562 (WO 2008/102120)에 기재된 장치를 사용하여 수행될 수 있다.
각종 상이한 유형의 측정이 이루어질 수 있다. 이는 전기적 측정 및 광학적 측정을 제한 없이 포함한다. 가능한 전기적 측정은 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정 (문헌 [Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12;11(1):279-85]), 및 FET 측정 (국제 출원 WO 2005/124888)을 포함한다. 광학적 측정은 전기적 측정과 조합될 수 있다 (Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301). 측정은 막횡단 전류 측정, 예컨대 세공을 통하여 흐르는 이온 전류의 측정일 수 있다. 대안적으로 측정은 문헌 [Heron et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (5), 1652-1653]에 의해 개시된 바와 같은, 채널을 통한 이온 흐름을 지시하는 형광 측정, 또는 FET를 이용하여 막을 가로지르는 전압의 측정일 수 있다.
전기적 측정은 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO 2000/28312에 기재된 바와 같은 표준 단일 채널 기록 장비를 사용하여 이루어질 수 있다. 대안적으로, 전기적 측정은, 예를 들어 국제 출원 WO 2009/077734 및 국제 출원 WO 2011/067559에 기재된 바와 같은 다채널 시스템을 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 방법은 막을 가로질러 인가된 전위를 이용하여 수행될 수 있다. 이와 같이 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 상기 인가된 전위는 화학적 전위일 수 있다. 이의 한 예는 막, 예컨대 양친매성 층을 가로지르는 염 구배를 이용하는 것이다. 염 구배는 문헌 [Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5]에 개시된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 세공을 관통하는 전류는 폴리뉴클레오티드의 서열을 평가 또는 결정하기 위해 사용된다. 이는 가닥 서열분석으로서 기재될 수 있다.
상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 세공을 관통하는 전류를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 방법에 사용된 장치는 또한, 전위를 인가할 수 있고 막 및 세공을 가로지르는 전기적 시그널을 측정할 수 있는 전기 회로를 포함할 수 있다. 상기 방법은 패치 클램프 또는 전압 클램프를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게, 전압 클램프의 사용을 포함한다.
상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 세공을 관통하는 전류를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 막횡단 단백질 세공을 통하여 이온 전류를 측정하는데 적합한 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 실시예에 개시된다. 상기 방법은 전형적으로, 막 및 세공을 가로 질러 인가된 전압을 이용하여 수행된다. 사용된 전압은 전형적으로, +5 V 내지 -5 V, 예컨대 +4 V 내지 -4 V, +3 V 내지 -3 V 또는 +2 V 내지 -2 V이다. 사용된 전압은 전형적으로, -600 mV 내지 +600 mV 또는 -400 mV 내지 +400 mV이다. 사용된 전압은 바람직하게, -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20 mV 및 0 mV로부터 선택된 하한치 및 +10 mV, + 20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV 및 +400 mV로부터 독립적으로 선택된 상한치를 갖는 범위 내이다. 사용된 전압은 보다 바람직하게, 100 mV 내지 240 mV의 범위 내이고, 가장 바람직하게 120 mV 내지 220 mV의 범위 내이다. 증가된 인가된 전위를 사용함으로써 세공에 의해 상이한 뉴클레오티드 간의 식별을 증가시키는 것이 가능하다.
상기 방법은 전형적으로, 임의의 전하 캐리어, 예컨대 금속 염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 할라이드 염, 예를 들어 클로라이드 염, 예컨대 알칼리 금속 클로라이드 염의 존재하에 수행된다. 전하 캐리어는 이온성 액체 또는 유기 염, 예를 들어 테트라메틸 염화암모늄, 트리메틸페닐 염화암모늄, 페닐트리메틸 염화암모늄, 또는 1-에틸-3-메틸 이미다졸륨 클로라이드를 포함할 수 있다. 상기 논의된 예시적인 장치에서, 염은 챔버 내의 수성 용액에 존재한다. 염화칼륨 (KCl), 염화나트륨 (NaCl), 염화세슘 (CsCl) 또는 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨의 혼합물이 전형적으로 사용된다. KCl, NaCl 및 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨의 혼합물이 바람직하다. 전하 캐리어는 막을 가로질러 비대칭적일 수 있다. 예를 들어, 전하 캐리어의 유형 및/또는 농도는 막의 각각의 측에서 상이할 수 있다.
염 농도는 포화일 수 있다. 염 농도는 3 M 이하일 수 있고, 전형적으로 0.1 내지 2.5 M, 0.3 내지 1.9 M, 0.5 내지 1.8 M, 0.7 내지 1.7 M, 0.9 내지 1.6 M 또는 1 M 내지 1.4 M이다. 염 농도는 바람직하게 150 mM 내지 1 M이다. 상기 방법은 바람직하게, 적어도 0.3 M, 예컨대 적어도 0.4 M, 적어도 0.5 M, 적어도 0.6 M, 적어도 0.8 M, 적어도 1.0 M, 적어도 1.5 M, 적어도 2.0 M, 적어도 2.5 M 또는 적어도 3.0 M의 염 농도를 사용하여 수행된다. 높은 염 농도는 높은 시그널 대 노이즈 비를 제공하고, 정상적인 전류 변동의 배경에 대항하여 확인될 뉴클레오티드의 존재를 지시하는 전류를 허용한다. 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공을 사용하여 높은 염 용액에서 폴리뉴클레오티드를 특징규명할 수 있긴 하지만, 변형된 ClyA 나노세공은 상기 기재된 바와 같이 심지어 낮은 이온 강도 용액에서도 나노세공을 통한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 DNA)의 효율적인 포획 및/또는 전위를 허용해 줄 수 있다.
상기 방법은 전형적으로, 완충제의 존재하에 수행된다. 상기 논의된 예시적인 장치에서, 완충제는 챔버 내의 수성 용액에 존재한다. 어떠한 완충제도 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로, 완충제는 인산염 완충제이다. 다른 적합한 완충제는 HEPES 및 트리스-HCl 완충제이다. 상기 방법은 전형적으로, 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 수행된다. 사용된 pH는 바람직하게 약 7.5 또는 8.0이다.
상기 방법은 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있다. 상기 방법은 전형적으로, 실온에서 수행된다. 상기 방법은 임의로, 효소 기능을 지원해 주는 온도, 예컨대 약 37℃에서 수행된다.
폴리뉴클레오티드 결합 단백질
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 방법은 특정 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 낮은 이온 강도 용액에 부가하여, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고 변형된 ClyA 나노세공을 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 것을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고 상기 세공을 통한 그의 이동을 제어할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질의 예는 헬리카제, 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, DNA 클램프 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 세공과 임의의 순서로 접촉될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제, 및 세공과 접촉되는 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드는 먼저, 상기 단백질과 복합체를 형성하는 것이 바람직하다. 세공을 가로질러 전압이 인가되는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드/단백질 복합체는 세공과 복합체를 형성하고, 이러한 세공을 통한 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어한다.
폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 사용하는 방법에서의 임의의 단계는 전형적으로, 유리 뉴클레오티드 또는 유리 뉴클레오티드 유사체, 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질의 작용을 촉진시켜 주는 효소 보조인자의 존재하에 수행된다.
헬리카제 (들) 및 분자 브레이크(들)
한 실시양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 폴리뉴클레오티드에, 이러한 폴리뉴클레오티드에 부착된 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크를 제공하는 단계;
(b) 막에 존재하는 변형된 ClyA 나노세공을 포함하는 낮은 이온 강도 용액에 상기 폴리뉴클레오티드를 부가하고 이러한 세공을 가로질러 전위를 인가하여, 하나 이상의 헬리카제와 하나 이상의 분자 브레이크를 합치게 하고 둘 다가 세공을 통한 상기 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 단계;
(c) 나노세공을 가로질러 전위를 인가하는 동안, 상기 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 변형된 ClyA 나노세공을 통한 이온 흐름을 측정하며, 여기서 이온 흐름 측정은 폴리뉴클레오티드의 1종 이상의 특징을 지시하는 것이고, 이로써 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 단계. 이러한 유형의 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB2014/052737에 상세히 논의되어 있다.
막
본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공은 막에 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 방법에서, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 막 내의 변형된 ClyA 나노세공과 접촉시킨다. 임의의 막이 사용될 수 있다. 적합한 막은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 막은 바람직하게 양친매성 층이다. 양친매성 층은 친수성 특성과 친지성 특성 둘 다를 갖는 양친매성 분자, 예컨대 인지질로부터 형성된 층이다. 양친매성 분자는 합성이거나 또는 자연적으로 발생할 수 있다. 비-자연적으로 발생하는 양친매성 물질, 및 단층을 형성하는 양친매성 물질은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 블록 공중합체를 포함한다 (Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450). 블록 공중합체는 2개 이상의 단량체 서브유닛이 함께 중합되어 단일 중합체 쇄를 창출시키는 중합체성 물질이다. 블록 공중합체는 전형적으로, 각각의 단량체 서브유닛에 의해 기인되는 특성을 갖는다. 그러나, 블록 공중합체는 개별 서브유닛으로부터 형성된 중합체가 보유하고 있지 않은 독특한 특성을 가질 수 있다. 블록 공중합체는 단량체 서브유닛 중 하나가 소수성 또는 친지성인 반면, 다른 서브유닛(들)이 수성 매질 중에서 친수성이 되도록 조작될 수 있다. 이러한 경우, 블록 공중합체는 양친매성 특성을 보유할 수 있고, 생물학적 막을 모방하는 구조를 형성할 수 있다. 블록 공중합체는 디블록 (2개의 단량체 서브유닛으로 이루어짐)일 수 있지만, 2개 초과의 단량체 서브유닛으로부터 구축되어, 양친매성 물질로서 행동하는 보다 복잡한 배열을 형성할 수 있다. 상기 공중합체는 트리블록, 테트라블록 또는 펜타블록 공중합체일 수 있다. 막은 바람직하게 트리블록 공중합체 막이다.
고세균 양극성 테트라에테르 지질은 지질이 단층 막을 형성하도록 구축되는 자연적으로 발생하는 지질이다. 이러한 지질은 일반적으로, 가혹한 생물학적 환경에서 생존하는 극한성 생물, 호열성 생물, 호염성 생물 및 호산성 생물에서 발견된다. 그들의 안정성은 최종 이중층의 융합된 성질로부터 유래되는 것으로 믿어진다. 일반적인 모티프 친수성-소수성-친수성을 갖는 트리블록 중합체를 창출시킴으로써 이들 생물학적 실체를 모방하는 블록 공중합체 물질을 구축하는 것은 간단하다. 이러한 물질은 지질 이중층과 유사하게 행동하는 단량체성 막을 형성할 수 있고, 소포로부터 층상 막을 통한 일정 범위의 위상 행동을 포괄한다. 이들 트리블록 공중합체로부터 형성된 막은 생물학적 지질 막에 비해 여러 이점을 보유하고 있다. 트리블록 공중합체가 합성되기 때문에, 그 정확한 구축은 막을 형성하고 세공 및 다른 단백질과 상호작용하기 위한 정확한 쇄 길이 및 특성을 제공하도록 조심스럽게 제어될 수 있다.
블록 공중합체는 또한, 지질 하위물질로서 분류되지 않는 서브유닛으로부터 구축될 수 있으며; 예를 들어, 소수성 중합체는 실록산 또는 다른 비-탄화수소 기반 단량체로부터 만들 수 있다. 블록 공중합체의 친수성 서브섹션은 또한, 낮은 단백질 결합 특성을 보유하며, 이는 미가공 생물학적 샘플에 노출될 때 고도로 저항성인 막의 창출을 허용해 준다. 이러한 헤드 기 단위는 또한, 비-고전적 지질 헤드-기로부터 유래될 수있다.
트리블록 공중합체 막은 또한, 생물학적 지질 막과 비교하여 증가된 기계적 및 환경적 안정성, 예를 들어 훨씬 더 높은 작동 온도 또는 pH 범위를 갖는다. 블록 공중합체의 합성 성질은 광범위한 적용 분야에서 중합체 기반의 막을 맞춤화할 수 있는 플랫폼을 제공한다.
막은 가장 바람직하게, 국제 출원 번호 PCT/GB2013/052766 또는 PCT/GB2013/052767에 개시된 막 중 하나이다.
양친매성 분자는 폴리뉴클레오티드의 커플링을 촉진시키도록 화학적으로 변형되거나 또는 기능성화될 수 있다.
양친매성 층은 단층 또는 이중층일 수 있다. 양친매성 층은 전형적으로 평면이다. 양친매성 층은 만곡될 수 있다. 양친매성 층은 지지될 수 있다.
양친매성 막은 전형적으로, 자연적으로 이동성이 있으며, 본질적으로 대략 10-8 cm s-1의 지질 확산 속도를 갖는 2차원 유체로서 작용한다. 이는 세공 및 커플링된 폴리뉴클레오티드가 전형적으로, 양친매성 막 내에서 이동할 수 있다는 것을 의미한다.
막은 지질 이중층일 수 있다. 지질 이중층은 세포 막의 모델이며 일정 범위의 실험 연구를 위한 탁월한 플랫폼 역할을 한다. 예를 들어, 지질 이중층은 단일 채널 기록에 의해 막 단백질의 시험관 내 조사에 사용될 수 있다. 대안적으로, 지질 이중층은 일정 범위의 물질의 존재를 검출하기 위한 바이오센서로서 사용될 수 있다. 지질 이중층은 임의의 지질 이중층일 수 있다. 적합한 지질 이중층은 평면 지질 이중층, 지지된 이중층 또는 리포솜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 지질 이중층은 바람직하게 평면 지질 이중층이다. 적합한 지질 이중층이 국제 출원 번호 PCT/GB08/000563 (WO 2008/102121로서 공개됨), 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (WO 2009/077734로서 공개됨) 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (WO 2006/100484로서 공개됨)에 개시된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나를 포함하는 막에 커플링될 수 있다. 본 방법은 폴리뉴클레오티드를, 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나를 포함하는 막에 커플링시키는 것을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 하나 이상의 앵커를 사용하여 막에 커플링된다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 공지된 방법을 사용하여 막에 커플링될 수 있다.
