CN114981450A - 人工纳米孔及其相关用途和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米孔及其在分析生物多聚体(包括多肽和多核苷酸)中的用途的领域。提供了包含亚基多聚组装体的人工纳米孔,每个亚基包含(i)β‑桶状或α‑螺旋成孔蛋白的跨膜(TM)序列,其融合至(ii)能够控制多肽或多核苷酸跨所述组装体的TM区转运的成环蛋白的亚基的氨基酸序列。
Description
本发明总体上涉及纳米孔及其在分析生物多聚体和其他(生物)化合物中的用途的领域。具体地,它涉及人工纳米孔及其多蛋白组装体,以及它们在单分子分析(如单分子多肽测序)中的应用。
在细胞中,剪接和翻译后修饰在蛋白质群体中引起很大的异质性,而其不容易通过集成技术来解决。然而,今天不存在允许对单一蛋白质进行测序的技术。生物纳米孔正在成为强大的单分子工具。
通过在生物膜上形成纳米级孔的蛋白质的离子电流正在成为强大的单分子工具。与在固态膜上形成的纳米孔相比,生物纳米孔的优势在于它们以原子精度自组装,并且它们可以与天然的纳米机器进行交互,这些机器已经进化了数十亿年以处理生物分子。
最值得注意的是,由DNA加工酶辅助的纳米孔现在可被用于对DNA进行测序1,2。最近我们已经证明29来自海葵Actinia fragacea的八聚体Fragaceatoxin C(FraC)纳米孔可被用于研究蛋白质和肽,并且在低pH值(即pH 3.8)下,从肽阻断物到FraC纳米孔的离子信号直接与肽的体积相关。另参见申请人名下的WO2018/012963。
蛋白质的鉴定和测序将需要设计和工程化能够控制多肽转运的新纳米孔。然而,由于蛋白质的折叠和组装不容易预测,因此使用多肽在纳米级的构建仍然极具挑战性。迄今为止,即使是在脂质双层中保持开口的蛋白质纳米孔的设计也尚未见报道,更不用说制备具有先进功能的纳米孔的制备。设计与完全由蛋白质制成的复杂分子机器连接的人工纳米孔的能力将扩大生物纳米孔在纳米技术中的使用,并将阐明有关膜蛋白结构的基本问题。复杂蛋白质结构的制造将解决纳米级组装中新出现的挑战。因此,构建强大的跨膜机器是纳米技术中的一个重要目标。
在单分子蛋白质测序的主流方法中,蛋白质在纳米孔中解折叠并逐步转移。在一项重要的概念验证工作(Nivala等人,Nat Biotechnol.2013Mar;31(3):47–250)中,由N-末端多肽延长的蛋白质部分穿过α-HL纳米孔,而在孔的另一侧以可溶性蛋白质的形式存在的ClpX解折叠酶通过将蛋白质相对于纳米孔的入口解折叠来有力地转移蛋白质。尽管可以鉴定蛋白质结构域,但由解折叠过程产生的复杂电流特征阻止了多肽序列的辨别。在另一种方法29中,蛋白质可能在特定位点被切割,并且纳米孔电流被用于鉴定释放的肽。
因此,本发明的发明人旨在设计和工程化新的、基于蛋白质的纳米孔,其能够(作为多蛋白传感器复合物的一部分)解折叠蛋白质,控制它们通过纳米孔的进行性和单向运输,并通过离子电流辨别蛋白质。
令人惊讶的是,表明直接在纳米孔上方引入蛋白酶后,肽一被释放就被捕获和读取,从而提供了有利地用于对溶液中的蛋白质进行测序的人造纳米孔。更具体地,发明人设计并产生了稳定且低噪声的β-桶状纳米孔,其与来自嗜酸热原体菌(Thermoplasmaacidophilum)的20S蛋白酶体密封连接。后者是一种多亚基蛋白酶,可在各种条件下(包括高盐、高温和低pH值)降解多肽。令人惊讶的是,包含人工纳米孔的多蛋白组装体允许解折叠酶对接,其将选定的蛋白质线性化并送入蛋白酶体室中,而不影响纳米孔信号。在剪切和读取模式下,解折叠的多肽首先被蛋白酶体降解,然后被离子电流辨别。在线程和读取模式下,解折叠酶将完整的底物穿过无活性的蛋白酶体并穿过纳米孔。然后通过纳米孔电流的特定调制鉴定线性化底物。这种集成的分子传感器有许多应用,例如在DNA或蛋白质测序和鉴定方面。
因此,本发明提供了包括蛋白质亚基的组装体的人工纳米孔,每个亚基包括:
(i)β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的跨膜(TM)氨基酸序列,其融合至(ii)控制多肽或多核苷酸跨所述组装体的TM区转运的成环蛋白的亚基的氨基酸序列。
此类纳米孔不同于根据WO2010/004265的酶孔构建体,后者公开了由与核酸处理酶共价连接的α-溶血素构成的纳米孔。具体公开的核酸处理酶是核酸外切酶。然而,WO2010/004265描述了整个纳米孔与环状蛋白的融合,而不是根据本发明将跨膜区添加到环状蛋白中。
TM区
本文提供的人工纳米孔包含成孔蛋白的TM区。该TM区是在每个亚基中存在的多个TM序列组装后形成的,它们一起形成功能性人工纳米孔。通常,如在膜蛋白和成孔毒素中的天然跨膜区域中观察到的那样,TM序列反映了疏水性和亲水性以及甘氨酸残基的交替。成孔蛋白(PFP)通常由细菌产生,并且包括许多蛋白质外毒素(PFT,也被称为成孔毒素),但也可能由其他生物体产生,如蚯蚓产生的胞溶素(lysenin)。它们通常具有细胞毒性(即它们会杀伤细胞),因为它们会在靶细胞的膜中产生不受管制的孔。根据膜成分的二级结构,PFP可被分为使用两亲螺旋环构建孔的α-PFP,或其中使用β-桶状穿过膜的β-PFP。
在一实施方案中,人工纳米孔包含α-螺旋成孔蛋白的TM区。α-成孔毒素在本领域中是众所周知的,并且包括大肠杆菌(E.coli)的溶血素E家族、海葵溶细胞素(actinoporins)、棒状杆菌孔蛋白B、细胞溶素A(ClyA)。优选地,使用FraC、ClyA、AhlB或Wza(大肠杆菌荚膜多糖的易位子)的TM区。
一方面,使用海葵溶细胞素或海葵溶细胞素样蛋白的TM序列。海葵溶细胞素(AP)是来自海葵的成孔毒素(参见Rojko等人,(BBA,第1858卷,第3期,2016,第446-456页)的综述)。AP由β-三明治组成,其两侧侧接有α-螺旋。孔由α-螺旋簇形成。AP在约40种不同的海葵物种中发现。迄今为止,表征最好的AP是来自海葵等指海葵(Actinia equine)的等指海葵毒素II(EqtII)、来自Stichodactyla helianthus的sticholysin I和II(StnI和StnII)以及来自Actinia fragacea的fragaceatoxin C(FraC)。一方面,使用了FraC的TM序列,其由序列SADVAGAVIDGAGLGFDVLKTVLEALGN组成。
在另一优选的实施方案中,使用了ClyA(细胞溶素A)蛋白家族的一个成员的α-螺旋TM序列(PDB:2WCD(clya)和6GY6(XaxAB)。
例如,TM序列是QDLDEVDAGSMTEIVADKTVEV VKNAIETADGALDLYNKYLDQV(ClyA)、FTGAIGGIIAMAITGGIF(YaxA)或LVDAFKDLIPTGENLSELDLAKPEIELLKQSLEITKKLLGQF(YaxB)。
在另一优选的实施方案中,使用了AhlB:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的十聚体孔的α-螺旋TM序列。(PDB:6GRJ;Wilson等人,Nat Commun,10:2900-2900,2019)。
在另一方面,使用了Wza的TM序列APLVRWNRVISQLVPTISGVHDMTETVRYIKRWPN——一种在大肠杆菌(Escherichia coli)中负责输出荚膜多糖的完整外膜蛋白(PDB:2J58;Dong等人,(2006)Nature 444:226)。
可选地,人工纳米孔包括β-桶状成孔蛋白或β-PFP的TM区,其之所以如此命名,是因为它们主要由基于β-链的结构域组成。它们具有不同的序列,并被Pfam分类为多个家族,包括杀白细胞素(Leukocidins)、Etx-Mtx2、毒素-10(Toxin-10)和杨树菇溶血素(aegerolysin)。X射线晶体结构揭示了一些共性:α-溶血素和Panton-Valentine杀白细胞素S在结构上是相关的。类似地,气单胞菌溶素和梭菌ε毒素和Mtx2在Etx/Mtx2家族中相关联。在优选的实施方案中,本发明的纳米孔包含α-溶血素、气单胞菌溶素或炭疽保护性抗原(PA)的TM区。
在具体方面,TM序列包括氨基酸序列VHGNAEVHASFFDIGGSVSAGF或由氨基酸序列VHGNAEVHASFFDIGGSVSAGF组成。
成环蛋白
