CN117417421A

CN117417421A - 一种突变体膜蛋白复合物纳米孔及其应用

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Publication number: CN117417421A
Application number: CN202310040838.2A
Authority: CN
Inventors: 张宁
Original assignee: Beijing Puyi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Puyi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-01-12
Filing date: 2023-01-12
Publication date: 2024-01-19
Anticipated expiration: 2043-01-12
Also published as: CN117417421B

Abstract

本发明属于基因工程和遗传工程领域，公开了一种突变体膜蛋白复合物纳米孔及其应用，包括孔蛋白复合物突变体CpsC‑CpsD_K49A的表达载体构建，蛋白的表达纯化、结构解析。

Description

一种突变体膜蛋白复合物纳米孔及其应用

技术领域

本发明涉及一种表征目标多核苷酸的方法，特别涉及一种经过改造的突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物及其应用，属于基因工程和遗传工程领域。

背景技术

作为近年来发展迅猛的第三代测序技术，纳米孔测序依据孔道类型可分为固态孔和生物纳米孔，生物纳米孔即能够允许底物通过的孔道蛋白，以下统称为生物纳米孔。生物纳米孔测序技术的基本原理是在电场力的作用下，带电核酸底物能够通过孔道蛋白，当核酸通过生物纳米孔时，不同碱基及其修饰能够影响通过生物纳米孔的电流强度，产生不同的电流信号，通过对电流信号的解析，可以获得通过纳米孔的核酸的碱基信息。作为影响纳米孔测序技术的关键因素，孔道蛋白的性质至关重要，而孔道蛋白种类单一是目前纳米孔测序技术所面临的主要问题之一，以常用的孔道蛋白——大肠杆菌CsgG突变体为例，由于其孔道收缩区厚度能够容纳4-5个碱基，使得单次记录的电流信号是由4-5个碱基的阻碍作用产生，造成后续信号分析难度较大，导致准确率难以达到二代测序的水平。因此，需要发掘具有新型收缩区的孔道蛋白，一方面能够增加纳米孔的可选择种类，另一方面减少电流信号解析难度，进一步提高测序的准确率。

发明内容

本发明针对现有来源于大肠杆菌的纳米孔蛋白收缩区较厚，导致电流信号检测涉及连续多个核苷酸协同作用的缺点，寻找到一种收缩区厚度较薄的突变体CpsD_K49A和CpsC组成的蛋白复合物纳米孔，该蛋白复合物收缩区仅厚度仅从而减少连续多核苷酸的数量，降低电流信号解码难度，提高碱基分辨效率。同时，目前能够用于测序的孔蛋白种类比较少，所以，本发明提供了一种新型纳米孔蛋白，该突变体蛋白复合物形成稳定的十六聚体，能够作为生物纳米孔，并具备进一步优化改造的潜力。

第一方面，本发明提供一种孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A，其中所述孔蛋白复合物突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列。

第二方面，本发明提供编码上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的核酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸序列选自：

1)如SEQ ID NO:3示；

2)与SEQ ID NO:3所示的核酸序列至少具有85％的同源性，且编码SEQ IDNO:1和2所示氨基酸序列的核酸序列；

3)与1)或2)互补的核酸序列。

在一些实施方案中，同源性在85％-99％之间。

在一些实施方案中，同源性为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

第三方面，本发明提供包含上述编码基因的重组载体，优选的载体序列为SEQ IDNO:4所示的CpsC-CpsD_K49A_pET28a。

第四方面，本发明提供一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有上述重组载体，或者其基因组中整合上述编码基因；优选地，所述微生物为大肠杆菌。

第五方面，本发明提供包含上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的产品。

在一些实施方案中，所述产品是组合物或试剂盒。

第六方面，本发明提供上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的制备方法，包括以下步骤：

1)构建孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的表达载体；

2)孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A表达、纯化。

第七方面，本发明提供一种膜层，所述膜层中嵌入上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A。

在一些实施方案中，所述膜层是磷脂膜层。

在一些实施方案中，所述膜层是磷脂单层膜层。

第八方面，本发明提供一种检测系统，包括上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A或者上述膜层。