이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열분석
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥인 경우, 본 방법은 접촉 단계 이전에, 헤어핀 어댑터를 폴리뉴클레오티드의 한 말단과 라이게이션하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 폴리뉴클레오티드의 두 가닥은 폴리뉴클레오티드가 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공과 접촉하거나 또는 이와 상호작용함에 따라 또는 그 이전에 분리될 수 있다. 상기 세공을 통한 폴리뉴클레오티드 이동이 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 예컨대 헬리카제, 또는 분자 브레이크에 의해 제어됨에 따라 상기 두 가닥은 분리될 수 있다. 이는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/051786 (WO 2013/014451로서 공개됨)에 기재되어 있다. 이러한 방식으로 이중 가닥 구조물 상에서 양쪽 가닥을 연결하고 그 정보를 얻는 것이 특성 규명의 효율과 정확성을 증가시켜 준다.
코너 서열분석 라운드
바람직한 실시양태에서, 표적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 한 말단에 헤어핀 루프 어댑터가 제공되고, 본 방법은 폴리뉴클레오티드를 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나와 접촉시켜, 이러한 폴리뉴클레오티드의 양쪽 가닥이 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계; 및 폴리뉴클레오티드의 양쪽 가닥이 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취하며, 여기서 이러한 측정치는 폴리뉴클레오티드의 가닥의 1종 이상의 특징을 지시하는 것이고, 이로써 표적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 단계를 포함한다. 상기 논의된 실시양태 중 임의의 것이 이러한 실시양태에도 동등하게 적용된다.
리더 서열
상기 접촉 단계 이전에, 상기 방법은 바람직하게, 세공 내로 우선적으로 스레딩되는 리더 서열을 폴리뉴클레오티드에 부착시키는 것을 포함한다. 이러한 리더 서열은 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 촉진시켜 준다. 리더 서열는 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나 내로 우선적으로 스레딩되고 이로써 나노세공을 통한 폴리뉴클레오티드의 이동을 촉진시키도록 설계된다. 리더 서열은 또한, 폴리뉴클레오티드를 상기 논의된 바와 같은 하나 이상의 앵커와 연결시키기 위해 사용될 수 있다.
변형된 폴리뉴클레오티드
특징규명 이전에, 주형으로서 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제가 변형된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 조건 하에 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 상기 폴리머라제 및 특정 집단의 유리 뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 이러한 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있으며, 여기서 변형된 폴리뉴클레오티드가 형성될 때, 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 종 중 하나 이상을 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시켜 준다. 이어서, 폴리뉴클레오티드에 부착된 하나 이상의 헬리카제 및 폴리뉴클레오티드에 부착된 하나 이상의 분자 브레이크가 상기 변형된 폴리뉴클레오티드에 제공될 수 있다. 이러한 유형의 변형이 국제 출원 번호 PCT/GB2015/050483에 기재되어 있다. 본원에 논의된 폴리머라제 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
주형으로서 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제가 변형된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 조건 하에 상기 주형 폴리뉴클레오티드를 상기 폴리머라제와 접촉시킨다. 이러한 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 상업적으로 이용가능한 폴리머라제 완충제, 예컨대 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)®로부터의 완충제에서 폴리머라제와 접촉된다. 프라이머 또는 3' 헤어핀은 전형적으로, 폴리머라제 연장을 위한 핵형성 지점으로서 사용된다.
막횡단 세공을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 것, 예컨대 서열분석하는 것은 전형적으로, k가 양의 정수인 k 뉴클레오티드 (즉, 'k-량체')로 구성된 중합체 단위를 분석하는 것을 포함한다. 이는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/052343 (WO 2013/041878로서 공개됨)에 논의되어 있다. 상이한 k-량체에 대한 전류 측정치 간을 명확히 분리하는 것이 바람직하지만, 이러한 측정치 중 일부는 중복되는 것이 일반적이다. 특히 k-량체 내의 중합체 단위의 수가 많으면, 즉 k 값이 높으면, 상이한 k-량체에 의해 생성된 측정치를 결정하는 것이 어려워질 수 있어, 폴리뉴클레오티드에 관한 정보, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 기본 서열의 추정을 유도하는데 손상이 초래된다.
표적 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 종을, 변형된 폴리뉴클레오티드 내의 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체함으로써, 변형된 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 것과 상이한 k-량체를 함유한다. 변형된 폴리뉴클레오티드 내의 상이한 k-량체는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 k-량체와는 상이한 전류 측정치를 생성시킬 수 있으므로, 변형된 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드와 상이한 정보를 제공한다. 변형된 폴리뉴클레오티드로부터의 부가 정보는 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 것을 더 용이하게 만들 수 있다. 일부 경우에는, 변형된 폴리뉴클레오티드 자체를 특징규명하는 것이 더 용이할 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리뉴클레오티드는 그들의 전류 측정치 간의 증가된 분리 또는 명확한 분리를 수반하는 k-량체 또는 감소된 노이즈를 갖는 k-량체를 포함하도록 설계될 수 있다.
폴리머라제는 바람직하게, 변형된 폴리뉴클레오티드를 형성시킬 때, 표적 폴리뉴클레오티드 내의 2개 이상의 뉴클레오티드 종을 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시킨다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 2개 이상의 뉴클레오티드 종 각각을 별개의 뉴클레오티드 종으로 대체시킬 수 있다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 2개 이상의 뉴클레오티드 종 각각을 동일한 뉴클레오티드 종으로 대체시킬 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드가 DNA인 경우, 변형된 폴리뉴클레오티드 내의 상이한 뉴클레오티드 종은 전형적으로, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 또는 메틸시토신과 상이한 핵염기를 포함하고/거나 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시시티딘 또는 데옥시메틸시티딘과 상이한 뉴클레오시드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우, 변형된 폴리뉴클레오티드 내의 상이한 뉴클레오티드 종은 전형적으로, 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신 또는 메틸시토신과 상이한 핵염기를 포함하고/거나 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 또는 메틸시티딘과 상이한 뉴클레오시드를 포함한다. 상이한 뉴클레오티드 종은 상기 논의된 범용 뉴클레오티드 중 임의의 것일 수 있다.
폴리머라제는 하나 이상의 뉴클레오티드 종을, 이러한 하나 이상의 뉴클레오티드 종에 없는 화학적 기 또는 원자를 포함하는 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시킬 수 있다. 이러한 화학적 기는 프로피닐 기, 티오 기, 옥소 기, 메틸 기, 히드록시메틸 기, 포르밀 기, 카르복시 기, 카르보닐 기, 벤질 기, 프로파르길 기 또는 프로파르길아민 기일 수 있다.
폴리머라제는 하나 이상의 뉴클레오티드 종을, 이러한 하나 이상의 뉴클레오티드 종에 존재하는 화학적 기 또는 원자가 결여된 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시킬 수 있다. 폴리머라제는 하나 이상의 뉴클레오티드 종을, 변경된 전기음성도를 갖는 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시킬 수 있다. 변경된 전기음성도를 갖는 상이한 뉴클레오티드 종은 바람직하게, 할로겐 원자를 포함한다.
본 방법은 바람직하게, 변형된 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 상이한 뉴클레오티드 종으로부터 핵염기를 선택적으로 제거하는 것을 추가로 포함한다.
다른 특징규명 방법
또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제가 뉴클레오티드를 상기 폴리뉴클레오티드 내로 혼입시킴에 따라 방출되는 표지된 종을 검출함으로써 그 특징이 규명된다. 폴리머라제는 상기 폴리뉴클레오티드를 주형으로서 사용한다. 각각의 표지된 종은 각각의 뉴클레오티드에 대해 특이적이다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공, 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오티드와 접촉시켜, 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드(들)에 부가될 때 폴리머라제에 의해 포스페이트 표지된 종이 순차적으로 방출되도록 하며, 여기서 포스페이트 종은 각각의 뉴클레오티드에 대해 특이적인 표지를 함유한다. 폴리머라제는 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 포스페이트 표지된 종은 세공을 이용하여 검출되며 이로써 폴리뉴클레오티드를 특징규명한다. 이러한 유형의 방법은 유럽 출원 번호 13187149.3 (EP 2682460으로서 공개됨)에 개시된다. 상기 논의된 실시양태 중 임의의 것이 본 방법에 동등하게 적용된다.
키트
본 개시내용의 또 다른 측면은 또한, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본원에 기재된 변형된 ClyA 나노세공 중 어느 하나 및 막의 성분을 포함한다. 막은 바람직하게, 상기 성분으로부터 형성된다. 세공은 바람직하게, 막에 존재한다. 키트는 상기 개시된 막 중 임의의 것의 성분, 예컨대 양친매성 층 또는 트리블록 공중합체 막을 포함할 수 있다.
키트는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
키트는 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키기 위한 하나 이상의 앵커를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것을 수행할 수 있게 해주는 하나 이상의 다른 시약 또는 기기를 부가적으로 포함할 수 있다. 이러한 시약 또는 기기는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 적합한 완충제(들) (수성 용액), 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단 (예컨대, 용기, 또는 바늘을 포함하는 기기), 폴리뉴클레오티드를 증폭 및/또는 발현시키기 위한 수단 또는 전압 또는 패치 클램프 장치. 시약은 키트 내에 건조 상태로 존재할 수 있으므로, 유체 샘플이 시약을 재현탁시키도록 한다. 키트는 또한 임의로, 이러한 키트가 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 사용될 수 있도록 해주는 설명서, 또는 본 발명의 방법이 사용될 수 있는 유기체에 관한 세부사항을 포함할 수 있다.
장치
본원에 기재된 또 다른 측면은 또한, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위한 장치를 제공한다. 이러한 장치는 복수개의 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ClyA 나노세공 및 복수개의 막을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 변형된 ClyA 나노세공이 복수개의 막에 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 ClyA 나노세공의 수와 막의 수는 동등하다. 한 실시양태에서, 단일 변형된 ClyA 나노세공이 각각의 막에 존재한다.
상기 장치는 본원에 기재된 바와 같은 방법 중 임의의 것을 수행하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 장치는 폴리뉴클레오티드 분석을 위한 임의의 통상적인 장치, 예컨대 어레이 또는 칩일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위한 방법을 참조하여 상기 논의된 실시양태 중 어떠한 것도 본원에 기재된 장치에 동등하게 적용가능하다. 장치는 본원에 기재된 키트에 존재하는 특징 중 임의의 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치는, 예를 들어 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하기 위한 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 수행하도록 설정된다.
한 실시양태에서, 상기 장치는 (a) 복수개의 변형된 ClyA 나노세공 및 막을 지지할 수 있고, 나노세공 및 막을 이용하여 폴리뉴클레오티드 특징규명을 수행하기 위해 작동가능한 센서 디바이스; 및 (b) 이러한 특징규명을 수행하기 위한 물질의 전달을 위한 적어도 하나의 포트를 포함한다.
대안적으로, 상기 장치는 (a) 복수개의 변형된 ClyA 나노세공 및 막을 지지할 수 있고, 나노세공 및 막을 이용하여 폴리뉴클레오티드 특징규명을 수행하기 위해 작동가능한 센서 디바이스; 및 (b) 이러한 특징규명을 수행하기 위한 물질의 유지를 위한 적어도 하나의 저장소를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 장치는 (a) 복수개의 변형된 ClyA 나노세공 및 막을 지지할 수 있고, 세공 및 막을 이용하여 폴리뉴클레오티드 특징규명을 수행하기 위해 작동가능한 센서 디바이스; (b) 이러한 특징규명을 수행하기 위한 물질의 유지를 위한 적어도 하나의 저장소; (c) 물질을 이러한 적어도 하나의 저장소로부터 상기 센서 디바이스로 제어가능하게 공급하도록 설정된 유체 공학 시스템; 및 (d) 각각의 샘플을 수용하기 위한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 유체 공학 시스템은 하나 이상의 용기로부터의 샘플을 선택적으로 센서 디바이스에 공급하도록 설정된다.
상기 장치는 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (WO 2009/077734로서 공개됨), PCT/GB10/000789 (WO 2010/122293으로서 공개됨), 국제 출원 번호 PCT/GB10/002206 (WO 2011/067559로서 공개됨) 또는 국제 출원 번호 PCT/US99/25679 (WO 00/28312로서 공개됨)에 기재된 것 중 임의의 것일 수 있다.
추가의 상세한 설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 근거하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 다음 구체적 실시양태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 임의의 방식으로 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 공보는 본원에 언급된 목적 또는 주제에 대한 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1. 생리학적 이온 강도에서 DNA 전위를 가능하게 하는 나노세공의 정확한 나노스케일 조작
생물학에 있어서의 많은 중요한 프로세스는 핵 세공을 가로지르는 핵산 수송, 막 채널을 통한 단백질 전위 및 표적 세포 내로의 바이러스 DNA 주사와 같은 나노미터 스케일 세공을 통한 생체 고분자의 전위를 포함한다. 더욱이, 절연 막에 매립된 생물학적 및 인공적 나노세공은 이러한 프로세스를 조사하는데 유용한 도구를 제공하고, 신속한 DNA 또는 단백질 서열분석, 단일 분자 DNA 서열분석 및 분석, 및 바이오마커 감지에 적용될 수 있다. 나노세공을 가로지르는 DNA 전위의 메카니즘이 특히 조사되었다. 여러 포탈 박테리오파지 단백질의 결정 구조는 DNA 패킹 및 주사 동안, dsDNA가 양전하의 고리로써 장식되는 강한 음의 표면을 수반한 좁은 나노세공 (~3.5 nm)을 가로질러 전위된다는 것을 밝혀내었다. 나노세공의 전기음성 내부 표면은 음으로 하전된 DNA의 슬라이딩을 촉진시키는 반면, 양전하의 역할은 이러한 프로세스를 촉진시키는 것으로 생각된다. 본 실시예에서는, 생리학적 이온 강도에서 포탈 단백질과 동일한 폴드, 크기 및 전체 내부 전하를 갖는 ClyA 나노세공을 가로지르는 DNA의 전기영동 전위가, 양전하의 2개 고리가 나노세공의 넓은 입구 및 중간-섹션에서 조작되는 경우에만 관찰될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 강하게 전기음성인 나노세공의 3.3 nm 내부 협착부는 변형을 필요로 하지 않았다. 이러한 발견은 좁은 협착부를 통한 DNA 전위에 대한 엔트로피 및 정전기 장벽을 극복하기 위해 DNA를 정렬하는데에는 상기와 같이 조작된 양전하가 중요하다는 것을 지시한다. 특정 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 음전하 밀도를 갖는 좁은 나노세공을 통해 전위시키기 위해서는 DNA 분자가 배향되어야 한다.