本文提供的人工纳米孔的特征之一在于可以控制聚合物(例如多肽或DNA分子)跨纳米孔的TM区转运的成环蛋白。例如,它是一种环形或甜甜圈状的多亚基蛋白,其可以对接到20S蛋白酶体的α环上。在一实施方案中,它是成环多聚体蛋白质,如八聚体、七聚体或六聚体蛋白质。一方面,成环多聚体蛋白的化学计量与TM序列所来源的成孔蛋白的化学计量相同。例如,炭疽保护性抗原的TM区适当地与形成七聚体环的转运蛋白结合。另一方面,匹配的化学计量不是必需的,因为许多纳米孔可以以不同的化学计量组装。例如,本发明的纳米孔还可以基于作为七聚体并且其中跨膜部分来自六聚体、八聚体、纳米聚体或十聚体的可溶性蛋白质。
在一实施方案中,成环蛋白是七聚体蛋白,其控制或能够控制多核苷酸跨TM区的转运。合适的七聚体蛋白质包括以以下唯一登录或鉴定代码之一提交给蛋白质数据库(theProtein Data Bank,PDB)的那些蛋白质:1g31、1h64、1hx5、1i4k、1i5l、1i8f、1i81、1iok、1j2p、1jri、1lep、1lnx、1loj、1mgq、1n9s、1ny6、1p3h、1tzo、1wnr、1xck、2cb4、2cby、2yf2、3bpd、3cf0、3j83、3ktj、3m0e、3st9、4b0f、4emg、4gm2、4hnk、4hw9、4jcq、4ki8、4owk、4qhs、4xq3、5jzh、5msj、5msk、5mx5和5uw8e。
可以使用七聚体ATP酶蛋白,优选地风产液菌ATP酶或其同源物或功能等效物获得良好的结果。例如,炭疽保护性抗原的TM序列与风产液菌ATP酶的单体融合(通过插入替换),该单体作为分子马达允许DNA解链和开口复合物的稳定化(图9)。
在另一实施方案中,成环多聚体蛋白质是控制或能够控制多肽跨TM区转运的七聚体蛋白质。用七聚体哺乳动物蛋白酶体激活剂PA28的亚基或其同源物或功能等效物获得了非常好的结果(参见实施例1-5)。已知七聚体蛋白酶体激活剂(PA)28αβ通过对接到20S蛋白酶体核心颗粒(CP)上来调节I类抗原加工(参见Huber等人,Structure.2017年10月3日;25(10):1473-1480)。一方面,使用了PA28α亚基或其同源物(参见实施例1-4)。在另一实施方案中,使用了PA28β亚基或其同源物。在另一实施方案中,使用了PA28γ亚基或其同源物。
PA28同源物可以来源于本领域。负责蛋白酶体结合的小鼠PA28序列(激活环和C-末端)的比对揭示了区域143-149和241-249中的关键序列。同源序列可以在其他序列中找到,如来自布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的PA26亚基。(参见PA26:Thestructureof a proteasome-11Sactivator complex and implications for proteasome-PAN/PA700 interactions.Mol.Cell 18,589–599(2005))。在一具体方面,本发明提供了人工PA26-纳米孔(参见实施例5)。
根据本发明的人工纳米孔可以被认为包括由跨膜成孔区代表的疏水部分,其融合到由控制底物(例如多肽或多核苷酸)转移穿过孔的成环蛋白代表的水溶性部分。为此,将β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的TM氨基酸序列融合至(ii)能够控制多肽或多核苷酸跨组装体的TM区转运的成环多聚蛋白的亚基的氨基酸序列。存在于两部分之间的“融合界面”处的氨基酸被认为与疏水性膜和保持膜水合(例如磷脂中的磷酸基团)以及相关地用于插入效率和纳米孔稳定性的亲水层接触。在一实施方案中,TM序列在N-末端或C-末端与成环多聚体蛋白的亚基融合。在另一实施方案中,TM序列插入成环蛋白的亚基序列内。在一些情况下,希望从成环多聚体蛋白的亚基的天然序列中去除一个或多个残基以优化纳米孔的形成。因此,如本文所用的,表述“其中β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的TM序列与成环(多聚体)蛋白的亚基的氨基酸序列融合”包括(i)TM序列与成环蛋白亚基的(任选地截短的)N-末端或C-末端的基因融合;(ii)将TM序列插入成环蛋白亚基的序列中;和(iii)TM序列的插入伴随着成环蛋白亚基序列的缺失。在后一种情况下,缺失序列的大小可以比插入的TM序列更小、更大或相同。在所有三种情况下,TM序列可以在融合位点处侧接柔性连接子。
TM序列的插入、替换或添加位点可能因使用的蛋白质而异,但其通常是通过替换成环蛋白中垂直定位于脂质双层并平行于新形成的人工纳米孔的开口的环来完成的。环的长度可以从几个到几十个氨基酸。通常,待缺失的环包含一个或多个无序区域。一方面,插入伴随着替换(交换)成环蛋白的一段氨基酸。例如,当将TM序列插入AP28亚基中同时替换其所谓的“无序区”(由AP28的氨基酸残基63-100表示)时,可以获得非常好的结果。再例如,将TM序列插入风产液菌的ATP酶的亚基中,同时替换ATP酶亚基的一段九个氨基酸残基。
可选地,成环蛋白的N-末端或C-末端可以被将形成跨膜区的TM序列替换或延伸。
柔性连接子
为了实现最佳功能(例如膜插入、双层稳定性),插入的TM序列可以(但不需要)在N-末端和/或C-末端侧侧接至少3个氨基酸,优选至少5个氨基酸,例如5-20个氨基酸的柔性亲水连接子。如本文所用的,术语“亲水的”是指其侧链可以与膜(磷)脂的带电头部基团相互作用的氨基酸。例如,亲水残基包括丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。在自然界中发现的许多实例中,两亲性-疏水性残基(酪氨酸、色氨酸和组氨酸)介导蛋白质和脂质双层之间的相互作用,并因此也可以使用这些残基。
在一实施方案中,柔性亲水连接子的至少50%的氨基酸是Ser和/或Thr残基。可能地,至少50%的氨基酸是Ser残基。TM跨越结构域的C-末端和N-末端侧侧接的柔性连接子可以具有相同或不同的(例如倒置的)序列。例如,N-末端连接子包含序列GSS或由序列GSS组成,而C-末端连接子由序列SSG组成。
本发明在此提供了将具有环形结构的蛋白质插入脂质双层的通用方法。为了研究连接子化学组成对纳米孔电性能的影响,我们筛选了几种不同的亲水性氨基酸。N-末端侧(β1)和C-末端侧(β2)的连接子长度保持固定为5个残基。β1似乎可以耐受大多数突变。相比之下,即使β2的微小变化也会增加两种电位下电记录的噪声(数据未显示)。然而,有趣的是,其中两个连接子中的所有五个氨基酸都被丝氨酸取代的构建体显示出高稳定性,并形成具有均匀单一电流的纳米孔。
融合至蛋白酶体α-亚基
为了允许将本发明的人工纳米孔应用于单分子蛋白质分析,它有利地密封地(即通过基因融合)连接到20S蛋白酶体,特别是连接到其α-亚基。有利地,使用来自嗜酸热原体菌的S20蛋白酶体,它是一种多亚基蛋白酶,可在生理条件以及极端条件(高盐、高温和低pH)下降解多肽。
在一实施方案中,本发明提供了如上文所述的人工纳米孔,其中包含(通过插入替换)侧接的TM序列的成环(多聚体)蛋白的亚基的C-末端与蛋白酶体α亚基的N-末端基因融合。优选地,它与N-末端截短的蛋白酶体α-亚基融合,使得蛋白酶体门向纳米孔敞开。在一实施方案中,蛋白酶体α-亚基缺少至少15个N-末端氨基酸(例如残基1-15、1-17、1-19、1-20、1-21、1-22或1-25)。优选地,去除至少20个N-末端残基(αΔ20)。例如,包含侧接的TM区的成环多聚体蛋白的C-末端与蛋白酶体α-亚基的残基L21基因融合。不建议缺失超过约30个残基,以保护蛋白酶体功能。
在具体的方面,本发明提供了人工纳米孔,其中包括炭疽保护性抗原(PA)的侧接的TM区的PA28的C-末端与蛋白酶体α-亚基,优选地αΔ20,更优选地嗜酸热原体菌αΔ20的N-末端基因融合。
融合至Clp蛋白酶-亚基
在另一实施方案中,为了允许将本发明的人工纳米孔应用于单分子蛋白质分析,它有利地密封地(即通过基因融合)连接到Clp蛋白酶(ClpP)家族的成员。
Clp蛋白酶家族包含属于MEROPS肽酶家族S14(ClpP内肽酶家族,SK族)的丝氨酸肽酶。ClpP是一种ATP依赖性蛋白酶,可切割多种蛋白质(如酪蛋白和白蛋白)。它作为ATP结合调节剂A和催化P亚基的异二聚体存在,这两者都是在ATP存在下有效水平的蛋白酶活性所必需的,尽管单独的P亚基确实具有一些催化活性。
已发现与ClpP高度相似的蛋白酶在细菌、后生动物、一些病毒的基因组和植物的叶绿体中编码。该家族中的许多蛋白质被归类为非肽酶同源物,因为实验发现它们没有肽酶活性,或缺乏据信对催化活性至关重要的氨基酸残基。