第九方面，本发明提供一种装置，包括上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A、上述膜层或者上述检测系统。

第十方面，本发明提供上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A、上述膜层或上述检测系统在制备样品测序和/或检测的装置中的应用。

在一些实施方案中，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。

第十一方面，本发明提供上述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A、上述膜层、上述检测系统或上述装置在样品测序和/或检测中的应用。

有益效果

根据已有生物纳米孔测序结果，纳米孔蛋白收缩区(核酸底物电流检测区，也可称为电流信号的读取头)的厚度会决定连续核酸过孔的数量，从而影响电流信号复杂度。本发明人通过冷冻电镜技术，解析了高分辨率突变体CpsC-CpsD_K49A复合物纳米孔结构结构分析发现CpsC-CpsD_K49A纳米孔蛋白收缩区宽度为/>厚度/>(附图7)。

附图说明

图1是野生型CpsC-CpsD复合物蛋白表达纯化图；

图2是野生型CpsC-CpsD蛋白复合物分子筛结果图；

图3是突变体CpsC-CpsD_K49A复合物蛋白表达纯化图；

图4是突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物分子筛结果图；

图5是突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物冷冻电镜map图；

图6是突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物纳米孔整体结构图；

图7是突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物纳米孔收缩区整体构象图；

图8是突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物纳米孔的电流曲线。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1：野生型及突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物表达载体构建与蛋白的制备

1.突变体CpsC-CpsD_K49A蛋白复合物表达载体构建

野生型及突变体CpsC-CpsD_K49A来源于Streptococcus agalactiae

蛋白CpsC,NCBI Reference Sequence:WP_001033068.1(SEQID1)

蛋白CpsD NCBI Reference Sequence:WP_000197406.1(突变体序列为SEQID2)

该蛋白表达基因通过人工合成的方式获得，合成过程进行适用于大肠杆菌表达的密码子优化并引入CpsD上第49位氨基酸的突变(SEQID：3),该基因序列中，CpsC和CpsD_K49A基因序列之间引入一段包含10个核苷酸的序列，合成后基因直接连接到pET-28a载体上，蛋白CpsC的N端添加6×his，作为亲和纯化标签，蛋白CpsD_K49A的C端添加strep标签用于蛋白检测。载体构建由基因合成公司完成，获得表达载体序列见SEQID：4.

在合成的表达突变体蛋白复合物的质粒基础上，利用定点突变PCR方法，获得野生型CpsC-CpsD蛋白复合物蛋白表达质粒。

引物序列如下

F:AAATCCACTACTTCAACAAGTTTAGCTTTATC

R:TTGTTGAAGTAGTGGATTTTCCTTCCCCTTCCCTAACAG

PCR体系如下(30μL)：

PCR程序如下：

PCR反应产物加入Dpn1，37℃消化1hr后转化DH5α细胞，挑点测序，选取正确克隆进行后续实验。

2.野生型和突变体CpsC-CpsD_K49A复合物纳米孔蛋白表达、纯化

野生型和突变体CpsC-CpsD_K49A复合物纳米孔蛋白经过Ni柱亲和层析、分子筛纯化后，蛋白纯度较高(附图1，野生型；附图3，突变体)，蛋白性质均一(附图2，野生型；附图4，突变体)，通过分子筛图判断可知和野生型CpsC-CpsD复合物相比，CpsC和CpsD_K49A能够形成稳定复合物。

表达纯化步骤如下：

1)将野生型和突变体CpsC-CpsD_K49A表达质粒(SEQID4)转入BL21(DE3)，进行表达。37℃200rpm获取种子液1mL后转入1L LB培养基，37℃200rpm至OD₆₀₀为1.2，降温至26℃0.2mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导过夜；