지질 막으로 재구성된 생물학적 나노세공을 통해 흐르는 이온 전류는 작은 분자 또는 폴딩된 단백질을 확인하고 단일 분자 수준에서 화학적 또는 효소적 반응을 모니터링하는데 사용되어 왔다. 인공 막으로 재구성된 나노세공을 가로지르는 DNA의 전기영동 전위는 DNA 서열분석 및 바이오마커 인식과 같은 실제적 적용 분야에 큰 가능성을 제공한다. 막 단백질 그 자체가 아닌 φ29 포탈 단백질이 블랙 지질 이중층에 삽입되는 것으로 밝혀졌고, 그러한 나노세공은 1.0/0.5 mM NaCl에서 dsDNA를 전기영동적으로 전위시켰다. 그러나, 막 삽입을 허용한 나노세공의 정확한 소수성 변형은 공지되어 있지 않았다. 사실, φ29 나노세공은 종종 지질 막으로부터 방출되므로, 실제적 적용에 있어서의 제한이 제기되었다. dsDNA는 그래핀 또는 이황화몰리브덴 이중층과 같은 원자 얇은 물질을 제외하고는 대부분이 음의 내부 표면 전하를 갖는 고체 상태 막 상에 제조된 인공 나노세공을 통해 전위되는 것으로 나타났다. 용액의 데바이 길이와 거의 동등한 수준의 반경을 갖는 이러한 나노세공에서는, 내부 나노세공 벽 상에 전기-이중층 (EDL)에 의해 생성된 표면 전위가 중첩되어, 나노세공 내로의 DNA의 진입을 위한 큰 정전기 장벽이 초래된다. 그 결과로서, 340 nM 염에서 또는 비대칭적 염 농도 하에 작은 나노세공 (~3.5 nm)을 사용하거나 또는 큰 나노세공 (10 nm)을 사용하여 생리학적 이온 강도에서 고체 상태 나노세공을 가로지르는 DNA의 전위가 관찰되었다. 부가적으로, DNA의 크기와 거의 동등한 수준의 직경 (dsDNA의 B-형태의 경우에는 ~2.2 nm이고 ssDNA의 경우에는 ~1 nm임)을 갖는 고체 상태 나노세공을 가로지르는 DNA의 전위는 아직까지 생리학적 이온 강도에서 관찰되지 않았다.
~3.3 nm의 내부 협착부를 수반한 12량체 단백질인 ClyA 나노세공 (도 1, 패널 A)이 폴딩된 단백질을 연구하기 위한 도구로서 사용되었다. 나노세공을 가로지르는 dsDNA 전위가 2.5 M NaCl 용액에서 관찰되긴 하였지만, 상기 세공의 강한 음성 내부 (도 1, 패널 A)는 더 낮은 이온 강도에서의 DNA 전위를 방지하였다. 본 실시예에서는, 생리학적 이온 강도에서 DNA를 전위시킬 수 있도록 ClyA 나노세공을 조작하였다. 이는 분자와 DNA 간의 정전기적 상호작용이 중요한 많은 적용 분야, 예를 들어 효소를 사용하여 나노세공을 가로지르는 DNA의 전위를 제어하거나 또는 DNA-단백질 상호작용을 연구하는 DNA 서열분석 또는 맵핑에 유용하다. 양전하의 2개 고리가 나노세공의 더 넓은 시스 측에 부가된 후에 DNA 전위가 관찰되었지만, 나노세공의 더 협착된 트랜스 진입부의 변형은 DNA 전위의 효율을 개선시키지 못하였다. 또한, 상기 변형은 나노세공의 이온 선택도를 변화시키지 않았고 φ29 포탈 단백질의 전하 분포를 반영하였다. 추가로, 조작된 세공은 나노세공의 넓은 측면에서만 DNA의 전위를 허용하였다. 흥미롭게도, DNA 상에 슬라이딩되는 많은 단백질은 상기 조작된 ClyA 나노세공과 유사한 표면 전하를 나타내며, 이는 양전하와 음전하의 교대가 나노스케일 세공을 가로지르는 DNA의 전위를 개선시키기 위한 일반적인 메카니즘을 제공할 수도 있다는 것을 지시한다. 본 실시예는 나노세공의 모양과 내부 표면 전하의 정확한 조작이 DNA의 직경과 유사한 직경을 갖는 나노-스케일 세공을 가로지르는 DNA의 전위와 슬라이딩에 중요하다는 것을 보여준다.
결과
DNA를 포획하도록 ClyA 나노세공을 조작함
ClyA-AS (도 1, 패널 A; 도 11, 패널 A)는 평면 지질 이중층에서의 그의 유리한 소유권을 위해 선택되고 ssDNA 또는 dsDNA의 전위가 2.0 M NaCl 이온 강도 이상에서만 관찰되는, 살모넬라 티피로부터의 세포용해소 A의 조작된 버전이다. 가장 가능하게는, 낮은 이온 강도에서, 나노세공 내부의 강한 음의 정전기 전위 (도 11, 패널 B)는 DNA 진입과 전위를 방지하는 반면, 높은 이온 강도에서는 나노세공 표면의 전하가 효과적으로 스크리닝된다. 생리학적 이온 강도에서 나노세공에 의한 DNA의 포획을 유도시키기 위하여, ClyA-AS 나노세공의 내부 전하가 변형되었다 (표 1 및 2 및 도 1, 패널 A; 도 11, 패널 A). 때때로 ClyA 변이체는 개방 세공 전도도 (게이팅)의 일시적인 감소를 보여주었다. 게이팅의 측정치로서, 전형적인 나노세공이 30초의 시간 간격 동안 개방된 채로 유지되는 인가된 전압으로서 규정된 게이팅 전압 (VG)이 사용되었다 (표 1). 1 μM의 90량체 3'-비오티닐화 ssDNA 분자 (도 1, 패널 A, 표 3)를 부가한 다음, 등몰 농도 하의 그의 상보적 가닥을 부가하고 (도 1, 패널 B, 표 3), 최종적으로 뉴트라비딘 (1.2 μM, 단량체)을 부가함으로써, 상기 변형된 나노세공을 통한 DNA의 전위를 VG에서 시험하였다.
아르기닌 잔기의 형태의 양전하의 단일 고리를 ClyA-AS의 시스 진입부에 도입한 다음 (S110R, ClyA-R, 도 1, 패널 A; 도 11, 패널 A), 나노세공의 3개 섹션: 시스 진입부, 중간-섹션, 및 트랜스 협착부를 변형시켰다 (도 1, 패널 A; 도 11, 패널 A). ClyA-R의 시스 개구부에서 중성 잔기를 양성 잔기로 치환시키면, 150 mM NaCl에서 DNA 전위가 나타나지 않았다 (표 1, 표 2). 시스 개구부에서의 부가 양전하는 평면 지질 이중층 내로의 채널 삽입이 전혀 없었거나 (ClyA-R-E106R 및 ClyA-R-D114R) 또는 150 mM NaCl에서의 DNA 전위가 없었다는 것을 보여주었다 (ClyA-R-D122R 및 ClyA-R-D129R). ClyA-R 나노세공의 중간-섹션 내의 아르기닌 고리는, 위치 64에서의 음으로 하전된 글루타메이트 잔기를 아르기닌으로 대체시킨 경우 (D64R, ClyA-RR)에 ssDNA (도 1, 패널 C) 및 dsDNA (도 1, 패널 D) 전위를 유도시켰지만, 인근 위치에서의 중성 측쇄를 아르기닌으로 치환시킨 경우 (Q56R)에는 그렇지 못하였다. 인근 위치에서의 중성 측쇄를 아르기닌으로 치환시키거나 (Q56R), 막횡단 영역 내의 음으로 하전된 잔기를 제거하거나 (ClyA-R-E11S) 또는 양으로 하전된 잔기를 부가하는 것이 (ClyA-R-Q8K) 150 mM NaCl 용액에서 DNA 전위 이벤트를 전혀 유도시키지 못하였다 (도 6). 놀랍게도, ClyA-R의 중간-섹션와 트랜스 진입부 둘 다 내에서 중성 잔기를 양으로 하전된 잔기로 치환시키는 것이 (ClyA-R-Q56R-Q8K) 또한, DNA 전위 이벤트를 유도시키지 못하였다 (도 6). ClyA-R-D129R을 제외한, 시험된 모든 돌연변이가 게이팅 전압을 감소시켰다 (표 1). ClyA-RR이, ssDNA 또는 dsDNA 중 하나를 나노세공의 시스 측에 부가한 후에 DNA 유도된 전류 이벤트를 나타낸 유일한 ClyA 돌연변이체였다 (+70 mV, 도 1C-D 및 6). ClyA-RR만이 DNA 전위를 허용하였다는 관찰 내용에도 불구하고, ClyA-RR, ClyA-R 및 ClyA-AS 모두가 동일한 이온 선택도를 나타내었으며 (PNa+/PCl- = 각각 1.9±0.7, 2.0±1.6, 1.9±0.9, 표 4), 이는 나노세공의 이온 선택도가 나노세공의 막횡단 영역의 전하 분포에 의해 지배되며 나노세공을 통한 증강된 전기 삼투 흐름에 의해 유도되지 않는다는 것을 지시한다.
보다 일반적으로, 영역 A에서의 제1 아미노산의 치환 (도 20에 나타낸 바와 같음)은 적어도 델타 1의 부가된 양전하를 가질 수 있고 (즉, 양으로 하전된 아미노산에 의한 중성 아미노산의 치환), 영역 B에서의 치환은 적어도 델타 2의 부가된 양전하를 가질 수 있다 (즉, 양으로 하전된 아미노산에 의한 음으로 하전된 아미노산의 치환).
2개의 부가 아르기닌 고리에 의해 유발된 정전기 전위의 변화에 관한 더 깊은 통찰을 얻기 위해, 이. 콜라이 ClyA 결정 구조로부터 출발하여 VMD (문헌 [Humphrey et al. J. Mol. Graphics (1996) 14: 33-38]) 및 NAMD (문헌 [Phillips et al., J. Comput. Chem. (2005) 26: 1781-1802])를 사용하여 ClyA-AS 및 ClyA-RR의 완전 원자 상동성 모델을 구축하였다. 예를 들어, 문헌 [Baker et al., PNAS (2001) 98: 10037-10041; Dolinsky et al., Nucleic Acids Res. (2004) 32: W665-W667; and Dolinsky et al., Nucleic Acid Res. (2007) 35: W522-W525]에 기재된 적응형 포아송-볼츠만 해법 (APBS)을 이용하여 150 mM NaCl에서의 양쪽 세공의 전기 전위 분포도를 계산하였다 (도 11, 패널 B). ClyA-AS에서는, 세공의 중심에서의 전위가 시스 진입부에서 중간-섹션을 거쳐 트랜스 진입부로 이동하는 것이 점점 더 음성적인 것으로 밝혀졌다 (각각 평균 -2.6, -4.8, 및 -15.2 mV). ClyA-RR의 경우에는, 세공의 시스 진입부와 중간-섹션 둘 다에서 전위 상의 상승이 관찰될 수 있었다 (각각 평균 -0.3 및 -1.1 mV). 트랜스 협착부에서의 전위는 평균 -17.3 mV로 더 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 값은 외부 바이어스가 인가되지 않은 경우에 계산된다는 것을 인지해야 한다.
표 1: 조작된 ClyA 나노세공 변이체의 전기적 특성. 나노세공의 활성은 시스 챔버에 ~0.1 ng의 올리고머성 단백질을 부가함으로써 시험되었다. 음의 활성은 채널 삽입이 관찰되지 않았다는 것을 지시한다. VG는 게이팅 전압이고, 30초의 시간 간격 이내에 게이팅 이벤트가 관찰되지 않는 가장 높은 인가 전압을 나타낸다. DNA 전위는 dsDNA 로탁산이 형성될 수 있었다는 것을 지시한다. 각각의 데이터 점은 적어도 3개의 실험의 평균이고 오차는 표준 편차이다. 실험은 0.15 M NaCl, 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5 용액에서 수행되었다.
표 1
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DNA 전위의 증거물로서의 DNA 로탁산
로탁산은 2개의 스토퍼(stopper)에 의해 고정된 스레드를 감싸는 매크로사이클에 의해 형성된 덤벨 모양의 분자이다. 본 실시예에서는, 나노세공을 통한 ssDNA 및 dsDNA의 전위를 입증하기 위하여 2개의 나노세공/DNA 로탁산을 150 mM NaCl 용액에서 형성시켰다. 제1 로탁산은 시스 구획에 부가된 초기 스레드 (2a, 표 3)로서 100량체 5'-비오티닐화 ssDNA 분자를 사용하여 형성시켰다. 제2 로탁산은 31개 염기 3' 비오틴 오버행으로 연장된 3'-비오티닐화 59개 염기 쌍 dsDNA 분자를 사용하여 형성시켰다 (1a/1c, 표 3). 이들 로탁산은 나노세공의 반대 측에, 2a 또는 1a/1c의 오버행과 각각 혼성화하도록 설계된 또 다른 비오티닐화 ssDNA 분자인 2b (50량체, 5'-비오티닐화) 또는 1d (31량체, 3'-비오티닐화)를 부가함으로써 고정시켰다. 시스 용액과 트랜스 용액 둘 다는 뉴트라비딘 (NA, 0.3 μM)을 함유하였으며, 이는 비오틴과 복합체를 형성하였고 나노세공을 가로지르는 DNA 가닥의 완전한 전위를 방지하였다.