如下文所证明的,当包含TM序列的成环多聚体蛋白的亚基的N-末端与Clp蛋白酶(ClpP)亚基的C-末端基因融合时,获得了能够进行单蛋白分析的人工纳米孔。更具体地,本发明提供了基于如上文所述的人工PA28-纳米孔的人工纳米孔,其中ClpP的亚基(PDB ID:1TYF)融合在PA28-纳米孔的N-末端处(参见实施例7)。
多蛋白纳米孔传感器组装体/复合物
另一方面涉及包括20S蛋白酶体组分的稳定的多蛋白组装体或亚复合体,该亚复合体可以起到人工跨膜蛋白酶体的作用。来自嗜酸热原体菌的20S蛋白酶体具有圆柱形结构,其由14个α亚基和14个β亚基组成的四个堆叠环构成(图1e)12。两个侧接的外部α环允许20S蛋白酶体与几种调节复合物缔合13,其中是蛋白酶体激活剂PA28(图1a),其控制底物转移进入催化腔14。
在一实施方案中,本发明提供了多蛋白纳米孔传感器组装体/复合物,其包括(i)如上文所述的人工纳米孔,以及(ii)由蛋白酶体α-亚基组成的环,和任选地(iii)由蛋白酶体β-亚基组成的环,其中(ii)和(iii)作为单独的蛋白质组分存在,即不融合或以其他方式连接到纳米孔。
在一实施方案中,多蛋白复合物包括与蛋白酶体α-亚基的“游离”环复合的人工纳米孔。例如,这种设计适用于以受控速度转移多肽而不需要通过蛋白酶体肽酶处理它们。
优选地,本发明提供了多蛋白纳米孔传感器组装体/复合物,其包括(i)如上文所述的人工纳米孔,以及(ii)由蛋白酶体α-亚基组成的一个或两个环,和任选地(iii)由蛋白酶体β-亚基组成的一个或两个环。此类复合物在本文中也称为“跨膜蛋白酶体”或“蛋白酶体纳米孔”。例如,复合物可以包括(i)人工纳米孔(例如TM-PA28-α-亚基),(ii)由蛋白酶体α-亚基组成的一个环,和(iii)由蛋白酶体β-亚基组成的两个环。
可以截短包括在多蛋白组装体中的蛋白酶体α-亚基的N-末端,以允许解折叠的蛋白底物的快速降解,而不需要蛋白酶体激活剂。例如,使用了缺少至少5个,优选至少10个,更优选至少12个N-末端氨基酸的蛋白酶体α-亚基。
蛋白酶体β-亚基可以在多蛋白组装体中如此使用。三个天然存在的β型亚基在其N-末端含有催化活性的苏氨酸残基,并显示出N-末端亲核试剂(Ntn)水解酶活性,表明该蛋白酶体是一种苏氨酸蛋白酶,其不属于已知的丝氨酰、硫醇、羧基和金属蛋白酶家族。β亚基分别与半胱天冬酶样/PGPH(肽基谷氨酰肽水解性)、胰蛋白酶样和糜蛋白酶样活性相关,它们分别赋予了在酸性、碱性和疏水性氨基酸残基的C-末端侧处切割肽键的能力。
可选地,复合物包含蛋白酶体β亚基的环,其经工程化以提供不同类型的蛋白酶活性,从而具有不同的底物特异性。例如,修饰的蛋白酶体β-亚基可以具有胰蛋白酶类型或糜蛋白酶类型的活性。参见例如:Ma等人,(2005).Specificity of trypsin andchymotrypsin:loop-motion-controlled dynamic correlation as adeterminant.Biophysical J.89(2),1183-1193),表明通过将胰蛋白酶的两个环替换为糜蛋白酶的环,可以将胰蛋白酶的活性转化为糜蛋白酶样蛋白酶。
复合物还可以包括蛋白易位酶,其能够以相继顺序结合、解折叠多核苷酸或多肽并将多核苷酸或多肽转移通过纳米孔传感器复合物。例如,蛋白易位酶是NTP驱动的解折叠酶,优选地AAA+解折叠酶。参见,例如US2016/0032235和Dougan等人(FEBS Letters 529(2002)1873-3468)。
迄今为止,在所有研究的生物体中都鉴定出了AAA+超家族的成员。它们涉及广泛的细胞事件。在细菌中,该超家族的代表参与转录和蛋白质降解等多种功能,并在蛋白质质量控制网络中发挥重要作用。它们通常采用共同的机制来介导蛋白质-蛋白质或DNA-蛋白质复合物的依赖于ATP的解折叠/分解。在越来越多的实例中,这些AAA+蛋白的活性似乎可能受到称为衔接子蛋白的一组其他不相关的蛋白的调节。
例如,本发明的复合物包含原核AAA+解折叠酶ClpX。ClpX通过ATP驱动的多肽链转移通过其六聚体组装体的中心孔来解折叠底物蛋白。与ClpP肽酶复合,ClpX通过将解折叠的底物直接转移到ClpP蛋白水解室中来进行蛋白质降解(Sauer等人,2004)。在具体的方面,本发明提供了多蛋白纳米孔传感器复合物,其包括人工ClpP纳米孔,例如,通过与PA融合,该传感器复合物还包含ClpX或同源蛋白解折叠酶。参见下文的实施例7。
在另一实施方案中,蛋白质易位酶是来自嗜酸热原体菌(VAT)的热原体VCP样ATP酶,它是双结构域AAA ATP酶的成员并且与哺乳动物p97/VCP和NSF蛋白同源。在另一实施方案中,使用来自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的蛋白酶体激活核苷酸酶(PAN),它是相对分子量为650,000的复合物,与真核生物26S蛋白酶体中的ATP酶同源。其他实例包括AMA——一种来自古生球菌属(Archaeoglobus)和产甲烷古细菌的AAA蛋白。
在另一实施方案中,易位酶是马氏甲烷球菌(M.mazei)基因组中的开放阅读框编号854(Forouzan,Dara等人,"The archaeal proteasome is regulated by a network ofAAA ATPases."J.Biological Chemistry 287.46(2012):39254-39262)。用于本发明的其他合适的易位酶包括MBA(膜结合的AAA;Serek-Heuberger,Justyna等人,"Two uniquemembrane-bound AAA proteins from Sulfolobus solfataricus."(2009):118-122)和SAMP(Humbard,Matthew A.等人,"Ubiquitin-like small archaeal modifier proteins(SAMPs)in Haloferax volcanii."Nature 463.7277(2010):54)。
优选的多核苷酸易位酶包括解旋酶(例如gp4)、核酸外切酶(λ核酸外切酶)、蛋白酶易位酶(例如Ftsk)和拓扑异构酶(例如拓扑异构酶II)。
如下文所例示,跨膜蛋白酶体有效地插入脂质双层中,并显示低噪声电流记录。活性测定揭示蛋白酶体纳米孔具有活性,其蛋白水解活性随温度而升高,且随盐浓度而降低。蛋白酶体-纳米孔在1M NaCl溶液中的电流-电压(I-V)曲线与PA-纳米孔相似,表明跨膜区域未发生变化,且α-亚基的门是打开的。因此,本发明的另一方面涉及包括根据本发明的人工纳米孔或多蛋白纳米孔复合物的分析系统。通常,凭借其TM区,纳米孔插入疏水膜中,该疏水膜将所述系统的流体室分隔成顺式侧和反式侧。例如,膜可以是脂质双层或其可以是非脂质系统,如嵌段共聚物或其他类型的人工膜。
还提供了根据本发明的用于将多核苷酸或多肽通过分析系统转移的方法。在具体的方面,本发明涉及用于单分子分析,优选地用于鉴定和/或测序生物多聚体,更优选地用于单分子多肽或多核苷酸测序的方法,其包括向分析系统的室中加入待分析的生物多聚体,使得生物多聚体可以接触并接入(蛋白酶体)纳米孔。
取决于使用的条件,例如ATP浓度、缓冲液种类,可根据需要选择分析类型。例如,VAT能够以可以通过ATP浓度调节的速度通过纳米孔送入多肽。我们表明跨膜蛋白酶体能够同时处理和鉴定不同的蛋白质底物(图1h)。在一实施方案中,系统因此用于所谓的“降解模式”,其中被转移的肽被蛋白水解降解。可选地,无活性的蛋白酶体识别蛋白质,因为它们被线性化并以受控的速度穿过纳米孔转运(图1i)。该系统允许在单分子水平上监测蛋白酶体的活性,并具有应用,例如在实时蛋白质测序应用中。因此,在另一实施方案中,该系统用于所谓的“转移模式”。
本文还提供了包括根据本发明的人工纳米孔或多蛋白纳米孔复合物的系统用于单分子分析,优选地用于生物多聚体的鉴定和/或测序,更优选地用于单分子多肽或多核苷酸测序的用途。我们设想了两种对蛋白质进行测序的方法。在(活性)肽模式中,蛋白酶体将辨别蛋白质,将其切成碎片并辨别单个片段。在无活性链模式中,蛋白质可以被辨别,因为它们被线性化并通过解折叠酶(例如VAT)以受控的速度穿过纳米孔转运,这使完整的底物穿过纳米孔通道。单个肽由通过蛋白酶体纳米通道的电渗流引导至纳米孔,其中它们通过特定的电流阻断被辨别。因此,本发明提供了用于实时单分子蛋白质测序应用的多蛋白蛋白酶体-纳米孔。它是第一个控制多肽穿过纳米孔转运的多组分蛋白水解纳米孔。值得注意的是,蛋白酶体-纳米孔不仅在生理条件下降解多肽,而且在包括高盐、高温和/或低pH的更极端条件下也降解多肽。重要的是,表明在上述条件下也可以区分蛋白质。