2)4000rpm收集菌体，使用裂解buffer重悬(20mL/L菌)，高压破碎后18000rpm 4℃离心1小时，收集沉淀膜组分；

3)使用溶膜buffer(10mL/L菌)重悬膜组分，4℃磁力搅拌1小时进行膜蛋白抽提，18000rpm 4℃离心1小时，收集上清膜蛋白组分；

4)上清中加入终浓度30mM的咪唑后与溶膜buffer平衡后的Ni beads进行孵育，4℃结合1小时后进行亲和纯化；

5)将上清和Ni beads导入柱子中，重力自然流穿；10mL wash buffer清洗，5mLElution buffer洗脱蛋白；

6)目的蛋白进行分子筛纯化后SDS-PAGE检测纯度，结果如附图1所示，分子筛结果如附图2所示。

裂解buffer：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0

溶膜buffer：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，1％DDM

Wash buffer：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.5％DDM，50mM咪唑

Elution buffer：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.1％DDM，200mM咪唑

分子筛buffer：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.02％GDN

实施例2：突变体CpsC-CpsD_K49A复合物纳米孔蛋白原子水平结构

得到纯度和均一度较高的突变体CpsC-CpsD_K49A复合物纳米孔蛋白后(实施例1)，本发明人利用冷冻电镜技术，解析了其分辨率为的近原子水平结构。

冷冻电镜结构解析步骤如下：

1)准备筛选好的样品，并在相同的冻样条件下制备几个备用样品，选取6个合适的样品上到Talos Arctica 200kV高端电镜中；

2)上样后等待真空和温度稳定后，开启镜筒在低倍下选择合适的方形孔。这一步和冷冻样品的筛选类似，其目的使选择合适的方形孔用于后面数据的收集；

3)根据电镜的机时空余以及每个方形孔能够采集的照片数量，计算大概需要选择的方形孔数量，选择完成后进行地图的拍摄；

4)地图拍摄过程中，我们可以离线选择地图中能够用于数据收集的孔，这样可以节省一部分的时间；

5)待地图拍摄完成后既可以对电镜进行调机，以备数据的收集工作。主要包括电镜的合轴、背底扣除及数据收集基本参数(欠焦量-1.5μm到-2.5μm，电子计量拍照帧数32帧和pixl size/>)的设置；

本发明人后续经过数据处理，结构解析，得到了其电子密度，整体如附图5所示，整体map为8聚体结构，单体位置如图所示(附图5左图为顶视图，右图为侧视图)，右图标注该纳米孔蛋白复合物跨膜区位置。随后，通过同源建模，结构搭建、精修获得了突变体CpsC-CpsD_K49A纳米孔蛋白复合物氨基酸的原子坐标(附图6，左图为侧视图，右图为顶视图)。结构分析可见，CpsC-CpsD_K49A纳米孔蛋白复合物收缩区有别于大肠杆菌纳米孔蛋白的三层结构，收缩区区宽度为(附图7左和右上)，收缩区厚度薄(附图7右下)仅为/>

实施例3：突变体CpsC-CpsD_K49A复合物纳米孔蛋白电流信号检测

在获得CpsC-CpsD_K49A突变体纳米孔蛋白复合物后，本发明人对这些蛋白的电流性质进行检测。本发明采用人工形成磷脂单层膜(DPhPC)，再嵌入单个纳米孔蛋白，后在180mV电压下记录电流变化。

嵌入纳米孔步骤如下：

在缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mMHepes，pH 8.0)中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2mL缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH 8.0)流过系统以除去残留的过量纳米孔。分别记录CpsC-CpsD_K49A突变体纳米孔蛋白复合物在磷脂膜上的电流信号，记录结果如图所示(附图8)。

由电流信号可见，该复合物纳米孔过孔电流为0.37nA，电流比较平稳，但自发阻碍作用相对比较强。电流信号的这些特征表明CpsC-CpsD_K49A突变体纳米孔蛋白具有对线性生物大分子链如核酸链进行测序的能力，通过适当的优化可以获得可用于测序的纳米孔突变体。