150 mM NaCl 및 +50 mV에서는, ssDNA와 dsDNA/ssDNA 둘 다가 나노세공을 스레딩하였지만 (각각 IRES+50 92±0.02, 및 0.84±0.07, N=3), 인가된 전위가 -50 mV로 역전되는 경우에는 세공으로부터 분출되었다 (도 2, 패널 A-B). DNA:뉴트라비딘 스토퍼를 트랜스 용액에 후속 부가하면, 양쪽 전위에서 영구적인 차단이 유도되었으며, 이는 DNA 로탁산의 어셈블리를 지시하고, 양쪽 스레드가 나노세공을 전위시켰다는 것을 보여준다. 음성 인가된 전위에서는, 차단된 이온 전류가 양쪽 로탁산에 대한 개방 세공 전류보다 더 높았다 (ssDNA 및 dsDNA/ssDNA 스레드의 경우, 각각 IRES-50 = 1.16±0.03 및 1.11±0.06; N=3 비의존성 나노세공 실험, 도 2, 패널 A-B; 도 12, 패널 A-B). 이러한 효과는 낮은 이온 강도에서 10 nm 고체 상태 나노세공을 통한 DNA의 전위에 대하여 이전에 관찰되었고, DNA 차단된 세공 내부의 반대이온의 축적에 의해 설명되었다. 이와는 반대로, 양성 인가된 전위에서는, 개방 세공 전류가 상기 차단된 전류보다 더 높았으며 (도 1, 패널 C-D 및 도 2, 패널 A-B; 도 12, 패널 A-B), 이는 이러한 입체배치에서는 뉴트라비딘이 나노세공의 루멘과 상호작용할 수도 있고 DNA 상의 반대 이온의 축적이 나노세공의 시스 측과 트랜스 측에서 상이하다는 것을 지시한다.
DNA 포획/ 스레딩 및 전위는 용액의 이온 강도에 좌우된다
이벤트 사이 시간 τon의 역수인 포획 속도 kon (표 7, +70mV, 1 μM DNA)는 ssDNA와 dsDNA 둘 다에 대한 용액의 데바이 길이 (λD)에 따라 증가되었다 (도 3, 패널 B-C; 도 13, 패널 A-B). 그러나, dsDNA 포획 속도는 λD에 따라 선형적으로 증가되었지만 (도 13, 패널 A), ssDNA 포획 속도는 λD에 따라 기하 급수적으로 증가되었다 (도 13, 패널 B). 따라서, 이는 dsDNA 및 ssDNA에 대한 상이한 포획 메카니즘을 지시한다. 시스 측 상에 부가된 dsDNA 전위의 빈도는 용액의 데바이 길이에 따라 선형적으로 증가되었으며 (+70 mV, 도 3A, 7 및 8), 이는 DNA와 나노세공 간의 정전기적 상호작용이 DNA 진입과 전위에 중요하다는 것을 지시한다. 고체 상태 나노세공을 이용하여 전에 보고된 바와 같이, DNA 차단된 나노세공의 잔류 전류는 용액의 이온 강도가 감소함에 따라 증가되었다 (예를 들어, 2.5 M NaCl에서의 0.78±0.09에서 150 mM NaCl에서의 0.92±0.02로 증가됨). 흥미롭게도, DNA 차단의 IRES와 용액의 데바이 길이 간의 선형 관계가 밝혀졌다 (도 3, 패널 B-C). 뉴트라비딘과의 복합체 내의 dsDNA에 대해서는, 잔류 전류가 유리 DNA 전위 동안보다 ~10% 더 낮았으며, 이는 뉴트라비딘이, 가장 가능하게는 나노세공 루멘과 상호작용함으로써 차단의 전반적인 이온 전류에 기여하였다는 것을 지시한다.
ssDNA 전위의 빈도는 용액의 데바이 길이에 따라 선형적 (R2=0.78)이 아니라 기하 급수적 (R2=0.99)으로 증가되었으며 (도 3, 패널 C), 이는 ClyA 루멘 내에서의 조작된 양전하와 DNA 간의 상호작용 이외의 부가 요인이 나노세공 진입 및/또는 전위에 중요한 역할을 한다는 것을 지시한다. 150 mM NaCl에서는, 뉴트라비딘과의 복합체 내의 ssDNA 분자가 ClyA-RR 나노세공에 대한 영구적인 차단을 나타낸 반면, 1 M NaCl 또는 그 초과에서는, 그 차단이 일시적이었다 (도 3, 패널 D, 도 10). 이들 데이터에 대한 가능성 있는 설명은, 높은 이온 강도에서는 ssDNA가 시스 측으로부터 세공 내로 들어가고 빠져나온다는 것이다. 이온 강도 ≥ 1 M에서는, 뉴트라비딘의 존재 및 부재 하에서의 ssDNA에 대한 IRES 값이 동일하였으며 (도 3, 패널 C; 도 10), 이는 이들 조건 하에서 ssDNA가 나노세공을 완전히 스레딩하지 않을 수도 있어, 뉴트라비딘이 ClyA의 루멘과 상호작용하지 못하게 한다는 것을 지시한다.
ClyA 나노세공 내로의 DNA의 단방향 진입
150 mM NaCl 용액 및 음성 인가된 전위 (-100 mV 이하) 하에서는, 1 μM의 ssDNA 또는 dsDNA를 ClyA-RR의 시스 및 트랜스 구획에 부가하는 것이 DNA 차단을 유도시키지 못하였으며, 이는 DNA가 나노세공의 트랜스 입구로부터 나노세공에 진입할 수 없다는 것을 지시한다 (도 4, 패널 A). 양성 인가된 바이어스 하에서는, ~+50 mV 초과 전위에서 전류 차단이 나타났으며, 이는 나노세공의 시스 측으로부터의 ssDNA의 전위에 대한 전압 한계치가 존재한다는 것을 암시한다. 그러나, 트랜스 구획으로부터의 DNA의 진입 (도 4, 패널 B) 및 전위 (도 9)가 1 M NaCl 용액에서 관찰되었으며, 이는 150 mM NaCl에서 트랜스 구획으로부터의 전위를 방지하는 에너지 장벽이 사실상 정전기라는 것을 지시한다.
생리학적 이온 강도 하에 트랜스 구획으로부터의 DNA의 진입을 관찰하기 위하여, ClyA-RR 나노세공의 막횡단 영역의 전하를 리모델링하였다 (표 5 및 도 10). 나노세공의 막횡단 영역 내에서의 음으로 하전된 잔기의 치환은, 1 μM의 dsDNA 1을 음성적으로 인가된 전위 하에 트랜스 챔버에 부가할 때 전류 차단을 유도시키지 못한 것으로 밝혀졌으며 (도 10), 이는 이들 조건 하에 ClyA-RR 나노세공의 시스 및 트랜스 측으로부터의 DNA의 전위에 대한 비교적 큰 비대칭적 장벽을 지시한다.
논의
정확한 나노세공 조작은 생리학적 이온 강도에서의 DNA 전위를 지지한 다
본 실시예에서는, 생리학적 이온 강도에서 DNA의 전기영동 전위를 허용하도록 ClyA 나노세공을 조작하였다. 두 세트의 양전하를 ClyA 나노세공의 진입부와 중간-섹션에 도입한 경우에 DNA 전위가 관찰되었다 (도 11, 패널 A). 놀랍게도, DNA 전위에 대한 가장 높은 엔트로피 및 정전기 장벽을 제공해 주는, 나노세공의 트랜스 진입 (도 11, 패널 A-B)은 변형을 필요로 하지 않았다. 추가로, ClyA의 트랜스 진입부의 전하에 대한 광범위한 리모델링에도 불구하고 (표 1-2), 나노세공의 더 넓은 시스 진입부로부터 개시된 경우에만 DNA 전위가 관찰될 수 있었다. 더욱이, ClyA-RR 나노세공을 통한 dsDNA 전위의 빈도는 용액의 데바이 길이에 따라 증가되었으며 (도 13, 패널 A), 이는 ClyA-RR의 시스 진입부와 dsDNA의 유리한 정전기적 상호작용이, 상기 DNA와 나노세공 협착부의 불리한 정전기적 반발력보다 압도적으로 우세하다는 것을 보여준다. dsDNA의 강성은 시험된 일정 범위의 이온 강도에 걸쳐 상당히 변화되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 추가로, 이온 강도가 더 낮아짐에 따라 증가된 전기 삼투 흐름은 DNA 전위의 증가된 빈도를 설명할 수 없으며, 이는 이러한 전기 삼투 흐름이 DNA 진입과 전위를 반대하기 때문이다. 따라서, 이들 데이터는 나노세공의 시스 루멘이 나노세공의 협착부를 통하여 DNA의 전위를 개시하는데 중요하다는 것을 지시한다.
나노세공을 통해 전위되는 DNA 분자는 전기 구동력과, DNA의 전위를 반대하는 나노세공 내부 전기 삼투 흐름 (EOF)으로부터 발생하는 유체 역학 점성 항력(drag force)을 받게 된다. ClyA와 대부분의 고체 상태 나노세공은, 통상적으로 전기 이중층 (EDL)이라고 불리는 표면과의 즉각적인 접촉에서 양이온 층에 의해 정전기적으로 균형 잡힌 음의 표면 전하를 갖고 있다. 인가된 전기장 하에, EDL에서의 이온의 이동은 반대 이온의 우선적 전위를 유도시켜, 결국에는 EOF를 생성하고 나노세공 이온을 선택적으로 만든다 (예를 들어, ClyA-AS PNa/Pk=1.9, 표 2). 전해질에 의한 스크리닝으로 인해, EDL 힘은 확산 층 전반에 걸쳐 기하 급수적 방식으로 붕괴된다. 이러한 힘의 범위는 데바이 길이와 표면 전위에 의한 그의 강도에 의해 제공된다. 좁은 나노세공, 특히 낮은 염 농도의 체제에서는, 확산 층을 포함한 EDL의 두께가 나노세공의 크기와 거의 동등한 수준일 수도 있어, 중첩된 EDL이 산출된다. 이러한 체제 하에서는, 그러한 나노세공에 접근하는 DNA 분자 (직경 2.2 nm)가 강한 표면 전위를 경험할 것이고, 음의 표면 전하를 갖는 나노세공의 경우에도 나노세공 내로의 DNA의 진입을 반대할 것이다.
ClyA 나노세공을 통한 dsDNA 및 ssDNA 전위의 메카니즘
ClyA는 원통형 시스 루멘 (5.5 nm 직경 및 10 nm 길이)에 근사할 수 있으며, 그 다음에 더 작고 음으로 하전된 트랜스 협착부 (3.3 nm 직경 및 3.0 nm 길이, 도 1)에 근사할 수 있으며, 이는 DNA 전위에 대한 주요 전기영동 및 엔트로피 장벽을 반대하는 것으로 예상된다. 놀랍게도, 특정 세트의 양전하가 나노세공의 시스 루멘에 부가될 때 (ClyA-RR) ClyA 나노세공을 통한 DNA의 전위가 관찰된 반면; 나노세공의 협착부는 어떠한 변형도 필요로 하지 않았다. ClyA의 트랜스 입구에 대한 광범위한 변형에도 불구하고 (표 2), 나노세공의 더 넓은 시스 측으로부터 개시되는 경우에만 DNA 전위가 관찰될 수 있었으며, 이는 나노세공의 시스 루멘이 나노세공을 통한 DNA의 전위를 개시하는데 중요하다는 것을 암시한다. ClyA-RR 나노세공을 통한 이중 가닥 DNA 전위의 빈도는 용액의 데바이 길이에 따라 선형적으로 증가되었으며 (도 3, 패널 A), 이는 dsDNA와 ClyA-RR 내에서의 조작된 전하 간의 정전기적 상호작용이 전위 프로세스를 반대하기보다는 오히려 선호한다는 것을 지시한다. dsDNA 가닥이 나노세공의 시스 루멘에 의해 미리 정렬되는 경우에 생리학적 이온 강도에서 트랜스 협착부를 통한 dsDNA의 전위가 수득되는 한 모델이 제안된다 (도 5, 패널 A). 이러한 관점에서, dsDNA는 초기에, 시스 진입부에서의 전하와 상호작용한 다음, 세공의 루멘에 들어가며, 여기서 나노세공의 중간-섹션에서 아르기닌 잔기와 추가로 상호작용한다 (도 1, 패널 A). 이들 정전기적 상호작용은 DNA의 포스페이트 기를 "그래빙하여", DNA가 시스 용액 내로 다시 빠져나가는 것을 방지한다. 이러한 입체배치에서는, dsDNA가 트랜스 협착부에 들어가도록 정렬되며, 여기서는 전기영동 힘이 가장 강하므로, 나노세공을 가로지르는 DNA의 매끄러운 전위가 허용된다 (도 5, 패널 A).
ssDNA 차단의 데바이 길이 의존성은 dsDNA에 대해 관찰된 바와 같이 선형 함수보다는 오히려 단일 지수 (도 3, 패널 A)에 잘 맞는 것으로 관찰되었으며, 이는 부가 요인이 dsDNA와 비교하여 ssDNA의 전위에 영향을 미친다는 것을 암시한다. 본 실험에서는, DNA가 완전히 연신될 때 그의 총 길이인 DNA 윤곽선 길이는 dsDNA의 지속 길이 (~50 nm)보다 더 낮은데, 이는 dsDNA 분자가 단단한 막대로서 전위된다는 것을 지시한다 (도 5, 패널 A ). 반대로, ssDNA는 그의 무게 중심으로부터 중합체 코일 내의 임의의 지점의 평균 제곱 거리인 회전 반경이 ~6 nm인 코일 구조 (지속 길이 ~1.5 nm)를 가지고 있다. 회전 반경은 나노세공의 시스 입구의 직경과 유사하기 때문에 (도 5, 패널 B), ssDNA는 부분적으로 코일된 구조로서 나노세공의 시스 측에 들어갈 가능성이 가장 크다 (도 5, 패널 B). ssDNA가 시스 저장소로부터 트랜스 측으로 이동함에 따라, 나노세공의 트랜스 협착부를 통해 길을 찾기 위해서는 점차적으로 언코일한 다음, 반대 측 상에서 리코일해야만 한다 (도 5, 패널 B). 높은 이온 강도에서 인가된 전위에 대항한 나노세공으로부터의 고정화된 ssDNA의 시스 분출을 증진시키는, 전이시 DNA의 입체 형태적 변화와 관련된 상기 엔트로피 언코일링 및 리코일링 힘 (도 3, 패널 D)은 용액의 이온 강도 감소와 함께 감소되며, 용액의 이온 강도가 감소함에 따라 DNA 전위의 효율이 증대된다. DNA 차단된 나노세공 내부의 이온 농도와 데바이 길이는 공지되어 있지 않다는 것을 인지해야 한다. 그럼에도 불구하고, 둘 다는 나노세공 전류와 상관이 있으며, 이는 결국 벌크 전해질의 농도와 연관된다 (도 3, 패널 B 및 C).