本发明还提供了用于提供本发明的人工纳米孔的手段和方法。在一实施方案中,它提供了编码如本文所公开的人工纳米孔的亚基的核酸分子。核酸分子编码融合蛋白,其包括(i)β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的跨膜(TM)序列,其融合至(ii)能够控制多肽或多核苷酸跨组装体的TM区转运的成环(多聚体)蛋白的亚基的氨基酸序列。
在一实施方案中,核酸分子编码融合蛋白,所述融合蛋白包括(i)β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的TM序列,其在N-末端和C-末端侧上侧接有(ii)至少3个氨基酸的柔性连接子,所述侧接的TM序列插入(iii)能够控制多肽或多核苷酸跨TM区转运的成环(多聚体)蛋白的亚基的氨基酸序列中。在优选的实施方案中,核酸分子编码上述融合蛋白,其中包括侧接的TM序列的成环多聚体蛋白的C-末端与任选地缺少至少15个N-末端氨基酸的蛋白酶体α-亚基的N-末端基因融合。在另一优选的实施方案中,核酸分子编码上述融合蛋白,其中包括侧接的TM序列的成环多聚体蛋白的N-末端与ClpP家族成员的亚基的C-末端基因融合。
用于本发明的其他核酸分子可以编码(N-末端截短的)蛋白酶体α-亚基或蛋白酶体β-亚基。由本发明的核酸分子编码的任何蛋白质可以例如在其N-末端或C-末端包括蛋白质标签,以用于纯化和/或分离蛋白质。例如,可以添加His标签或Strep标签。其他优选的核酸分子包括编码如上文所述的优选人工纳米孔的那些核酸分子。
还提供了包含根据本发明的核酸分子的表达载体,以及包含表达载体的宿主细胞(例如的细菌或酵母宿主细胞)。宿主细胞还可以包含(即与之共转染)编码蛋白酶体β-亚基和/或蛋白酶体α-亚基的不同的表达载体。在具体的方面,宿主细胞包括两个单独的载体,其中一个编码融合蛋白酶体α-亚基的(His标记的)人工纳米孔亚基,且另一个编码蛋白酶体β-亚基和第二个(Strep标记的)蛋白酶体α-亚基。此类宿主细胞的表达允许多蛋白人工蛋白酶体-纳米孔复合物的所有组分的重组产生和共组装。可以根据本领域已知的方法分离蛋白质,例如使用利用一种或多种蛋白质标签的存在的亲和层析和/或基于蛋白质彼此的天然亲和力的共纯化。特别参见图4b。
附图说明
图1|用于单分子蛋白质分析的跨膜蛋白质装置的设计。a,小鼠PA28α的结构(PDBID:5MSJ)。b,丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸连接子结构的棒图。c,炭疽保护性抗原结构(PDB ID:3J9C)的带状图。保护性抗原的跨膜区为洋红色。脂质分子由圆形极性头部区域和两个柔性酰基链示意性地表示。d,通过分子动力学模拟产生的人工纳米孔的结构。PA28(a)经由短连接子(b)基因融合至保护性抗原(c)的跨膜区。e,嗜酸热原体菌蛋白酶体α和β亚基的结构(PDB ID:1YA7)。f,设计的蛋白酶体纳米孔的结构。g,来自嗜酸热原体菌(VAT)中的热原体VCP样ATP酶的结构(PDB ID:5G4G),h和i,与人工纳米孔结合的VAT。然后转移的蛋白质被降解为肽(h)或释放(i)。
图2|纳米孔的制造和电气优化。a,连接子长度对大肠杆菌细胞中纳米孔表达、插入效率和纳米孔稳定性的影响。跨膜区域经由短连接子(SSG,红色)插入PA28的中间。三个苯丙氨酸和一个缬氨酸残基定义了脂质-水边界,并用绿色方块突出显示。指向桶外侧和内侧的侧链分别用灰色和黑色线条突出显示。七个亚基中的每一个都贡献了由一个转角(黑线)分隔的两条β链。第一种设计的纳米孔用更宽的箭头突出显示。根据保护性抗原的天然序列制备了一个缺失突变体(Δ2)和五个插入突变体 和)。为了清楚起见,PA28显示为青色方块。b,突变体的电学性质。左:突变体的连接子序列。中间:±35mV时的单个纳米孔的电记录。右:-35mV时59个纳米孔的单一电导值的直方图。c,突变体的电学性质。左:突变体的连接子序列。中间:典型的电流迹线和电流直方图,对应于在+35mV时将单个孔插入脂质膜中。右:-35mV时59个人工纳米孔的单一电导值的直方图。使用10kHz采样率和2kHz低通Bessel滤波器在1M NaCl、15mM Tris、pH 7.5中以±35mV收集数据。d,DPhPC与通过分子动力学模拟产生的人工跨膜孔的相互作用。
图3|优化的人工孔的电学性质和底物的区分。a,离子电流测量装置的示意图。将人工孔添加到顺式侧,并插入悬浮的脂质膜中。经由两个Ag/AgCl电极施加电势,其诱导Na+和Cl-离子的电流通过纳米孔(1MNaCl、15mM Tris,pH 7.5)。根据PyMOL计算的真空静电势,将孔着色成蓝色(正)和红色(负)。b,在±35mV优化后通过有效单孔记录的典型电流迹线。平均电流值在-35mV时为41.24±0.02pA,且在+35mV时为45.43±0.06pA。c,三种不同纳米孔的平均电流–电压(I–V)特性。误差线代表与平均曲线的标准偏差。d,纳米孔的离子选择性。反转电位的测定表明孔是阳离子选择性的,正如在其收缩处的静电势所预期的那样(a)。电流信号以2kHz过滤并以10kHz采样。e,β-CD的化学结构、Ires%相对于停留时间的散点图,以及代表性迹线。f,γ-CD的化学结构、Ires%相对于停留时间的散点图,以及代表性的迹线。g,血管紧张素I的肽序列、Ires%相对于停留时间的散点图,以及代表性迹线。h,强啡肽A的肽序列、Ires%相对于停留时间的散点图,以及代表性迹线。
图4|人工蛋白酶体-纳米孔的设计。a,嗜酸热原体菌蛋白酶体-PA26的结构。PA26、蛋白酶体α亚基和β亚基分别着色为橙色/洋红色和绿色。PA26(S231)的C-末端接近α亚基的L21。b,人工蛋白酶体-纳米孔的重构。为了获得子复合物3,将两种单独的载体用于表达四种蛋白质。将PA孔融合至具有N-末端His标签的蛋白酶体α亚基(α△20),并克隆至pET-28a载体中。将未标记的β亚基和具有C-末端Strep标签的第二个α亚基(α△12)克隆到pETDuet-1载体中。首先是His标签亲和层析共纯化复合物1和3。然后是Strep标签亲和层析纯化3。c,纯化的复合物3的SDS-PAGE(左)和天然PAGE(右)分析。SDS-PAGE揭示存在三个独特的条带PAα△20(上)、α△12(中)和β(下),分子量分别为52.7、25.8和22.3kDa。这些结果表明PAα△20、β和α△12形成了一个稳定的亚复合物3。天然PAGE仅显示一条带,表明复合物是稳定的。d,单孔在±35mV时于1MNaCl、15mM Tris、pH 7.5中的行为。亚复合物3在正电位下表现出一些快速的门控行为。e,根据由PyMOL计算的真空静电势着色(蓝色,正;红色,负)的人工跨膜蛋白酶体的表面图示的直通式。
图5SDS-PAGE分析亚复合物3的水解活性。a,β-酪蛋白(1mg/mL)与亚复合物3于53℃下在缓冲液A(50mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl)中一起孵育。b,β-酪蛋白(1mg/mL)与亚复合物3在缓冲液A中一起孵育2小时。c,β-酪蛋白(1mg/mL)与亚复合物3于53℃下在缓冲液B(50mM Tris,pH 7.5,0.3-1.0M NaCl)中一起孵育0.5小时。β-酪蛋白/亚复合物3浓度比为42。
图6|用蛋白酶体纳米孔区分底物。a,使用无活性蛋白酶体-纳米孔通过底物1(S1)引发的典型电流迹线。b,S1(20μM)通过由VAT(20.0μM)和ATP(2.0mM)介导的无活性蛋白酶体-纳米孔的转移。c,当在存在ATP和VAT的情况下使用无活性蛋白酶体时,GFP-ssrA会解折叠并完整地通过蛋白酶体室和纳米孔转移。d,使用活性蛋白酶体-纳米孔通过S1引发的典型电流迹线。e,当使用活性蛋白酶体时,在VAT和ATP存在的情况下,仅观察到罕见且快速的事件,表明活性蛋白酶体-纳米孔有效地切割S1,产生小片段。f,当在存在ATP和VAT的情况下使用活性蛋白酶体时,解折叠的GFP-ssrA在蛋白酶体室中被切割,并且降解的肽太短而无法被纳米孔检测到。数据是在40℃和-30mV下于1M NaCl、15mM Tris、pH 7.5中收集的。