序列信息

SEQ ID1

>CpsC

MHHHHHHNKIANTEVEINIFNLLKKLWKKKFLITFVAIAFATAGLFYSLFIVTPQYISSTRIYVINPNTPNNS

ITAQDLQAGSFLANDYKEIITSTDVLEKVISSEKLNYPSSQLLQKITVSILKDTRVISISVEDANPKMSQKLA

NSVREAAVSKIKAVTQVEDITTLEKGNLPKAPSSPNIKKNVLIGFIVGAGLSTIVLVIMGILDDRVNTEEDIE

KALGLTSLGIVPDLNKLSEQ ID2

>CpsD_K49A

MTRLEIVDSKLRQAKKTEEYFNAIRTNIQFSGKENKILAITSVREGEGASTTSTSLALSLAQAGFKTLLIDA

DTRNSVMSGTFKATGTIKGLTNYLSGNADLGDIICETNVPRLMVVPSGKVPPNPTALLQNAYFNKMIEAI

KNIFDYIIIDTPPIGLVVDAAIIASACDGFVLVTQAGRIKRNYVEKAKEQMEQSGSKFLGIILNKVNESVAT

YGDYGNYGKRDRKRKWSHPQFEK

SEQ ID3>

CpsC-CpsD_K49A

ATGCATCATCATCATCATCATAATAAAATAGCTAATACAGAAGTTGAAATAAATATATTCAACCTTT

TAAAAAAATTGTGGAAAAAGAAATTTTTAATCACATTTGTTGCCATTGCATTTGCAACAGCTGGACTTTTCTATAGTCTTTTTATTGTTACGCCACAATATATTTCTTCAACAAGGATATATGTCATTAACCCTAATACCCCTAATAATAGTATTACTGCACAAGATCTACAAGCGGGGAGTTTTCTTGCCAATGACTATAAGGAGATTATTACGTCTACTGACGTTCTAGAAAAAGTTATTTCTTCTGAAAAATTGAATTATCCTTCGTCTCAGTTGTTGCAAAAAATAACAGTTTCTATTTTAAAAGATACACGTGTTATTTCAATATCGGTCGAAGATGCTAATCCAAAAATGTCTCAAAAATTAGCAAATTCAGTTAGAGAAGCAGCAGTTTCAAAAATCAAGGCAGTTACTCAAGTAGAGGATATCACTACTCTTGAGAAGGGAAATTTACCTAAAGCACCATCTTCTCCTAATATTAAAAAGAATGTACTAATCGGGTTTATTGTTGGTGCAGGATTATCAACTATTGTTTTAGTTATTATGGGTATTTTGGATGATCGTGTTAATACTGAAGAAGATATTGAAAAGGCCCTAGGACTTACTTCTTTAGGTATAGTACCAGATTTGAATAAACTTTAAGGAGAATATAATGACTCGTTTAGAAATAGTTGATAGCAAGTTAAGACAAGCAAAAAAAACAGAAGAATACTTCAATGCGATCCGTACAAACATACAGTTTAGTGGAAAGGAAAATAAAATTCTTGCAATTACCTCTGTTAGGGAAGGGGAAGGAGCATCCACTACTTCAACAAGTTTAGCTTTATCTTTAGCTCAAGCAGGATTTAAAACATTATTAATTGATGCGGATACTAGGAACTCTGTTATGTCTGGAACCTTTAAAGCAACTGGAACTATTAAAGGCTTGACGAATTATTTATCAGGTAATGCAGATCTTGGAGATATTATCTGTGAAACCAATGTTCCTAGACTGATGGTCGTTCCTTCAGGGAAAGTACCACCAAATCCAACAGCATTACTTCAGAACGCTTATTTTAATAAGATGATTGAAGCTATTAAAAATATATTTGATTATATTATCATCGATACTCCACCTATTGGTTTAGTTGTTGATGCCGCAATAATCGCTAATGCTTGCGATGGTTTTATTTTAGTAACCCAAGCAGGTAGAATAAAACGTAATTATGTTGAAAAAGCAAAAGAACAGATGGAACAAAGTGGTTCAAAGTTCTTAGGTATTATTCTTAATAAAGTTAGTGAATCTGTTGCAACTTACGGCGATTATGGAAATTACGGAAAAAGGGATAGAAAAAGGAAGTGGTCTCACCCTCAGTTCGAAAAATAA