DNA 전위의 메카니즘: dsDNA 포획은 확산 제한적이고 ssDNA 포획은 반응 제한적이다
상이한 염 농도에서의 DNA 전위 실험은 dsDNA 및 ssDNA에 대한 2종의 상이한 포획 메카니즘을 보여주었다 (각각 도 13, 패널 A-B, 및 도 14, 패널 A-B). dsDNA의 행동은 확산 제한적 포획 프로세스와 일치한다. 이것은 이러한 작업에 사용된 dsDNA가 그의 지속 길이 (150 bp)보다 더 짧고 단단하며 균일하게 하전된 막대처럼 행동하기 때문이다. 포획 반경 (0.5 nm의 λD에 대한 나노세공 중심으로부터 약 50 nm) 내에서, 전기장은 DNA를 세공 쪽으로 끌어당기고 그것을 필드 라인을 따라 정렬하여 한 말단을 갖는 세공 진입부에 도달하도록 한다 (도 14, 패널 A, i). 세공 안에 일단 들어가면, 조작된 전하가 DNA와 상호작용하여, 시스 용액으로 되돌아가는 것을 방지한다 (도 14, 패널 A, ii-iv). 따라서, DNA 포획의 역학은 전기영동 기원의 순전히 견인적 전위에서의 확산 입자의 역학에 근사할 수 있다. 이러한 경우, dsDNA의 전기영동 이동도는 용액의 데바이 길이에 비례하고, 상응하는 드리프트 확산 방정식이 정확하게 해결될 수 있으며, 이는 아래에 상세히 추가로 기재된다. ClyA 나노세공의 기하학적 구조를 길이 l = 13 nm 및 포획 직경 d = 6 nm의 실린더로 근사시킴으로써 (도 11, 패널 A), 포획 빈도는 다음에 의해 추정될 수 있다:
Figure pct00005
이것은 λD에 대한 실험 데이터와 매우 잘 일치한다 (높은 염 농도에서, 도 13, 패널 A). 적합한 파라미터가 사용되지 않기 때문에 이것은 놀라운 일이다. 그러나, ClyA의 기하학적 구조가 완벽한 실린더에서 상당히 벗어나므로 세공 파라미터의 선택은 어느 정도 임의적이기 때문에, 이러한 비교에서는 주의를 기울여야 한다. 낮은 염 농도 (0.15 M NaCl, λD = 0.8 nm)에서는, 포획 속도가 상기 방정식에 의해 예측된 것보다 더 높다 (도 13, 패널 A). 마찬가지로, 본 모델에서 고려되지 않은 ClyA-RR 진입부에서의 양전하는 낮은 염 농도에서 포획 속도를 올리는 반면, 더 높은 염 농도에서는 이들 전하가 보다 효과적으로 스크리닝된다.
ssDNA의 경우, kon와 λD 간의 관계는 지수적인데, 이는 장벽 크로싱과 일치한다 (반응 제한적 프로세스). 용액에서는, DNA가 나노세공에 접근할 때 전기영동 힘에 의해 나노세공 쪽으로 끌어 당겨지는 동안 ssDNA가 코일된 입체 형태를 취한다 (도 14, 패널 B, i). 그러나, 상기 세공의 진입부 부근에서는, 가닥의 한 말단이 세공 진입부를 향하는 경우에만 (도 14, 패널 B, ii) 및 ssDNA가 언코일된 경우에만 (도 14, 패널 B, iii, iv) 성공적인 전위 이벤트가 일어날 수 있다. 엔트로피 기원의 이러한 부가 반발력은 효과적으로, 전위 이전에 크로싱되어야만 하는 에너지 장벽을 초래한다. 이러한 장벽 제한적 전위에 관한 이론이 논의되어 왔으며, 일반적으로 포획 속도는 다음과 같이 주어진다:
Figure pct00006
여기서 ΔFb는 장벽 높이이고 ω는 장벽 크로싱에 대한 특징적인 시도 비율이다. 지수 요인은 성공적인 크로싱 이벤트의 확률을 제공한다. 모델 입력으로부터 ΔFb를 추정하는 것이 달성될 수 있으며; 성공적인 전위의 확률은 전기영동 이동도에 비례하는 항목을 함유하며, 이것은 결국 λD에 비례하는 것으로 밝혀졌다. 이는 λD에 대한 kon의 지수 의존성을 설명할 것이다 (도 13, 패널 B). kon이 역 이벤트 사이 시간으로부터 수득되긴 하지만, 측정된 모든 전류 차단이 반드시 전위 이벤트를 설명하지는 않는다는 것을 인지해야 한다. 이들 차단의 일부는 DNA 가닥이 진입된 다음, 시스 측으로 되돌아가는 것에 기인할 수 있다 (도 14, 패널 B, iii 내지 i). 그럼에도 불구하고, 로탁산의 형성은 적어도 일부 분자가 성공적으로 전위된다는 것을 보여준다. 어떠한 경우에도, λD에 대한 kon의 지수 의존성으로 이어지는 논쟁은 여전히 유효하다.
생물학적 유의성
흥미롭게도, 생물학적 기능이 DNA를 따라 슬라이딩되어야 하는 단백질에서도, ClyA 나노세공을 통한 DNA의 전위를 허용한 변형이 관찰된다. 박테리오파지에서는, DNA가 유사한 치수, 화학량론, 내부 표면 전하 및 ClyA와 유사한 내부 구조 크기를 갖는 포탈 단백질을 통해 DNA를 정렬하고 밀어 넣는 단백질을 패킹함으로써 프로캡시드 내로 전달된다. 음의 내부 표면 전하는 DNA를 둘러싸고 이를 따라 슬라이딩하는 다른 단백질, 예컨대 β-클램프 단백질에서 관찰되는 바와 같이, 포탈 단백질을 가로지르는 DNA의 매끄러운 전위에 중요한 것으로 여겨진다. 포탈 단백질 및 β-클램프 단백질은 또한, 전위되는 DNA의 음으로 하전된 포스페이트 주쇄와 상호작용함으로써 게놈 DNA 패키징에 직접적인 역할을 하는 것으로 제안되었던 양으로 하전된 고리를 갖고 있다. ClyA 나노세공을 통한 DNA의 전기영동 전위는 양으로 하전된 잔기의 2개 고리가 나노세공의 시스 입구와 중간-섹션에 도입되어, 좁은 전기음성 협착부를 통한 통과를 위해 DNA가 정렬될 때 관찰될 수 있었다. 이러한 상호작용의 부재하, 즉 트랜스 측으로부터의 스레딩 동안에는, DNA 전위가 관찰될 수 없었다. 따라서, 본원에 제시된 결과는 커넥터 단백질에서 양전하의 상기 고리가 DNA를 캡시드로부터 감염된 세포 내로 분출하는 것을 개시하는데 중요할 수도 있다는 것을 지시한다.
본 실시예에는 양전하의 2개 고리의 도입시, 생리학적 이온 강도에서 dsDNA 및 ssDNA를 전위시키기 위해 조작된 ClyA 12량체성 나노세공인 ClyA-RR이 제시된다. ClyA-RR을 사용하여 단일 분자 수준에서의 단백질-DNA 상호작용을 연구할 수 있고, 이를 DNA 맵핑 및 서열분석 적용 분야에 이용할 수 있으며, 여기서는 특정 효소가 나노세공을 통한 핵산의 전위를 제어한다. 나노세공의 더 넓은 진입부 (시스 측)에서 견인적 상호작용인 양전하의 고리의 도입은 좁고 음으로 하전된 트랜스 협착부를 통해 DNA 전위를 유도하는데 중요한 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 협착부 그 자체는 변형을 필요로 하지 않았다. 이러한 결과는 좁은 음으로 하전된 트랜스 협착부를 통해 효과적인 전기영동 구동된 슬라이딩을 위하여 DNA를 "그래빙하고" 배향하는데에는, 나노세공의 진입부와 중간-섹션에서의 견인적 상호작용이 중요하다는 것을 지시한다. 흥미롭게도, ClyA-RR 내에서의 전하 분포가 바이러스 포탈 단백질에 반영되며, 이는 생물학적 나노세공의 정확한 조작이 바이러스 캡시드 안팎으로 DNA를 효율적으로 패킹하고 분출시키는데 중요하다는 것을 지시한다. 추가로, dsDNA 및 ssDNA 전위의 빈도의 선형 및 지수 이온 강도 의존성 각각은 dsDNA 포획이 확산 제한적 프로세스를 따르는 반면, ssDNA 포획은 반응 제한적 프로세스를 따르는 메카니즘을 지시하는 것으로 예상된다. 나노세공의 협착부를 통해 전위시키기 위해서는 언코일될 필요가 있는 코일된 구조로서 ssDNA가 나노세공 내로 들어가는 것으로 또한 밝혀졌다. 이러한 발견은 고체 상태 나노세공의 조작을 돕는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 나노세공 위에 놓여진 DNA의 회전 반경과 유사한 직경과 유리한 표면 전하를 가진 나노-스케일 챔버는, 특히 낮은 이온 강도에서 DNA의 전위를 선호해야 한다. 또한, DNA 전위를 허용하는 ClyA 나노세공에 대한 변형이 바이러스 포탈 단백질에 반영되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 생물학적 나노세공의 정확한 조작이 바이러스 캡시드 안팎으로 DNA를 효율적으로 패킹하고 분출시키는데 중요하다는 것을 지시한다.
예시적인 물질 및 방법
DNA는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스 (Integrated DNA Technologies; IDT)로부터 구입하였다. 뉴트라비딘은 써모 피셔(Thermo Fisher)로부터 획득하였고, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린은 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)로부터 획득하였다. β-도데실 말토시드 (DDM)는 글리콘 바이오케미칼즈 게엠베하(GLYCON Biochemicals GmbH)로부터 구입하였다. 효소는 퍼멘타스(Fermentas)로부터 구입하였고, 다른 모든 물질은 달리 명시되지 않는 한 시그마(Sigma)로부터 구입하였다.
단백질 정제 . ClyA-AS 유전자에 대한 단일 점 돌연변이는 문헌 [Soskine et al., J. Am. Chem . Soc . (2013) 135: 13456-13463 and Miyazaki et al., Methods Enzymol. (2011) 498: 399-406]에 기재된 바와 같은 "메가 프라이머" 방법을 사용함으로써 수행되었다. ClyA는 pT7 플라스미드를 사용함으로써 이. 클로니(E. cloni)® EXPRESS BL21 (DE3) 세포에서 발현시켰다. 단량체는 Ni-NTA 친화 크로마토그래피를 사용함으로써 정제하였고, 문헌 [Waduge et al., ACS Nano (2015) 9: 7352-7359]에 기재된 바와 같이 0.5% β-도데실 말토시드 (글리콘 바이오케미칼즈 게엠베하)의 존재하에 올리고머화하였다. 단량체 (C-말단 올리고-히스티딘 태그를 함유함)는 이. 콜라이 BL21 세포에서 발현시켰고, 가용성 분획은 Ni-NTA 친화 완충제 (150 mM NaCl, 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5, 0.2% DDM 및 1 mM EDTA)를 사용하여 정제하였으며, 이를 4℃ 하에 저장하였다.
DNA 제조 . dsDNA 1은 먼저, 등몰 농도의 1a와 1b를 혼합함으로써 제조하였다 (표 3). 이러한 혼합물을 95℃로 유지시키고, 온도를 일정한 간격으로 낮추었다. 아가로스 비드 (써모 사이언티픽 피어스(Thermo Scientific Pierce)) 상에 고정화된 단량체성 아비딘을 함유하는 비오틴-결합 칼럼을 사용하여 친화 크로마토그래피로 과량의 ssDNA로부터 상기 DNA를 정제하였다. 이어서 dsDNA를 제조업자의 프로토콜에 따라서 상기 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출 분획을 농축시키고, PCR 신속 정제 키트 (퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 추가로 정제하였다. 전형적으로, 0.2 μg/mL의 DNA 농도를 수득하였다. 1a/1c 이중 나선을 1에 대해 설명된 바와 같이 어닐링시켰지만, 정제하지는 않았다.