图7|用蛋白酶体纳米孔区分底物。a,底物1和2的序列比较。b,分数阻断相对于时间的散点图以及由切割的S1和S2在40℃和-30mV下于1M NaCl、15mM Tris、pH 7.5中诱导的代表性阻断的散点图。
图8|PA26人工纳米孔的设计和膜插入。a,炭疽保护性抗原结构(PDB ID:3J9C)的带状图。跨膜区域以蓝色突出显示。b,PA26的结构(PDB ID:1YA7)。c,人工PA26-纳米孔的结构。d,典型的电流迹线显示单个孔的插入。在1M NaCl、15mM Tris、20mM MgCl2、pH 7.5中于±35mV下收集数据。
图9|ATP酶人工纳米孔的设计和插入。a,炭疽保护性抗原结构(PDB ID:3J9C)的带状图。跨膜区域以蓝色突出显示。b,风产液菌ATP酶的结构(PDB ID:3M0E)。c,人工ATP酶跨膜孔的结构。d,典型的电流迹线显示单个孔的插入和ATP水解。ATP酶纳米孔在正电位下显示门控。当在溶液中加入ATP(2mM)时,电流迹线变得嘈杂且更大。在1M NaCl、15mM Tris、20mM MgCl2、pH 7.5中于±35mV下收集数据。
图10|用于单分子蛋白质分析的ClpP人工纳米孔的设计。a,PA-纳米孔的结构。b和c,ClpP结构(PDB ID:1TYF)的带状图。d,PA纳米孔与ClpP基因融合。e,设计的ClpP-纳米孔的结构。f,解折叠酶ClpX的结构(PDB ID:3HWS)。
图11|三种不同纳米孔的电流–电压(I–V)特性。人工开口和封闭的ClpP纳米孔不会改变纳米孔的电导。电流信号在0.5M KCl、20mM HEPES、pH 7.5中记录,以2kHz过滤,并以10kHz采样。
图12|通过ClpP纳米孔的受控转移。在存在2.0mM ATP的情况下,ClpX辅助GFP穿过开口的ClpP-纳米孔转运。ClpP-纳米孔、ClpX和GFP被添加到顺式侧。使用10kHz低通Bessel滤波器和50kHz采样率在22℃和-50mV下于0.1M KCl、0.3M NaCl、10%甘油、15mM Tris、pH7.5中收集数据。然后利用具有5kHz阈值的Gaussian低通滤波器对迹线进行数字滤波。
实验部分
材料与方法
一般材料。寡核苷酸和gBlock基因片段获自Integrated DNA Technologies(IDT)。Phire Hot Start II DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶和Dpn I购自FisherScientific。血管紧张素I、强啡肽A、戊烷、十六烷和Trizma碱获自Sigma-Aldrich。1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)购自Avanti Polar Lipids。氯化钠和Triton X-100购自Carl Roth。
蛋白质的质粒构建。gBlock基因片段通过IDT订购合成,并使用Nco I和Hind III限制性消化位点克隆到pT7-SC1质粒33中。使用T4连接酶(Fermentas)将质粒和基因连接在一起。通过电穿孔将0.5μL连接混合物掺入50μL E.10G(Lucigen)感受态细胞中。将转化子在补充有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂板上于37℃培养过夜。挑取氨苄青霉素抗性菌落并接种到补充有氨苄青霉素(100μg/mL)的5mL LB培养基中,用于质粒DNA制备。用GeneJET提取试剂盒(Fisher Scientific)提取质粒。通过在Macrogen测序确认克隆的身份。
用于构建测序蛋白酶体机器的质粒构建。通过IDT订购合成嗜酸热原体菌α和β的gBlock基因片段。编码α亚基的基因被克隆到pETDuet-1载体(Novagen)的上游,位于Nco I和Hind III位点之间,C-末端具有Strep标签的基因。随后,将编码未标记的β亚基的基因克隆到下游Nde I和Kpn I位点之间。PA-纳米孔通过PCR剪接经重叠延伸34与α亚基基因融合,并使用Nco I和Hind III限制性消化位点克隆到在N-末端具有His标签的pET-28a载体(Novagen)中。
突变体的构建。所有突变体均使用QuickChange方案35构建,以用于用Phire热启动II聚合酶对环状质粒模板DNA进行定点诱变。使用部分重叠的引物来避免引物自延伸。PCR扩增如下:98℃下变性3min,然后30个循环的98℃ 30s,55℃ 30s和72℃ 3min,以及最后延伸循环72℃ 5min。PCR反应后,将亲本DNA模板用Dpn I酶在37℃下消化1h。将PCR扩增的质粒在1%琼脂糖凝胶上分离,用GeneJET凝胶提取试剂盒(Fisher Scientific)提取,并通过电穿孔掺入50μL E.10G(Lucigen)感受态细胞中。将含有质粒的转化子在37℃下于补充有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂板上培养过夜。挑取氨苄青霉素抗性菌落并接种到补充有氨苄青霉素(100μg/mL)的5mL LB培养基中,以用于质粒DNA制备。用GeneJET提取试剂盒(Fisher Scientific)提取质粒,并在Macrogen测序以确认突变。
表达和纯化。PA纳米孔的基因被转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞中。在补充有氨苄青霉素(100mg/L)的溶原性肉汤(LB)琼脂平板上于37℃过夜生长后选择转化子。将所得菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素的200mL LB培养基中。细胞在37℃(180rpm摇动)下生长。在光密度于600nm处达到0.6的吸光度后,通过添加0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。将温度降至25℃,并将细胞培养物进一步培养过夜。通过在4℃下离心20min(4000x g)收获细胞,并将颗粒储存在-80℃。将约100mL的细胞培养沉淀解冻,并用~20mL裂解缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、1mM MgCl2、0.1单位/mL DNA酶I、10μg/mL溶菌酶、1%v/v Triton X-100)溶解,并在22℃下用涡旋振荡器搅拌1小时。然后通过超声裂解细菌(占空比10%,输出控制3,Branson Sonifier 450)。随后将裂解物在4℃下以6000x g离心20min,并丢弃细胞碎片。将上清液与100μL Strep-Tactin树脂(IBA)混合到用洗涤缓冲液(1%v/v Triton X-100、150mM NaCl、15mM Tris-HCl、pH7.5)预平衡的50mL falcon管中。1小时后,将树脂加载到用5mL洗涤缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、1%v/v Triton X-100)预洗涤的柱(Micro Bio Spin,Bio-Rad)中。总共使用10mL洗涤缓冲液(1%v/v Triton X-100、150mM NaCl、50mM Tris、pH 7.5、20mM咪唑)来洗涤珠。用大约100μL洗脱缓冲液(2.5mM脱硫生物素、150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、0.2%v/v Triton X-100)洗脱蛋白质。