SEQ ID4

>CpsC-CpsD_K49A_pET28a

TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAA

GATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCAC

CGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTC

AGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACT

CTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAA

GTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC

GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCG

TGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCA

GGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTG

TCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATG

GAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCT

TTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGC

CGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTA

TTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGA

TGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGAC

ACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGC

TGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAG

CTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCA

GCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGT

TTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGA

TGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTT

GTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCC

AGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCG

GAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGAC

CATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCG

GTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCAC

GATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTG

GCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCC

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CCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGT

GAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG

CTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTT

CTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCA

AGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATA

ACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGAC

TCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACG

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CCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAG

AAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATA

GTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACG

CCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCG

CGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTT

TGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTT

TCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACAC

CGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCC

GGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCT

CCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCG

CAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATAC

CCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGG

CGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGA

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AATAAAATAGCTAATACAGAAGTTGAAATAAATATATTCAACCTTTTAAAAAAATTGTGGAAAAAG

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GTTCTAGAAAAAGTTATTTCTTCTGAAAAATTGAATTATCCTTCGTCTCAGTTGTTGCAAAAAATAAC

AGTTTCTATTTTAAAAGATACACGTGTTATTTCAATATCGGTCGAAGATGCTAATCCAAAAATGTCTC

AAAAATTAGCAAATTCAGTTAGAGAAGCAGCAGTTTCAAAAATCAAGGCAGTTACTCAAGTAGAGG

ATATCACTACTCTTGAGAAGGGAAATTTACCTAAAGCACCATCTTCTCCTAATATTAAAAAGAATGT

ACTAATCGGGTTTATTGTTGGTGCAGGATTATCAACTATTGTTTTAGTTATTATGGGTATTTTGGATG

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AAAAAAAACAGAAGAATACTTCAATGCGATCCGTACAAACATACAGTTTAGTGGAAAGGAAAATAA

AATTCTTGCAATTACCTCTGTTAGGGAAGGGGAAGGAGCATCCACTACTTCAACAAGTTTAGCTTTA

TCTTTAGCTCAAGCAGGATTTAAAACATTATTAATTGATGCGGATACTAGGAACTCTGTTATGTCTGG

AACCTTTAAAGCAACTGGAACTATTAAAGGCTTGACGAATTATTTATCAGGTAATGCAGATCTTGGA

GATATTATCTGTGAAACCAATGTTCCTAGACTGATGGTCGTTCCTTCAGGGAAAGTACCACCAAATC

CAACAGCATTACTTCAGAACGCTTATTTTAATAAGATGATTGAAGCTATTAAAAATATATTTGATTAT

ATTATCATCGATACTCCACCTATTGGTTTAGTTGTTGATGCCGCAATAATCGCTAATGCTTGCGATGG

TTTTATTTTAGTAACCCAAGCAGGTAGAATAAAACGTAATTATGTTGAAAAAGCAAAAGAACAGAT

GGAACAAAGTGGTTCAAAGTTCTTAGGTATTATTCTTAATAAAGTTAGTGAATCTGTTGCAACTTAC

GGCGATTATGGAAATTACGGAAAAAGGGATAGAAAAAGGAAGTGGTCTCACCCTCAGTTCGAAAAA

TAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAG

TTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGG

GTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A，其中所述孔蛋白复合物突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列。

2.编码权利要求1所述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的核酸序列；

1)如SEQ ID NO:3示；

3)与1)或2)互补的核酸序列；

优选地，同源性在85％-99％之间；

优选地，同源性为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

3.包含权利要求2所述核酸序列的重组载体。

4.一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有权利要求3所述的重组载体，或者其基因组中整合权利要求2所述的核酸序列；优选地，所述微生物为大肠杆菌。

5.包含权利要求1所述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的组合物或试剂盒。

6.权利要求1所述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的制备方法，包括以下步骤：

1)构建孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A的表达载体；

2)孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A表达、纯化。

7.一种膜层，所述膜层中嵌入权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A；

优选地，所述膜层是磷脂膜层；

优选地，所述膜层是磷脂单层膜层。

8.一种检测系统，包括权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A或者权利要求7所述的膜层。

9.一种装置，包括权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统。

10.权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统在制备样品测序和/或检测的装置中的应用；优选地，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。

11.权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsD_K49A、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统或权利要求9所述装置在样品测序和/或检测中的应用；优选地，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。