이온 투과성 . 대칭 조건 (시스와 트랜스 용액 둘 다에서 150 mM NaCl, 15 mM 트리스-HCl pH 7.5)하에 시스 챔버에 ClyA를 부가함으로써 비대칭 조건 하의 I-V 곡선을 수집하였다 (표 6). 그 후 전극을 평형시키고, 5 M NaCl 스톡 용액의 분취액을 시스 구획에 부가함으로써 시스 내의 전해질 농도를 1 M까지 증가시켰다. 트랜스 챔버의 용적은 시스 용액의 동일한 완충제 (150 mM NaCl)를 사용하여 시스 측에 동일한 용적을 부가함으로써 조정되었다.
투과성 비 (PNa +/PCl -, 표 4)는 I-V 곡선으로부터 외삽된, 측정된 역전 전위 (Vr) 값을 사용하여 골드만-호지킨-카츠(Goldman-Hodgkin-Katz) 방정식 (아래)을 이용하여 계산되었다.
Figure pct00007
R은 범용 기체 상수 (8.314 J K- 1 mol- 1)이고, T는 켈빈 온도이며, F는 패러데이(Faraday) 상수 (96 485 C mol- 1)이고, PNa + 및 PCl -는 이온 Na+ 또는 Cl-에 대한 상대적 막 투과성이며, aNa + 및 aCl -은 그들의 각각의 활성이다. 시스 챔버가 접지되었다. 2.5 M NaCl을 함유하는 2.5% 아가로스 브릿지를 수반한 Ag/AgCl 전극을 사용하여 모든 실험을 수행하였다.
전기 기록. 디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (아반티 폴라 리피즈; 미국 앨라배마주 앨러배스터)으로부터 형성된 평면 이중층으로부터 기록함으로써 이온 전류를 측정하였다. 전류는 문헌 [Ho et al., Sci . Adv. (2015) 1, e1500905; and Maglia et al., Methods Enzymol. (2010) 475: 591-623]에 기재된 바와 같이 패치-클램프 증폭기 (액소패치(Axopatch) 200B, 액손 인스트루먼츠(Axon Instruments; 미국 캘리포니아주 포스터 시티))를 사용하여 아가 브릿지 (2.5 M NaCl 완충제 중의 3% w/v 저-용융 아가로스)에 침수된 Ag/AgCl 전극을 이용하여 전류를 측정하였다. 전류 대 인가된 전압 관계를 측정함으로써 단일 채널을 특징규명하였다 (I-V 곡선; 전위는 21s에서 -100에서 +100 mV까지 10 mV 간격으로 인가되었다; 도 6, 10 및 표 5). 0.15 M NaCl에서는, 2 kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 10 kHz 샘플링 속도를 사용함으로써 이온 전류를 기록하였다. 더 높은 염 농도에서는, 이온 전류가 50 kHz에서 샘플링되었고, 저역 통과 베셀 필터는 10 kHz에서 설정되었다. 0.3 및 0.5 M NaCl에서의 전류 트레이스는 4 kHz 베셀 디지털 필터로의 포착 후 필터링되었다 (도 16, 17). 상이한 필터링 빈도의 사용은 검출된 이벤트의 전반적인 수에 영향을 미친다. 예를 들어, 10 kHz 베셀 필터를 적용하는 동안 50 kHz에서 샘플링된 트레이스에 2 kHz 디지털 가우시안 필터를 적용하는 것은 이벤트 사이 시간을 약 50% 정도 증가시킨다 (221에서 311 ms로 증가시킴, 0.17 μM dsDNA, 1 M NaCl, 평균 체류 시간 0.12 ms). 따라서, DNA 포획 빈도의 데바이 길이 의존성에 대한 과도한 필터링의 효과를 시험하기 위하여, 1 kHz 가우시안 필터를 모든 전류 트레이스에 적용한 후에 도 13, 패널 A에 기재된 데이터를 플롯하였다 (도 18). ssDNA 및 dsDNA 차단이 지수 및 선형 회귀에 각각 잘 맞는 것으로 밝혀졌다 (도 18).
데이터 분석. 전류 차단 이벤트는 0.05 ms의 데이터 수집 한계치를 사용하여 클램프피트 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스)의 "단일 채널 검색" 기능을 이용함으로써 개별적으로 수집되었다. 개방 세공 및 차단된 세공 전류를 수득하였고, 이는 모든 점 히스토그램에 대한 가우시안 피팅으로부터 계산되었다. 잔류 전류는 차단된 세공 전류 값을 개방 세공 전류 값으로 나눔으로써 계산되었다. DNA 전위 체류 시간 (τoff) 값은 DNA 차단 체류 시간의 이벤트 히스토그램으로부터의 단일 지수 적합도로부터 계산된 반면, (τon) 값은 이벤트 사이 시간의 대수 히스토그램으로부터의 지수 대수 확률 적합도를 사용하여 계산되었다 (도 13, 표 7, 및 도 16, 17). 오차는 적어도 3개의 독립적인 나노세공 실험으로부터의 평균으로부터의 표준 편차를 지시하며, 그의 수는 N으로서 지시된다.
본원에 기재된 한 실시양태에 따르는 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 제조에 관한 부가 정보
ClyA-AS 유전자에 대한 단일 점 돌연변이는 "메가 프라이머" 방법을 사용함으로써 수행되었다. 전형적으로, 2회의 PCR 주기를 수행하여 새로운 DNA 구축물을 제조하였다: 제1 PCR 반응에서는, 2개의 프라이머를 이용하여 플라스미드 DNA를 증폭시켰으며; 정방향 프라이머는 염기 치환을 수반한, 그 길이가 올리고뉴클레오티드 20 내지 30개 염기였고, 역방향 프라이머는 T7 프로모터 또는 T7 종결인자 중 하나였다. 막횡단 영역에서의 돌연변이의 경우, 역방향 프라이머는 단백질 서열의 중간부에 있는 연장물에 대해 상보적인 25량체 올리고였다 (표 3). 메가 프라이머 (200-300 bp)를 함유하는 PCR 생성물을 아가로스 겔 (2% 아가로스/TAE 및 크리스털 바이올렛) 내로 부하하였고, 메가 프라이머를 커팅한 다음, PCR 신속 정제 키트 (퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. 5 μL의 정제된 메가 프라이머를 2% 아가로스/TAE 겔 상에 부하하여 순도를 검사하였고, 5 내지 10 μL의 메가 프라이머를 제2 PCR 반응에 이용하였다. 이어서, 제2 PCR 생성물을 먼저, DpnI로 소화시켜 (1-2 h, 37℃, 급속 소화 DpnI, 퍼멘타스) ClyA-AS 주형 DNA를 제거한 다음, ~1 μL를 전기적격한 세포 이. 클로니® EXPRESS BL21 (DE3) (메이커)로의 형질전환에 사용하였다.
DNA 제조에 관한 부가 정보
dsDNA 1은 1a, 3'-비오티닐화 ssDNA 분자 (표 3)를 20% 과량의 상보적 ssDNA 1b (표 3)와 함께 인큐베이션함으로써 형성시켰다. 온도를 1분 동안 95℃로 유지시킨 후, 실온으로 단계적으로 낮추었다. 70℃의 예상 어닐링 온도 부근에서, 온도를 2℃ 간격으로 21℃로 낮추었다. 각각의 간격은 1분 동안 지속되었다. 이어서, 아가로스 비드 (써모 사이언티픽 피어스) 상에 고정화된 단량체성 아비딘을 함유하는 비오틴-결합 칼럼을 사용하여 친화 크로마토그래피로 과량의 ssDNA로부터 상기 DNA를 정제하였다. 그 다음, dsDNA를 제조업자의 프로토콜에 따라서 비오틴 차단/용출 완충제로부터 용출시켰다. 용출 분획을 농축시키고, PCR 신속 정제 키트 (퀴아젠)를 사용하여 추가로 정제하였다. 전형적으로, 0.2 μg/mL의 DNA 농도를 수득하였다. dsDNA의 크기와 순도는 TAE 완충제 중의 2% 아가로스 겔을 사용함으로써 검사하였고 분광적으로 정량화하였다. 상기와 같이 정제된 dsDNA를 1 mM EDTA의 존재하에 -20℃에서 저장하였다. 3'-비오티닐화 ssDNA 분자 (1a, 표 3)를 등 몰 농도의 1c와 함께 인큐베이션함으로써 1a:1c를 형성하였다. 온도를 1분 동안 95℃로 유지시킨 후, 실온으로 단계적으로 낮추었다. 70℃의 예상 어닐링 온도 부근에서, 온도를 2℃ 간격으로 낮추었고, 각각은 1분 동안 유지되었다.
전기 기록 및 데이터 분석에 관한 부가 정보
인공 평면 지질 이중층을 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 달리 명시되지 않는 경우, 시그널은 10-kHz 베셀 필터로 프로세싱한 후에 50 kHz의 샘플링 속도 하에 수집되었다. 지질 이중층은 테플론 필름 (굿펠로우(Goodfellow), 영국)) 상의 작은 애퍼처 (~100 μm)를 펜탄 중의 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린의 10% 용액 1 내지 2 μl로 미리 처리함으로써 형성되었다. 아가 브릿지 (2.5 M NaCl 완충제 중의 3% w/v 저 용융 아가로스)에 침수된 Ag/AgCl 전극을 이용함으로써 전기 전류를 인가하였다. 인가된 전위는 상기 장치의 트랜스 구획에 연결된 작동 전극의 전위를 지칭한다. ClyA 나노세공 용액 (0.01 내지 0.1 ng/mL)을 시스 구획에 부가하였으며, 이는 접지 전극에 연결되었다. 단일 세공을 삽입한 후, 과량의 단백질을 수회 주기의 관류에 의해 제거하였다. 전기 기록을 22℃ 하에 0.15 내지 2.5 M NaCl, 15 mM 트리스 HCl, pH 8.0에서 수행하였다. 0.15 M NaCl에서는, 2-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 10 kHz 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다. 더 높은 염 농도이긴 하지만, 데이터가 50 kHz에서 샘플링되었고, 저역 통과 베셀 필터는 10 kHz에서 설정되었다. 0.3 및 0.5 M NaCl에서의 전류 트레이스는 4-kHz 베셀 디지털 필터로의 포착 후 필터링되었다. 전류 차단 이벤트는 0.05 ms의 데이터 수집 한계치를 사용하여 클램프피트 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스)의 "단일 채널 검색" 기능을 이용함으로써 개별적으로 수집되었다. IO 및 IB 값은 개방 및 차단된 세공 전류 각각의 모든 점 히스토그램에 대한 가우시안 피팅으로부터 계산되었다. DNA 전위 체류 시간 τoff은 상기 차단 세공 전류 이벤트 (toff)의 이벤트 히스토그램으로부터의 단일 지수 표준 적합도에 의해 계산되었다. 이벤트 사이 시간 τon은 차단 세공 전류 이벤트들 간의 이벤트 사이 시간 (ton)의 대수 히스토그램으로부터의 지수 대수 확률 적합도를 사용함으로써 계산되었다. 오차는 적어도 3개의 독립적인 반복으로부터의 평균으로부터의 표준 편차를 지시하며, 그의 수는 "n"으로서 지시된다.
시스 챔버로부터 삽입된 세공은 양성 인가된 전위에서 더 높은 전도도를 보였으며, 이는 삽입된 채널의 배향을 평가하는데 도움이 되었다. 전류 대 인가된 전압 관계를 측정함으로써 단일 채널을 특징규명하였다 (I-V 곡선; 전위는 21초 내에 -100에서 +100 mV까지 10 mV 간격으로 인가되었음). 세공 정류는 + 100 mV에서의 개방 세공 전류와 -100 mV에서의 개방 세공 전류의 비 (I0+100mV/I0-100mV)로부터 수득되었다. 나노세공의 게이팅에 대한 성향은 소정의 인가된 전위에서 개방 세공 전류의 연속적인 측정에 의해 평가되었다. 그 다음, VMAX는 30초의 시간 간격 내에서 게이팅 이벤트가 관찰되지 않는 인가된 전위에 의해 제공되었다. VMAX보다 더 높은 인가 전압에서는 이온 전류의 자발적인 가역 게이팅이 관찰되었다. 세공을 통한 DNA 진입 및 전위는 VMAX와 동등한 인가된 전위 하에 시스 챔버에 1 μM의 3' 말단 비오티닐화 ssDNA 1a를 부가한 다음, 상보적 ssDNA 1b (표 3)를 부가한 후, 뉴트라비딘 (1.2 μM, 단량체)을 부가함으로써 시험되었다.
이온 투과성에 관한 부가 정보
ClyA 나노세공에 대한 투과성 비는 비대칭적 염 조건: 150 mM NaCl 트랜스, 1 M NaCl 시스에서 역전 전위를 측정함으로써 계산되었다. 단백질 나노세공을 시스 챔버에 부가하고, 단일 채널을 먼저, 대칭적 조건 (시스와 트랜스 용액 둘 다에서 150 mM NaCl, 15 mM 트리스 HCl pH 7.5)에서 특징규명하였다. 전극을 평형시킨 후, 5 M NaCl 스톡 용액의 분취액을 시스 구획에 부가함으로써 시스 내의 전해질 농도를 1 M까지 증가시켰다. 트랜스 챔버의 용적은 시스 용액의 동일한 완충제 (150 mM NaCl)를 사용하여 시스 측에 동일한 용적을 부가함으로써 조정되었다. 제로 전류를 수득하기 위해 사용된 전기 전위인 역전 전위 (Vr, 표 3)는 전류-전압 (IV) 곡선에 의해 수득되었다 (표 6). 이온 선택도 (PNa +/PCl)는 골드만-호지킨-카츠 (GHK) 방정식을 사용함으로써 Vr로부터 계산되었다. GHK 방정식 둘 다에 따르면, ClyA 나노세공에 대해 관찰된 Vr에 대한 양의 값은 세공을 통한 양이온의 우선적인 이동을 보여주며, 이는 세공이 양이온성의 선택적 채널이라는 것을 지시한다. 시스 챔버는 접지되었고, 2.5 M NaCl을 함유하는 2.5% 아가로스 브릿지를 수반한 Ag/AgCl 전극을 사용하여 모든 실험을 수행하였다.