将编码测试肽S1和S2的基因分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)电感受态细胞中。在补充有氨苄青霉素(100mg/L)的溶原性肉汤(LB)琼脂板上于37℃过夜生长后选择转化子。将所得菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素的200mL LB培养基中。细胞在37℃(180rpm摇动)下生长。在光密度于600nm处达到0.6的吸光度后,通过在37℃下添加0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。并将细胞培养物进一步培养4小时。通过在4℃下离心20min(4000x g)收获细胞,并将沉淀储存在-80℃。将约100mL的细胞培养沉淀解冻,并用~20mL裂解缓冲液(300mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、1mM MgCl2、0.1单位/mL DNA酶I、10μg/mL溶菌酶、0.2%v/v Triton X-100)溶解,并在4℃下用涡旋振荡器搅拌1小时。然后通过超声裂解细菌(占空比10%,输出控制3,Branson Sonifier 450)。随后将裂解物在4℃下以6000x g离心20min,并丢弃细胞碎片。将上清液与100μL Ni-NTA树脂(Qiagen)混合到用洗涤缓冲液(300mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、0.2%v/v Triton X-100)预平衡的50mL falcon管中。在4℃下1小时后,将树脂加载到用5mL洗涤缓冲液(300mM NaCl、50mMTris-HCl、pH 7.5、0.2%v/v Triton X-100)预洗涤的柱(Micro Bio Spin,Bio-Rad)中。总共使用10mL洗涤缓冲液(300mM NaCl、50mM Tris、pH 7.5、20mM咪唑)来洗涤珠。用大约200μL洗脱缓冲液(500mM咪唑、300mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5)洗脱蛋白质。
将编码VAT和GFP的基因分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)电感受态细胞中。在补充有氨苄青霉素(100mg/L)的溶原性肉汤(LB)琼脂板上于37℃过夜生长后选择转化子。将所得菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素的200mL LB培养基中。细胞在37℃(180rpm摇动)下生长。在光密度于600nm处达到0.6的吸光度后,通过在25℃下添加0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。并将细胞培养物进一步培养过夜。通过在4℃下离心20min(4000x g)收获细胞,并将沉淀储存在-80℃。将约100mL的细胞培养沉淀解冻,并用~20mL裂解缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、1mM MgCl2、0.1单位/mL DNA酶I、10μg/mL溶菌酶)溶解,并用涡旋振荡器在4℃下搅拌1小时。然后通过超声裂解细菌(占空比10%,输出控制3,Branson Sonifier 450)。随后将裂解物在4℃下以6000x g离心20min,并丢弃细胞碎片。将上清液与100μL Ni-NTA树脂(Qiagen)混合到用洗涤缓冲液(150mM NaCl、50mMTris-HCl、pH 7.5)预平衡的50mL falcon管中。在4℃下1小时后,将树脂加载到用5mL洗涤缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5)预洗涤的柱(Micro Bio Spin,Bio-Rad)中。总共使用10mL洗涤缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris、pH 7.5、20mM咪唑)洗涤珠。用大约200μL洗脱缓冲液(500mM咪唑、150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5)洗脱蛋白质。
蛋白酶体共表达和纯化。为了组装蛋白酶体-纳米孔,将含有编码蛋白酶体α和β亚基的基因的pETDuet-1和含有编码PA28-α△20纳米孔质粒基因的pET28a共转化到大肠杆菌BL21(DE3)电感受态细胞中。在补充有氨苄青霉素(100mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的LB琼脂板上于37℃过夜生长后选择转化子。将所得菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素和卡那霉素的200mL LB培养基中。当A600达到约0.6时,通过0.5mMβ-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。将温度降至25℃。诱导12h后,收集细胞,并将沉淀储存于-80℃。
将约100mL细胞培养沉淀解冻,并用~20mL裂解缓冲液(150-1000mM NaCl、50mMTris-HCl、pH 7.5、1mM MgCl2、20mM咪唑、0.1单位/mL DNA酶I、10μg/mL溶菌酶、1%v/vTriton X-100)溶解,并在22℃下用涡旋振荡器搅拌1小时。然后通过超声裂解细菌(占空比10%,输出控制3,Branson Sonifier 450)。随后将裂解物在4℃下以6000x g离心20min,并丢弃细胞碎片。将上清液与100μL Ni-NTA树脂(Qiagen)混合到用洗涤缓冲液(1%v/vTriton X-100、150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.5)预平衡的50mL falcon管中。1小时后,将树脂加载到用5mL洗涤缓冲液(150mM NaCl、15mM Tris-HCl、pH 7.5、1%v/v Triton X-100)预洗涤的柱(Micro Bio Spin,Bio-Rad)中。用大约200μL洗脱缓冲液(500mM咪唑、150-1000mM NaCl、15mM Tris-HCl、pH 7.5、1%v/v Triton X-100)洗脱蛋白质。随后,将洗脱的蛋白质与50μL Strep-Tactin树脂(IBA)混合到用洗涤缓冲液(1%v/v Triton X-100、150mM NaCl、15mM Tris-HCl、pH 7.5)预平衡的2mL管中。30分钟后,将树脂加载到用5mL洗涤缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、1%v/v Triton X-100)预洗涤的柱(MicroBio Spin,Bio-Rad)中。总共使用10mL洗涤缓冲液(150-1000mM NaCl、50mM Tris、pH 7.5、20mM咪唑、0.2%v/v Triton X-100)来洗涤珠子。用大约100μL洗脱缓冲液(2.5mM脱硫生物素、150-1000mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、0.2%v/v Triton X-100)洗脱蛋白质。
人工蛋白酶体-纳米孔(复合物3)的蛋白水解活性。为了确定人工蛋白酶体-纳米孔的蛋白水解活性,将β-酪蛋白与纯化的复合物3在各种孵育时间、温度和盐浓度下孵育(图5)。首先,在缓冲液A(50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl)中,将0.1mLβ-酪蛋白(1mg/mL)的等分试样与复合物3于53℃下孵育。最终的β-酪蛋白/复合物3浓度比为42(图5a)。在没有蛋白酶的情况下,没有观察到β-酪蛋白的降解。在53℃下与复合物3一起孵育15min后,几乎所有的β-酪蛋白都被消化,大约四分之三的最初观察到的蛋白质在SDS-PAGE上不再可检测到。孵育30分钟后,所有β-酪蛋白均被消化。然后,测试了降解β-酪蛋白的各种温度和盐浓度。如图5b和图5c所示,蛋白水解活性随温度而升高,并随盐浓度升高而降低。
平面脂质双层中的电记录。该装置由两个由25μm厚的聚四氟乙烯薄膜(Goodfellow Cambridge Limited)隔开的腔室组成,其含有一个直径约为100μm的孔,该孔是通过施加高压火花形成的。为了形成脂质双层,用一滴5%十六烷/戊烷溶液对孔进行预处理。在等待约1-5分钟以使戊烷蒸发后,将500μL缓冲溶液(150mM NaCl、15mM Tris-HCl、pH 7.5)添加到每个隔室中。然后在每个隔室中加入一滴于戊烷(~10mg/mL)中的1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)。戊烷蒸发后,通过在孔上上下吹打溶液自发形成脂质单层。将银/氯化银电极浸入每个隔室的溶液中。纳米孔被添加到反式侧。所有实验均在~23℃下进行36。