Figure pct00008
여기서 Vr은 막 전위이고, R은 범용 기체 상수 (8.314 J.K- 1 mol- 1)이며, T는 켈빈 온도이고, F는 패러데이 상수 (96485 C.mol- 1)이며, Px는 Na+ 또는 Cl-에 대한 상대적 막 투과성이며, [aX] 시스 는 시스 구획 내에서의 Na+ 및 Cl-의 활성이고, [aX] 트랜스 는 트랜스 구획 내에서의 Na+ 및 Cl-의 농도이며, aX는 Na+ 및 Cl-의 활성이다 (J.F. Zemaitis, Handbook of aqueous electrolyte thermodynamics: theory and application, 1986; Ludwig Molecular Microbiology 1999; Li-Qun Gu PNAS 2000; Petr G. Merzlyak Biophysics 2005).
dsDNA 및 ssDNA의 포획 속도를 각각 설명하고 있는 방정식 (1) 및 (2)의 도출에 관한 세부사항이 제시된다.
dsDNA 포획
본 접근 방식은 그로스베르크 앤 라빈(Grosberg and Rabin)에 의해 개발된 것에 관한 것이다. ClyA 나노세공 막은 직경 d의 원통형 홀이 있는 두께 l의 평면 유전체 표면으로서 기재된다. ClyA 세공에 대한 특징적인 거리는 l = 13 nm 및 d = 6 nm이다. 막의 시스 측과 트랜스 측 간의 전위 차이를 나타내기 위한 ΔV를 사용하여, 다음 식에 의해 제공되며:
Figure pct00009
시스 측 내에서의 전기 전위는 시스 측에서 세공으로부터 1r/ 떨어짐에 따라 붕괴된다 (통상적으로, 시스 측 내의 전극에서의 전위는 0으로 설정됨). 좌표의 원점 (r = 0 nm)은 세공의 중간부이다 (도 19).
dsDNA는 확산 상수 D와, 전기영동 이동도 μ로써 특징지을 수 있는 전기영동 드리프트로 확산 운동을 수행하는 하전된 점 입자로서 근사된다. 이로써 생성되는 dsDNA 농도 c(r,t)에 대한 방사 좌표계에서의 드리프트 확산 방정식은 다음 식에 의해 제공된다:
Figure pct00010
여기서 전기영동 전류 앞에 있는 마이너스 부호는 DNA가 음전하를 띠고 있기 때문이다. 이러한 협약에서, 이동도 계수 양성 μ>0이 유지되므로, 인가된 전기장으로 인한 드리프트 속도는 v=-μE이다. 아인슈타인 관계는 이러한 시스템에서 유지되지 않으므로 (즉, D≠ μkBT), 간단히 D와 μ를 관련지을 수 없다는 것을 인지해야 한다.
방정식 (2)의 고정 용액 (∂c∂t/=0)은 다음이다:
Figure pct00011
여기서 경계 조건은 무한대에서의 c(R)→c 0이고, R을 수반한 c(R)=0은 세공 크기 정도의 현미경적 거리이다. 거리 r*는 하기로서 정의되고:
Figure pct00012
이는 하기로서 전기영동 전위 (1)를 재작성할 수 있게 한다:
Figure pct00013
해법 (3)과 이전의 관계로부터 방사상 입자 전류 밀도를 수득한다:
Figure pct00014
그리고 속도는 반경 r의 반 구형 쉘 상으로 전류 밀도를 통합함으로써 수득된다 (시스 측 상에서 이용가능한 표면을 설명함):
Figure pct00015
여기서 근사치 r*≫R, 유효성을 나중에 검사하였다. 최종 결과는 외부 전위의 부재하에 확산 입자에 대한 스몰루코프스키(Smoluchowski) 확산 제한적 반응 속도와 공식적으로 유사하다. 여기서 r*는 dsDNA가 세공에 의해 비가역적으로 포획되는 거리로서 해석될 수 있다. 이러한 포획 반경은 더 높은 인가된 전위에서 또는 증가된 전기영동 이동도 (4)를 위해 증가된다.
(4)와 (7)를 합하여 다음을 수득한다:
Figure pct00016
r*는 D에 반비례하므로, D는 이전 방정식에서 취소된다.
계속 진행하기 위해 추가의 μ가 추정되었다. 길이 L을 갖는 dsDNA 분자 상의 총 전하는 Q=- 2αeLa /인데, 여기서 a = 0.34 nm는 두 염기 간의 거리이고, α < 1은 모든 포스페이트 기가 이온화되지 않는다는 사실을 반영하는 수치 계수이다. DNA를 표면적 A의 실린더로서 근사치 계산하면, 항력은 (ηAλ D /)v로서 추정되었으며, 여기서 η=10-3 kg m-1 s-2는 물의 점도이고 λ D 는 데바이 길이이다. 정의 v=-μE를 사용하여 다음을 얻는다:
Figure pct00017
여기서 b = 2 nm는 이중 나선 직경이다. ζ-전위의 계산에 근거하여, 이러한 방정식의 대안적인 유도가 그로스베르크 앤 라빈에 의해 제공된다. 지금, 방정식 (7)과 (9)를 합하고 본 실험에 관련된 수치 값 (ΔV = +70 mV, c 0 = 1 μM)을 사용하며 α = 1로 설정하여, 즉 완전히 이온화하여, 다음을 수득하며, 이는 상기 보고된 방정식 (1)이다:
Figure pct00018
포획 반경 r*을 최종적으로 계산하였다. 이를 위하여, 스토크스 법칙을 이용하여 확산 계수를 추정한다:
Figure pct00019
여기서 R H 는 유체역학적 반경이다. 문헌 [Hansen et al., J. Chem . Phys. (2004) 121: 9111-9115]에 제공된 표현을 사용하여, 반경 1 nm 및 34 nm의 실린더로서의 dsDNA (100 bp)를 고려하면, RH
Figure pct00020
6 nm인 것으로 추정되었다. (11)과 (4)를 합한다:
Figure pct00021
여기서 λ D = 0.5 nm 및 kBT
Figure pct00022
25 meV. 포획 반경은 데바이 길이보다 두 자릿수 정도 더 크고 세공 반경보다 훨씬 더 크므로, 방정식 (7)에 사용된 근사치는 정당하다.
ssDNA 포획
ssDNA 포획에 관한 논의는 장벽 제한적 프로세스에 대한 문헌 [Rowghanian et al., Phys. Rev. E (2013) 87: 042723]에 보고된 접근 방식에 영감을 받았다. 이러한 경우는 확산 제한적 경우보다 훨씬 더 복잡하며 그 이론은 확립되지 않았다. 이 모델은 세공 진입부로부터 한 말단의 거리인 단일 "반응" 좌표 r을 사용하는 드리프트 확산 방정식에 근거한다. 세공으로부터 충분히 멀리 떨어져 있는 ssDNA는 방정식 (1)에 의해 기재된 바와 같은 견인적 전기영동 힘만을 받는다. 거리 ≤Rg에서의 세공 부근에는 (여기서 Rg는 회전의 평형 반경임), 엔트로피 원점에 대한 부가 반발력이 있으며: ssDNA 코일은 그 말단이 세공 진입부에 더 가까워지도록 강요받을 때 그의 입체배치적 엔트로피를 감소시킨다. 가닥의 길이가 충분히 길면, 엔트로피 반발력이 정전기 견인력보다 압도적으로 우세하여 장벽이 생긴다 (도 19).
U(r)로 엔트로피 전위가 다음 방사상 전류 밀도를 지시한다:
Figure pct00023
여기서 μ는 전기영동 이동도인 반면,
Figure pct00024
는 일반적인 비-전기력, 이 경우에는 엔트로피 반발력과 연관된 이동도이다. μ가 아인슈타인 관계식을 충족시키지 못하지만 (D ≠ μk B T), 일반적 이동도
Figure pct00025
는 이러한 관계식을 충족시킨다 (
Figure pct00026
=D/ k B T). 방정식 (13)에서의 입자 전류는 다음과 같이 재작성될 수 있다:
Figure pct00027
여기서:
Figure pct00028
따라서 문제는 전위 F b 에서의 입자의 확산 운동에 있다. 아인슈타인 관계식을 위반하기 때문에, 이러한 전위는 또한, 전기영동 이동도 μ 및
Figure pct00029
~ η-1로부터의 용매 점도 η와 같은 운동 파라미터를 함유한다. 전위는 거리 Rg와 최소한도로 근접하고 장벽 높이를 규정하는 세공 진입부와 최대한도로 근접한다: ΔFb≡Fb max-Fb min. 크라머스 이론에 따르면 포획 속도 k on은 장벽 높이에 지수적으로 좌우된다:
Figure pct00030
장벽은 세공을 향하는 정전기 견인력을 강화시키도록 인가된 전압 ΔV를 증가시킴으로써 낮출 수 있다. 방정식 (15)은 ssDNA의 전기영동 이동도 μ를 증가시킴으로써 유사한 효과를 수득할 수 있다는 것을 시사한다. μ를 변형시키는 하나의 확실한 방식은 용액의 이온 강도의 변화를 통해서인데, 이는 이것이 데바이 길이를 변형시키기 때문이다. 방정식 (9)에 나타낸 바와 같이, 전기영동 이동도는 λ D 에 비례한다. 염 농도는 또한, ssDNA 지속 길이에 효과를 나타내므로, 장벽에 대한 엔트로피 기여 U(r)에 대해서도 효과를 갖지만, 이러한 효과는 더 약해지는 것으로 예상된다는 것에 주목해야 한다. 장벽 높이에 대한 염 농도 상의 변화의 주요 효과는 λ D 에 있어서 용어 선형을 함유하는 것으로 예상된다:
Figure pct00031
(15)와 함께 a, b > 0을 이용하는 것이, 본 실험에서 관찰된 λ D 에 대한 k on의 기하급수적인 성장을 설명한다.
표 2. 트랜스 측으로부터의 세공 조작 DNA 전위. 각각의 데이터 점은 적어도 3개의 실험의 평균이고, 오차는 표준 편차이다. 실험은 0.15 M NaCl, 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5 용액에서 수행되었다. 나노세공의 활성은 0.01 내지 0.1 ng 올리고머성 단백질을 트랜스 챔버에 부가함으로써 시험되었다. 음성 활성은 채널 삽입이 관찰되지 않았다는 것을 지시한다. VG는 30초 이내에 게이팅 이벤트가 관찰되지 않았던 최대 인가 전압을 나타낸다. DNA 포획은 뉴트라비딘과의 복합체에 비오티닐화 dsDNA를 부가할 때 일시적인 전류 차단만이 관찰되었다는 것을 지시한다. DNA 전위는 dsDNA 로탁산이 형성될 수 있었다는 것을 지시한다.
표 2
Figure pct00032
표 3: 본 작업에 사용된 DNA 분자. 1은 1a를 20% 과량의 1b와 함께 인큐베이션함으로써 형성되었고, 이는 방법에 기재된 바와 같이 친화 크로마토그래피함으로써 정제되었다. 1*는 추가의 정제 없이 1a를 20% 과량의 1b와 함께 인큐베이션함으로써 형성되었다. 두 DNA 가닥 내의 상보적 서열이 이탤릭체로 제시된다. 접미사 bio는 비오틴 모이어티를 지시한다.
표 3
Figure pct00033
표 4: 선택된 ClyA 나노세공의 이온 선택도. ClyA 변이체 나노세공에 대한 투과성 비 (PNa +/PCl -) 및 역전 전위 (Vr)가 평균 ± 표준 편차로서 보고되었다. 각각의 변이체에 대하여 4개 이상의 단일 채널을 측정하였다. 사용된 완충제는 시스 챔버에 1 M NaCl를 수반하고 트랜스 챔버에 150 mM을 수반하는, 15 mM 트리스.HCl pH 7.5였다.
표 4
Figure pct00034
표 5: ClyA 돌연변이체에 대한 IV 곡선. 전기 기록은 22℃ 하에 0.15 M NaCl, 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 각각의 데이터 점은 적어도 3개의 실험의 평균이고, 오차는 표준 편차이다.
표 5
Figure pct00035
Figure pct00036
표 5 계속
Figure pct00037
Figure pct00038
표 6: 비대칭적 염 농도 하의 ClyA 변이체의 IV 곡선. 각각의 변이체에 대하여 4개 이상의 단일 채널을 측정하였다. 각각의 데이터는 평균 ± 표준 편차로서 보고된다. 사용된 완충제는 15 mM 트리스.HCl pH 7.5인 반면, 시스 챔버는 1 M NaCl을 함유하였고, 트랜스 챔버는 150 mM을 함유하였다. 전기 기록은 22℃ 하에 0.15 M NaCl, 15 mM 트리스 HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 2-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 100 μs (10 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다.
표 6
Figure pct00039
Figure pct00040
표 7: ClyA-RR 나노세공을 통한 ssDNA (1a) 및 dsDNA (1) 전위. 각각의 조건에 대하여 3개 이상의 단일 채널을 측정하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로서 보고된다. 전기 기록은 22℃ 하에 15 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 수행되었다. 10-kHz 저역 통과 베셀 필터를 적용하고 20 μs (50 kHz) 샘플링 속도를 사용함으로써 데이터를 기록하였다.
표 7
Figure pct00041
서열 목록:
Figure pct00042
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로써 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 동등하거나 또는 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 본 개시내용의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 또한, 본 청구범위 내에 있다.
등가물
여러 본 발명의 실시양태가 본원에 기재되고 예시되긴 하였지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나 결과를 수득하고/거나 이점 중 하나 이상을 수득하기 위한 각종의 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 이러한 변이 및/또는 변형 각각은 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 입체배치가 예시적인 것으로 의도되고 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 입체배치가 그에 대하여 본 발명의 교시가 사용하는 특이적 적용 분야(들)에 의존한다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시양태는 단지 예로서 제시되고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범위 내에서, 본 발명의 실시양태는 구체적으로 기재되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 제품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 제품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 서로 모순되지 않는다면, 2종 이상의 이러한 특징, 시스템, 제품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합이 본 개시내용의 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용되는 바와 같은 모든 정의는 사전 정의, 참조로 포함된 문헌에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미보다 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제에 관해서 참고로 포함되며, 일부 경우에는 그 문헌 전체를 포괄할 수도 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는, 반대되는 것으로 명확히 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 "및/또는"이라는 문구는 그에 의해 결합된 요소들 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 즉 이러한 요소는 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재한다. "및/또는"과 함께 열거된 다수의 요소는 동일한 방식으로, 즉 이와 같이 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는 지의 여부와 상관없이 "및/또는" 구절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "포함하는" 것과 같이 제한이 없는 언어와 연계해서 사용될 때, "A 및/또는 B"에 대한 참조는 한 실시양태에서는 A만을 지칭할 수 있고 (임의로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서는 B만을 지칭할 수 있으며 (임의로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서는, A와 B 둘 다를 포함할 수 있다 (임의로 다른 요소를 포함함).
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석되어야 하며, 즉 수많은 요소 또는 요소 목록, 및 임의로 부가 목록에 없는 항목 중 적어도 하나뿐만 아니라 2개 이상을 포함한다. 그 반대로 명백하게 지시된 용어, 예컨대 "오직 하나" 또는 "정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "~로 이루어진"이란 용어만이 수많은 요소 또는 요소 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 "어느 하나", "하나", "오직 하나" 또는 "정확히 하나"와 같이 배타적인 용어가 선행될 때, 배타적인 대안 (즉, "하나 또는 다른 것이지만, 둘 다가 아닌")을 지시하는 것으로 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용된 바와 같은 그의 통상적인 의미를 지닐 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 "적어도 하나"라는 문구는 상기 요소의 목록 내의 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어로 하나를 반드시 포함하지 않고, 요소의 목록 내의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지의 여부와 상관없이, "적어도 하나"라는 문구가 지칭된 요소 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외에 요소가 임의로 존재할 수 있게 한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서, 적어도 하나, 임의로 둘 이상의 A를 포함하고, B가 존재하지 않은 것 (및 임의로 B 이외의 요소를 포함함)을 지칭하고; 또 다른 실시 양태에서, 적어도 하나, 임의로 둘 이상의 B를 포함하고, A가 존재하지 않은 것 (및 임의로 A 이외의 요소를 포함함)을 지칭하며; 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나, 임의로 둘 이상의 A를 포함하고, 적어도 하나, 임의로 둘 이상의 B를 포함하는 것 (및 임의로 다른 원소를 포함함)을 지칭한다.
반대로 명확하게 지시되지 않는 한, 둘 이상의 단계 또는 동작을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서는, 그러한 방법의 단계 또는 동작의 순서가 반드시, 그 방법의 단계 또는 동작이 나열되는 순서에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Katholieke Universiteit Leuven KU Leuven Research & Development <120> MODIFIED NANOPORES, COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, AND USES THEREOF <130> O0366.70046WO00 <140> Not Yet Assigned <141> 2016-12-08 <150> US 62/264,709 <151> 2015-12-08 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 303 <212> PRT <213> S. typhi <400> 1 Met Thr Gly Ile Phe Ala Glu Gln Thr Val Glu Val Val Lys Ser Ala 1 5 10 15 Ile Glu Thr Ala Asp Gly Ala Leu Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr Leu Asp 20 25 30 Gln Val Ile Pro Trp Lys Thr Phe Asp Glu Thr Ile Lys Glu Leu Ser 35 40 45 Arg Phe Lys Gln Glu Tyr Ser Gln Glu Ala Ser Val Leu Val Gly Asp 50 55 60 Ile Lys Val Leu Leu Met Asp Ser Gln Asp Lys Tyr Phe Glu Ala Thr 65 70 75 80 Gln Thr Val Tyr Glu Trp Cys Gly Val Val Thr Gln Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Tyr Ile Leu Leu Phe Asp Glu Tyr Asn Glu Lys Lys Ala Ser Ala Gln 100 105 110 Lys Asp Ile Leu Ile Arg Ile Leu Asp Asp Gly Val Lys Lys Leu Asn 115 120 125 Glu Ala Gln Lys Ser Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Phe Asn 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ctctcctgac aagttcacaa agtttcaaca acgcttccgg aaaactgctg gcattagata 600 gccagttaac taatgatttt tcggaaaaaa gtagttattt ccagtcacag gtggatagaa 660 ttcgtaagga agcttatgcc ggtgctgcag ccggcatagt cgccggtccg tttggattaa 720 ttatttccta ttctattgct gcgggcgtga ttgaagggaa attgattcca gaattgaata 780 acaggctaaa aacagtgcaa aatttcttta ctagcttatc agctacagtg aaacaagcga 840 ataaagatat cgatgcggca aaattgaaat tagccactga aatagcagca attggggaga 900 taaaaacgga aaccgaaaca accagattct acgttgatta tgatgattta atgctttctt 960 tattaaaagg agctgcaaag aaaatgatta acacctgtaa tgaataccaa caaagacacg 1020 gtaagaagac gcttttcgag gttcctgacg tctgatacat tttcattcga tctgtgtact 1080 tttaacgccc gatagcgtaa agaaaatgag agacggagaa aaagcgatat tcaacagccc 1140 gataaacaag agtcgttacc gggctgacga ggttatcagg cgttaagctg gtag 1194 <210> 4 <211> 945 <212> DNA <213> S. typhi <400> 4 atgacgggta tctttgcgga acagacggtg gaagttgtga aaagtgcgat tgaaacggct 60 gacggtgcgc tggacctgta taataaatat ctggatcagg tcatcccgtg gaaaaccttt 120 gacgaaacga ttaaagaact gagccgtttc 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Claims (62)

  1. 시스 개구부, 중간-섹션, 및 트랜스 개구부를 포함하며, 여기서 시스 개구부의 내부 표면은 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하고; 중간-섹션의 내부 표면은 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하고; 트랜스 개구부는 전기음성 협착부를 포함하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  2. 제1항에 있어서, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환이 시스 개구부 내에 위치설정되어, 변형된 ClyA 나노세공 내로의 데옥시리보핵산의 포획을 허용하도록 하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  3. 제2항에 있어서, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 중간-섹션 내에 위치설정되어, 변형된 ClyA 나노세공을 통한 데옥시리보핵산의 전위를 허용하도록 하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환 각각이 아르기닌을 포함하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환이 ClyA-AS의 아미노산 서열 내의 S110R 돌연변이에 상응하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 ClyA-AS의 아미노산 서열 내의 D64R 돌연변이에 상응하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 ClyA 나노세공이 12량체성 세공인, 변형된 ClyA 나노세공.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변형된 ClyA 나노세공을 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 인공 막을 추가로 포함하며, 여기서 변형된 ClyA 나노세공이 인공 막에 존재하는 것인 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 낮은 이온 강도 용액을 추가로 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 낮은 이온 강도 용액이 약 50 mM 내지 약 1 M의 이온 강도를 갖는 염 용액인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 이온 강도가 약 150 mM인 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 염 용액이 염화나트륨 (NaCl)을 포함하는 것인 조성물.
  14. 하기 단계를 포함하는, ClyA 나노세공을 통하여 DNA를 전위시키는 방법:
    a. 낮은 이온 강도 용액에, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형된 ClyA 나노세공 및 인공 막을 제공하는 단계이며, 여기서 변형된 ClyA 나노세공은 인공 막에 존재하여, 변형된 ClyA 나노세공의 시스 개구부가 낮은 이온 강도 용액의 시스 측에 존재하고 변형된 ClyA 나노세공의 트랜스 개구부가 낮은 이온 강도 용액의 트랜스 측에 존재하도록 하는 것인 단계;
    b. 낮은 이온 강도 용액의 시스 측에 DNA를 제공하는 단계; 및
    c. 변형된 ClyA 나노세공을 가로질러 전기 전위를 인가하며, 이로써 상기 DNA를 변형된 ClyA 나노세공을 통하여 시스 측에서부터 트랜스 측으로 전위시키는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 낮은 이온 강도 용액이 약 150 mM 내지 약 300 mM의 이온 강도를 갖는 염 용액인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 이온 강도가 약 150 mM인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 염 용액이 염화나트륨 (NaCl)을 포함하는 것인 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, DNA가 단일 가닥 DNA인 방법.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, DNA가 이중 가닥 DNA인 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 서열분석을 위해 사용되는 방법.
  21. 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 (야생형 ClyA의 아미노산 서열에 상응함) 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 (ClyA-AS의 아미노산 서열에 상응함)과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 이러한 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 106-78의 범위 내의 위치에서의 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환 및 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 41-74의 범위 내의 위치에서의 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 위치 1-32에서의 아미노산이 순 음전하를 산출하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 위치 110에 위치되는 것인, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 위치 64에 위치되는 것인, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 각각 독립적으로 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신을 포함하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 복수개의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 동종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  28. 제27항에 있어서, 12 내지 14개의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 동종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환이 동종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공의 제1 개구부 내에 위치설정되어, 제1 개구부에 노출된 용액 내에 음으로 하전된 중합체의 포획을 허용하도록 하는 것인, 동종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  30. 제29항에 있어서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 동종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공의 중간-섹션 내에 위치설정되어, 나노세공을 통한 음으로 하전된 중합체의 전위를 허용하도록 하는 것인, 동종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  31. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 이종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  32. 제31항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함한 12 내지 14개의 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 이종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환이 이종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공의 제1 개구부 내에 위치설정되어, 제1 개구부에 노출된 용액 내에 음으로 하전된 중합체의 포획을 허용하도록 하는 것인, 이종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  34. 제33항에 있어서, 변형된 ClyA 나노세공 서브유닛 폴리펩티드의 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 이종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공의 중간-섹션 내에 위치설정되어, 나노세공을 통한 음으로 하전된 중합체의 전위를 허용하도록 하는 것인, 이종-다량체성 변형된 ClyA 나노세공.
  35. 제1 개구부, 중간-섹션, 제2 개구부, 및 중간-섹션을 통하여 제1 개구부로부터 제2 개구부까지 연장되는 루멘을 포함하며, 여기서 제1 개구부의 루멘내 표면은 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하고, 중간-섹션의 루멘내 표면은 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함하고, 제2 개구부의 루멘내 표면은 전기음성 협착부를 규정하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  36. 제35항에 있어서, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환에서부터 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환까지의 루멘 내의 거리가 0.5 nm 내지 10 nm의 범위 내인, 변형된 ClyA 나노세공.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 변형된 ClyA 나노세공.
  38. 제35항 또는 제36항에 있어서, 제1 및 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환을 포함한, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 10개 이하의 치환을 갖는 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 변형된 ClyA 나노세공.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 110, 106, 114, 121, 122, 129, 85, 78, 268, 267, 265, 및 258로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 74, 71, 64, 53, 161, 158, 46, 42, 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 양으로 하전된 아미노산 치환이 제1 개구부 내에 위치설정되어, 제1 개구부에 노출된 용액 내에 음으로 하전된 중합체의 포획을 허용하도록 하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  42. 제41항에 있어서, 제2의 양으로 하전된 아미노산 치환이 중간-섹션 내에 위치설정되어, 세공의 루멘을 통한 음으로 하전된 중합체의 전위를 허용하도록 하는 것인, 변형된 ClyA 나노세공.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 음으로 하전된 중합체가 핵산인, 변형된 ClyA 나노세공.
  44. 제43항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산인, 변형된 ClyA 나노세공.
  45. 제44항에 있어서, 데옥시리보핵산이 이중 가닥인, 변형된 ClyA 나노세공.
  46. 제44항에 있어서, 데옥시리보핵산이 단일 가닥인, 변형된 ClyA 나노세공.
  47. 제35항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 ClyA 나노세공이 12량체성 세공인, 변형된 ClyA 나노세공.
  48. 제35항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 ClyA 나노세공이 13량체 세공인, 변형된 ClyA 나노세공.
  49. 제27항 내지 제48항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 변형된 ClyA 나노세공을 포함하는 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 막을 추가로 포함하며, 여기서 변형된 ClyA 나노세공이 막에 존재하는 것인 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 변형된 ClyA 나노세공에 커플링되는 것인 조성물.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 낮은 이온 강도 용액을 추가로 포함하는 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 낮은 이온 강도 용액이 약 150 mM 내지 약 300 mM의 이온 강도를 갖는 염 용액인 조성물.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 염 용액이 염화나트륨 (NaCl)을 포함하는 것인 조성물.
  56. 하기 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 방법:
    (a) 약 150 mM 내지 약 300 mM의 낮은 이온 강도 용액에, 제27항 내지 제48항 중 어느 한 항의 변형된 ClyA 나노세공 및 막을 제공하는 단계이며, 여기서 변형된 ClyA 나노세공은 막에 존재하는 것인 단계;
    (b) 단계 (a)의 낮은 이온 강도 용액에 표적 폴리뉴클레오티드를 부가하는 단계; 및
    (c) 나노세공을 가로질러 전위를 인가하는 동안, 변형된 ClyA 나노세공을 통한 이온 흐름을 측정하며, 여기서 이온 흐름 측정은 표적 폴리뉴클레오티드의 1종 이상의 특징을 지시하는 것인 단계.
  57. 제56항에 있어서, 1종 이상의 특징이 (i) 표적 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 실체, (iii) 표적 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 표적 폴리뉴클레오티드의 2차 구조, 및 (v) 표적 폴리뉴클레오티드가 변형되는지의 여부, 및 이로써 표적 폴리뉴클레오티드를 특징규명하는 것으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 단계 (b)의 낮은 이온 강도 용액에 부가하여, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 하고 변형된 ClyA 나노세공을 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA인 방법.
  60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 DNA인 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 흐름 측정이 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정 또는 전계 효과 트랜지스터 (FET) 측정을 포함하는 것인 방법.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 낮은 이온 강도 용액이 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
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