数据记录和分析。通过使用Axopatch 200B(Axon Instruments)记录电子信号,并使用Digidata 1440(Axon Instruments)进行数字化。Clampex10.7软件和Clampfit 10.7软件(Molecular Devices)分别用于电子信号记录和后续数据分析。事件是使用clampfit中的单通道搜索功能收集的,且小于0.05ms的事件被忽略。
离子选择性。利用自动电压方案记录电流–电压(I-V)电流迹线,该方案以1mV的步进施加从-30到+30mV的每个电位0.4s。Ag/AgCl电极被含有2.5M NaCl的2.5%琼脂糖桥包围。从在不对称盐浓度条件下收集的I-V曲线外推来测量反转电位。实验进行如下:首先,在两个腔室中使用相同的缓冲液(1M NaCl、15mM Tris、pH 7.5、500μL)重构单个纳米孔。这允许评估纳米孔的方向并允许平衡电极。然后将含有4M NaCl、15mM Tris,pH 7.5的500μL溶液缓慢添加到顺式侧,并将500μL不含NaCl(15mM Tris,pH 7.5)的缓冲溶液添加到反式侧(顺式:反式,2.0MNaCl:0.5M NaCl)。
实施例1:人工纳米孔的设计
来自嗜酸热原体菌的20S蛋白酶体具有圆柱形结构,其由14个α和14个β亚基组成的四个堆叠环构成(图1e)12。两个侧接的外部α环允许20S蛋白酶体与几种调节复合物缔合13,其中是蛋白酶体激活剂PA28(图1a),其控制底物转移进入催化腔内14。我们通过将PA28亚基中的无序区域(从I63到P100)替换为两侧中的每侧上各有一个短的柔性连接子(SSG)的炭疽保护性抗原的跨膜区域(VHGNAEVHASFFDIGGSVSAGF)15,设计了PA28纳米孔(图1a-d、图2a)。该跨膜(TM)区域的22个残基足以跨越脂质双层的疏水核心。
人工PA28-纳米孔亚基的氨基酸序列如下:
将侧接有2个短连接子(SSG)(以粗体表示)的保护性抗原的跨膜区插入PA28α的多肽序列中,该插入还涉及以斜体表示的PA28的氨基酸片段的缺失。
为了优化融合纳米孔,通过在跨膜区域的每一侧上添加或去除残基来改变连接子的长度。基于保护性抗原纳米孔的序列15制备了一个缺失突变体(Δ2)和五个插入突变体(和)(图2a)。除Δ2外,所有变体都可以插入脂质双层中。然而,突变体之间的插入效率和随后的双层稳定性不同。和显示出较大的电流波动,这阻碍了纳米孔分析,表明连接子为纳米孔引入了较大的构象灵活性。显示低噪声电导,在正施加电位下偶尔会出现全电流阻断。然而,纳米孔显示出异质的单一电导并且通常在负施加电位下闭合(图2b)。在所有构建体中,有效表达和纯化的在脂质双层中产生最均匀的孔(在-35mV下1.17±0.14nS的平均单一电导、1M NaCl、15mM Tris、pH 7.5、n=59,图2c)。
对PA-纳米孔(以下称为PA-纳米孔)进行分子动力学(MD)模拟,以更好地了解纳米孔和脂质双层之间的静电和疏水相互作用。如图2d所示,疏水残基的两个环将TM区锚定到双层的疏水边缘,而具有脂肪族侧链的交替残基与双层核心接合。孔的内腔通过亲水性残基保持水合。正如预期的那样,连接子残基的亲水侧链与膜脂的带电头基相互作用。
实施例2:优化的人工孔的电学和功能特性
与其他β-桶状纳米孔(如αHL18和气单胞菌溶素19)纳米孔类似,人工PA-纳米孔显示出不对称的电流–电压(I–V)关系(图3c),这允许鉴定脂质双层中孔的方向。使用不对称NaCl浓度(0.5M/顺式和2M/反式)的离子选择性测量揭示了阳离子选择性纳米孔(PK+/PCl-=1.76±0.20,图3d)。在这里和整个文稿中,误差表示从三个实验中获得的标准偏差。PA-纳米孔的正确折叠使用环糊精(CD)进行表征,环糊精(CD)是与β-桶状纳米孔结合的环状分子20。将α-CD、β-CD和γ-CD添加到人工纳米孔的顺式侧,并测量与阻断(IB)相关的离子电流的大小。为了表征阻断,我们使用排除电流的百分比(Ires%),定义为[(IO–IB)/IO]×100,其中IO代表开口孔电流。α-CD很可能过快地穿过纳米孔转移,因为没有观察到电流阻断。相比之下,β-CD和γ-CD显示出特征性阻断(图3e和图3f)。最后,使用血管紧张素I和强啡肽A测试了纳米孔鉴定肽的能力。我们发现这两种肽诱导了阻断,其可以很容易地使用几个参数来区分,包括剩余电流和电流阻断的持续时间(图3g和图3h)。
实施例3:人工跨膜蛋白酶体的设计
在细胞中,PA28对接到20S蛋白酶体上,并控制底物转移到催化腔中21。然而,我们发现,当在1M NaCl溶液中将蛋白酶体添加到单个PA28纳米孔的顺式侧时,没有观察到明显的相互作用。最有可能的是,使用的高离子强度不允许这种相互作用22。嗜酸热原体菌蛋白酶体与来自布氏锥虫的PA26(PA28的同源物)复合物的晶体结构表明,PA26的羧基末端尾部滑入20S蛋白酶体上靠近α亚基氨基末端的口袋中(图4a)。因此,我们将PA28(S231)的C-末端与蛋白酶体α亚基的L21融合。在设计的蛋白质复合物中,α亚基的前20个残基被去除,使蛋白酶体门向PA28纳米孔敞开。蛋白酶体的正确组装需要α亚基和β亚基的共同组装。因此,将与含有N-末端His标签的蛋白酶体△20-α亚基(PA28-α△20纳米孔)融合的PA28克隆到携带卡那霉素抗性基因的pET-28a载体中。含有C-末端Strep标签的蛋白酶体α△12和β亚基都被克隆到携带卡那霉素抗性基因的pETDuet-1载体中(图4b)。在α△12中,α亚基的前12个残基被去除,从而可以快速降解解折叠的底物,而无需蛋白酶体激活剂24。然后使用1M NaCl、50mM Tris,pH 7.5溶液通过亲和层析分两步纯化共组装的蛋白酶体-纳米孔(图4b)。SDS-PAGE和天然PAGE证实了多蛋白复合物的成功组装(图4c)。活性测定表明,蛋白酶体纳米孔具有活性,蛋白水解活性随温度而升高,并随盐浓度而降低(图5)。跨膜蛋白酶体有效插入脂质双层中并显示低噪声电流记录,尽管观察到一定程度的正电位快速门控(图4d)。蛋白酶体-纳米孔在1M NaCl溶液中的I-V曲线与PA-纳米孔相似(数据未显示),表明跨膜区域没有变化,且α-亚基的门是打开的。这些结果表明,共表达和两步纯化程序可用于在含有1MNaCl的溶液中有效分离大肠杆菌中形成的稳定亚复合物3(PAα△20-ββ-α△12纳米孔)。
实施例4:实时蛋白加工
使用含有C-末端ssrA标签的底物测试跨膜蛋白酶体的活性,其介导与VAT(嗜酸热原体菌的含缬酪肽的蛋白样ATP酶)的相互作用25,VAT是一种将底物蛋白通过蛋白酶体室的解折叠酶。第一种底物,命名为S1,长123个氨基酸,且设计为非结构化的,并包含四段15个丝氨酸残基,侧接有一组10个精氨酸和三个疏水残基。第二种底物是S2,一种210个氨基酸的较长多肽。第三种底物是绿色荧光蛋白(GFP)25,在C-末端带有10个精氨酸和一个ssrA标签(AANDENYALAA)。
使用跨膜蛋白酶体进行初始测试,其中通过用丙氨酸取代活性位点中的氨基末端苏氨酸1来去除蛋白水解活性26。反应在1M NaCl、15mM Tris-HCl、pH 7.5、20mM MgCl2溶液中进行。将20.0μM的S1添加到无活性的蛋白酶体纳米孔的顺式隔室中会导致短的(平均停留时间为0.62±0.11ms)和第二长的电流阻断(图6a)。最有可能的是,短事件表示底物穿过纳米孔转移,且长事件表示底物在蛋白酶体腔内保持阻塞。两种阻断都显示出接近零的剩余电流(Ires%=11.56±0.13),这表明在转移期间,非结构化底物堵塞了大部分纳米孔。当在存在2.0mM ATP的情况下在溶液中添加VAT(20.0μM)时,不再观察到第二长的阻断(图6b)。此外,与非辅助转移事件相比,在VAT辅助转移事件期间观察到更多离子电流(Ires%=83.81±0.11),这表明在VAT解折叠底物时底物被拉伸。在转移期间中观察到几个反复出现的电流特征(平均停留时间为5.8±3.9ms),表明底物的不同特征反映在离子信号中(图6b)。
当使用GFP代替S1时,电流阻断变得更长(平均停留时间为22.1±20.2ms),并且电流特征与S1相比有显著差异(图6b、图6c),表明两种底物可以根据它们的离子电流信号进行区分。当ATP浓度增加到6.0mM时,GFP阻断剂的平均停留时间减少了10倍至2.4±1.7ms(数据未显示)。因此,VAT能够以可以通过ATP浓度调节的速度通过纳米孔送入多肽。
当在S1存在但没有VAT和ATP的情况下使用活性蛋白酶体时,观察到均匀和短的阻断(图6d)。它们的平均停留时间(0.51±0.03ms)比用无活性的蛋白酶体记录的类似事件所观察到的短,这表明蛋白酶体在转移过程中至少部分处理了底物。当测试更长的解折叠底物(S2)时,观察到的事件的平均停留时间更长(2.26±0.26ms),并且与S1相比,观察到更深的剩余电流,表明形成了更大的多肽片段。S1和S2的混合物可以很容易地通过离子电流阻断来区分。有趣的是,当用VAT(20.0μM)和ATP(2.0mM)测试S1时,观察到更多间隔和更短的阻断(图6e),这表明多肽穿过蛋白酶体室的速度降低允许更有效地降解多肽为小肽,这些小肽可以快速转运穿过纳米孔。因此,当在相同条件下测试GFP时,没有观察到阻断,这表明与非结构化S1相比,GFP的较慢解折叠允许底物更有效地蛋白水解成更小的肽。这些肽通过纳米孔转运太快而无法观察到27。
实施例5:PA26人工纳米孔
本实施例描述了人工纳米孔的设计和表征,该纳米孔包括成环多聚体蛋白酶体激活剂蛋白PA26,PA26是PA28的同源物。
炭疽保护性抗原(PDB ID:3J9C)的跨膜序列(粗体)经由2个连接子(GSSSE----SNSSG)在PA26(PDB ID:1YA7)的一个亚基中间融合,其中斜体显示的12个氨基酸序列被删除。
人工PA26-纳米孔的N-末端Strep标记的亚基的完整序列如下:
图8显示了所得人工PA26-纳米孔的结构,以及证明单个孔插入的典型电流迹线。
实施例6:ATP酶人工纳米孔
本实施例描述了包含作为能够转运多核苷酸的蛋白质的实例的成环多聚体风产液菌ATP酶(PDB ID:3M0E)的人工纳米孔的设计和表征。
炭疽保护性抗原(PDB ID:3J9C)的跨膜序列(粗体)被插入到ATP酶亚基的中间,其中斜体所示的氨基酸序列被删除(插入替换)。如粗体所示,插入的TM序列侧接在均具有连接子(SSSSS)的两侧上。N-末端Strep标记的人工ATP酶-纳米孔亚基的完整序列如下:
图9显示了组装的亚基的结构,以提供人工ATP酶跨膜纳米孔。值得庆幸的是,人工ATP酶纳米孔可以有效地表达并重构为脂质双层以形成纳米孔。向溶液中添加ATP会增加基线纳米孔的噪音,表明该蛋白质是有活性的。因此,提供了基于β桶与环形蛋白的融合的人工纳米孔的另一实例。
实施例7:ClpP人工纳米孔
本实施例描述了用于单分子蛋白质分析的人工纳米孔的设计。其基于如实施例1中所述的人工PA28-纳米孔,在其N-末端融合到ClpP的亚基上。
ClpP(PDB ID:1TYF)是来自大肠杆菌的酪蛋白分解Clp蛋白酶(ClpP)。Wang等人(1997)Cell 91:447-456)以的分辨率确定了ClpP的结构。活性蛋白酶类似于一个空心的实心壁圆柱体,由两个背靠背堆叠的7重对称环组成。它的14个蛋白水解活性位点位于直径约的中央大致球形腔室中。蛋白水解室入口由两个轴向孔控制,每个孔具有的最小直径大约为
人工ClpP-纳米孔的C-末端Strep标记的亚基的完整序列如下:
残基1-208(斜体)代表来自大肠杆菌的ClpP的一级序列;残基209-462是PA-纳米孔,其包括C-末端Strep标记肽WSHPQFEK;带下划线的残基271-273和300-302是连接子;且残基274-299(粗体)代表TM区。
图10示出了人工ClpP-纳米孔的示意性设计。
对纯化的ClpP-纳米孔进行SDS-PAGE分析,存在的两个独特的条带很好地对应了活性ClpP-PA孔、活性ClpP、无活性的ClpP-PA孔和无活性的ClpPPAα△20的分子量(数据未显示)。
图11显示了三种不同纳米孔的电流–电压(I–V)特性。人工开口和封闭的ClpP-纳米孔不会改变纳米孔的电导。电流信号在0.5M KCl、20mM HEPES、pH 7.5中记录,以2kHz过滤,并以10kHz采样。
图12显示了蛋白质(GFP)通过ClpP-纳米孔的受控转移。在存在ATP的情况下,ClpX辅助GFP通过开口的ClpP-纳米孔转运。ClpP-纳米孔、ClpX和GFP被添加到顺式侧。
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Claims (25)
1.包含亚基的多聚组装体的人工纳米孔,每个亚基包含:
(i)β-桶状或α-螺旋成孔蛋白的跨膜(TM)序列,其融合至(ii)控制多肽或多核苷酸跨所述组装体的TM区转运的成环蛋白的亚基的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的人工纳米孔,其包含α-螺旋成孔蛋白的TM序列,优选地FraC、ClyA、AhlB或Wza(大肠杆菌(E.coli)荚膜多糖的易位子)的TM序列。
3.如权利要求1所述的人工纳米孔,其包含β-桶状成孔蛋白的TM序列,优选地α-溶血素、气单胞菌溶素或炭疽保护性抗原(PA)的TM序列。
4.如权利要求3所述的人工纳米孔,其中所述TM序列包括氨基酸序列VHGNAEVHASFFDIGGSVSAGF或由氨基酸序列VHGNAEVHASFFDIGGSVSAGF组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的人工纳米孔,其中所述TM序列在N-末端或C-末端与所述成环蛋白的亚基融合。
6.如权利要求1-4中任一项所述的人工纳米孔,其中所述TM序列被插入所述成环蛋白的亚基序列中。
7.如权利要求1-5中任一项所述的人工纳米孔,其中所述TM序列在N-末端和/或C-末端侧侧接有至少3个、优选地至少5个氨基酸的柔性连接子,更优选地,其中所述N-末端连接子包括序列GSS或由序列GSS组成,和/或其中所述C-末端连接子包括序列SSG或由序列SSG组成。
8.如权利要求1-7中任一项所述的人工纳米孔,其中所述成环蛋白是七聚体蛋白。
9.如权利要求8所述的人工纳米孔,其中所述成环七聚体蛋白控制多核苷酸跨所述TM区的转运。
10.如权利要求9所述的人工纳米孔,其中所述七聚体蛋白为ATP酶,优选地为风产液菌(A.aeolicus)ATP酶或其同源物或功能等效物。
11.如权利要求8所述的人工纳米孔,其中所述成环七聚体蛋白控制多肽跨所述TM区的转运。
12.如权利要求11所述的人工纳米孔,其中所述七聚体蛋白是蛋白酶体激活剂PA28、PA26或其同源物或功能等效物。
13.如权利要求1-12中任一项所述的人工纳米孔,其中所述包含所述TM序列的成环蛋白亚基的C-末端与蛋白酶体α-亚基的N-末端基因融合。
14.如权利要求1-12中任一项所述的人工纳米孔,其中包含所述TM序列的成环蛋白亚基的N-末端与Clp蛋白酶(ClpP)亚基的C-末端基因融合。
15.多蛋白纳米孔传感器复合物,其包括(i)权利要求1-14中任一项所述的人工纳米孔,(ii)由蛋白酶体α-亚基组成的一个或两个环,和任选地(iii)由蛋白酶体β-亚基组成的一个或两个环。
16.如权利要求15所述的多蛋白纳米孔传感器复合物,其中所述蛋白酶体α-亚基在其N-末端缺少至少5个氨基酸。
17.如权利要求15或16所述的多蛋白纳米孔传感器复合物,其中所述由蛋白酶体β-亚基组成的环被工程化以提供不同类型的蛋白酶活性。
18.如权利要求15-17中任一项所述的多蛋白纳米孔传感器复合物,其还包括蛋白易位酶,所述蛋白易位酶能够以相继顺序结合、解折叠多核苷酸或多肽并使多核苷酸或多肽转移通过所述纳米孔传感器复合物。
19.如权利要求18所述的多蛋白纳米孔传感器复合物,其中所述蛋白易位酶为NTP驱动的解折叠酶,优选为AAA+解折叠酶,更优选地其中所述蛋白易位酶选自ClpX、VAT、PAN、AMA、854、MBA和SAMP。
20.分析系统,其包括将流体室分成顺式侧和反式侧的疏水性膜,所述膜包含如权利要求1-14中任一项所述的人工纳米孔,或权利要求15-19中任一项所述的多蛋白纳米孔传感器复合物。
21.用于单分子分析,优选地用于生物多聚体鉴定和/或测序,更优选地用于单分子多肽和多核苷酸测序的方法,其包括向权利要求20所述的分析系统的室中加入待分析的生物多聚体,并允许所述生物多聚体接触所述孔。
22.权利要求20所述的分析系统用于单分子分析,优选地用于生物多聚体鉴定和/或测序,更优选地用于单分子多肽或多核苷酸测序的用途。
23.核酸分子,其编码如权利要求1-14中任一项所述的人工纳米孔的亚基。
24.表达载体,其包含权利要求23所述的核酸分子。
25.宿主细胞,其包含权利要求24所述的表达载体,任选地还包含编码蛋白酶体β-亚基和/或蛋白酶体α-亚基的不同表达载体。
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